BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

CHỌN LỌC MÔI TRƢỜNG NHÂN SINH KHỐI NẤM
Beauveria bassiana TẠO CHẾ PHẨM DẠNG BÀO TỬ
VÀ ĐÁNH GIÁ HIỆU LỰC CỦA CHẾ PHẨM
LÊN CÔN TRÙNG GÂY HẠI

Ngành học

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện

: PHAN CÔNG NHẬT

Niên khóa

: 2011 – 2013

Tháng 01/2014


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

CHỌN LỌC MÔI TRƢỜNG NHÂN SINH KHỐI NẤM
Beauveria bassiana TẠO CHẾ PHẨM DẠNG BÀO TỬ
VÀ ĐÁNH GIÁ HIỆU LỰCCỦA CHẾ PHẨM
LÊN CÔN TRÙNG GÂY HẠI

Hƣớng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

ThS. TRẦN THỊ VÂN

PHAN CÔNG NHẬT
Niên khóa: 2011 – 2013

Tháng 01/2014


LỜI CẢM ƠN
Chân thành cảm ơn:


Ban Giám hiệu Trƣờng Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, Ban Chủ

nhiệm Bộ môn Công nghệ sinh học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt kiến thức
cho em trong suốt quá trình học tại trƣờng.


Xin gởi lời biết ơn sâu sắc đến cô Th.s Trần Thị Vân đã hết lòng hƣớng dẫn em


trong suốt thời gian thực tập tốt nghiệp.


Thành kính ghi ơn cha mẹ đã nuôi dƣỡng, thƣơng yêu và dạy dỗ con nên ngƣời.



Sau cùng, xin cảm ơn bạn Ƣng Thị Mỹ Tiên và toàn thể các bạn trong lớp đã

động viên giúp đỡ em trong suốt thời gian thực hiện đề tài.
Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 01/2014
Phan Công Nhật

[Type text]


TÓM TẮT
Nấm côn trùng Beauveria bassiana có hiệu lực cao tiêu diệt nhiều loài côn
trùng và sâu bệnh hại cây trồng, chiếm vị trí quan trọng trong các chế phẩm thuốc trừ
sâu vi sinh từ vi nấm góp phần giảm tỷ lệ kháng thuốc cũng nhƣ thiệt hại do ô nhiễm
môi trƣờng, mất cân bằng sinh thái và đặc biệt là ảnh hƣởng đến con ngƣời do các
thuốc trừ sâu hóa học gây ra. Để nâng cao hiệu quả ứng dụng của chế phẩm nấm cần
đẩy mạnh thực hiện nhiềuthí nghiệm khảo sát và nghiên cứu trong việc sản suất chế
phẩm để phòng trừ sâu hại cây trồng,đề tài“Chọn lọc môi trƣờng nhân sinh khối nấm
Beauveria bassiana tạo chế phẩm dạng bào tử và đánh giá hiệu lực của chế phẩm lên
côn trùng gây hại”đƣợc thực hiện.
Nội dung: chọn lọc môi trƣờng bán rắn thích hợp cho nấm phát triển, theo dõi
các điều kiện phát triển nhƣ: ẩm độ, nhiệt độ, thời gian phát triển cao nhất của bào tử
và thời gian sấy ảnh hƣớng đến chế phẩm. Thử nghiệm hoạt lực gây chết lên sâu xanh
bƣớm trắng và châu chấu trong nhà lƣới.

Kết quả: Đã chọn lọc ra đƣợc môi trƣờng bán rắn nhân sinh khối thích hợpcho
nấm B. bassiana là gạo (tấm) có bổ sung khoáng chất, nấm phát triển tốt ở ẩm độ 20%
và nhiệt độ là 27ºC, cũng nhƣ thời gian phát triển đạt hàm lƣợng bào tử cao sau 10
ngày cấy lên môi trƣờng và nhiệt độ sấy ở 37ºC trong 48 giờ là đạt mật số bào tử tốt và
thích hợp cho việc bảo quản.
Hiệu lực gây chết của chế phẩm B. bassiana lên sâu xanh bƣớm trắng là 70%
sau 15 ngày phun và đối với châu chấu là 65% sau 15 ngày phun với tỷ lệ mọc lại nấm
38,46% và 43% đối với sâu xanh bƣớm trắng.

ii


SUMMARY
Beauveria bassiana, a high effective insect fungus have killed many insects and
pests of crops, occupy an important position in the microorganisms pesticide
preparations from fungal contribute to reduce the rate of drug resistance as well as
damage due to environmental pollution, ecological imbalance and particularly affects
people by chemical pesticides cause.
To improve the efficiency application of fungal preparations should do
promotion many experiments in the research and surveys about production
preparations to prevent insects and crop pests,the thesis"Selective increase medium
Beauveria bassiana fungus biomass make spores produce and evaluate the
effectiveness of the products on harmful insects"is performed.
Contents: Selective suitable semi-solid medium for fungal development and
monitoring of development conditions such as humidity, temperature, the highest time
development of cell and drying timeaffects products. Lethal potency testing to Pieris
rapaeand Caeliferain a greenhouse.
Results: Selectedsemi-solid mediumincrease biomasssuitablyfor Beauveria
bassiana fungus is rice (broken grains of rice) supplemented with minerals, fungi grow
well in humidity 20% and temperature of 27ºC,as well as development time

reachedhigh levels of spores after 10 days culture on the medium and the drying
temperature at 37ºC in 48 hours to reach the density of spores is good and suitable for
storage.
Lethal effective of productB. bassiana onPieris rapae was 70% after 15 spray
days and Caelifera is 65% after 15spray days with the rate of fungus regrowth nearly
38.46 % and nearly 43% on Pieris rapae.
Key words: Beauveria bassiana

iii


MỤC LỤC
NỘI DUNG

TRANG

LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................... i
TÓM TẮT........................................................................................................................ii
SUMMARY................................................................................................................... iii
MỤC LỤC ...................................................................................................................... iv
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ..........................................................................vii
DANH SÁCH CÁC BẢNG ........................................................................................ viii
DANH SÁCH CÁC HÌNH ............................................................................................. ix
Chƣơng 1 MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 1
1.1. Đặt vấn đề ................................................................................................................ 1
1.2. Yêu cầu ..................................................................................................................... 2
1.3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................................ 2
Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................ 3
2.1. Giới thiệu về nấm Beauveria bassiana .................................................................... 3
2.2. Đặc điểm hình thái .................................................................................................... 3

2.3. Khả năng sinh độc tố diệt côn trùng ......................................................................... 3
2.3.1. Độc tố .................................................................................................................... 3
2.3.2. Cơ chế tác động ..................................................................................................... 4
2.4. Triệu chứng của sâu nhiễm bệnh .............................................................................. 4
2.5. Các yếu tố cơ bản ảnh hƣớng đến sự sinh trƣởng và phát triến của B.bassiana ...... 5
2.5.1. Ảnh hƣởng của môi trƣờng và phƣơng pháp nuôi cấy ......................................... 5
2.5.2. Ảnh hƣởng của nhiệt độ,ánh sáng độ thoáng khí và độ pH .................................. 6
3. Khái niệm các loài côn trùng dùng trong thí nghiệm .................................................. 6
3.1. Sâu xanh bƣớm trắng (Pieri rapae) .......................................................................... 6
3.2. Châu chấu (Caelifere)............................................................................................... 7
4. Các nghiên cứu về nấm Beauveria bassiana ............................................................... 8
4.1. Các nghiên cứu ngoài nƣớc ...................................................................................... 8
4.2. Các nghiên cứu trong nƣớc....................................................................................... 9
Chƣơng 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................. 11
iv


