BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA MƯỜI CHỦNG
Agrobacterium rhizogenes

Ngành học:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện:

NGÔ MINH NHÂM

Niên khóa:

2010 – 2014

Tháng 1/2014


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH SINH HỌC CỦA MƯỜI CHỦNG
Agrobacterium rhizogenes

Hướng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

ThS. NGUYỄN NHƯ NHỨT

NGÔ MINH NHÂM

Tháng 1/2014


LỜI CẢM ƠN
Trong suốt thời gian thực hiện khóa luận tốt nghiệp, em đã nhận được sự giúp đỡ
nhiệt tình của gia đình, thầy cô và bạn bè. Đó là động lực lớn giúp em hoàn thành khóa
luận tốt nghiệp này.
Đầu tiên, em xin gửi lời cảm ơn đến Ban giám hiệu trường Đại học Nông Lâm TP.
Hồ Chí Minh, ban chủ nhiệm Bộ môn Công nghệ sinh học cùng tất cả quý thầy cô đã luôn
tận tình truyền đạt kiến thức cho em trong suốt quá trình học tại trường.
Em xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến ThS. Nguyễn Như Nhứt. Người đã tận tình
hướng dẫn, góp ý và không ngừng động viên em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận.
Xin cảm ơn quý Công ty TNHH Gia Tường đã tạo điều kiện tốt nhất cho em thực
hiện khóa luận tốt nghiệp.
Em cũng xin gửi lời cảm ơn đến các anh chị đang làm việc tại Công ty TNHH Gia
Tường chi nhánh Bình Dương đã nhiệt tình hướng dẫn giúp đỡ em trong suốt thời gian
qua.
Con thành kính ghi ơn ba mẹ đã tận tuỵ chăm sóc, dạy bảo con. Gia đình thân yêu
đã luôn tin tưởng, khích lệ và làm chỗ dựa vững chắc trong những lúc khó khăn nhất để
con vững bước trên con đường đã chọn.
Chân thành cảm ơn!

Ngày 07 tháng 01 năm 2014

Ngô Minh Nhâm

i


TÓM TẮT
Agrobacterium rhizogenes là một loài vi khuẩn phổ biến trong đất vùng rễ cây,
mang nhiều đặc tính sinh học quan trọng có tiềm năng ứng dụng cao trong nghiên cứu
cũng như trong đời sống. Chúng có khả năng tổng hợp curdlan, là một loại
exopolysaccharide có nhiều ứng dụng trong y dược và thực phẩm. Trong nông nghiệp,
Agrobacterium rhizogenes còn được ứng dụng trong kiểm soát nấm gây bệnh hại cây
trồng.
Nội dung nghiên cứu gồm: xác định khả năng chịu kháng sinh (các loại kháng
sinh: ampicillin, chloramphenicol, kanamycin, streptomycin), khả năng gây cảm ứng tạo
rễ tơ trên cây đậu xanh và đậu đen, khả năng đối kháng với nấm Rhizoctonia solani và
Fusarium oxysporum gây bệnh cây trồng, khả năng sinh tổng hợp polysaccharide ngoại
bào và xác định hàm lượng các thành phần trong tế bào (protein, lipid) nhằm sàng lọc
những chủng vi khuẩn mang đặc tích hữu ích.
Kết quả nghiên cứu trên cho thấy, hàm lượng protein trong sinh khối của mười
chủng A. rhizogenes khá cao, trong khoảng từ 40 – 80 %. Hàm lượng lipid trong mười
chủng này khoảng 1,2 – 6,2 %. Hàm lượng polysaccharide ngoại bào trong khoảng 1,4 –
9,9 (g/g). Hầu hết các chủng thử nghiệm đều có khả năng gây cảm ứng tạo rễ tơ trên đậu
đen và đậu xanh, ngoại trừ chủng 90 và 121. Kết quả xác định khả năng chịu kháng sinh
cho thấy các chủng A. rhizogenes có khả kháng kháng sinh khác nhau với kháng sinh
ampicillin, chloramphenicol, kanamycin và streptomycin. Tất cả các chủng thử nghiệm
đều có khả năng kiểm soát nấm bệnh Rhizoctonia solani và Fusarium oxysporum.

ii



SUMMARY
Thesis “Study on characteristics of ten Agrobacterium rhizogenes strains”
Agrobacterium rhizogenes is a popular bacteria in soil in association with root, it
has many important biological characteristics and other high potential applications in
research as well as in life. They have the ability to synthesize curdlan, is a type of
exopolysaccharide has many applications in medicine and food. In agriculture,
Agrobacterium rhizogenes also be applied in controlling fungal plant diseases.
The research content includes sections: identify antibiotic resistance (antibiotics:
ampicillin, chloramphenicol, kanamycin, streptomycin), the ability hairy root formation
on black beans and green beans, the ability of resistance fungal pathogen Rhizoctonia
solani and Fusarium oxysporum, the ability of extracellular polysaccharide biosynthesis,
to define components in cells (proteins, lipids) in order to screen strains have
characteristics useful statistics.
The study results showed that, the protein content in the biomass of the ten strains
of Agrobacterium rhizogenes high, about 40-80 %. Lipid content in ten strains about 1.2 6.2 %. Extracellular polysaccharide content about 1.4 – 9.9 (g/g). Most strains test were
have the ability hairy root formation on black beans and green beans, except strains 90
and 121. The results of determination of antibiotic resistant strains showed Agrobacterium
rhizogenes different antibiotic resistance. All strains test were have the ability controlling
fungal diseases.
Keywords:

Agrobacterium

rhizogenes,

rhizogenes.

iii


characteristics

of

Agrobacterium


MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN........................................................................................................................i 
TÓM TẮT.............................................................................................................................ii 
SUMMARY........................................................................................................................ iii 
MỤC LỤC ...........................................................................................................................iv 
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ................................................................................vi 
DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ HÌNH .............................................................................vii 
DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ HÌNH .............................................................................vii 
Chương 1 MỞ ĐẦU ............................................................................................................. 1 
1.1. Đặt vấn đề ...................................................................................................................... 1 
1.2. Yêu cầu của đề tài.......................................................................................................... 2 
1.3. Nội dung thực hiện ........................................................................................................ 2 
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................................... 3 
2.1. Giới thiệu chung về Agrobacterium .............................................................................. 3 
2.2. Đại cương về giống vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes ............................................. 4 
2.2.1. Đặc điểm hình thái...................................................................................................... 4 
2.2.2. Phân loại ..................................................................................................................... 5 
2.2.3. Đặc điểm sinh học của A. rhizogenes ......................................................................... 5 
2.2.3.1. Khả năng kháng kháng sinh của A. rhizogenes ....................................................... 6 
2.2.3.2. Khả năng sinh tổng hợp Curdlan của vi khuẩn A. rhizogenes ................................ 8 
2.2.3.3. Khả năng gây bệnh trên cây trồng và chuyển gen vào tế bào thực vật ................. 11 

