BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
NGHIÊN CỨU CẢI TIẾN QUY TRÌNHPHÁT HIỆN
VI-RÚT ĐỐM TRẮNG (WSSV) TRÊN TÔM
BẰNG KỸ THUẬT PCR

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Sinh viên thực hiện: PI NĂNG THỊ HỒNG
Niên khóa: 2009 – 2013

Tháng 12 năm 2013
 
 


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRUỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
NGHIÊN CỨU CẢI TIẾN QUI TRÌNH PHÁT HIỆN
VI-RÚT ĐỐM TRẮNG (WSSV) TRÊN TÔM
BẰNG KỸ THUẬT PCR

Hướng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

PGS.TS. LÊ ĐÌNH ĐÔN

PI NĂNG THỊ HỒNG

KS. HUỲNH ĐĂNG SANG

Tháng 12 năm 2013
 
 


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin chân thành cảm ơn:
Ban giám hiệu trường Đại học Nông lâm thành phố Hồ Chí Minh.
Ban chủ nhiệm Bộ môn Công nghệ Sinh học cùng toàn thểthầy cô đã truyền đạt
kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tại trường.
PGS.TS. Lê Đình Đôn đã giúp đỡ tôi trong quá trình làm thực tập tốt nghiệp.
KS. Huỳnh Đăng Sang đã tạo mọi điều kiện thuận lợi, tận tình giúp đỡ tôi trong
Quá trình thực tập tại Viện Công nghệ Sinh học và Môi Trường - Đại học Nông lâm
Thành phố Hồ Chí Minh.
Chị Lê TốTrâm và chị Thi (Sở Nông nghiệp và Phát triển nông thôn tỉnh Cà
Mau); Chú Huy (Chi Cục Thú Y Tỉnh Cà Mau); Anh Thiên và chị Bé (Cán bộ Thú y
huyện Đâm dơi) đã giúp đỡ trong thời gian tôi ở Cà Mau.
Các em HồThị Bích Trâm, Huỳnh Thanh Trúc lớp Công nghệ Sinh học khóa 36
đã giúp tôi trong suốt quá trình thực tập.
Bạn bè thân yêu của lớp Công nghệ Sinh học khóa 35 đã chia sẻ cùng tôi những
vui buồn cũng như hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ, động viên tôi trong suốt 4 năm qua.
Thành kính ghi nhớ công ơn cha mẹ cùng những người thân trong gia đình đã
luôn là chỗ dựa vững chắc cho con, động viên, khuyến khích, tạo mọi điều kiện cho
con học tập tốt.

Tp.Hồ Chí Minh, tháng 1 năm 2014
Sinh viên thực hiện

Pi Năng Thị Hồng

i


TÓM TẮT
Vi-rút gây bệnh đốm trắng (WSSV), là một trong những nhóm tác nhân gây tổn
thất nghiêm trọng cho người nuôi tôm. Tỷ lệ tôm chết khi nhiễm WSSV có thể lên đến
100% trong vòng 7 – 10 ngày sau khi nhiễm. Cho đến nay, công tác phòng bệnh vẫn là
biện pháp hiệu quả nhất để hạn chế thiệt hại do bệnh đốm trắng. Trong đó việc thả
nuôi tôm giống sạch bệnh là điều cần thiết. Do đó, cần có quy trình chẩn đoán sớm
WSSV trên tôm giống và tôm. Để phát triển công tác sản xuất tôm giống sạch bệnh
cũng như hỗ trợ cho công tác phòng ngừa dịch bệnh, việc chẩn đoán sớm và chính xác
sự hiện diện của WSSV trên tôm là điều cực kỳ quan trọng.
Quy trình nested PCR được sử dụng để sàng lọc mẫu tôm dương tính với WSSV.
Các mẫu tôm dương tính được sử dụng làm vật liệu cho cải tiến quy trình PCR nhằm
rút ngắn thời gian và giảm tạp nhiễm. Quy trình cải tiến PCR thực hiện bằng cách tối
ưu các nhiệt độ bắt cặp của mồi, thời gian bắt cặp của mồi, thể tích mẫu DNA. Kết quả
cho thấy ở nhiệt độ bắt cặp của mồi (Ta) = 620C, thời gian bắt cặp của mồi 10 giây, thể
tích mẫu DNA 0,5µllà tối ưu nhất. Sản phẩmgiải trình tự cho thấy quy trình cải tiến có
thể phát hiện chính xác WSSV. Từ kết quả của quy trình PCR cải tiến có thể sử dụng
để phát hiện WSSV tôm.

ii


SUMMARY

Thesis: “StudyImprovement PCR procedureto detect white spot syndrome virus
on shrimp by PCR”
White spot syndrome virus (WSSV) is an important viral pathogen responsible
for severely economic loss to shrimp farmers. Mortality rate when infected with
WSSV can be up to 100% within 7 - 10 days after infection. So far, disease prevention
is still the most effective measure to limit damages caused by white spot disease. In
which the breeding of disease-free shrimp seeds is essential. Therefore, there should be
a procedure for early diagnosing of WSSV on shrimp seed and mature shrimp. For
developing disease-free shrimp seed production as well as supporting the disease
prevention, early and accurate diagnosis of the presence of WSSV on shrimp is
extremely important.
Nested PCR procedure was used for sample screening positive for WSSV. The
positive samples are used materials for improvement PCR procedure to shorten the
time and reducecontamination.ImprovementsPCR procedure was implemented by
optimizing the annealing temperature, annealing to time, the volume DNA. The results
show that annealing temperature (Ta) = 620C, annealing time 10 seconds, the volume
of 0,5μl DNA was the most optimal.Production was sequence showedimprovements
PCR procedure can accurately detect WSSV. The result of process PCR improved
could be used for WSSV dection on shrimp .
Keywords: diagnosis, detection, nested PCR, white spot syndrome virus.

iii


MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN................................................................................................................ i
TÓM TẮT..................................................................................................................... ii
SUMMARY................................................................................................................. iii
MỤC LỤC ................................................................................................................... iv

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ..........................................................................v
DANH SÁCH CÁC BẢNG ........................................................................................ vi
DANH SÁCH CÁC HÌNH ......................................................................................... vii
Chương1 MỞ ĐẦU .......................................................................................................1
1.1 Đặt vấn đề .............................................................................................................1
1.2 Yêu cầu đề tài .......................................................................................................2
1.3 Nội dung đề tài......................................................................................................2
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU .............................................................................3
2.1 Tình hình dịch bệnh đốm trắng ở Việt Nam .........................................................3
2.2