3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu .......................................................................... 11
3.2. Vật liệu nghiên cứu................................................................................................. 11
3.2.1. Chủng vi sinh vật ................................................................................................. 11
3.2.2. Môi trƣờng nuôi cấy ............................................................................................ 11
3.3. Dụng cụ và thiết bị ................................................................................................. 11
3.3.1. Dụng cụ................................................................................................................ 11
3.3.2. Thiết bị ................................................................................................................. 11
3.4. Phƣơng pháp nghiên cứu ........................................................................................ 12
3.4.1. Khảo sát và chọn lọc môi trƣờng bán rắn để nhân sinh khối nấm Beauveria
bassiana .......................................................................................................................... 12
3.4.2. Khảo sát các yếu tố ảnh hƣởngđến sự phát triển củaB. Bassiana trên môi trƣờng
nhân sinh khối tốt nhất .................................................................................................. 13
3.5. Đánh giá hiệu lực của chế phẩm nấm Beauveria bassiana để phòng trừ côn trùng

hại cây trồng .................................................................................................................. 15
3.5.1. Đối với sâu xanh bƣớm trắng .............................................................................. 15
3.5.2. Đối với châu chấu ................................................................................................ 16
3.6. Phƣơng pháp pha loãng và đếm số lƣợng bào tử ................................................... 16
3.6.1. Phƣơng pháp pha loãng ....................................................................................... 16
3.6.2. Phƣơng pháp đếm số lƣợng bào tử ...................................................................... 17
3.6.3. Phƣơng pháp tính toán ......................................................................................... 17
Chƣơng 4 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ........................................................................ 19
4.1. Tuyển chọn nấm Beauveria bassiana đƣợc nuôi cấy ............................................. 19
4.2. Khảo sát và chọn lọc môi trƣờng bán rắn để nhân sinh khối nấm ........................ 19
4.3. Khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến sự phát triển của nấm B. bassiana trên môi
trƣờng nhân sinh khối tốt nhất ...................................................................................... 21
4.3.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hƣởng của độ ẩm và nhiệt độ đến sự phát triển của
B.bassiana...................................................................................................................... 21
4.3.1.1. Khảo sát ảnh hƣởng của độ ẩm đến sự phát triển của nấm B.bassiana ........... 21
4.3.1.2. Khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ đến sự phát triển củaB. bassiana ................ 24
4.3.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát sự ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy đến sự phát triển
của nấm B. bassiana ...................................................................................................... 26

v


4.3.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hƣởng của thời gian sấy tới năng suất và chất lƣợng
của chế phẩm B. bassiana ............................................................................................. 27
4.4. Các bƣớc sản xuất chế phẩm nấm Beauveria bassiana ......................................... 28
4.5. Đánh giá hiệu lực của chế phẩm nấm Beauveria bassiana để phòng trừ côn trùng
hại cây trồng .................................................................................................................. 29
4.5.1. Đánh giá hiệu lực trừ sâu xanh bƣớm trắng của chế phẩm ................................ 29
4.5.2. Đánh giá hiệu lực trừ châu chấu của chế phẩm .................................................. 31
Chƣơng 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ....................................................................... 33

5.1. Kết luận................................................................................................................... 33
5.2. Đề nghị ................................................................................................................... 33
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 34
PHỤ LỤC

vi


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
B.bassiana

: Beauveria bassiana.

CMA

: Corn meal agar.

Cs

: Cộng sự.

Ha

: Hecta.

LLL

: Lần lặp lại.

MEA


: Malt extract agar.

NA

: Nutrient agar.

PGA

:

SDA

: Sabouraud’s dextrose agar.

YPDA

: Yeast extract potato dextrose agar.

PDA

: Potato dextrose agar.

Potato glucoza agar.

vii


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 4.1 Sự phát triển của B.bassiana ở các môi trƣờng bán rắn sau các ngày cấy ở

nhiệt độ 27ºC ................................................................................................................. 20
Bảng 4.2 Khảo sát ảnh hƣởng của tỷ lệ nƣớc đến sự phát triển của B. bassiana trên
môi trƣờng đƣợc chọn lọc. ............................................................................................ 23
Bảng 4.3 Khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ đến sự phát triển của B.bassiana ở độ ẩm
20% ................................................................................................................................ 25
Bảng 4.4 Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy đến sự phát triển của B. bassiana ở ẩm độ
20% và nhiệt độ 27ºC .................................................................................................... 26
Bảng 4.5 Ảnh hƣởng của thời gian sấy tới chất lƣợng của chế phẩm nấm
B.bassiana...................................................................................................................... 27
Bảng 4.6 Hiệu lực của chế phẩm trừ sâu xanh bƣớm trắng thử nghiệm trong nhà lƣới
....................................................................................................................................... 30
Bảng4.7 Hiệu lực của chế phẩm trừ châu chấu xanh thử nghiệm trong nhà lƣới ......... 31

viii


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 2.1 Nấm Beauveria bassiana ký sinh côn trùng .................................................... 3
Hình 4.1 Đĩa nấm Beauveria bassiana sau 7 ngày nuôi bằng phƣơng pháp cấy điểm
và cấy trải...................................................................................................................... 19
Hình 4.2 Sơ đồ biểu diễn sự khác biệt giữa các nghiệm thức 10 ngày sau cấy ............ 21
Hình 4.3 Nấm Beauveria bassianaphát triển trên môi trƣờng .........................................
bán rắn của các nghiệm thức sau 10 ngày nuôi cấy ở 27ºC theo loại nút bông ............ 22
Hình 4.4 Nấm Beauveria bassianaphát triển trên môi trƣờng bán rắn của các nghiệm
thức sau 10 ngày nuôi cấy ở 27ºC theo loại nút bấm kim ............................................. 22
Hình 4.5 Nấm Beauveria bassiana phát triển trên môi trƣờng bán rắn với các lƣợng
nƣớc bổ sung khác nhau sau 14 ngày, ở nhiệt độ 27ºC ................................................. 24
Hình 4.6 Nấm Beauveria bassiana phát triển trên môi trƣờng bán rắn với các mức
nhiệt độ khác nhau sau 14 ngày ..................................................................................... 26
Hình 4.7 Sơ đồ các bƣớc sản xuất chế phẩm nấmB. bassiana ..................................... 28