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................... 13 
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ............................................................................... 13 
3.2. Vật liệu ........................................................................................................................ 13 
3.3. Phương pháp ................................................................................................................ 14 
3.3.1. Phương pháp nuôi cấy, bảo quản Agrobacterium zhizogenes .................................. 14 
3.3.2. Phương pháp xác định số lượng tế bào vi khuẩn...................................................... 14 
iv


3.3.4. Định lượng lipid bằng phương pháp Soxhlet ........................................................... 16 
3.3.5. Phương pháp tách chiết polysaccharide ngoại bào................................................... 17 
3.3.6. Phương pháp xác định khả năng cảm ứng tạo rễ tơ của A. rhizogenes .................... 18 
3.3.7. Phương pháp xác định khả năng chịu kháng sinh của A. rhizogenes ....................... 18 
3.3.8. Phương pháp xác định khả năng kiểm soát nấm gây bệnh cho cây trồng ................ 19 
3.3.8.1. Phương pháp cấy trung gian nấm bệnh ................................................................. 19 
3.3.8.2. Cấy đối kháng với cấy A. rhizogenes trước........................................................... 19 
3.3.9. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................................... 20 
3.3.10. Phương pháp xử lý số liệu ...................................................................................... 20 
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................................... 21 
4.1. Hàm lượng protein trong sinh khối ............................................................................. 21 
4.2. Hàm lượng lipid trong sinh khối ................................................................................. 22 
4.3. Hàm lượng polysaccharide ngoại bào ......................................................................... 22 
4.4. Khả năng gây cảm ứng tạo rễ tơ của vi khuẩn A. rhizogenes trên cây đậu ........................ 24 
4.5. Khả năng chịu kháng sinh của vi khuẩn A. rhizogenes ............................................... 25 
4.6. Khả năng kiểm soát nấm gây bệnh cho cây trồng của A. rhizogenes ......................... 27 
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................................... 31 
5.1. Kết luận........................................................................................................................ 31 
5.2. Đề nghị ........................................................................................................................ 31 
TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................................. 32 
PHỤ LỤC ........................................................................................................................... 34 


v


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Am:

ampicillin

Cl:

chloramphenicol

Chv:

chromosomal virulence

ĐC:

đối chứng

Kn:

kanamycin

PGA:

potato glucose agar

pRi:


root – inducing plasmid

Ri:

root - inducing

Sm:

streptomycin

T - DNA:

tranferred deoxyribomucleic acid

Ti:

tumer - inducing

Vir:

Virulence

YMB:

yeast manitol broth

vi



DANH SÁCH CÁC BẢNG VÀ HÌNH
Trang
Bảng 4.1 Kết quả hàm lượng lipid trong sinh khối của A. rhizogenes .............................. 22 
Bảng 4.2 Tần suất cảm ứng tạo rễ tơ trên cây đậu xanh và đậu đen .................................. 24 
Bảng 4.3 Kết quả khả năng chịu kháng sinh của vi khuẩn A. rhizogenes ......................... 26 
Bảng 4.4 Kết quả đối kháng giữa A. rhizogenes với nấm bệnh ......................................... 28 
Bảng 4.5 Bảng tổng hợp kết quả thí nghiệm...................................................................... 30 
Hình 2.1 Con đường sinh tổng hợp Curdlan ...................................................................... 10 
Hình 4.1 Hàm lượng protein trong sinh khối vi khuẩn A. rhizogenes. .............................. 21 
Hình 4.2 Hàm lượng exopolysaccharide của 10 chủng A. rhizogenes .............................. 23 
Hình 4.3 Chế phẩm polysaccharide thô ............................................................................. 24 
Hình 4.4 Khả năng gây cảm ứng tạo rễ tơ của chủng 38 ................................................... 25 
Hình 4.5 Khả năng kháng kháng sinh của chủng 37 và 90................................................ 27 
Hình 4.6 Hình minh hoạ cho khả năng kiểm soát nấm bệnh của A. rhizogenes ............... 29 

vii


Chương 1 MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Xung quanh chúng ta, ngoài các sinh vật lớn mà chúng ta có thể nhìn thấy được,
còn có vô vàn vi sinh vật nhỏ bé. Trong đó, vi khuẩn là một trong những vi sinh vật có vai
trò quan trọng trong việc chuyển hóa liên tục của vật chất trong tự nhiên. Với nhiều ứng
dụng khác nhau, vi khuẩn có mặt trong hầu hết các lĩnh vực của đời sống.
Đặc biệt với sản xuất nông nghiệp, vi sinh vật có vai trò rất lớn, tham gia vào việc
phân giải các hợp chất hữu cơ, chuyển hóa các chất khoáng, cố định nitơ phân tử để làm
giàu thêm dự trữ nitơ của đất. Trong quá trình sống, vi sinh vật còn sản sinh ra rất nhiều
chất có hoạt tính sinh học cao có nhiều ứng dụng rộng rãi trong đời sống.
Agrobacterium rhizogenes là một loài vi khuẩn phổ biến trong đất vùng rễ cây,
được các nhà khoa học quan tâm nhiều do chúng có khả năng chuyển gen cảm ứng tạo rễ

tơ. Việc nghiên cứu nuôi cấy rễ tơ sau khi chuyển gen bằng vi khuẩn này đang được ứng
dụng trong sản xuất các hợp chất thứ cấp trong nhiều loài thực vật.
Gần đây, người ta phát hiện rằng A. rhizogenes còn mang nhiều đặc tính sinh học
quan trọng khác có tiềm năng ứng dụng cao trong nghiên cứu cũng như trong đời sống.
Chúng có khả năng tổng hợp curdlan, là một loại exopolysaccharide có nhiều ứng dụng
trong y dược và thực phẩm. Loài vi khuẩn này còn có khả năng kéo dài tuổi thọ của hoa
cắt cành, tạo cây trồng có kiểu hình mới. Trong nông nghiệp, A. rhizogenes còn được ứng
dụng trong kiểm soát nấm gây bệnh hại cây trồng.
Với nhiều đặc tính ứng dụng hữu ích như trên, đề tài “Nghiên cứu đặc tính sinh
học của mười chủng Agrobacterium rhizogenes” được tiến hành.