Sơ lược bệnh đốm trắng .......................................................................................5

2.2.1 Giới thiệu ..............................................................................................................5
2.2.2 Tác nhân gây bệnh ................................................................................................5
2.2.2.1Đặc điểm hình thái ..............................................................................................5
2.2.2.2 Đặc điểm sinh học .............................................................................................5
2.2.3 Con đường lây truyền .........................................................................................6
2.2.4

Vật chủ mang mầm bệnh ...................................................................................6

2.2.5

Cơ quan xâm nhập .............................................................................................6

2.2.6

Triệu chứng và bệnh tích của bệnh ...................................................................6


2.2.7

Phương pháp chẩn đoán ....................................................................................7

2.2.8

Phòng bệnh ........................................................................................................7

2.3

Phương pháp Polymerase Chain Reaction (PCR) ...............................................8

2.4

Kỹ thuật nested PCR ............................................................................................8

2.5

Phương pháp điện di DNA tự động .....................................................................9

2.6

Giải trình tự DNA tự động ...................................................................................9

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ..............................................................11
iv


3.1 Địa điểm và thời gian thực hiện đề tài ................................................................11
3.2 Vật liệu và hóa chất ............................................................................................11

3.2.1

Vật liệu ............................................................................................................11

3.2.2

Hóa chất ...........................................................................................................11

3.2.3

Dụng cụ và thiết bị ..........................................................................................11

3.3

Phương pháp nghiên cứu ...................................................................................12

3.3.1 Phương pháp thu mẫu và bảo quản ..................................................................12
3.3.2

Phương pháp tách chiết DNA..........................................................................12

3.3.3

Phương pháp nested PCR xác định mẫu tôm nhiễm WSSV ...........................12

3.3.4

Phương pháp cải tiến quy trình PCR ...............................................................13

3.3.5


Giải trình tự sản phẩm PCR được khuếch đại .................................................14

Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................................15
4.1 Kết quả sàng lọc mẫu tôm dương tính với WSSV bằng nested PCR ...................15
4.2 Thực hiện cải tiến quy trình PCR .........................................................................15
4.3 Khẳng định sự chính xác của quy trình bằng phương pháp giải trình tự ..............19
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................................20
5.1 Kết luận ...............................................................................................................20
5.2

Đề nghị ...............................................................................................................20

TÀI LIỆU THAM KHẢO ...........................................................................................21
PHỤ LỤC ........................................................................................................................

v


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Bp

base pair

Ctv

Cộng tác viên

DNA


Deoxyribonucleic acid

dNTP

Deoxyribonucleotide triphosphate

ddNTP

Deoxyribonucleoside triphosphate

EDTA

Ethylene Diamine Tetra acetic Acid

OD

Opitical density

SDS

Sodium Dodecyl Sulfate

Taq

Thermus aquaticus

TBE

Tris Borate EDTA


TE

Tris – EDTA

UV

Ultraviolet radiation

V

Volt (đơn vị hiệu điện thế)

WSSV

White Spot Syndrome Virus

Rpm

revolutions per minute (số vòng quay trong một phút)

vi


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Trang
Bảng 3.1 Trình tự đoạn mồi sử dụng trong quy trình nested PCR .............................12
Bảng 3.2 Thành phần phản ứng trong quy trình nested PCR .....................................13
Bảng 3.3Chu trình nhiệt của quy trình nested PCR ....................................................13
 


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1 Triệu chứng bên ngoài tôm bị bệnh đốm trắng..............................................7
Hình 2.2 Nguyên tắc nested PCR .................................................................................9
Hình 4.1 Kết quả sàng lọc mẫu tôm dương tính với WSSV.......................................15
Hình 4.2 Kết quả nhiệt độ bắt tối ưu của mồi với DNA dương tính với WSSV ........16
Hình 4.3 Kết quả thời gian bắt cặp tối ưu mồi với DNA dương tính với WSSV .......17
Bảng 4.4 Kết quả thể tích mẫu DNA tối ưu với DNA dương tính với WSSV ...........18

vii


Chương 1 MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Nước ta có một lợi thế rất lớn về điều kiện tự nhiên, môi trường, vị trí địa lí thuận
lợi cho sự phát triển nuôi trồng thủy sản và có lợi thế cạnh tranh lớn trong khu vực và
thế giới với tổng diện tích có khả năng phát triển nuôi trồng thủy sản của toàn quốc là
2.057.250 ha, trong đó nước mặn, lợ khoảng 1.000.000 ha và nước ngọt 1.057.250
ha.Nuôi trồng thủy sản nước ta ngày càng được phát triển mạnh theo hướng sản xuất
hàng hóa và hướng tới xuất khẩu là mục tiêu để phát triển.Thủy sản việt nam đang
xuất khẩu ra 115 thị trường. Theo Tổ chức Nông lương Liên hợp quốc (FAO) cho
thấy, sản lượng nuôi trồng thuỷ sản (2006) của thế giới là 63 triệu tấn. Trong đó, Việt
Nam cung cấp gần 1,7 triệu tấn, vẫn giữ ở vị trí thứ 5, chỉ sau Trung Quốc, Ấn Độ,
Indonesia và Philippines. Sự phát triển nhanh của nghề nuôi tôm đã đem lại lợi ích
đáng kể về mặt kinh tế; với sản lượng năm 2011 là 482,2 nghìn tấn, chiếm 11,6% tổng
sản lượng thủy sản toàn quốc (Theo thông tin từ Tổng Cục Thống kê năm 2011). Tuy
nhiên, trong những năm gần đây nghề nuôi tôm hiện đang phải đương đầu với nhiều
loại bệnh xuất hiện trong quá trình nuôi, nhất là bệnh do vi-rút gây ra. Theo cơ quan
quốc tế về dịch bệnh động vật (1995), WSSV là vi-rút gây bệnh cực kì nghiêm trọng
cho nghề nuôi tôm, chúng có khả năng lây rất nhanh và nhiều con đương khác nhau,