Hình 4.8 Chế phẩm nấm B. bassianadạng bột bào tử.................................................. 29
Hình 4.9 Sâu xanh bƣớm trắng chết do chế phẩm nấm B.bassiana ............................. 31
Hình 4.10 Châu chấu chết do chế phẩm nấm B. bassianasau 15 ngày ........................ 32

ix


Chƣơng 1 MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Việt Nam là một nƣớc nông nghiệp có khí hậu nhiệt đới nóng ẩm nên rất thuận
tiện cho cây trồng phát triển. Đồng thời với cây trồng phát triển là sâu bệnh hại cũng
phát sinh, gây hại đáng kể đến năng suất. Theo thống kê của Cục Bảo vệ thực vật
(BVTV), hàng năm các loại dịch hại, bệnh hại, đã làm giảm 35 – 40% tổng sản lƣợng,
mặt khác làm giảm phẩm chất của nông sản. Để bảo vệ cây trồng, mức chi phí cho
công tác bảo vệ thực vật, phòng trừ dịch hại đã không ngừng tăng lên trong phạm vi
toàn quốc. Trong quá trình làm giảm thiệt hại do sâu, bệnh hại gây ra, ngƣời nông dân
đã sử dụng nhiều biện pháp phòng trừnhƣcanh tác thủ công, luân canh, chuyên canh,
chọn tạo giống mới, dùng thuốc hóa học. Trong đó biện pháp sử dụng thuốc hóa học
đƣợc xem là phổ biến vì dễ áp dụng, có hiệu quả ngay, kịp thời và hiệu quả cao mà
giá thành lại rẻ. Nhƣng việc sử dụng thuốc trừ sâu hóa học gây ô nhiễm môi trƣờng
trầm trọng, để lại dƣ lƣợng chất hóa học trong nông sản, giảm số lƣợng sinh vật có
ích, làm mất cân bằng sinh thái trong tự nhiên, làm tăng tính kháng thuốc của sâu
bệnh. Do vậy, sử dụng thuốc hóa học chỉ là biện pháp tình thế.
Hiện nay đời sống xã hội Việt Nam ngày càng phát triển, ý thức của ngƣời
nông dân cũng đƣợc nâng cao, họ hiểu đƣợc các tác hại của thuốc hóa học và muốn có
một loại thuốc mới diệt trừ sâu đạt hiệu quả cao mà không gây ra hậu quả xấu nhƣ
thuốc hóa học. Điều đó đòi hỏi các nhà khoa học cần phải nghiên cứu để thay thế
thuốc hóa học bằng các loại thuốc khác theo hƣớng công nghệ sinh học. Qua nghiên
cứu, các nhà khoa học đã phát triển các loại vi nấm, vi khuẩn, vi rút có khả năng ký
sinh gây bệnh trên nhiều loại sâu hại cây trồng đạt hiệu quả cao.

Nhiều cơ quan khoa học đã và đang tiến hành nghiên cứu sản xuất các chế
phẩm có nguồn gốc từ vi sinh vật (vi khuẩn, vi rút và vi nấm). Trong số các chế phẩm
đó, vi nấm đƣợc Viện Bảo vệ thực vật nghiên cứu từ những năm 1990 thế kỷ XX, đến
nay mang lại kết quả cao trong việc bảo vệ cây trồng. Chế phẩm thuốc trừ sâu vi nấm
có những ƣu điểm là không độc hại với ngƣời và vật nuôi, không gây ô nhiễm môi
trƣờng, không làm mất đi nguồn sinh vật có ích trong tự nhiên. Nấm ký sinh côn trùng
chƣa tạo ra tính kháng thuốc và có khả năng lây nhiễm trên nhiều loại sâu khác nhau,
[Type text]


ngoài ra nấm ký sinh côn trùng không chỉ tiêu diệt trực tiếp sâu hại vào thời kỳ phá
hoại mà còn tích lũy trên đồng ruộng và lan truyền cho thế hệ sâu tiếp theo.
NấmBeauveria bassiana (B.bassiana) đƣợc nghiên cứu phổ biến hiện nay vì lợi
ích lâu dài của nó. Có nhiều công trình nghiên cứu đã lựa chọn đƣợc những chủng
giống mới, môi trƣờng nuôi cấy thích hợp, cho sự phát triển của nấm B.bassiana.
Để góp phần vào việc nhân nuôi tạo chế phẩm nấm Beauveria bassianadạng
bột, hƣớng tới thƣơng mại hóa chế phẩm, đề tài“Chọn lọc môi trƣờng nhân sinh
khối nấm Beauveria bassianatạo chế phẩm dạng bào tử và đánh giá hiệu lực của
chế phẩm lên côn trùng gây hại”đƣợc thực hiện.
1.2. Yêu cầu
Tạo chế phẩm nấm Beauveria bassiana dạng bào tử dựa trên các cơ sở
nghiên cứu và các yếu tố ảnh hƣởng đến sự phát triển của nấm B. bassiana.
Chọn lọc môi trƣờng tốt nhất để nhân sinh khối nấm Beauveria bassiana.
1.3. Nội dung nghiên cứu
Khảo sát và chọn lọc môi trƣờng bán rắn để nhân sinh khối nấm.
Khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến sự phát triển của nấm Beauveria bassiana
trên môi nhân sinh khối tốt nhất.
- Thí nghiệm 1: Khảo sát sự ảnh hƣởng của ẩm độ, nhiệt độ đến sự phát triển
của nấm.
- Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy đến sự phát triển

của nấm.
- Thí nghiệm 3: Khảo sátảnh hƣởng củathời gian sấy tới năng suất và chất lƣợng
của chế phẩm Beauveria bassiana.
Đánh giá hiệu lực của chế phẩm lên côn trùng gây hại.

2


Chƣơng 2 TỒNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Giới thiệu về nấm Beauveria bassiana
Lớp: Deuteromycetes.
Bộ: Moniliales.
Họ: Moniliaceae.
Chi: Beauveria.
Hình 2.1 Nấm Beauveria bassiana ký sinh côn trùng
Giống Beauveria thƣờng đƣợc chia thành 3 loài:Beauveria bassiana,Beauveria
erongniarti, Beauveria alba, trong đó 2 loài đầu là tác nhân gây bệnh côn trùng
(Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn Cửu Thị Hƣơng Giang, 1997).
2.2 Đặc điểm hình thái
Theo Phạm Thị Thùy (2004)Beauveria bassiana có màu trắng nên ngƣời Trung
Quốc và ngƣời Việt Nam gọi là nấm trắng hay nấm bạch cƣơng. Trên môi trƣờng
thạch đĩa hoặc thạch nghiêng, nấm bạch cƣơng có sợi màu trắng đến màu kem có pha
một ít màu đỏ, da cam, đôi khi pha một ít màu lục, có thể tiết vào môi trƣờng sắc tố
màu vàng, màu đỏ nhạt hoặc màu xanh da trời. Sợi nấm phân nhánh có vách ngăn, sợi
nấm dài khoảng 3-5µm phát triển dày đặc trên môi trƣờng, về sau xuất hiện chi chít
các cuống sinh bào tử. Trên cơ thể tằm và các côn trùng khác, sợi nấm mọc nhanh và
chẳng mấy chốc đã phủ kín trên bề mặt cơ thể, sợi nấm có dạng phấn trắng khi khô
chuyển thành màu vàng sữa. Nấm Beauveria bassiana sinh ra những bào tử trần đơn
bào không màu, trong suốt không ngăn vách từ hình cầu (đƣờng kính 1-4 µm) đến

hình trứng (kích thƣớc 1,5-5,5 µm). Tế bào sinh bào tử trần đơn hoặc trong vòng
xoắn, phát sinh từ sợi sinh dƣỡng mọc thành từng đám, có cuống phình ra. Tế bào sinh
bào tử trần có hình zíc zắc nhƣng là mấu dạng răng nhỏ phát sinh bởi sự kéo dài của
gốc ghép. Phần gốc của tế bào sinh bào tử trần hình cầu hoặc hình chai (kích thƣớc
2,5-3,5 x 3,0-6,0 µm), khi thời gian nuôi cấy kéo dài, trong môi trƣờng những bào tử
trần sinh ra sẽ mảnh và kết chặt hơn với nhau.
2.3. Khả năng sinh độc tố diệt côn trùng
2.3.1. Độc tố
3


