BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

HOÀN THIỆN QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG CÂY GỪNG
(Zingiber officinale Rose.) BẰNG PHƯƠNG PHÁP
NUÔI CẤY PHÔI SOMA

Ngành học

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện

: LÊ NGUYỄN TẤN LỰC

Niên khóa

: 2009 – 2013

Tháng 6/2013


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

HOÀN THIỆN QUY TRÌNH NHÂN GIỐNG CÂY GỪNG
(Zingiber officinale Rose.) BẰNG PHƯƠNG PHÁP
NUÔI CẤY PHÔI SOMA

Hướng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

ThS. TÔN BẢO LINH

LÊ NGUYỄN TẤN LỰC

KS. TÔ THỊ NHÃ TRẦM

Tháng 6/2013


LỜI CẢM ƠN
Xin chân thành cảm ơn!
Ban Giám hiệu Trường Đại học Nông lâm Tp. Hồ Chí Minh đã tạo điều kiện cho
tôi thực hiện đề tài này.
Bộ môn Công Nghệ Sinh Học đã tạo điều kiện về cơ sở vật chất và trang thiết bị
trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Cô Tô Thị Nhã Trầm và cô Tôn Bảo Linh đã trực tiếp hướng dẫn, giúp đỡ và
động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài nghiên cứu.
Tập thể lớp DH09SH, cùng các bạn làm đề tài ở Bộ môn Công Nghệ Sinh Học đã
hết lòng hỗ trợ tôi trong thời gian thực hiện đề tài.
Con xin tỏ lòng biết ơn đến cha mẹ và những người thân trong gia đình đã luôn
ủng hộ và động viên con trong suốt quá trình học tập tại trường.
Thành phố Hồ Chí Minh, tháng 6 năm 2013.

Lê Nguyễn Tấn Lực

i


TÓM TẮT
Gừng (Zingiber officinale Rosc.) là một trong những cây gia vị phương đông được
biết sớm nhất, có giá trị thương mại quan trọng trong việc sử dụng làm dược liệu và thực
phẩm. Những năm gần đây, việc trồng gừng đã đem lại lợi nhuận cao cho người nông dân.
Phương pháp nhân giống truyền thống gừng bằng củ cần một lượng giống khá lớn và có
thể lây lan bệnh do nấm khuẩn đặc biệt là bệnh thối củ. Vì vậy đề tài “Hoàn thiện quy
trình nhân giống cây gừng (Zingiber officinale Rosc.) bằng phương pháp nuôi cấy phôi
soma” để tạo nguồn giống ban đầu đồng nhất, sạch bệnh và đáp ứng cho nhu cầu giống
hiện nay.
Đề tài gồm 5 thí nghiệm nhằm mục đích khảo sát nồng độ và thời gian các chất khừ
trùng ảnh hưởng đến quá trình vô mẫu. Ảnh hưởng của các chất điều hòa sinh trưởng đến sự
tạo sẹo, tái sinh phôi soma, tái sinh chồi và tạo rễ của cây gừng in vitro. Ngoài ra, đề tài còn
thí nghiệm ảnh hưởng của giá thể đến thuần hóa cây gừng in vitro ngoài vườn ươm.
Khi khử trùng mẫu cây gừng bằng Ca(OCl)2 10% trong thời gian 15 phút kết
hợp với HgCl2 0,1% trong thời gian 3 phút có hiệu quả khử trùng cao nhất. Tạo sẹo từ
bẹ lá của cây gừng nồi in vitro trên môi trường MS bổ sung 2,4-D (1,0 mg/l) và BA (2,0
mg/l) cho kết quả cao nhất. Việc tạo phôi soma đạt kết quả tốt nhất khi nuôi cấy trên môi
trường MS bổ sung BA (2,0 ml/l). Bên cạnh đó, môi trường MS có bổ sung BA (2,0
ml/l) + NAA (1,0 ml/l) cho tỉ lệ tạo chồi và số rễ cao nhât. Khi trồng trên giá thể 70%
mụn dừa + 30% tro trấu cho tỉ lệ sống của cây con ngoài vườn ươm cao nhất 91%.

ii


SUMMARY

Ginger (Zingiber officinale Rosc.) is one of the earliest well known oriental spice crops
having significant commercial value for its use in various medicinal and culinary preparations.
In the recent years, the benefit of ginger cultivation was great. Traditional breeding methods by
ginger roots need a large amount of seed and can be infected by bacterial and fungi diseases,
especially root rot disease. Thesis “Complete ginger (Zingiber officinale Rosc.) breeding
process by somatic embryo culture method” was conducted to create enough homogeneous and
heathy initial seeds for human demands.
This study had 5 experiments to examine the effection of concentration and duration of
sterilization to sample process, effection of growth regulators to scarring, embryos, shoots and
roots regeneration of invitro ginger. In additional, influence of potting medium to ginger
domestication is a part of this thesis.
When ginger samples were sterilizated by Ca(OCl)2 10% in 15 minutes and HgCl2 0,1%
in 3 minutes, sterilazation effection was good. Scarring from sheath of in vitro ginger on MS
medium with 2,4-D (1.0 mg/l) and BA (2.0 mg/l) gave best result. Somatic embryogenesis
achieved the best result when samples were cultured on MS medium with BA (2.0 ml/l). MS
medium with BA (2.0 ml/l) and NAA (1.0 ml/l) gave the best result on shoot regeneration rate
and large amount of roots. When gingers were grown on potting medium with 30% husk ash,
survival rate of young gingers was higher than growing on cocopeat potting medium without
husk ash.
Key words: 2,4-D, BA, ginger, shoot multiplication, Zingiber officinale Rosc.