có hệ ký chủ rộng (Bonilla và ctv, 2008), tỉ lệ tôm chết khi bị nhiễm bệnh có thể lên
đến 80 - 100% trong vòng 5 – 10 ngày nhiễm WSSV.Năm 2011, Bộ Nông Nghiệp và
Phát Triển Nông Thôn đã ban hành thông tư số 83/2011/TT - BNNPTNT về việc công
bố các dịch bệnh nguy hiểm trên tôm sú và tôm thẻ chân trắng; bao gồm hội chứng
Taura và bệnh hoại tử cơ ở tôm chân trắng; bệnh đốm trắng, bệnh đầu vàng, bệnh hoại
tử cơ quan tạo máu và cơ quan biểu mô gây hại trên cả tôm sú và tôm chân trắng. Năm
2012, cả nước có tới 106.000 ha tôm nuôi bị thiệt hại, tập trung chủ yếu ở ĐBSCL.
Sang năm 2013 (tính đến ngày 27/4/2013), diện tích nuôi tôm sú và tôm thẻ chân trắng
bị thiệt hại khoảng 14.550 ha, chiếm trên 2,8% tổng diện tích thả nuôi. Trong đó, diện
tích tôm sú bị thiệt hại là 13.884 ha (chiếm 2,7% diện tích thả nuôi), tôm chân trắng là
666 ha (chiếm 8,9% diện tích thả nuôi) (www.vielinh.com.vn)

1


Khi dịch bệnh bùng phát, người dân thường sử dụng thuốc Doxicyline, Oxy
Tetracycline để điều trị nhưng cách làm này không hữu hiệu vì bệnh có thể tái phát
mạnh sau 2 tuần đến 1 tháng. Hiện tại chưa có thuốc đặc hiệu để trị bệnh nên công tác
phòng ngừa tổng hợp bao gồm tẩy trùng ao nuôi, ngăn cản sự xâm nhập của các sinh
vật mang mầm bệnh vào ao nuôi và sử dụng tôm giống sạch bệnh được khuyến cáo
như một biện pháp an toàn sinh học (Bonilla và ctv, 2008). Do đó cần có phương pháp
phát hiện sớm sự hiện diện vi-rút gây bệnh trên đàn tôm giống trước khi thả nuôi trên
ao nuôi tôm công nghiệp nhằm hạn chế nguy cơ bùng phát dịch bệnh.WSSV có thể
phát hiện bằng nhiều kỹ thuật khác nhau như kỹ thuật mô bênh học (Takahashi và ctv.
1994; Wang và ctv. 1997), phương pháp miễn dịch (Nadala và ctv. 1997; Hameed và
ctv. 1998; Yoganandhan và ctv. 2004),kỹ thuật PCR(Takahashi và ctv. 1996; Kim và
ctv. 1998; Nunan và ctv. 1998; Tapay và ctv. 1999; Yoganandhan và ctv. 2003) và
phương pháp lai tại chỗ sử dụng DNA probe (Durand và. 1996; Chang và ctv. 1998).
Trong các phương pháp, kỹ thuật PCR được xác định là nhạy nhất để phát hiện WSSV
(Lightner and Redman 1998). Tuy nhiên các phương pháp trên tốn nhiều thời gian, khả

năng tạp nhiễm cao, đề tài: “Nghiên cứu cảitiến quy trình phát hiện vi-rútđốm trắng
(WSSV) trên tôm bằng kỹ thuật PCR”. Đã được thực hiện nhằm mục tiêu phát triển
qui trình PCR có thể ứng dụng trong điều kiện phòng thí nghiệm đơn giản. Đặc biệt
phương pháp cần đáp ứng được yêu cầu về độ chính xác cao, rút ngắn thời gian thực
hiện, giúp giải quyết kịp thời các đòi hỏi của vụ nuôi.
1.2 Yêu cầu đề tài
Cải tiến quy trình PCR cho phép phát hiện chính xác vi-rút đốm trắng và rút
ngắn thời gian thực hiện PCR.
1.3 Nội dung đề tài
Sàng lọc mẫu tôm dương tính với WSSV bằng kỹ thuật nested PCR.
Cải tiến và tối ưu quy trình phát hiện WSSV bằng kỹ thuật PCR.
Khẳng định sự chính xác của quy trình bằng phương pháp giải trình tự.

2


Chương 2TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Tình hình dịch bệnh đốm trắng ở Việt Nam
Trong nghề nuôi tôm thì bệnh dịch luôn là rủi ro và gây thiệt hại lớn cho người
nuôi. Trong đó, bệnh đốm trắng là một trong những bệnh hay gặp và có tỷ lệ chết cao,
thời gian chết nhanh, trong khi đó công tác phòng chống dịch lại gặp nhiều khó
khăn,nguy cơ dịch bệnh có thể lan ra diện rộng.Theo Chi cục Thủy sản Tiền Giang.
Năm 2010, bệnh đốm trắng trên tôm gây thiệt hại 66.972.000 con/275,82 ha (tôm sú:
45.617.000 con/232,77 ha; tôm thẻ chân trắng: 21.355.000 con/43,05 ha), chiếm tỷ lệ
8,3% lượng giống thả nuôi và 12,1% diện tích thả nuôi. Năm 2011, diện tích tôm nuôi
tại Tiền Giang bị thiệt hại là 951,04 ha, chiếm tỷ lệ 18,3% diện tích thả nuôi (cao gấp 3
lần so với cùng kỳ năm 2010). Trong 4 tháng đầu năm 2012, tình hình tôm chết tại khu
vực Đồng bằng sông Cửu Long diễn biến hết sức phức tạp. Diện tích nuôi tôm bị thiệt
hại tại Cà Mau đã lên đến 555 ha (cả tôm sú và tôm thẻ chân trắng), tại Bạc Liêu là
1.270 ha và tại Sóc Trăng là 1.400 ha (gồm 500 ha tôm thẻ chân trắng và hơn 900 ha