Hamill và cs (1996) đã xác định đƣợc độc tố diệt côn trùng của nấm bạch
cƣơng Beauveria bassiana và đặt tên cho độc tố này là Beauvericin. Ovehinnokov và
cs (1971) đã tổng hợp lại độc tố này, tác giả Jame và cs (1971) đã xác định bản chất
của độc tố sinh ra trong quá trình trao đổi chất đó là vòng peptid có các sắc tố màu
vàng tenelin và basianin, những sắc tố này có thể do hydroxylat progesteron và những
phần nhỏ tách ra từ testosteron (C19H28O2) sinh ra. Về mặt hóa học, độc tố Beauvericin
có danh pháp là xyclo (N – metyl – L – phenylalanin – D –α- hydroxyizovaleryl)3. Đây
là một loại depxipeptid vòng, có điểm sôi khoảng 93-94oC. Từ một lít môi trƣờng nuôi
cấy nấm Beauveria bassiana, các nhà khoa học Trung Quốc ở trƣờng Đại học Tổng
hợp Nam Khai (Thiên Tân) đã tách đƣợc 1,5g độc tố Beauvericin và từ 1 kg môi
trƣờng đặc các tác giả đã tách ra đƣợc 3,8 g Beauvericin (Phạm Thị Thùy,2004).
2.3.2. Cơ chế tác động
Trong tự nhiên, khi bào tử nấm rơi vào cơ thể côn trùng gặp điều kiện thuận
lợi, chỉ sau 12 – 24 giờ bào tử nấm nẩy mầm. Chúng hình thành sợi nấm đâm xuyên
qua lớp vỏ kitin và sau đó phát triển bên trong cơ thể côn trùng gây hại. Côn trùng gây
hại phải huy động hết các tế bào bạch huyết để chống lại nhƣng nấm đã tiết ra độc tố
Beauvericin và các chất khác làm phá hủy tế bào bạch huyết. Sợi nấm mọc rất nhiều
bên trong cơ thể làm cho cơ thể cứng lại, sau đó một thời gian nấm mọc ra ngoài, lớp
bào tử phủ lên côn trùng gây hại.Khi lớp bào tử nấm bao phủ này đƣợc gió phân tán

bay đến bám dính vào cơ thể côn trùng khác,lúc này cũng thực hiện cơ chế tác động
nhƣ trên (Phạm Thị Thùy,2004).
2.4. Triệu chứng của sâu nhiễm bệnh
Triệu chứng đặc trƣng nhất là sự thay đổi về khả năng di động của côn trùng,
sự di động này tùy theo mức độ phát triển của bệnh. Khi bị bệnh các mô dần dần bị
phá hủy từng phần, lúc đầu côn trùng di động yếu sau đó ngừng hẳn nằm im một chỗ
cho đến khi chết. Khi bị bệnh nấm, vận động của côn trùng ngừng từ 2-3 ngày thậm
chí một tuần trƣớc khi nấm phát triển đầy bên trong thân côn trùng. Chỉ những côn
trùng bị thƣơng hay bị bệnh nấm, màu sắc toàn thân mới thay đổi và xuất hiện những
vết đen. Khi sâu hại bị bệnh do nấm Beauveria bassiana ở chỗ bào tử bám vào, nấm
phát triển vào bên trong thân sâu hại tạo nên một vệt đen không có hình thù nhất định.
Côn trùng chết do nấm thƣờng có màu hồng, vàng nhạt, trắng và toàn thân cứng lại.
Khi bị bệnh nấm, thân côn trùng bị ngắn lại hoặc khô là do hệ thống tiêu hóa bị tổn
4


thƣơng hoặc do thiếu thức ăn. Vi sinh vật gây bệnh trên côn trùng thƣờng tác động
đến những mô nhất định, côn trùng bị nấm Beauveria bassiana ký sinh thì tuyến mỡ
và các mô khác bị hòa tan do enzym lipaza và proteaza của nấm tiết ra, cũng chính
nhờ đặc điểm đó mà ngƣời ta có thể xác định đƣợc côn trùng bị bệnh là do động vật
nguyên sinh hay là do nấm bậc thấp(Coelomycidium, Entomophthora) gây ra.Hiện
tƣợng chết hoặc gắn liền với hiện tƣợng tiêu hủy mô là đặc trƣng của bệnh nấm, quá
trình này tiến triển qua hai giai đoạn(Phạm Thị Thùy,2004).
Giai đoạn chấn thƣơng: Các mô tổn thƣơng bị phá hoại là do nấm từ bên ngoài
gây ra, trong trƣờng hợp này các lympho máu đọng lại và mô tái sinh đƣợc tạo nên
trên bề mặt phần thân côn trùng bị chấn thƣơng.
Giai đoạn nhiễm trùng máu:Côn trùng khi bị bệnh nấm là do lympho máu chứa
đầy sợi nấm.
2.5. Các yếu tố cơ bản ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng và phát triển của B .bassiana
Điều kiện cần thiết cho quá trình hình thành bào tử cũng nhƣ hệ sợi nấm

Beauveria bassiana nói riêng và nấm côn trùng nói chung là nhiệt độ, ẩm độ, độ pH
trong môi trƣờng, cũng nhƣ phƣơng pháp nuôi cấy.
2.5.1. Ảnh hƣởng của môi trƣờng và phƣơng pháp nuôi cấy
Môi trƣờng nuôi cấy là yếu tố quan trọng cho nấm sinh trƣởng và phát
triển,nếu môi trƣờng không tốt,nấm mọc yếu hoặc không mọc. Trong quá trình nẩy
mầm để hình thành bào tử nấmBeauveria bassiana cần các nguồn Cacbon, Nitơ. Sự
phát triển của nấm phụ thuộc vào các chất ức chế khác nhau.
Môi trƣờng thích hợp nhất cho nấm phát triển là môi trƣờng có chứa kitin làm
nguồn cacbon, nếu bổ sung thêm chất kitin và glucoza thì trong quá trình nuôi cấy,
nấm Beauveria bassiana sẽ thu đƣợc số lƣợng bào tử cao, bởi vì thành phần kitin
trong môitrƣờng nuôi cấy là rất cần thiết đối với các loại nấm, nó giúp cho sự phát
triển và hình thành bào tử đính (Conidiospore) và bào tử trần (Blastospore). Tuy
nhiên không phải nguồn thức ăn chứa Cacbon và Nitơ nào cũng đều có lợi cho sự sinh
trƣởng và phát triển cũng nhƣ sự nẩy mầm và hình thành bào tử của nấm B. bassiana,
vì ngoài nguồn nitơ vô cơ ra nấm B. bassiana còn sử dụng tốt nguồn hữu cơ nhƣ
protein, pepton, các axitamin trong đó có axit glutamic là axit thích hợp cho nấm phát
triển. Các nguyên tố vi lƣợng nhƣ C++, Zn++ có tác dụng kích thích cho sự phát triển