1


1.2. Yêu cầu của đề tài
Khảo sát vài đặc tính sinh học (hàm lượng protein, lipid, khả năng sinh tổng hợp
polysaccharide ngoại bào, chịu kháng sinh, gây cảm ứng tạo rễ tơ và kiểm soát nấm bệnh)
của các chủng Agrobacterium rhizogenes nhằm sàng lọc được những chủng A. rhizogenes
mang một hoặc một vài đặc tính sinh học có ích để phục vụ cho các nghiên cứu ứng dụng
sau này.
1.3. Nội dung thực hiện
Khảo sát một số đặc điểm vi sinh - sinh hóa của mười chủng Agrobacterium
rhizogenes như: khả năng kháng kháng sinh (kháng sinh ampicillin, chloramphenicol,
kanamycin, streptomycin), xác định khả năng đối kháng với nấm Rhizoctonia solani và
Fusarium oxysporum gây bệnh trên cây trồng, khả năng gây cảm ứng tạo rễ tơ trên cây
đậu xanh và đậu đen, khả năng sinh tổng hợp polysaccharide ngoại bào, xác định hàm
lượng các thành phần trong tế bào (protein, lipid).

2



Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu chung về Agrobacterium
Agrobacterium là giống gồm những loài khó phân biệt với các loài trong giống
Rhizobium ngoại trừ khả năng gây bệnh cho cây trồng. Chúng được phân loại thuộc lớp
alpha-2 dựa trên đặc tính của ribosome (Murugesan và ctv, 2010).
Agrobacterium được chia thành loài chủ yếu dựa vào tính chất gây bệnh trên thực
vật. Các loài chủ yếu là A. radiobacter (không bây bệnh), A. tumefaciens (tác nhân gây
khối u), A. rhizogenes (tác nhân gây bệnh rễ tơ) và A. vitis (tác nhân gây khối u và bệnh
hoại tử trên nho). Ngoài ra còn có các loài ít được nghiên cứu như A. rubi, phân lập từ
khối u cây mía (Matthysse, 2006).
Agrobacteria cũng đã được chia thành các biotype (biovar) dựa trên các đặc tính
sinh lý. Biovar 1, trong đó bao gồm hầu hết các chủng A. tumefaciens, không có yêu cầu
yếu tố tăng trưởng và sẽ tăng trưởng trong sự hiện diện của NaCl 2 %. Hầu hết các chủng
này đều sản xuất 3 – ketolactose. Tất cả các biovar sản sinh acid từ mannitol và adonitol.
Vi khuẩn biovar 1 cũng sản sinh acid từ dulcitol, melizitose, ethanol và arabitol. Một số
chủng biovar 1 có thể phát triển ở 37 oC. Tuy nhiên, chúng có thể bị mất tumor – inducing
(Ti) plasmid khi phát triển ở nhiệt độ này. Biovar 2 bao gồm hầu hết các chủng A.
rhizogenes. Những vi khuẩn này đòi hỏi biotin cho sự tăng trưởng. Chúng không phát
triển ở môi trường có NaCl 0,5 % hoặc ở 37 oC. Một số chủng biovar 2 có thể phát triển
trên tartrate và sản xuất kiềm. Biovar 3 bao gồm hầu hết các chủng A. vitis. Giống như các
chủng biovar 1, vi khuẩn sẽ phát triển trong NaCl 2 % nhưng không phát triển ở 37 oC. Cả
hai biovar 2 và 3 không sản xuất 3 – ketolactose. Biovar 3 có thể sản sinh kiềm từ tartrate.
Một số chủng biovar 3 yêu cầu biotin cho sự tăng trưởng (Matthysse, 2006).
Agrobacteria thường được tìm thấy trong vùng đất có rễ, củ hoặc thân ngầm.
Chúng có thể được phân lập từ các khối u. Không có nhiều vi khuẩn trong khối u già,
phân lập từ phần đất vùng rễ cây dễ hơn phân lập từ các khối u. Trong một số trường hợp,
chúng có thể được phân lập từ xylem của cây bị nhiễm bệnh. Do đó thường có thể phân
lập A. vitis từ xylem của cây nho bị nhiễm bệnh (Matthysse, 2006).
3



Agrobacteria phát triển dễ dàng trong môi trường nuôi cấy phức tạp hoặc xác định.
Thạch dinh dưỡng (có hoặc không có cao nấm men) hoặc thạch nấm men mannitol sẽ hỗ
trợ sự tăng trưởng của hầu hết các chủng. Một số chủng cần vitamin B cho sự tăng
trưởng. Nhiều chủng, bao gồm hầu hết A. rhizogenes rất nhạy cảm với muối và sẽ không
phát triển trên môi trường như thạch Luria – Bertani vì chứa quá nhiều NaCl. Các khuẩn
lạc thường có màu trắng, hơi kem hoặc màu hồng nhạt. Polyasccharide ngoại bào có thể
được tạo ra với số lượng lớn trên một số môi trường cho các khuẩn lạc nhầy. Nhiệt độ tối
ưu cho hầu hết các chủng là từ 25 – 28 oC (Matthysse, 2006).
Agrobacteria là vi khuẩn gram âm, không sản sinh sắc tố huỳnh quang trên môi
trường King B và tạo các khối u (hoặc rễ tơ) khi gây nhiễm trên thực vật thử nghiệm. Các
loại thực vật thường được sử dụng để thử nghiệm là cà chua, hướng dương, thuốc lá…
Các thực vật này đáp ứng tương đối dễ dàng và nhanh chóng khi gây nhiễm các chủng
Agrobacterium bằng cách tạo các khối u trong vài ngày (khoảng là 10 ngày). Quá trình
lên men đường và sản xuất ketolactose cũng được sử dụng trong việc xác định
agrobacteria. Hàm lượng lipid và acid béo cũng đã được sử dụng để xác định cả
agrobacteria độc lực và không độc lực. PCR cũng được sử dụng trong việc xác định và
phân biệt các chủng gây bệnh (Matthysse, 2006).
2.2. Đại cương về giống vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes
2.2.1. Đặc điểm hình thái
Agrobacterium rhizogenes thuộc giống Agrobacterium, họ Rhizobiaceae là nhóm
vi khuẩn hiếu khí, hình que, Gram âm, chiều rộng khoảng 0,6 – 1,0µm và chiều dài
khoảng 1,5 – 3,0µm. Tế bào Agrobacterium đứng đơn lẻ hoặc kết đôi (Murugesan và ctv,
2010). Agrobacterium có vỏ nhầy, di động bằng roi (mỗi tế bào có 1 đến 6 roi xếp thành
vòng tròn, không xếp ở cực tế bào). Trên môi trường có cacrbohydrate, khuẩn lạc có dạng
nhầy điển hình, nhiều chất nhờn do chúng tiết ra polysaccharide ngoại bào có cấu trúc β1,3-glucan (Willey và ctv, 2008). Khuẩn lạc Agrobacterium rhizogenes có dạng lồi, trơn
nhẵn, hình tròn và không chứa sắc tố. Agrobacterium là vi khuẩn không tạo bào tử, kích
thước bộ gen 2,5Mb (Murugesan và ctv, 2010).