tôm sú nghịch vụ) (theo báo cáo tháng 4/2012 của Sở Nông Nghiệp và Phát Triển
Nông Thôn tỉnh Cà Mau, tỉnh Bạc Liêu và tỉnh Sóc Trăng).Theo đánh giá của các nhà
quản lý, nhà khoa học, nguyên nhân chủ yếu khiến dịch bệnh bùng phát trên tôm nuôi
nước lợ là do diễn biến thời tiết không thuận lợi, nắng nóng xen lẫn mưa lớn gây bất
lợi cho quá trình nuôi tôm. Ngoài ra, việc chăm sóc và quản lý ao nuôi không hợp lý,
chất lượng giống không đảm bảo, môi trường nuôi không đúng quy trình kỹ thuật dẫn
đến tôm chết hàng loạt. Không chỉ có vậy, một bộ phận người nuôi tôm còn tùy tiện
nuôi, thả giống tôm chưa qua kiểm dịch. Cá biệt, tại một số địa phương, ban ngành
chuyên môn đã kịp phát hiện nhưng báo cáo chậm và chưa tập trung cao trong chỉ đạo,
tổ chức thực hiện các biện pháp phòng chống dịch quyết liệt, kịp thời dẫn đến dịch
bệnh tiếp tục bùng phát và lây lan trên diện rộng. Để khống chế và giảm thiểu thiệt hại
do dịch bệnh gây ra trên tôm nuôi, một số địa phương đã chủ động, tích cực triển khai
các biện pháp phòng chống dịch bệnh (www.fistenet.gov.vn).
Trước tình hình dịch bệnh như trên,lãnh đạo Bộ NN&PTNT xác định việc tìm ra
nguyên nhân dịch bệnh và giải pháp phòng trị nhiệm vụ cấp bách về chỉ tiêu kế hoạch
sản xuất năm 2013, diện tích nuôi tôm của cả nước sẽ là 655.000ha và phấn đấu đạt
3


sản lượng 530.000 tấn, giảm 0,4% về diện tích nhưng tăng 11,24% về sản lượng so với
năm 2012. Để đạt được mục tiêu này, hội nghị đã đóng góp nhiều ý kiến về việc xem
xét và thay đổi quy trình kĩ thuật nuôi tôm, tăng cường quản lý chất lượng để giữ vững
thị trường xuất khẩu và những giải pháp về vốn. Kết thúc hội nghị, Bộ Trưởng Cao
Đức Phát yêu cầu Tổng cục thủy sản sớm đưa ra quy trình nuôi tôm nước lợ thâm canh
mới, đồng thời hoàn chỉnh 2 thông tư về quản lý giống và quản lý chế phẩm sinh học
dùng trong nuôi trồng thủy sản để kiểm soát chất lượng thủy sản. Bộ trưởng khẳng
định Bộ NN&PTNT sẽ tiếp tục huy động tối đa các nguồn lực để nghiên cứu phòng trừ
dịch bệnh tôm và xem đây là nhiệm vụ ưu tiên hàng đầu. Theo Ông Nguyễn Văn Khởi,
PGĐ Sở NN-PTNT Sóc Trăng cho biết, kết quả khảo sát mới nhất cho thấy, tỉnh này
đã có 1.510 ha được thả giống, trong đó khoảng 260 ha tôm bị thiệt hại. Nguyên nhân

thiệt hại chủ yếu do bệnh đốm trắng. Bên cạnh đó, nhiều diện tích tôm bị thiệt hại do
sốc môi trường vì ban ngày quá nóng, nhưng đêm lại lạnh. Tôm giống kém chất lượng
cũng là một nguyên nhân gây thiệt hại nhiều diện tích ở Sóc Trăng.
Chẳng hạn, Ở Trà Vinh, đến nay đã có 9.039 ha được thả giống tôm sú và tôm
thẻ chân trắng, với tổng số giống đã thả là 645 triệu con. Trong đó, đã có 399 hộ có
tôm bị thiệt hại do dịch bệnh, diện tích bệnh là 545 ha, tổng số tôm giống đã thả trên
diện tích bệnh này là 26 triệu con… Ở Cà Mau, đến cuối tuần trước, đã có khoảng
20% diện tích tôm bị bệnh trên tổng số diện tích đã thả giống là 2.500 ha. Trong tuần
này, các cơ quan chức năng của Cà Mau đang tiến hành khảo sát lại tình hình thả nuôi
và diễn biến dịch bệnh, nên chưa có con số cập nhật về diện tích thả nuôi và diện tích
nhiễm bệnh. Tuy nhiên, một số thông tin cho thấy trong tháng 1 và tháng 2, ở tỉnh này
có nhiều cơn mưa lớn trái vụ. Mà sau mỗi cơn mưa như thế, tỷ lệ tôm chết ở Cà Mau
tăng rất nhanh. Tôm chết chủ yếu bởi các bệnh đốm trắng, hoại tử gan.Còn ở Long An,
đến ngày 24/2, trong tổng số 1.018 ha đã thả giống, có 268,5 ha đã bị thiệt hại. Nguyên
nhân thiệt hại chủ yếu vẫn do tôm thả sớm trước lịch thời vụ, bị sốc môi trường vì mưa
nhiều, chênh lệch nhiệt độ khá cao giữa ngày và đêm, độ mặn không ổn định…Đại
diện Vụ Nuôi trồng Thủy sản - Tổng cục Thủy sản (Bộ NN&PTNT) cho biết, tính đến
hết tháng 8/2012, diện tích thiệt hại do tôm nhiễm bệnh trên cả nước là 68.909 ha, tăng
750 ha so với tháng 7 và bằng 89,1% so với cùng kỳ 2011, trong đó tôm sú bị thiệt hại
là 63.781 ha và diện tích tôm chân trắng bị thiệt hại là 5.128ha. UBND tỉnh Sóc Trăng
đã ký Quyết định công bố dịch bệnh đốm trắng trên địa bàn các huyện Trần Đề, Mỹ
4


Xuyên và thị xã Vĩnh Châu. Đây là địa bàn trọng điểm nuôi tôm nước lợ của tỉnh,
thông qua Quyết định này, các địa phương áp dụng các biện pháp ngăn chặn, khống
chế dịch bệnh lây lan trong vùng nuôi. Ông Đào Văn Bảy, Chi cục phó Chi cục Thú y
tỉnh Sóc Trăng cho biết: “Quyết Định công bố dịch của UBND tỉnh Sóc Trăng năm
nay diện tích thiệt hại do bệnh đốm trắng chiếm trên 40%. Thái Bình nuôi thả 265 triệu
con tôm giống trên diện tích khoảng gần 3.000 ha, giảm so với các năm trước do