5


của nấm.Tùy vào điều kiện nuôi cấy nấmB. bassianamà chúng ta nghiên cứu để lựa
chọn môi trƣờng thích hợp sao cho nấm phát triển tốt nhất (Phạm Thị Thùy, 2004).
2.5.2.Ảnh hƣởng của nhiệt độ, ánh sáng, độ thoáng khí và độ pH
Nhiệt độ và ánh sáng là 2 yếu tố quan trọng quyết định đến sự phát triển của
nấm. Nhiệt độ thích hợp cho nấm phát triển trong phạm vi 25- 30oC.
Nấm Beauveria bassiana phát triển tốt nhất trong điều kiện ánh sáng yếu, chỉ
cần một lƣợng ánh sáng nhỏ trong thời gian 6- 8 giờ cũng đủ cho nấm côn trùng phát
triển
Hầu hết các loại nấm côn trùng thuộc loại hiếu khí, khi nấm phát triển chúng

cần có hàm lƣợng oxi thích hợp trong dụng cụ nhân nuôi cũng nhƣ trong cả biên độ
rộng của không gian nuôi cấy, nếu phù hợp thì nấm sẽ phát triển tốt
Nấm côn trùng đòi hỏi hàm lƣợng nƣớc thích hợp, nếu quá khô hoặc quá ƣớt
thì nấm phát triển không tốt, tỷ lệ thích hợp là 30- 50% tùy theo điều kiện ẩm độ của
không khí môi trƣờng.
Phạm vi nấm côn trùng sống ở độ pH từ 3,5- 8,0, song nấm côn trùng ƣa môi
trƣờng axit và nấm phát triển thích hợp nhất ở độ pH từ 5,5– 6. (Phạm Thị Thùy,
1996).
3. Khái niệm về các loài côn trùng dùng trong thí nghiệm
3.1. Sâu xanh bƣớm trắng (Pieri rapae)
Sâu xanh bƣớm trắng là loài sâu hại chủ yếu trên các loại rau cải, xu hào,
sau xanh bƣớm trắng thuộc bộ cánh phấn Lepidoptera.Theo tác giả Phạm Thị
Nhất(1995), sâu xanh bƣớm trắng có một số đặc điểm sau
Vòng đời: ở nhiệt độ 17,4ºC và độ ẩm 78,5% vòng đời sâu kéo dài khoảng 30
ngày, còn ở nhiệt độ 29,3ºC và độ ẩm 79,1% thì vòng đời sâu xanh bƣớm trắng chỉ
kéo dài 19,5 ngày.
Đặc điểm hình thái: Bƣớm có thân dài từ 15- 20mm, cánh trƣớc màu trắng xòe
rộng từ 40- 50mm, trứng hình vỏ phích có nhiều khía dọc. Sâu non có nhiều chấm
đen, sâu đẫy sức dài 28- 35mm. Nhộng màu xanh nhạt hơi vàng dài từ 18– 20mm,
dính một đầu trên lá rau, hai bên sƣờn có những chấm đen thƣa, giữa lƣng nổi hẳn lên
một đƣờng nhƣ hình xƣơng sống.
Đặc điểm đời sống: Hằng năm sâu thƣờng xuất hiện nhiều vào tháng 2 đến
tháng 5, chúng gây hại chủ yếu trên nhóm rau họ thập tự (rau cải, su hào, cải
6


bắp). Bƣớm cái đẻ trứng rải rác từng quả trên lá rau, một bƣớm cái có thể đẻ 150
trứng. Sau khi nở sâu non bắt đầu gặm nhấm lá xanh và chừa lại màng lá, từ tuổi
2 trở đi sâu cắn thủng lá làm lá bị khuyết.
3.2. Châu chấu (Caelifera)

Phân bộ châu chấu là một phân bộ chứa các côn trùng ăn lá, với danh pháp
khoa học là Caelifera thuộc bộ cánh thẳng (Orthoptera). Trong tiếng Việt, thông
thƣờng ngƣời ta phân biệt các loài bằng hai tên gọi phổ biến là châu chấu hay cào
cào. Tùy theo hình dáng bên ngoài của phần đầu tà bằng hay nhọn, nhƣng đó không
phải là một đặc điểm để phân loại trong khoa học và vì thế trong một đơn vị phân loại
cụ thể nào đó có thể có cả châu chấu lẫn cào cào.
Đặc điểm:Châu chấu có các râu gần nhƣ luôn luôn ngắn hơn phần thân (đôi
khi có nhiều sợi nhỏ), cũng nhƣ cơ quan đẻ trứng ngắn. Nhiều loài phát tiếng kêu
bằng cách cọ xát các xƣơng đùi sau vào các cánh trƣớc hay bụng, hoặc bằng cách
bật tanh tách các cánh khi bay. Các màng thính giác(nếu có) nằm ở các bên của
đoạn bụng thứ nhất. Các xƣơng đùi sau thông thƣờng dài và to khỏe, thích hợp để
nhảy. Nói chung, châu chấu có cánh, nhƣng các cánh sau giống nhƣ màng, trong
khi các cánh trƣớc thì dài và không phù hợp để bay. Châu chấu cái thƣờng to hơn
châu chấu đực, với cơ quan đẻ trứng ngắn.
Đặc tính sinh sản: Hệ thống sinh sản của châu chấu bao gồm các tuyến sinh
học, là các ống đƣa các sản phẩm sinh dục ra bên ngoài, cùng các tuyến phụ trợ.
Ở con đực, tinh hoàn bao gồm một số nang giữ khoang chứa tinh trùng khi chúng
trƣởng thành và tạo ra các tinh trùng thuôn dài. Sau khi chúng đƣợc giải phóng
thành chùm thì các tinh trùng này tích lũy trong bọng (Vesicula semainalis).Ở con
cái, mỗi buồng trứng bao gồm vài ống trứng. Các ống trứng này tụ lại trong hai
vòi trứng nhỏ, chúng hợp lại thành một vòi trứng chung để chuyên chở các trứng
đã chín. Mỗi ống trứng bao gồm một germanium (một khối các tế bào tạo ra noãn
bào, tế bào nuôi dƣỡng và các tế bào nang), cùng một loạt các nang. Các tế bào
nuôi dƣỡng noãn bào trong các giai đoạn đầu của sự phát triển, còn các tế bào
nang cung cấp vật liệu cho noãn hoàn và làm vỏ trứng (màng đệm)(Flook, 1997).
4. Các nghiên cứu về nấm Beauveria bassiana
4.1. Các nghiên cứu ngoài nƣớc
7