4


2.2.2. Phân loại
Vị trí phân loại của Agrobacterium rhizogenes (theo Riker và cộng sự, 1930 và
Conn, 1942):
Kingdom ( giới)

: Bacteria

Phylum (ngành)

: Proteobacteria

Class (lớp)

: Alpha Proteobacteria

Order (bộ)

: Rhizobiales

Family (họ)

: Rhizobiaceae

Genus (giống)

: Agrobacterium


Species (loài)

: A. rhizogenes

Tên khác

: Rhizobium rhizogenes

Những chủng Agrobacterium rhizogenes có thể được phân loại theo các phân
nhóm dựa vào dạng opine chúng tổng hợp. Hiện nay, Agrobacterium rhizogenes được
phân biệt gồm dạng agropine (đại diện là root – inducing (Ri) plasmid, pRiHRI, pRi15834
và pRiLBA9402), dạng manopine (đại diện Ri plasmid, pRi8196), dạng cucumopine (đại
diện Ri plasmid, pRi2659) và mikimopine (đại diện Ri plasmid, pRi1724). Mikimopine
và cucumopine là các stereo-isomer, nhưng không tìm thấy sự tương đồng giữa các gen
sinh tổng hợp opine tại mức độ nucleotide. Trong số các chủng Agrobacterium rhizogenes
được biết đến K47, K599 và HRI là các dạng độc tính cao có thể xâm nhiễm vào một
phạm vi rộng các loài thực vật khác nhau (Matthysse, 2006).
2.2.3. Đặc điểm sinh học của Agrobacterium rhizogenes
Từ lâu, Agrobacterium đã được công nhận là có liên quan chặt chẽ với Rhizobium.
Vi khuẩn trong chi Agrobacterium và Rhizobium có khả năng độc đáo như hình thành
nhiều rễ. Ngoài tầm quan trọng rõ ràng của chúng trong nông nghiệp, những vi khuẩn này
đã trở thành công cụ rất hữu hiệu trong nghiên cứu để hiểu rõ hơn về cơ bản của hình thái
thực vật, bệnh trên cây và mối liên hệ giữa vật chủ với kí sinh trùng (Murugesan và ctv,
2011).

5


Hiện nay, việc phân loại vi khuẩn không chỉ dựa trên sự tiến hóa mà còn dựa vào
các đặc điểm dễ dàng xác định như hình thái, sinh lý, sinh học, sinh thái và bản chất sinh

hóa của sinh vật. Phương pháp mới nhất và thuận tiện để xác định mối quan hệ trong tiến
hóa giữa các vi sinh vật dựa trên so sánh protein, plasmid và acid béo (Murugesan và ctv,
2010).
Các Agrobacterium phân lập dựa trên các đặc điểm nuôi cấy, sinh hóa và sinh lý
như thử nghiệm Congo đỏ, thử nghiệm Hofer’s alkaline broth. Phát triển trong môi trường
glucose peptone agar, phản ứng sữa quỳ, nhuộm màu poly β – hydroxybutyrate (PHB) và
thử nghiệm đặc trưng của Agrobacterium là phát triển trên khoai tây dextrose agar (PDA),
thử nghiệm 3 – ketolactose, thử nghiệm khả năng chịu sodium chloride… Ngoài ra, tất cả
các chủng vi khuẩn Agrobacterium phân lập đã được xác nhận bởi thử nghiệm khả năng
gây bệnh và hình thành rễ tơ. Hơn nữa, các nghiên cứu sinh hóa như đánh giá hàm lượng
exo-polysaccharide, glycogen, protein tổng số, biểu đồ nhạy cảm kháng sinh hoặc kháng
sinh đồ cũng có thể được sử dụng để phân biệt giữa các chủng Agrobacterium khác nhau
(Murugesan và ctv, 2010).
2.2.3.1. Khả năng kháng kháng sinh của Agrobacterium rhizogenes
Tính nhạy cảm kháng sinh của Agrobacterium spp. được thực hiện bằng phương
pháp khuếch tán trên đĩa. Dùng tăm bông vô trùng nhúng vào dịch chứa vi khuẩn đã nuôi
cấy sau 48 giờ. Ria theo chiều ngang và sau đó ria theo chiều dọc để đảm bảo sự phân bố
của vi khuẩn trên toàn bộ bề mặt thạch. Để khô trong 5 phút. Đĩa giấy tẩm các loại kháng
sinh khác nhau, với nồng độ khác nhau được đặt trên môi trường thạch đã cấy vi khuẩn.
Đặt các đĩa giấy tẩm kháng sinh cách đều nhau và nhấn nhẹ nhàng bằng kẹp vô trùng.
Làm tương tự với nhiều lần lặp lại cho tất cả các loại thuốc kháng sinh được thử nghiệm.
Sau đó ủ các đĩa thạch ở 37 oC trong 48 giờ. Kiểm tra kết quả bằng cách đo vòng vô
khuẩn (Murugensan và ctv, 2011).
Tất cả các chủng thử nghiệm cho thấy kháng với penicillin. Còn với các loại kháng
sinh khác thì các chủng khác nhau cho các kết quả khác nhau. Tất cả các chủng đều có
khả năng kháng với amikacin trừ A. rhizogenes phân lập từ rễ của S. rostrata. Tương tự
như vậy, tất cả các chủng kháng với cephalexin trong khi chủng phân lập từ V. ungiculata
6