chuyển một phần diện tích sang nuôi cá, ngao (www.fistenet.gov.vn).
2.2 Sơ lược bệnh đốm trắng
2.2.1 Giới thiệu
Bệnh đốm trắng xuất hiện đầu tiên tại Bắc Á từ năm 1992-1993, đồng thời
nhanh chống lan rộng khắp khu châu Á và thế giới nhất là nước có hình thức
nuôi tôm công nghiệp thâm canh. Dịch bệnh đốm trắng phát hiện lân cận đầu
tiên tại Đài loan -1992, Trung Quốc-1993, Nhật Bản- 1994, sau đó là các nước
Indonesia, Thái Lan, Malaysia, Ấn Độ,Bangladesh, Tesxas (hoa kỳ, 1995) gây
tổn thất nghiêm trọng về sản lượng nuôi.
2.2.2Tác nhân gây bệnh
2.2.2.1 Đặc tính hình thái
Vi-rút gây bệnh đốm trắng là vi-rút hình que có bao chứa ADN cấu trúc sợi
đôi (Wang và ctv., 1995 và Wongteerasupaya và ctv., 1995), có kích thước 70 –
150nm x 275 – 380 nm. Trước đây WSSV được xếp vào nhómBaculovirusngày
nay được xếp vào họ mới Nimaviridae. Giống mới đã được chấp nhận
Whispovirus (Van Hulten và ctv, 2001).
Virus có ít nhất 5 lớp protein, trọng lượng phân tử từ 15 – 28 kDa. Vỏ bao có 2
lớp protein VP28 và VP29, Nucleocapsid có ba lớp VP26,VP24,VP15 (Tạp chí thông
tin KHCN và kinh tế Thủy Sản, số 4 – 2004).
Khi nhiễm WSSV có thể làm chết 100% tôm chỉ trong vòng 3-10 ngày (Lightner, 1996)
2.2.2.2 Đặc tính sinh học
Vi-rút đốm trắng ký sinh ở các tổ chức ngoại bì, trung bì, mang, cơ quan
lymphoid và biểu bì dưới vỏ kitin. Vi-rút xâm nhập vào nhân tế bào gây hoại tử và
sưng to. Vi-rút sống và tồn tại trong nước có độ mặn từ 5 – 40%, độ mặn pH từ 4 – 10,
có khả năng chịu đựng được nhiệt từ 0 – 80oC (Trần Thị Việt Ngân, 2002).
5


2.2.3 Con đường lây truyền
Bệnh đốm trắng do WSSV lây lan rất nhanh qua 2 con đường chính: lây lan theo

chiều dọc (vertical transmission) từ bố mẹ nhiễm lây cho con. Lây lan theo chiều
ngang (horizontal transmission) là đường lan truyền chủ yếu, nhiễm vi-rút từ nguồn
nước nuôi, từ cua, còng mang vi-rút từ ao này sang ao kia, từ dụng cụ sản xuất mang
mầm bệnh, từ tôm chết, chim, cò vô tình đưa vào ao (Trần Thị Việt Ngân, 2002).
2.2.4 Vật chủ mang mầm bệnh
Một trong những nguyên nhân dẫn đến việc lây lan nhanh của WSSV là do phổ
loài cảm nhiễm rộng. WSSV đã được phát hiện cảm nhiễm nhiều loài vật chủ khác
nhau Penaeus monodon, P. japonicus, P. indicus, P. chinensis, P. merguensis, P.
aztecus, P. stylirostris, P. vannami, P. duorarum và P. setiferus (Lightner, 1996); tôm
càng xanh - Macrobrachium rosenbergii (Peng và ctv., 1998), cua - Calappa lophos,
Portunus sanguinolentus, Charybdis granulata và C. feriata (Lo và ctv., 1996).
2.2.5 Cơ quan xâm nhập
Vi-rút gây hội chứng đốm trắng khi xâm nhập vào tôm sẽ cư trú ở nhiều bộ phận
của tôm như mô nội bì, mô dạ dày, mang, buồng trứng, hệ thống thần kinh, mắt, chân
bơi và các bộ phận khác. Sau khi xâm nhập vào tế bào chủ, virus này tiến hành tự nhân
bản dựa trên cơ sở vật chất và năng lượng tế bào. Thông qua quá trình này, số lượng
thể vi-rút tăng rất nhanh, đồng thời làm thay đổi hoạt động bình thường của tế bào. Khi
quan sát dưới kính hiển vi, các tế bào bị nhiễm vi-rút thường có nhân phình to. Vi-rút
phát triểnđến giai đoạn phá vỡ nhân và giết chết tế bào, vi-rút lan truyền ra môi trường
nước, đi tìm ký chủ khác và tiếp tục xâm nhập (Trần Thị Việt Ngân, 2002).
2.2.6 Triệu chứng và bệnh tích của bệnh
Những dấu hiệu đặc trưng: có những đốm trắng ở dưới vỏ với đường kính từ 0.52nm, thường liên quan đến sự suất hiện của bệnh đỏ thân (Bùi quang Tề, 2003).
Những dấu hiệu khác: đầu tiên thấy tôm ở tầng mặt và dạt vào bờ, bỏ ăn, hoạt
động kém, các phần phụ bị tổn thương, nắp mang phồng lên và vỏ có nhiều sinh vật
bám.Khi có dấu hiệu sức khoẻ tôm yếu, đồng thời các đốm trắng xuất hiện, tỷ lệ tôm
phát bệnh trong vòng từ 3-10 ngày lên đến 100% và tôm chết hầu hết trong ao nuôi
(Bùi Quang Tề, 2003).