Cuối thế kỷ 19 ở Hoa Kỳ đã dùng nấm Beauveria bassiana để trừ một loại bọ
xít cánh trắng. Nấm Beauveria bassiana có trong đất ít hơn Metarhizium anisopliae
trong 100 mẫu đất chỉ có 22 mẫu nấm Beauveria bassiana.
Kumar và cs (1999) đã nghiên cứu sự nẩy mầm và xâm nhiễm của Beauveria
bassiana trên tằm Bombyx mori chủng NB18, nuôi ở 26± 1ºC, độ ẩm tƣơng đối 80 ±
5% và chiếu sáng 16 giờ. Tiến hành lây nhiễm ở giai đoạn tằm lột xác sang tuổi 5, liều
lây nhiễm 1 x 106 bào tử nấm/ml. Độc tính Beauveria bassiana chỉ 50 bào tử/ấu trùng,
đã đủ mạnh để gây chết 100% ấu trùng. Bào tử nẩy mầm khoảng 8 giờ sau khi lây
nhiễm, tạo thành một giác bám trong vòng 24 giờ và các sợi nấm xuyên vào lớp biểu
bì nhờ nấm có thể sản xuất enzym teolytic và lipolytic exocellula giúp cho việc giải
thể lớp da của ấu trùng. Các sợi nấm xâm nhập và trong vòng 48 giờ nấm tăng trƣởng
mạnh tạo thành một phức hợp sợi nấm, gây ra cái chết của ấu trùng trong khoảng 5 - 6
ngày. Sợi nấm phát triển tạo một tấm thảm màu trắng nấm trên toàn bộ cơ thể ấu trùng
trong 6- 7 ngày. Sau khi vật chủ chết các sợi nấm di chuyển ra ngoài để bắt đầu giai
đoạn bào tử. Do đó, nấm hoàn thành vòng đời của nó trên ấu trùng tằm trong 7 - 8
ngày. Nhiều lớp tinh thể khác nhau về hình dạng và kích thƣớc đã đƣợc quan sát trên
da và xung quanh viền lỗ thở của ấu trùng. Các tinh thể có thể là oxalat của amon và
magie đã đƣợc tạo ra khi nấm nhiễm vào.
Đối với nấm Nomuraea rileyi (Farlow), theo nghiên cứu của Kumarvà cs
(1997) các bào tử trƣởng thành sẽ nẩy mầm trên da ấu trùng tằm sau 24 giờ và xâm
nhập vào lớp biểu bì trong vòng 36 giờ sau khi lây nhiễm ở nhiệt độ 24 ± 1ºC và ẩm
độ 80 ± 5%. Các sợi nấm nhân lên bắt đầu sinh sôi và hình thành vách ngăn trong
khoang máu, ấu trùng không thể chống cự lại tác động sau 6- 7 ngày. Các sợi nấm
mọc dài ra và đan xen với nhau trong mô biểu bì 7- 8 ngày. Nhiều đính bào tử xuất
hiện tạo thành một lớp bột phấn trắng trên bề mặt ấu trùng 9- 10 ngày. Bào tử nấm
màu xanh nhạt phát triển, làm cho bề mặt ấu trùng có màu xanh nhạt. Vòng đời của
nấm trên tằm dâu Bombyx mori đƣợc hoàn thành trong 10- 11 ngày.
Kamp và Bidochka (2002) tiến hành đánh giá sự sản xuất bào tử của 3 loại nấm
ký sinh côn trùng Metarhizium anisopliae, Beauveria bassiana và Verticillium lecanii
đƣợc đánh giá ở các độ sâu khác nhau (2 mm, 3 mm, 4 mm tƣơng ứng với 10 ml, 15

ml, 20 ml) và các loại môi trƣờng khác nhau (SDA, MEA, NA, CMA, YPDA, PDA)
cho biết sự sản xuất bào tử sau 14 ngày của nấm Metarhizium anisopliae và Beauveria
8


bassiana là tốt nhất trên môi trƣờng PDA ở độ sâu 2 mm, trong khi Verticillium
lecanii sản xuất bào tử tốt nhất trên môi trƣờng YPDA và độ sâu của môi trƣờng thì
không đáng kể.
Santa và cs (2005), tiến hành nghiên cứu “sản xuất bào tử Beauveria bassiana
từ chế phẩm công nông nghiệp” trong nồi lên men với điều kiện nuôi cấy đƣợc tối ứu
hóa ở nhiệt độ nuôi cấy 26ºC, pH 6,0, mật độ 107 bào tử/gram và độ ẩm ban đầu 75%.
Trong điều kiện tối ƣu có sục khí, bào tử tạo ra lớn nhất (1,07 x 1010 bào tử/gram) sau
10 ngày nuôi cấy.
4.2. Các nghiên cứu trong nƣớc
Từ giữa thập niên 1970, Trƣờng Đại học Lâm Nghiệp Hà Hội bắt đầu nghiên
cứu nấmBeauveria bassianađể trừ sâu róm thông D. punctatus, nhƣng chƣa đƣa đƣợc
chế phẩm nào vào ứng dụng trong sản xuất.
Phạm Thị Thùy và cs (1991- 1995) cho rằngnguồn nấm Beauveria ở nƣớc ta
khá phong phú. Chế phẩm nấm Beauveria bassiana đƣợc sản xuất bằng phƣơng pháp
lên men xốp, sinh khối nấm đạt 5 x108 bào tử/gram, thời gian thu hoạch nấm tốt nhất
theo phƣơng pháp này là 10 ngày, chế phẩm đƣợc làm khô ở nhiệt độ 45ºC trong 8 giờ
và có thể đƣợc bảo quản trong 6 tháng. Khi thí nghiệm phƣơng pháp lên men chìm có
sục khí trong nồi lên men 5 lít chứa môi trƣờng có pepton, cao nấm men và muối
khoáng thì sau 48 giờ ở 30ºC bào tử nấm đạt 8,5 x109 bào tử/gram. Hiệu quả sử dụng
tốt nhất của chế phẩm là trên rầy nâu hại lúa, sâu đo xanh hại đậu, châu chấu sống
lƣng vàng với nồng độ sử dụng là 5- 6 x108 bào tử/ml. Hiệu lực của thuốc nấm phụ
thuộc chủ yếu vào nhiệt độ và ẩm độ.
Phạm Thị Thùy và cs (1996), tiến hành thí nghiệm trong nhà lƣới với hai chế
phẩm Beauveria và Metarhizium. Với nồng độ dƣới 200 triệu bào tử/ml cho hiệu quả
thấp đối với rầy non tuổi 3 của rầy nâu. Ở nồng độ 500 triệu bào tử/ml các nấm thí

nghiệm cho hiệu quả đối với rầy non tuổi 3 của rầy nâu đạt 72 – 75%. Nồng độ cao
hơn 600 – 650 triệu bào tử/ml, hiệu lực của hai loại nấm đều đạt từ 65- 80%. Trên cơ
sở kết quả thí nghiệm trong nhà lƣới, đã tiến hành ở viện BVTV, tỉnh Tiền Giang, Hà
Nam, Bà Rịa- Vũng Tàu. Diện tích thí nghiệm thay đổi từ 100 m2 đến 5000 m2. Kết
quả cho thấy sau 10 ngày phun chế phẩm, ở các thí nghiệm, hiệu lực đối với rầy nâu
của nấm Beauveria, Metarhizium đạt 47,5 – 69,9 và 20,6 – 79,5%. Hiệu lực này kéo
dài đến ngày thứ 15 sau phun nấm.
9