là nhạy cảm với kháng sinh này. Trong số các loại kháng sinh được thử nghiệm,
norfloxacin là có hiệu quả nhất trong việc kiểm soát sự phát triển của A. rhizogenes sau
đó là ciprofloxacin, chloramphenical và nalidixic acid. Tetracyclin có hiệu quả trên các
chủng phân lập từ Pisum sativum, Vigna mungo và Vigna radiata và các chủng còn lại thì
cho thấy kháng với tetracycline. Agrobacterium phân lập từ Satosphaerria rostrata (thân
cây) và V. mungo cho thấy kháng với 5 loại kháng sinh và nhạy cảm với 3 loại kháng
sinh. Tương tự như vậy, các chủng phân lập từ P. sativum và V. radiata có khả năng
kháng với 4 loại kháng sinh. Chủng phân lập từ Vigna ungiculata nhạy cảm với 5 kháng
sinh là cephalaxin, chloramphenicol, ciprofloxacin, nalidixic acid và narfloxacin, các loại
thuốc kháng sinh còn lại không hiệu quả trên Agrobacterium của V. ungiculata.
Agrobacterium phân lập từ thân và rễ cây của S. rostrata cho kết quả tương tự nhau với
các loại thuốc kháng sinh khác nhau trừ kháng sinh ciprofloxacin thì có hiệu quả trên
chủng phân lập từ rễ hơn là chủng phân lập từ thân của cùng một loài. Tương tự như vậy
độ nhạy của amikacin ở mức trung gian với Agrobacterium phân lập từ rễ của S. rostrata,
trong khi với cùng loại kháng sinh đó lại không có hiệu quả đối với chủng phân lập từ
thân của S. rostrata. Nói chung, Agrobacterium của S. rostrata và V. mungo cho thấy khả
năng kháng nhiều loại kháng sinh được thử nghiệm (Murugensan và ctv, 2011).
Trong nghiên của Murugesan và cộng sự (2011), các chủng phân lập từ các cây họ
đậu khác nhau cho kết quả khác nhau trong mô hình tính nhạy cảm kháng sinh của chúng.
Trừ penicillin, tất cả các kháng sinh khác cho thấy kết quả khác nhau, ví dụ amikacin,
cephalaxin và tetracyclin không hiệu quả trong việc kiểm soát sự phát triển của chủng
Agrobacterium phân lập từ các cây họ đậu khác nhau trong khi đó, narfloxacin và
nalidixic acid có hiệu quả trong việc kiểm soát sự phát triển của agrobacteria. Tương tự
như vậy, các kháng sinh tetracycline có hiệu quả hơn trên agrobacterial P. sativum, V.
mungo và V. radiata so với S. rostrata và V. ungiculata. Ngay cả những agrobacteria
phân lập từ cùng một loài thực vật, S. rostrata cũng cho thấy kết quả kháng nhau của tính
nhạy cảm kháng sinh. Kết quả trên cũng dùng để xác định các chủng khác nhau của A.
rhizogenes phân lập từ nốt sần của các loài kí chủ khác nhau (Murugensan và ctv, 2011).

7



2.2.3.2. Khả năng sinh tổng hợp Curdlan của vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes
 Sơ lược về Curdlan
Polysaccharide của vi sinh vật có nhiều ứng dụng thực tế trong các ngành công
nghiệp khác nhau như thực phẩm, dược phẩm, y tế và mỹ phẩm. Curdlan, là một polymer
sinh học, thuộc nhóm đại phân tử (1,3) – β – glucan. Những polysaccharide này được
hình thành từ các đơn phân là D – glucose nối với nhau bằng các carbon ở vị trí số 1 và 3
trên vòng (Moscovici và ctv, 2006).
Curdlan được tiết ra sẽ tạo thành những hạt nhỏ như tinh bột xung quanh tế bào,
không tan trong nước nhưng tan trong dung dịch kiềm loãng vì bị ion hóa các liên kết
hydrogen, tạo thành gel khi được đun nóng trên 54 oC trong dung dịch NaCl. Tính chất
gel tạo thành phụ thuộc vào nồng độ NaCl và nhiệt độ đun nóng (Moscovici và ctv,
2006).
Curdlan lần đầu tiên được phát hiện trong Agrobacteirum biovar, sau đó được tìm
thấy trong các loài Agrobacteirum khác. Ngoài ra, nó cũng được tìm thấy trong vài chủng
Rhizobium và trong các loài vi khuẩn gram dương như Cellulomonas và C. flavigena.
Nhiều chủng thuộc loài A. rhizogenes hoang dại có khả năng tổng hợp một lượng lớn
polysaccharide ngoại bào dạng Curdlan (Laroche và ctv, 2007).
Curdlan không hòa tan trong nước, rượu và hầu hết các dung môi hữu cơ nhưng nó
có thể hòa tan trong kiềm, dễ dàng phân tán trong nước lạnh và có thể được nhũ hóa thông
qua sự pha trộn tốc độ cao để tạo thành một đồng nhất phân tán. Curdlan có thể được hòa
tan hoàn toàn trong Sodium hydroxide, Trisodium phosphate, Calcium phosphate và dung
dịch nước kiềm khác (pH > 12). Curdlan không thay đổi trong quá trình đông lạnh và rã
đông, vì vậy nó được ứng dụng trong lĩnh vực thực phẩm đông lạnh (Laroche và ctv,
2007).
Nhóm β – glucan của vi khuẩn A. rhizogenes tiết ra hay còn gọi là Curdlan được
ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực chủ yếu là trong thực phẩm.
Năm 1989, Curdlan được phê duyệt và thương mại hóa và được đưa vào sử dụng
trong thực phẩm tại Hàn Quốc, Đài Loan và Nhật Bản. Năm 1996, Curdlan chính thức