6



a

b

Hình 2.1Triệu chứng bên ngoài tôm bị bệnh đốm trắng. (a) tôm sú
bị đốm trắng bơi lờ đờ và chết, (b) dưới lớp vỏ kitin ở phần giáp đầu
ngực ở tôm bị đốm trắng(Lightner, 1996).
2.2.7 Phương pháp chẩn đoán
Kết hợp với dấu hiệu lâm sàng của bệnh đốm trắng đã được mô tả ở trên, để phát
hiện mầm bệnh WSSV có trên tôm bằng nhiều phương pháp khac nhau: phương pháp
mô học xác định bệnh dựa trên các thể vùi trong các tế bào biểu mô của các cơ quan có
nguồn gốc trung bì; phương pháp lai tại chỗ (In situ hybridization) dấu hiệu xác định
bệnh là kết quả lai giữa đoạn gen dùng làm mẫu dò và đoạn gen của tác nhân gây bệnh
trong điều kiện nghiêm ngặt; phương pháp PCR xác định bệnh dựa trên sản phẩm
khuếch đại của một đoạn gen đặc trưng của tác nhân gây bệnh; phương pháp Dot blot
và Southern blot được thực hiện với sản phẩm PCR; phương pháp miễn dịch huỳnh
quang dấu hiệu xác định bệnh là kết quả kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng
thể. Trong đó kỹ thuật PCR là kỹ thuật chẩn đoán nhanh, nhạy, có tính đặc hiệu cao
và được nhà nghiên cứu quan tâm. Tuy nhiên, các phương pháp trên tốn nhiều thời
gian nên đã đưa ra quy trình cải tiến PCR.
2.2.8 Phòng bệnh
Cho đến nay, công tác phòng bệnh vẫn là biện pháp hữu hiệu nhất để hạn chế
thiệt hại do bệnh đốm trắng. Phòng bệnh tức là sử dụng biện pháp phòng trừ tổng hợp
nhằm ngăn chặn mầm bệnh từ bên ngoài vào ao nuôi, duy trì các yếu tố môi trường
thích hợp cũng như chất lượng thức ăn tốt, khẩu phần ăn hợp lý để khống chế dịch
bệnh xảy ra trong khi nuôi. Sự phòng ngừa gồm có các biện pháp sau: chọn tôm bố mẹ
có chất lượng tốt, không nhiễm WSSV, không vận chuyển tôm giống mật độ cao.
7



Thức ăn tươi sống không hư thối và dùng nhiệt nấu chính, hàng tháng cho tôm ăn
Vitamin C từ 1-2 đợt với liều 2-3g/1 kg thức ăn cơ bản, mỗi tuần cho tôm ăn 1 tuần
liên tục. Nguồn nước cấp cho ao nuôi tôm phải lắng lọc và khử trùng, vớt tôm chết ra
khỏi ao, ngăn chặn không cho tôm và giáp xác khác và ao nuôi. Nước nuôi tôm bị
bệnh WSSV phải xử lý bằng cholorua vôi nồng nộ (30-50 g/m3), không được xả ra
ngoài. Khi phát hiện bệnh tốt nhất là thu hoạch ngay (Bùi Quang Tề, 2003).
2.3 Phương pháp Polymerase Chain Reaction (PCR)
PCR là phương pháp nhân nhanh một đoạn phân tử DNA mục tiêu trong ống
nghiệm. Phản ứng PCR được thực hiện trên cơ sở sinh tổng hợp DNA theo nhiều chu
kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm 3 trình tự như sau: biến tính, bắt cặp, kéo dài (Bùi
Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999). Các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả phản ứng
PCR: độ dài của mồi khoảng 17 – 30 nucleotide; tỷ lệ G - C lý tưởng trong đoạn mồi
vào khoảng 50% để nhiệt độ bắt cặp của đoạn mồi là không quá thấp; các đoạn mồi
không nên chứa hơn 3 nucleotide giống nhau xếp liên tiếp; tránh sử dụng các đoạn mồi
có thể nhân lên các đoạn gen phụ; hai đoạn mồi không được có trình tự nucleotide bổ
sung lẫn nhau; nhiệt độ lúc bắt đầu phản ứng PCR tức là lúc cho enzym tổng hợp DNA
vào, không nên thấp hơn nhiệt độ bắt cặp của đoạn mồi (Nguyễn Ngọc Hải, 2007).
2.4 Kỹ thuật nested PCR
Nested PCR là phương pháp phát hiện các sản phẩm PCR với tốc độ nhanh và độ
chính xác cao. Trong phương pháp này, cặp mồi được thiết kế nhằm khuếch đại
đoạn DNA đích nằm bên trong sản phẩm PCR lần thứ nhất. Sản phẩm PCR lần thứ
nhất làm khuôn DNA cho sản phẩm PCR lần thứ hai được khuếch đại qua cặp mồi
trong. Do đó sản phẩm PCR lần hai sẽ ngắn hơn sản phẩm PCR lần nhất. Nested PCR
có độ nhạy tăng gấp 104lần khi phát hiện chính xác sản phẩm PCR mong đợi
(McPherson và ctv, 2001).
Nguyên tắc : Trước tiên khuếch đại một đoạn DNA trên bộ gen của vi sinh vật
đích, sau đó khuếch đại một đoạn DNA bên trong sản phẩm khuếch đại đầu tiên này để
có sản phẩm khuếch đại cuối cùng phát hiện được nhỏ hơn sản phẩm khuếch đại ban
đầu (Phạm Hùng Vân, 2002).


8


DNA đích
Mồi Rout

Mồi Fout
PCR vòng ngoài

Sản phẩm PCR vòng ngoài

Sản phẩm PCR vòng ngoài
Mồi Fin

Mồi Rin
PCR vòng trong

Sản phẩm PCR vòng trong
Hình 2.2Nguyên tắc nested-PCR
(Phạm Hùng Vân, 2009).
2.5 Phương pháp điện di DNA trên gel
Điện di là kỹ thuật đểtách và định lượng acid nucleic với các kích thước và hàm lượng
khác nhau. Kỹthuật này dựa trên một đặc tính cấu trúccủa acid nucleic là các đại phân tử
tích điện âm đồng điều trên khắp bề mặt nên khi chịu tác động của một điện trường, chúng
sẽ di chuyển về phía cực dương của điện trường. Gel được sử dụng trong kỹ thuật điện di là
gel agarose (với các phân tử có kích thước lớn) hoặc polyacryamid (các phân tử có kích
thước nhỏ). Trong thí nghiệm này, sửdụng gel agarose với nồng độ 1% với kích thước các
đoạn cần phân tách (0,5 – 7,0 kb) (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1997).
2.6 Giải trình tự DNA tự động