Nguyễn Thị Lộc (2000), sản xuất chế phẩm trừ sâu sinh học từ nấm trắng
Beauveria basiana ở dạng bột thấm nƣớc cho chất lƣợng tốt, số lƣợng bào tử cao (1,5
– 2,0 x1010 bào tử/gram). Nấm có hiệu lực ổn định với sâu hại sau 8 tháng bảo quản ở
nhiệt độ và ẩm độ thƣờng, có hiệu lực bền lâu và kéo dài 3- 4 tuần sau khi phun. Các
thí nghiệm trong nhiều vụ ở nhà lƣới và thực nghiệm trên diện rộng cho kết quả diệt
trừ rầy đạt từ 65- 87% sau khi phun từ 5 - 7 ngày, diệt trừ bọ xít hại cây trồng là 6987% sau khi phun 5- 7ngày.
Theo Viện sinh học nhiệt đới, Thành phố Hồ Chí Minh, các loài nấm có hiệu
lực diệt sâu cao có thể mất dần tính độc trong quá trình nuôi cấy. Sử dụng phƣơng
pháp tách tế bào đơn từ sâu nhiễm nấm đã chọn đƣợc các chủng nấm diệt sâu có độc
tính cao. Từ các mẫu sâu chết ngoài đồng ruộng đã phân lập đƣợc 9 chủng nấm
Beauveria bassiana từ sâu xanh da láng, châu chấu và bọ hại khoai lang tại Đà Lạt,
Hóc Môn và Indonesia. Thử nghiệm trong phòng thí nghiệm cho thấy 9 chủng đều có
hiệu lực diệt trùng ấu trùng tằm, ấu trùng bọ hà, bọ hà trƣởng thành và sâu xanh da
láng nhƣng ở các mức độ khác nhau. Thử nghiệm kết hợp nấm Beauveria bassianavới
pheromon trên ruộng khoai lang ở Thủ Đức làm giảm 10% số củ khoai lang bị hà
(Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn Cửu Thị Hƣơng Giang, 1997).

10



Chƣơng 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Đề tài đƣợc thực hiện từ tháng 6/2013 đến tháng 12/2013.
Viện Nghiên Cứu Công Nghệ Sinh Học và Môi Trƣờng, Trƣờng Đại Học Nông
Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh.
3.2. Vật liệu nguyên cứu
3.2.1. Chủng vi sinh vật
Sử dụng chủng nấm Beauveria bassiana tồn trữ tại phòng thí nghiệm vi
sinh – Viện Nghiên Cứu Công Nghệ Sinh Học và Môi Trƣờng.
Một số côn trùng sử dụng trong thí nghiệm
- Sâu tơ bƣớm trắng.
- Châu chấu.
3.2.2. Môi trƣờng nuôi cấy
- Gạo (tấm).
- Bột ngô (ngô xay nát).
- Nƣớc cất khử trùng.
- Muối khoáng: MgSO4.7H2O; K2HPO4.3H2O; NaNO3.
- Khoai Tây.
- Glucoza.
- Agar.
3.3. Dụng cụ và thiết bị
3.3.1. Dụng cụ
Nồi nấu môi trƣờng, bình tam giác (250ml và 500ml), pipet 10ml, micropipette
100ml, đĩa petri, giấy bạc, bông giòn, đèn cồn, que cấy thẳng, que cấy trang, buồng
đếm hồng cầu…
3.3.2. Thiết bị
Bếp điện, nồi hấp khử trùng (Autoclave), tủ cấy vô trùng, tủ sấy, tủ đông, tủ
mát, kính hiển vi, cân phân tích.

11



3.4. Phƣơng pháp nghiên cứu
3.4.1. Khảo sátvà chọn lọc môi trƣờng bán rắn để nhân sinh khối B. bassiana
Thí nghiệm đƣợc bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên đơn yếu tố với mỗi nghiệm thức 3 lần
lặp lại (LLL) với một lần LLL là một bịch môi trƣờng. Trong đó nghiệm thức 1: gạo
(tấm)+ nƣớc (10%); nghiệm thức 2: bột ngô+ nƣớc (10%); nghiệm thức 3: gạo (tấm) +
MgSO4.7H2O; K2HPO4.3H2O; NaNO3 (0,005g; 0,005g; 0,03g) + nƣớc (10%) và cuối
cùng nghiệm thức 4: bột ngô + MgSO4.7H2O; K2HPO4.3H2O; NaNO3 (0,005g;
0,005g; 0,03g) + nƣớc (10%)
Tiến hành thí nghiệm:
Các nghiệm thức đƣợc phân ra làm 2 loại gạo và bột ngô:mỗi lần lặp lại là một
bịch, cân 100g (gạo hay bột ngô) cho vào bịch, với hai nghiệm thức 3 và 4 bổ sung
thêm khoáng chất đúng theo tỷ lệ phù hợp đã phân ra từ trƣớc (từng loại chất khoáng
đƣợc pha với nƣớc cất, sau đó hút 10 ml cho vào mỗi bịch môi trƣờng), với nghiệm
thức 1 và 2 chỉ cho 10 ml nƣớc cất không bổ sung thêm chất khoáng.
Các nghiệm thức trên đƣợc nhân nuôi khảo sát trên 2 loại nút: nút bông và nút
bấm kim với mục đích khảo sát độ thoáng khí trong bịch sử dụng để nuôi cấy.
Sau khi đã chuẩn bị xong môi trƣờng các nghiệm thức khảo sát nhân nuôi theo
từng tỷ cácloại nút đã phân ra, tất cả các bịch môi trƣờng đƣợc hấp khử trùng bằng nồi
hấp khử trùng (Autoclave) ở 121ºC thời gian 20 phút ở 1atm, sau đó để nguội.
Sử dụng đĩa petri chứa nấm Beauveria bassiana đã đƣợc nuôi cấy trong
vòng10 ngày. Dùng nƣớc cất đã đƣợc hấp khử trùng với một lƣợng nhất định là 10 ml
cho vào đĩa petri, sau đó dùng que cấy trang cào nhẹ trên bề mặt lớp thạch agar có
nấm mọc, tiếp đó hút ra (lƣợng nƣớc hút ra sau khi lấy bào tử 8 ml tƣơng đƣơng với 3
x105 bt/ ml)cấy lên môi trƣờng nuôi cấy và đặt ở nhiệt độ 27ºC cho nấm phát triển.
Chỉ tiêu theo dõi:
Đếm mật độ số bào tử của nấm Beauveria bassiana.
Kiểm tra sự tạp nhiễm của môi trƣờng sau nuôi cấy.
Hàm lƣợng của độ ẩm trên môi trƣờng sau khi nuôi cấy.