8


được bộ y tế của Mỹ chấp nhận được sử dụng trong thực phẩm dưới dạng là chất bổ trợ,
chất ổn định và làm đặc. Curdlan được dùng chủ yếu để tăng cường độ nhớt trong thực
phẩm, làm ổn định cấu trúc, tăng khả năng giữ nước của thực phẩm chín chẳng hạn như
mì ăn liền. Curdlan có thể được dùng làm chất ổn định trong thực phẩm, cải thiện hương
vị trong các sản phẩm từ thuỷ sản (Laroche và ctv, 2007).
Thực phẩm nấu chín, đồ ăn nhẹ chẳng hạn như hamburger, gà rán, bánh bao dùng
Curdlan có thể cải thiện chất lượng thực phẩm và hương vị. Curdlan có thể làm tăng độ
nhớt, chống bồi lắng, cải thiện chất lượng của nước sốt và có thể chống nhỏ giọt cải thiện
chất lượng của thực phẩm đóng hộp.
Ngoài ra, Curdlan có thể cải thiện khả năng giữ nước của thực phẩm trong quá
trình đông lạnh, ức chế sự hấp thụ dầu chiên thức ăn, hấp thụ ion, thay thế các chất béo để
đạt được thực phẩm có hàm lượng chất béo thấp. Hiện nay, Curdlan đang được nghiên
cứu ứng dụng trong việc sản xuất các thực phẩm mới những thực phẩm chức năng ít calo,
thực phẩm giành cho người ăn kiêng (Laroche và ctv, 2007).
 Sự sinh tổng hợp Curdlan ở A. rhizogenes
Theo Sutherland (1994), sự sinh tổng hợp curdlan xảy ra theo 3 bước:
 Hấp thu cơ chất
 Tổng hợp polysaccharide nội bào
 Tiết ra khỏi tế bào
Con đường biến dưỡng được trình bày trong hình 2.1. Trước tiên, một cơ chất đi
vào trong tế bào qua con đường hấp thu chủ động và sự chuyển vị nhóm có liên quan đến
sự phosphoryl hóa cơ chất. Sau đó, cơ chất sẽ đi vào các con đường biến dưỡng khác hoặc
con đường sinh tổng hợp polysaccharide. UPD – glucose là tiền chất chính. Chất này
được tạo thành bằng cách chuyển đổi từ chất glucose – 1 – phosphate nhờ enzyme UPD –
glucose phosphorylase. Sau đó, sự tổng hợp polymer xảy ra đồng thời với phản ứng
chuyển các monosaccharide từ UPD – glucose tới một lipid mang tạo thành lipid – P –
glucose. Sau khi kéo dài, polymer được tiết ra khỏi tế bào.


9


Hình 2.1 Con đường sinh tổng hợp Curdlan (Lee, I. Y., 2005)
Isoprenoid lipid đóng vai trò điều hòa sinh tổng hợp polysaccharide. Sự tổng hợp
curdlan xảy ra khi tế bào ngừng tăng trưởng do cạn kiệt nguồn nitrogen. Trong điều kiện
này, isoprenoid lipid là chất mang oligosaccharide hiệu quả hơn các liposaccharide và
peptidoglycan (Sutherland, 1994).
Kai và cộng sự (1993) đã nghiên cứu sự tổng hợp curdlan ở Agrobacterium sp.
ATCC 31749 bằng cách bổ sung glucose có chứa đồng vị phóng xạ C. Các kết quả phân
tích các sản phẩm đồng vị phóng xạ cho thấy quá trình tổng hợp curdlan có thể xảy ra
theo 5 con đường: 1) Sự polymer hóa trực tiếp từ glucose; 2) Sự tái sắp xếp; 3) Sự đồng
phân hóa các đường ba; 4) Từ Fructo – 6 – phosphate; 5) Từ các sản phẩm trung gian
trong quá trình glycosis từ cơ chất ban đầu fructose. Kết quả cho thấy đến 60% curdlan
được tổng hợp bằng sự polymer hóa trực tiếp từu glucose. Lượng curdlan được tổng hợp
qua con đường các chất trung gian của glycosis tương đối thấp. Quá trình glycosis ở
Agrobacterium chủ yếu xảy ra theo chu trình pentose và con đường Entner – Doudoroff, ít
xảy ra theo con đường Embden – Meyerhof.
10


2.2.3.3. Khả năng gây bệnh trên cây trồng và chuyển gen vào tế bào thực vật
A. rhizogenes là tác nhân gây bệnh rễ tơ. Vi khuẩn này gây ra sự phát triển khối u
của các tế bào thực vật tạo thành rễ tơ. Hình thái rễ tơ A. rhizogenes gây ra rất giống với
cấu trúc rễ hoang dại với một vài ngoại lệ đáng chú ý: rễ tơ dài hơn, nhiều hơn và hệ
thống rễ có nhiều nhánh (Veena và ctv, 2007).
A. rhizogenes có chứa một plasmid lớn (200 đến 800 kb) gọi là Ri – plasmid (root
inducing plasmid) chính là tác nhân gây bệnh cho cây, vi khuẩn không xâm nhập vào tế bào
thực vật mà chỉ Ri – plasmid được chuyển vào. Qua nghiên cứu người ta phát hiện bộ gen