Giải trình tựDNA tự động dựa theo nguyên lý của phương pháp dideoxy được cải
tiến dựa vào các thiết bị tự động hóa nhanh và chính xác hơn. Máy đọc trình tự trên cả
hai mạch đơn, do vậy có thể phát hiện và giảm các nhầm lẫn do kỹ thuật. Trong kỹ
9


thuật này không phải đánh dấu bằng chất đồng vị phóng xạ mà bằng chất huỳnh quang
(fluorescent). Mỗi loại dideoxy nucleotide được đánh dấu bằng một fluorescent có
màu khác nhau. Máy giải trình tự có thể phát hiện cùng lúc hiện tượng huỳnh quang ở
bốn độ dài sóng khác nhau (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999).
Các phương phápxác định trình tự nucleic acid đều dựa vào 2 nguyên tắc:
Nguyên tắc hóa học: dựa vào các phân tử hóa học thủy giải đặc hiệu phân tử
DNA, tạo thành một tập hợp nhiều phân đoạn có kính thước khác nhau.
Nguyên tắc enzyme: dựa vào sự tổng hợp mạch bổ sung cho trình tự cần xác định
nhờ DNA polymerase. Với việc sử dụng thêm các dideoxynucleotide cùng với các
deoxynucleotide thông thường, kết quả tổng cũng là sự hình thành một tập hợp nhiều
đoạn DNA có kích thước khác nhau.
Các đoạn DNA sẽ được phân tách qua điện di trên gel polyacrylamide có khả
năng phân tách hai trình tự DNA chỉ chênh nhau một nucleotide. Việc sử dụng một
đoạn nucleotide có đánh dấu đồng vị phóng xạ, kết quả trình tự cần xác định được đọc
trên bản phóng xạ tự ghi từ bản điện di (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1997).

10


Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài
Thời gian thực hiện đề tài từ tháng 12 năm2012 đến tháng 12 năm 2013. Tại
phòng thí nghiệm sinh học phân tử của Viện nghiên cứu công nghệ sinh học và môi
trường – Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh.

3.2. Vật liệu và hóa chất
3.2.1 Vật liệu
Mẫu tôm nghi ngờ nhiễm WSSV được hỗ trợ bởi Trung tâm dịch vụ kỹ thuật
huấn luyện nghiệp vụ quản lý chất lượng nông lâm, thủy sản Cà Mau được dùng làm
đối chứng dương.
3.2.2 Hóa chất
Hóa chất điện di: Agarose (abm, Mỹ), Ethiumbromide 10 mg/ml (Sigma, Mỹ),
loading dye, thang DNA 1000 bp (abm, Mỹ), dung dịch đệm TBE 10X.
Hóa chất ly trích DNA: NaOH, SDS, TE 10X, Ethanol 70 %.
Hóa chất PCR (abm, Mỹ) gồm Taq DNA polymerase, PCR buffer 10X, MgCl2
25mM , Nucleotides 25 mM (dNTPs), nước cất.
3.2.3 Dụng cụ và thiết bị
Thiết bị: tủ lạnh – 20oC và tủ mát 4oC, tủ hấp, tủ sấy dụng cụ, máy ly tâm, bếp
điện, cân điện tử, lò vi sóng (microwave), máy votex, máy PCR (Eppendorf), máy ảnh,
bộ điện di gồm nguồn và bồn điện di ngang, micropipette các loại: 0,5μl – 10μl; 2 μl –
20 μl; 10 μl – 100 μl và 100 μl - 1000 μl.
Dụng cụ: đầu típ 10 μl, 100 μl, 1000 μl, ống đong, đèn cồn, chày vô trùng, giấy
thấm, giấy bạc, kéo cắt mẫu, eppendorf 1,5 ml và 0,2 ml, giá đựng eppendorf, dụng cụ
gắp mẫu, khẩu trang, găng tay.

11


Bảng 3.1 Trình tự đoạn mồi sử dụng trong quy trình nested PCR
Đoạn mồi

Trình tự

Mồi 146F1


5’-ACT-ACT-AAC-TTC-AGC-CTA-TCTAG-3’

Mồi 146R1

5’-TAA-TGC-GGG-TGT-AAT-GTT-CTT-ACG-3’

Mồi 146F2

5’-GTA-ACT-GCC-CCT-TCC-ATC-TCC-A-3’

Mồi 146R2

5’-TAC-GGC-AGC-TGC-TGC-ACC-TTG-T-3’

Kích thước
sản phẩm
1447bp
941bp

3.3 Phương pháp nghiên cứu
3.3.1 Phương pháp thu mẫu và bảo quản mẫu
Mẫu tôm nghi ngờ nhiễm WSSV được dùng làm đối chứng dương và Tôm được
trữ trong cồn 96%.
3.3.2 Phương pháp tách chiết DNA
Trong nghiên cứu này, DNA tôm được tách chiếttheonghiên cứu của
Kiatpathomchai và ctv (2001). Quy trình đuợc tiến hành như sau:
Cho mẫu mang tôm vào eppendorf 1,5 ml và thêm 500 μl dung dịch đệm ly trích
thô DNA (0,025 N NaOH và 0,0125% SDS).
Dùng chày vô trùng nghiền cho mẫu đồng nhất.
Thêm 300 μl dung dịch ly trích thô DNA, tiếp tục nghiền.

Đun sôi eppendorf ở 100oC trong 10 phút (thấy dung dịch trong mẫu sôi lên).
Làm lạnh mẫu nhanh: chuyển eppendorf vào nước đá lạnh trong 5 phút.
Ly tâm ở12.000 rpm trong 5 phút. Hút dịch nổi vào eppendorf mới. Nên thực hiện
phản ứng PCR ngay sau khi tách chiết. Tuy nhiên có thể giữ mẫu ở - 20oC trong thời gian
ngắn (khoảng 1 - 2 ngày).
3.3.3 Phương pháp Nested PCR xác định mẫu tôm nhiễm WSSV
Quy trình nested PCRsử dụng trong nghiên cứu này nhằm mục đích sàng lọc mẫu
tôm dương tính với WSSV để thực hiện quy trình cải tiến PCR.

12


Bảng 3.2Thành phần phản ứng trong quy trình nested PCR
Nồng độ đầu

Nồng độ cuối

10X

2X

MgCl2

25mM

1,75mM

dNTP

25mM


0,2mM

Mồi 146F1

10µM

0,8 µM

Mồi 146R1

10µM

0,8 µM

Tag DNA polymerase

5U/µl

1,5U

Thành phần
Đệm

1 µl

DNA mẫu
Thêm vừa đủ 25 µl

Nước cất


Bảng 3.3 Chu trình nhiệt của quy trình nested PCR
Nhiệt độ (0C)

Thời gian (phút)