3.4.2. Khảo sát các yếu tố ảnh hƣởng đến sự phát triển của B. bassiana trên
môi trƣờng nhân sinh khối tốt nhất
Sau khi kết thúc nội dung 1, chọn lọc ra đƣợc môi trƣờng nấm phát triển tốt
nhất làm vật liệu cho nội dung 2.
12


Thí nghiệm 1: Khảo sát sự ảnh hƣởng của tỷ lệ nƣớc và nhiệt độ đến sự phát triển của
nấm
 Khảo sát sự ảnh hƣởng của tỷ lệ nƣớc theo 3 công thức
+ Công thức 1: Gạo (tấm) + MgSO4.7H2O; K2HPO4.3H2O; NaNO3(0,005g; 0,005g;
0,03g) + nƣớc (10%)
+ Công thức 2: Gạo (tấm) + MgSO4.7H2O; K2HPO4.3H2O; NaNO3(0,005g; 0,005g;
0,003g) + nƣớc (20%)
+ Công thức3: Gạo (tấm) + MgSO4.7H2O; K2HPO4.3H2O; NaNO3 (0,005g; 0,005g;
0,03g) + nƣớc (30%)
Thí nghiệm đƣợc bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên đơn yếu tố với mỗi nghiệm thức
3 lần lặp lại (LLL) với một lần LLL là một bịch môi trƣờng.
Tiến hành thí nghiệm:
Các nghiệm thức đƣợc cân 100g (gạo) cho vào bịch, sau đó bổ sung thêm
khoáng chất theo tỷ lệ tƣơng ứng, mỗi nghiệm thức 10ml (các loại chất khoáng đƣợc
pha với nƣớc cất, sau đó hút tƣơng ứng 10ml cho vào mỗi bịch môi trƣờng).Ở các
công thức 2 và 3 sau khibổ sung 10 ml khoáng chất thêm 10 và 20 ml nƣớc cất cho
đúng theo tỷ lệ tƣơng ứng trên mỗi bịch môi trƣờng. Sau khi đã chuẩn bị xong môi
trƣờng các nghiệm thức khảo sát ẩm độ theo từng tỷ lệ, tất cả các bịch môi trƣờng
đƣợc hấp khử trùng bằng nồi hấp khử trùng (Autoclave) ở 121ºC thời gian 20 phút ở
1atm, sau đó để nguội.
Sử dụng đĩa petri chứa nấm Beauveria bassiana đã đƣợc nuôi cấy trong vòng
10 ngày. Dùng nƣớc cất đã đƣợc hấp khử trùng với một lƣợng nhất định là 10 ml cho
vào đĩa petri, sau đó dùng que cấy trang cào nhẹ trên bề mặt lớp thạch agar nấm mọc,

sau đó hút ra (lƣợng nƣớc hút ra sau khi lấy bào tử 8 ml tƣơng đƣơng với 3 x105 bt/ml)
cấy lên môi trƣờng nhân nuôi và đặt ở nhiệt độ 27ºC cho nấm phát triển.
Chỉ tiêu theo dõi:
Đếm mật số bào tử nấm để xác định công thức nào là tối ƣu nhất.
 Khảo sát sự ảnh hƣởng của nhiệt độ đến sự phát triển của nấm:dựa theo kết quả
thí nghiệm chọn lọc ẩm độ tốt nhất để làm tiền đề cho thí nghiệm khảo sát nhiệt độ
theo 3 công thức sau:
+ Công thức 1: Gạo (tấm) + MgSO4.7H2O; K2HPO4.3H2O; NaNO3 (0,005g; 0,005g;
0,003g) + nƣớc (20%) và đặt ở 25ºC
13


+ Công thức 2: Gạo (tấm) + MgSO4.7H2O; K2HPO4.3H2O; NaNO3 (0,005g; 0,005g;
0,003g) + nƣớc (20%) và đặt ở 27ºC
+ Công thức 3: Gạo (tấm) + MgSO4.7H2O; K2HPO4.3H2O; NaNO3 (0,005g; 0,005g;
0,003g) + nƣớc (20%) và đặt > 32ºC
Thí nghiệm đƣợc bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên đơn yếu tố với mỗi nghiệm thức
3 lần lặp lại (LLL) với một lần LLL là một bịch môi trƣờng.
Tiến hành thí nghiệm:
Các nghiệm thức đƣợc cân 100g (gạo) cho vào bịch, với các nghiệm thức bổ
sung thêm khoáng chất theo tỷ lệ quy định từ trƣớc 10 ml (các loại chất khoáng đƣợc
pha với nƣớc cất, sau đó hút tƣơng ứng 10 ml cho vào mỗi bịch môi trƣờng). Ở các
nghiệm thức của thí nghiệm này khi đƣợc bổ sung 10 ml khoáng chất sau đó đƣợc
thêm 10 ml nƣớc cất cho đúng theo tỷ lệ tƣơng ứng trên mỗi bịch môi trƣờng để đạt
đƣợc ẩm độ 20%.
Sử dụng đĩa petri chứa nấm Beauveria bassiana đã đƣợc nuôi cấy trong vòng
10 ngày. Dùng nƣớc cất đã đƣợc hấp khử trùng với một lƣợng nhất định là 10 ml cho
vào đĩa petri, sau đó dùng que cấy trang cào nhẹ trên bề mặt lớp thạch agar nấm mọc,
sau đó hút ra (lƣợng nƣớc hút ra sau khi lấy bào tử 8ml tƣơng đƣơng với 3 x10 5 bt/
ml) cấy lên môi trƣờng nuôi và đặt ở nhiệt độ 25, 27 và >32ºC cho nấm phát triển.

Chỉ tiêu theo dõi:
Đếm mật số bào tử nấm để xác định công thức nào là tối ƣu nhất.
Thí nghiệm 2: Khảo sát sự ảnh hƣởng của thời gian đến sự phát triển của nấm
Sau khi tiến hành các bƣớc khảo sát ở các thí nghiệm trƣớc và kết quả thu đƣợc
sử dụng để làm tiền đề tiến hành thí nghiệm 2. Khảo sát thời gian phát triển của nấm ở
các mốc 5, 7, 10, 14 ngày.
Tiến hành thí nghiệm:
Thí nghiệm đƣợc bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên đơn yếu tố với mỗi nghiệm thức
3 lần lặp lại (LLL) với một lần LLL là một bịch môi trƣờng.
Các nghiệm thức đƣợc cân 100g (gạo) cho vào bịch, với các nghiệm thức bổ
sung thêm khoáng chất theo tỷ lệ quy định từ trƣớc 10 ml (các loại chất khoáng đƣợc
pha với nƣớc cất, sau đó hút tƣơng ứng 10 ml cho vào mỗi bịch môi trƣờng). Ở các
nghiệm thức của thí nghiệm này sau khi đƣợc bổ sung 10 ml khoáng chất sau đó đƣợc

14