của các tế bào rễ bất định có gắn một đoạn DNA từ vi khuẩn. Và các DNA được chuyển
vào tế bào thực vật này (gọi là T – DNA :tranferred DNA) là một phần của phân tử DNA
nhỏ nằm ngoài nhiễm sắc thể của vi khuẩn. Phân tử DNA vi khuẩn này được gọi là Ri –
plasmid. Thực vật bị thương sẽ tiết ra các hợp chất phenol (ví dụ như acetosyringone,
ferulate), kích thích sự biểu hiện của gen vir (virulence gene) nằm trên Ri – plasmid. Gen
vir mã hóa cho các protein thực hiện việc cắt, chuyển và gắn T – DNA vào bộ gen thực vật.
Gen nằm trên vùng T – DNA có khả năng điều khiển sự tổng hợp hormone sinh trưởng
auxin, dẫn đến sự phân bào nhanh chóng ở các tế bào ngay chỗ bị lây nhiễm, đây chính là
lý do hình thành rễ bất định. Sự hình thành rễ bất định sau đó có thể tiếp tục mà không cần
thiết phải có sự hiện diện của vi khuẩn. Vi khuẩn này thường được sử dụng trong nuôi cấy
mô để nuôi cấy rễ chuyển gen sản xuất các hợp chất thứ cấp (Veena và ctv, 2007).
Cấu trúc Ri – plasmid có 4 vùng tương đồng, vùng T – DNA và vùng vir, liên quan
trực tiếp đến sự hình thành rễ tơ, hai vùng còn lại chứa gen mã hóa cho việc tái bản
plasmid và chuyển nạp (Veena và ctv, 2007).
T – DNA được tách ra thành hai phần: TL và TR. Mỗi phần có kích thước khoảng
20 kb nằm kẹp giữa hai trật tự 25 bp lặp lại không hoàn chỉnh gọi là biên trái và biên phải.
Biên trái và biên phải là những yếu tố cần thiết để định hướng cho sự chuyển TL – DNA
và TR – DNA. Trên TR – DNA chứa các gen quan trọng là gen tổng hợp auxin, tổng hợp
opine, trên TL – DNA chứa ít nhất 18 khung đọc mở (ORF) trong đó có 4 khung đọc mở
quan trọng là ORF 10, 11, 12 và 15 tương ứng với 4 gen rolA, rolB, rolC và rolD. Các
gen rolA, rolB và rolC đóng vai trò quan trọng trong sự cảm ứng tạo rễ tơ, các nghiên
11


cứu đều tập trung vào các đặc điểm của những gen này, trong khi gen rolD được nghiên
cứu ít nhất (Veena và ctv, 2007).
Trong các vùng DNA của Ri – plasmid, ngoài T – DNA, được nghiên cứu nhiều
hơn cả là vùng DNA phụ trách khả năng lây nhiễm còn gọi là vùng vir. Vùng vir có kích
thước khoảng 30,2 kb chứa 23 gen tương ứng là virH1, virA, VirB – 11, virG, virC1 – C2,
virD1 – D5, virF, virE. Những gen vir này mã hóa cho các vai trò như: nhận ra tế bào

thực vật, tấn công vào tế bào thực vật và có vai trò quan trọng trong sự xâm nhập của T –
DNA. Hoạt động của gen này có liên quan chặt chẽ đến sự có mặt của các hợp chất
phenolic được tiết ra từ vết thương của cây (Satuti và ctv, 2000).
Để gắn T – DNA vào tế bào thực vật, đầu tiên vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes
phải tiếp xúc với thành tế bào thực vật bị tổn thương. Quá trình này được thực hiện nhờ
các gen chvA và chvB. Gen chvB mã hóa một protein liên quan đến hình thành β – 1,2
glucan mạch vòng, trong khi đó gen chvA xác định một protein vận chuyển, định vị ở
màng trong của tế bào vi khuẩn. Protein vận chuyển giúp vận chuyển β – 1,2 glucan vào
khoảng giữa thành tế bào và màng sinh chất. β – 1,2 glucan giữ vai trò quan trọng để vi
khuẩn tiếp xúc với thành tế bào thực vật. Nếu không có sự tiếp xúc này, sẽ không có sự
dẫn chuyền T – DNA. Thực tế, chỉ có T – DNA của plasmid được chuyển vào bộ gen của
tế bào thực vật, mà không còn phần nào khác (Satuti và ctv, 2000).
Trước hết gen virA trong tổ hợp gen vùng vir được phosphoryl hóa nhờ tác động
của các hợp chất phenol như acetosyringone giải phóng ra từ tế bào thực vật tổn thương.
Sản phẩm của quá trình này lại tiếp tục phosphoryl hóa gen virG. Sản phẩm của gen virG
liên tiếp làm hoạt hóa toàn bộ các gen vir còn lại, mà hai gen cuối cùng được hoạt hóa là
gen virB và virE (Satuti và ctv, 2000).
Trước đó, khi gen virD được hoạt hóa, sản phẩm của nó cảm ứng nhận biết biên
trái và biên phải của T – DNA và làm đứt phần T – DNA ra khỏi T – DNA của plasmid
thành các sợi đơn. Đồng thời, quá trình phosphoryl hóa này cũng làm thay đổi thẩm suất
màng tế bào thực vật, được ổn định và di truyền như các gen bình thường khác (Satuti và
ctv, 2000).

12


Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Đề tài được thực hiện từ tháng 7/2013 đến tháng 12/2013 tại phòng thí nghiệm Chi
nhánh Công ty TNHH Gia Tường tỉnh Bình Dương.

3.2. Vật liệu
- Mẫu thí nghiệm gồm 10 chủng Agrobacterium rhizogenes do phòng thí nghiệm
Chi nhánh Công ty TNHH Gia Tường tỉnh Bình Dương cung cấp, bao gồm các chủng 32,
36, 37, 38, 39, 47, 90, 91, 121, 131 được phân lập từ vùng rễ cây họ đậu tại Việt Nam.
- Các hóa chất, dụng cụ và thiết bị cho phòng vi sinh, sinh hóa.
- Các môi trường nuôi cấy chủ yếu:
 Môi trường YMB agar (Yeast Manitol Broth agar)
MgSO4

0,2g

KH2PO4

0,5g

Manitol

10,0g

NaCl

0,1g

Cao men

0,4g

Nước

1000ml


Agar

20,0g

 Môi trường YMB (Yeast Manitol Broth)
MgSO4

0,2g

KH2PO4

0,5g

Manitol

10,0g

NaCl

0,1g

Cao men

0,4g

Nước

1000ml


13


3.3. Phương pháp
3.3.1. Phương pháp nuôi cấy, bảo quản Agrobacterium zhizogenes
Nuôi cấy và bảo quản Agrobacterium rhizogenes theo phương pháp của Asma
(1995). Dùng que cấy cấy chuyền vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes trên môi trường
YMB agar. Giữ ở nhiệt độ mát khoảng 25 oC, sau 48 giờ đem đi giữ lạnh để nghiên cứu.
Giống được cấy chuyền hàng tháng vào môi trường YMB agar để giữ giống.
3.3.2. Phương pháp xác định số lượng tế bào vi khuẩn bằng phương pháp đếm
khuẩn lạc
Phương pháp đếm khuẩn lạc cho phép xác định số lượng tế bào vi sinh vật sống
hiện diện trong mẫu. Mỗi tế bào sống là một tế bào có khả năng phân chia tạo thành
khuẩn lạc trên môi trường chọn lọc.
Dùng nước muối sinh lý NaCl 0,85 % pha loãng mẫu tuần tự thành các nồng độ
thập phân (10-1, 10-2, 10-3,…). Dùng micropipet và đầu típ vô trùng để chuyển dịch chứa
vi khuẩn đã pha loãng vào bề mặt đĩa petri để dịch giống được trộn đều trong môi trường
nuôi cấy.
Để nguội nuôi ủ ở nhiệt độ 25 oC trong 48 giờ tiến hành qua sát và đếm khuẩn lạc:
Cách tính:
N(CFU/ml) =