Tiến hành biến tính

94

4

Biến tính

94

1

Bắt cặp

55

1

Kéo dài

72

2


Kéo dài cuối cùng

72

5

Giữ sản phẩm

4

Giai đoạn

Số chu kỳ
1

40

1

3.3.4 Phương pháp cải tiến quy trình PCR
Từ chu trình nhiệt PCR có chu kỳ tiền biến tính tại 940C ở 3 phút, 40 chu kỳ cho
nhiệt độ biến tính tại 940C ở 20 giây,nhiệt độ bắt cặp của mồi (Ta) 620C ở 20 giây, nhiệt
độ kéo dài 720C ở 30 giây, nhiệt độ kéo dài cuối cùng 720C ở 3 phút sau đó tiến hành cải
tiến quy trình PCR theo những thông số như nhiệt độ bắt cặp của mồi, thời gian bắt cặp
của mồi, thể tích mẫu DNA. Để cải tiến nhiệt độ bắt cặp của mồi thì tiến hành thực
13


hiệnphản ứng PCR ở các nhiệt độ bắt cặp của mồi là 580C, 600C, 620C, 640C, 660C các
thông số như nhiệt độ biến tính, nhiệt độ kéo dài giữnguyên. Mẫu xuất hiện băng tại 5

nhiệt độ bắt cặp của mồi sẽ chọn là nhiệt độ tối ưu cho quy trình cải tiến. Để cải tiến thời
gian bắt cặp của mồi (ta) thì cũng tiến hành thực hiện phản ứng PCR với các thời gian bắt
cặp của mồi là 10 giây, 20 giây, 30 giây các thông số khác cũng được giữ nguyên như cải
tiến nhiệt độ bắt cặp của mồi. Mẫu xuất hiện băng ở những thời gian bắt cặp của mồi thích
hợp nhất được chọn là thời gian tối ưu cho quy trình cải tiến PCR. Để tiến hành cải tiến
thể tích mẫu DNA thì tiến hành thực hiện phản ứng PCR ở các thể tích mẫu DNA 5µl,
2µl, 0,5µl. Mẫu cho băng thích hợp nhất sẽ chọn là mẫu tối ưu cho quy trình cải tiến.
3.3.5 Giải trình tự sản phẩm PCR được khuếch đại
Sau khi thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi 146F2/146R2, 15µl sản phẩm
khuếch được giải trình tự 2 chiều với cặp mồi 146F2/146R2 tại công ty Nam Khoa
(793/58Trần Xuân Soạn, Quận7, TP. Hồ Chí Minh). Kết quả giải trình tự được xem và
xử lý bằng mềm BioEdit để có được trình tự chính xác.Trình tự DNA được so sánh với
các trình tự khác trên NCBI bằng chương trìnhBLAST(www.ncbi.nlm.nihigov) để
xác định mức độ tương đồng và khẳng định sản phẩm khuếch đại là trình
tự của WSSV.

14


Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Kết quả sàng lọc mẫu dương tính với WSSV bằng nested PCR
Nested PCR là phương pháp phát hiện sản phẩm PCR có độ chính xác cao, là
một trong những quy trình chuẩn để phát hiện WSSV bằng PCR (OIE,2009), nên có
thể sử dụng quy trình này để sàng lọc mẫu tôm dương tính với WSSV, sau đó các mẫu
dương tính với WSSV sẽ dùng làm vật liệu cho quy trình cải tiến PCR.
M

1

2


3

4

1000bp

941bp

Hình4.1Kết quả sàng lọc mẫu tôm dương tính
với WSSV bằng nested PCR. M thang DNA
100bp, giếng 1, 2, 3 là sản phẩm khuếchđại
với cặp mồi 146F2/146R2, giếng 4 đối chứng
âm. Điện di với gel agarose 1% dưới hiệu điện
thế 80V trong 30 phút.
4.2 Thực hiện cải tiến quy trình PCR
Quy trình cải tiến PCR, sử dụng cặp mồi thứ 2 (146F2/146R2) ở bước 2 trong quy
trình nested PCR của (Lo và ctv 1996). Quy trình cải tiến PCR giảm thiểu lây nhiễm chéo
do sản phẩm PCR chỉ sử dụng một lần duy nhất chạy PCR, rút ngắn thời gian thực hiện.
Trong nghiên cứu này, đã tiến hành cải tiến quy trình bằngcách khảo sát các thông số như
nhiệt độ bắt cặp của mồi, thời gian bắt cặp của mồi, thể tích mẫu DNA để tìm ra những
thông số tối ưu nhất cho quy trình cải tiến PCR. Để tối ưu nhiệt độ bắt cặp thì các mẫu
15


tômdương tính với WSSV (hình 4.1) tiến hành thực hiện phản ứng PCR ở nhiệt độ bắt cặp
của mồi là 580C, 600C,620C, 640C, 660C. Băng khuếch đại DNA chỉ xuất hiện ở nhiệt độ
bắt cặp của mồi 620C còn ở những nhiệt độ khác không xuất hiện băng, điều này có thể giải
thích là ở nhiệt độ 580C, 600C thấp hơn nhiệt độ tối ưu của mồi 620C nên băng khuếch đại
DNA mong muốn không xuất hiện hoặc xuất hiện băng khuếch đại DNA không mong

muốn còn ở nhiệt độ 640C,660C do quá cao nên cũng không xuất hiện băng DNA. So với
nested PCR (Lo và ctv,1996) ở nhiệt độ bắt cặp của mồi 550C cho ra băng, còn quy trình cải
tiến PCR cho băng ở nhiệt độ bắt cặp của mồi 620C. Vì vậy, chọn nhiệt độ bắt cặp tối ưu
của mồi trong quy trình cải tiến là 620C (hình 4.2).
580C

600C

620C

640C

660C

1000bp

941 bp

Hình 4.2 Kết quả nhiệt độ bắt cặp tối ưu của mồi
với mẫu DNA dương tính WSSV. Sản phẩm
khuếch đại với cặp mồi 146R2/146F2 của quy
trình cải tiếnvới nhiệt độ bắt cặp 580C,
600C,620C, 640C, 660C; M thang DNA 100bp.
Điện di với gel agarose 1% dưới hiệu điện thế
80V trong 30 phút.
Trong các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng PCR thì thời gian phản ứng cũng có vai
trò quan trọng đến phản ứng PCR (vì thời gian cho mỗi phản ứng phụ thuộc vào độ dài
của đoạn DNA đích). Nếu thời gian quá dài sản phẩm PCR sẽ không chuyên biệt vì đến
một thời gian nào đó nguyên liệu tổng hợp DNAsẽgiảm dần, xuất hiện các sản phẩm phụ
nên các đoạn mồi sẽ tự bắt cặp với nhau và với các sản phẩm phụ tạo ra băng nhưng

16