⋯

Trong đó:
N: số tế bào (đơn vị hình thành khuẩn lạc, CFU) vi khuẩn tỏng 1ml mẫu
A: tổng số khuẩn lạc đã đếm được trên các đĩa đã được chọn
ni: số lượng đĩa cấy tại độ pha loãng thứ i
V: thể tích dịch mẫu cấy vào trong mỗi đĩa (ml)
fi: độ pha loãng tương ứng.


14


3.3.3. Xác định hàm lượng nitơ tổng số bằng phương pháp Kjeldahl
 Nguyên lý
Vô cơ hóa mẫu bằng H2SO4 đậm đặc và chất xúc tác, sau đó dùng kiềm mạnh
(NaOH hay KOH) để đẩy NH3 từ muối (NH4)2SO4 hình thành ra thể tự do. Định lượng
NH3 bằng H2SO4 0,1N.
 Tiến hành
- Vô cơ hóa mẫu: Cho 1g mẫu, 5g chất xúc tác (K2SO4 và CuSO4) và 10ml H2SO4
đậm đặc vào bình Kjeldahl và đun trên bếp từ từ cho đến khi thu được dung dịch trong
suốt không màu hoặc có màu xanh lơ của CuSO4 để nguội. Sau đó pha loãng với nước cất
thành 100ml
- Cất đạm: Đun sôi bình nước của máy cất đạm. Đặt bình tam giác có chứa 20ml
H2SO4 N/100 và vài giọt methyl đỏ vào phần đuôi của máy sao cho phần nhọn nhúng
chìm vào dung dịch. Hút 10ml dung dịch vô cơ hóa đã pha loãng thành 100ml, cho vào
phễu của máy cất đạm và mở khóa cho chảy từ từ đến khi hết, tráng phễu 3 lần với nước
cất. Cho 10ml NaOH đậm đặc và cũng cho chảy xuống từ từ (nếu cho chảy xuống quá
nhanh thì dung dịch sẽ bị máy hút ra ngoài). Để máy lôi cuốn trong 3 phút rồi hạ bình tam
giác xuống và để thêm 2 phút nữa, tráng vòi của máy bằng một tia nước cất. Lấy bình tam
giác ra và định phân với dung dịch NaOH có chuẩn độ là x N/100 cho đến khi dung dịch
đổi màu (từ hồng nhạt sang màu da cam). Thực hiện 3 sự thử thật và 2 sự thử không để
lấy trị số trung bình. Phải xác định hệ số hiệu chỉnh x của dung dịch NaOH N/100 bằng
dung dịch (COOH)2 N/100.
Công thức tính hàm lượng nitơ:
N (%) =

. ,


. . ,

.

.

.

Trong đó:
a: thể tích dung dịch NaOH x.N/100 (trị số trung bình của ba lần thử không) (ml)
b: thể tích dung dịch NaOH x.N/100 (trị số trung bình của ba lần thử thật) (ml)
0,01: nồng độ NaOH
0,01401: mili đương lượng gram của nitơ tính bằng gram
15


V1: thể tích dung dịch mẫu sau khi pha loãng (ml)
V2: thể tích dung dịch mẫu đã pha loãng lấy đi xác định đạm (ml)
m: khối lượng mẫu khô tuyệt đối (g)
x: hệ số hiệu chỉnh
3.3.4. Định lượng lipid bằng phương pháp Soxhlet
 Nguyên lý
Dùng dung môi nóng để hòa tan tất cả chất béo tự do có trong mẫu. Sau khi đuổi
hết dung môi, cân chất béo còn lại và tính ra hàm lượng lipid có trong 100g mẫu.
 Tiến hành:
Bước 1: Chuẩn bị mẫu để chiết rút lipid
Cân chính xác 1-5g mẫu đã nghiền nhỏ và đồng nhất, trộn với 40g cát sạch hay
Na2SO4 khan . Chuyển mẫu sang bao giấy đã chuẩn bị sẵn, gấp miệng bao lại. Sấy bao
đựng mẫu cho đến khi trọng lượng không thay đổi. Sau đó lấy ra để nguội trong bình hút
ẩm, cân lại bao có chứa mẫu (P)

Bước 2: Chuẩn bị mẫu trên máy Soxhlet
Cho mẫu vào ống hình trụ đựng mẫu một cách cẩn trọng để tránh rơi rớt. Đặt bình
cầu đựng dung môi lên bếp đun. Lắp ống đựng mẫu với bình cầu đựng dung môi, lắp ống
sinh hàn với ống đựng mẫu. Lắp các ống dẫn dung môi theo nguyên tắc bình thông nhau.
Mở nước để nước chảy vào hệ thống sinh hàn. Sau cùng đổ dung môi chiết lipid qua phễu
thuỷ tính sao cho lượng dung môi đủ ngập mẫu và chiếm khoảng 2/3 dung tích bình đựng
dung môi.
Bước 3: Chiết rút lipid trên máy Soxhlet
Đặt máy lên bếp cách thuỷ, chỉnh nhiệt độ ở 40 – 45 oC. Đun cách thuỷ để trích
lipid trong 10-12 giờ với điều kiện khoảng 10 phút thì dung môi chảy đầy ống hình trụ và
tự động chảy xuống bình cầu. Nếu trong quá trình ly trích cần nghỉ thì phải để ete đầy ống
hình trụ.
Chiết cho đến khi hoàn toàn hết lipid. Có thể nhận biết lipid đã chiết hết chưa bằng
cách lấy vài giọt ete ở ông đựng mẫu nhỏ lên mặt kính đồng hồ hay mảnh giấy lọc, nếu

16