iii


MỤC LỤC
Trang
Lời cảm ơn .................................................................................................................... i
Tóm tắt ......................................................................................................................... ii
Summary .....................................................................................................................iii
Mục lục ....................................................................................................................... iv

Danh sách chữ viết tắt ................................................................................................ vi
Danh sách các bảng ................................................................................................... vii
Danh sách các hình ...................................................................................................viii
Chương 1 MỞ ĐẦU .................................................................................................... 1
1.1 Đặt vấn đề ............................................................................................................. 1
1.2 Yêu cầu ................................................................................................................. 2
1.3 Nội dung thực hiện ................................................................................................ 2
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................................... 3
2.1 Tổng quan về cây gừng ......................................................................................... 3
2.1.1 Vị trí phân loại gừng........................................................................................... 3
2.1.2 Đặc điểm hình thái cây gừng .............................................................................. 3
2.1.3 Phân bố, sinh học và sinh thái ............................................................................ 3
2.1.4 Thành phần hóa học............................................................................................ 4
2.1.5 Công dụng của gừng ........................................................................................... 4
2.1.6 Công dụng của cây gừng .................................................................................... 5
2.2 Các phương pháp nhân giống gừng ....................................................................... 6
2.2.1 Phương pháp nhân giống gừng truyền thống ..................................................... 6
2.2.2 Phương pháp nhân giống gừng bằng nuôi cấy in vitro....................................... 6
2.3 Nuôi cấy mô tế bào thực vật .................................................................................. 7
2.3.1 Ý nghĩa và ứng dụng của phương pháp nuôi cấy mô ......................................... 7
2.3.2 Các giai đoạn nhân giống in vitro....................................................................... 8
2.3.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến nhân giống in vitro .................................................. 9
2.3.4 Các phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật thường được sử dụng ............... 9
2.3.5 Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật ............................................................ 11
iv


2.3.6 Các chất điều hòa sinh trưởng thường được dùng trong nuôi cấy mô sẹo ....... 11
2.3.7 Điều kiện nuôi cấy ................................................................................. 12
2.3.8 Các yếu tố khác ................................................................................................ 13

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................. 15
3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu ...................................................................... 15
3.2. Vật liệu nghiên cứu............................................................................................ 15
3.2.1 Thiết bị và dụng cụ .......................................................................................... 15
3.2.2 Môi trường nuôi cấy ....................................................................................... 15
3.2.3 Điều kiện thí nghiệm .............................................................................. 15
3.3. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................... 16
3.3.1 Khảo sát ảnh hưởng Ca(OCl)2 10% và HgCl2 0,1% đến hiệu quả khử ............ 16
3.3.2 Khảo sát ảnh hưởng của 2,4-D và BA lên khả năng tạo sẹo ............................ 17
3.3.3 Khảo sát ảnh hưởng của BA lên khả năng tạo phôi soma từ mô sẹo ............... 18
3.3.4 Khảo sát ảnh hưởng của BA và NAA lên khả năng tái sinh chồi và tạo rễ ..... 18
3.3.5 Thí nghiệm thuần hóa cây gừng in vitro ngoài vườn ươm ............................... 19
3.6 Phương pháp xử lý số liệu ................................................................................... 19
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................. 20
4.1 Ảnh hưởng của Ca(OCl)2 10% và HgCl2 0,1% ................................................... 20
4.2 Ảnh hưởng của 2,4-D và BA lên khả năng tạo mô sẹo ....................................... 22
4.2.1 Khả năng tạo mô sẹo từ mẫu lá của cây gừng in vitro ..................................... 22
4.2.2 Khả năng tạo mô sẹo từ mẫu bẹ lá của cây gừng in vitro ................................ 22
4.3 Ảnh hưởng của BA lên khả năng tạo phôi soma từ mô sẹo ................................ 25
4.4 Ảnh hưởng của BA và NAA lên khả năng tái sinh chồi và tạo rễ ...................... 26
4.5 Ảnh hưởng của giá thể đến thuần hóa cây gừng in vitro ngoài vườn ươm ......... 28
4.6 Quy trình nhân giống gừng in vitro ..................................................................... 28
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..................................................................... 30
5.1 Kết luận............................................................................................................... 30
5.2 Đề nghị ............................................................................................................... 30
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................ 31
PHỤ LUC .................................................................................................................. 33
v



DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
2,4-D

: 2,4 - Dichlorophenoxy Acetic Acid

ANOVA

: Analysis of Variance

BA

: 6 - Benzyl adenine

Ca(OCl)2

: Hypochlorite calcium

Ctv

: Cộng tác viên

ĐC

: Đối chứng

HgCl2

: Mercuryy Cloricle

Kinetin


: 6-burburylaminopurine

MS

: Murashige và Skoog (1962)

NAA

: 1-naphtalene acetic acid

NaOCl

: Hypochlorite sodium

vi


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 3.1 Thời gian khử trùng Ca(OCl)2 10% và HgCl2 0,1% đến mẫu cấy gừng ............. 16
Bảng 3.2 Ảnh hưởng của 2,4-D và BA đến sự hình thành mô sẹo của lá gừng ............ 17
Bảng 3.3 Ảnh hưởng 2,4-D và BA đến sự hình thành mô sẹo từ bẹ lá gừng in vitro…….. 17
Bảng 3.4 Ảnh hưởng của BA lên khả năng tạo phôi soma từ mô sẹo cây gừng in vitro......... 18
Bảng 3.5 Ảnh hưởng của BA và NAA lên khả năng tái sinh chồi và tạo rễ.................. 19
Bảng 3.6 Thí nghiệm thuần hóa cây gừng in vitro ngoài vườn ươm ............................. 19
Bảng 4.1 Ảnh hưởng Ca(OCl)2 10% và HgCl2 0,1% đến sự vô trùng mẫu ............... 21
Bảng 4.2 Tỉ lệ mẫu nhiễm sau 4 tuần nuôi cấy .............................................................. 21
Bảng 4.3 Ảnh hưởng của BA và 2,4-D cảm ứng tạo sẹo từ mẫu bẹ lá gừng ....... 23
Bảng 4.4 Ảnh hưởng của BA lên tỉ lệ tạo phôi soma từ mô sẹo gừng .......................... 25
Bảng 4.5 Ảnh hưởng của BA và NAA lên khả năng tái sinh chồi ............................... 27

Bảng 4.6 Tỉ lệ sống của cây gừng in vitro ngoài vườn ươm sau 4 tuần ........................ 28

vii


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 2.1 Gừng trồng trong bao ................................................................................................ 3
Hình 3.1 Cây gừng được sử dụng làm vật liệu thu ngọn .................................................. 15
Hình 4.1 Cây gừng in vitro sau 6 tuần nuôi cấy trên môi trường MS .............................. 20
Hình 4.2 Mẫu lá gừng in vitro trên môi trường tạo sẹo. ................................................... 22
Hình 4.3 Bẹ lá gừng in vitro trên môi trường cảm ứng sẹo sau 4 tuần nuôi cấy .............. 24
Hình 4.4 Hình mô sẹo trên môi trường nghiệm thức sau 6 tuần nuôi cấy trên môi trường......... 24
Hình 4.5 Mô sẹo trên môi trường cảm ứng tạo sẹo từ bẹ lá sau 6 tuần nuôi cấy ............. 25
Hình 4.6 Phôi của cây gừng in vitro sau 4 tuần nuôi cấy ................................................ 26
Hình 4.7 Chồi được hình thành phôi soma sau 5 tuần nuôi cấy ....................................... 27
Hình 4.8 Tỉ lệ sống của cây gừng in vitro ngoài vườn ươm sau 4 tuần............................ 29
Hình 4.9 Cây gừng in vitro chết sau 2 tuần trồng trên giá thể 100% mụn dừa ............... 29
Hình 4.10 Quy trình nhân giồng cây gừng in vitro........................................................... 29

viii


Chương 1 MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Gừng (Zingiber officinale Rose.) là cây thân thảo, cao khoảng 0,6 – 1m. Lá màu
xanh đậm dài 15 – 20 cm, rộng 2 cm, mọc so le, thẳng đứng. Thân ngầm phình to chứa
các chất dinh dưỡng gọi là củ, xung quanh củ có các rễ tơ. Rễ và củ chỉ phát triển tập
trung ở lớp đất mặt, sâu 0 – 15 cm, mắt chồi nằm ở củ gừng với số lượng ít. Gừng tươi
thường được sử dụng phổ biến để làm gia vị, mứt, kẹo, rượu. Trong Ðông y, gừng
thường được dùng làm thuốc giải cảm, làm ấm tỳ vị và để chống nôn, giảm đau. Ngoài

ra, củ gừng còn có nhiều tác dụng kỳ diệu khác như: tác dụng chống lão hóa (những
thành phần tạo ra cảm giác cay trong củ gừng có tác dụng chống oxy hóa rất mạnh đối
với các chất mỡ có trong cá và thịt), phòng bệnh sỏi mật (các loại tinh dầu thơm có tác
dụng ức chế sự hợp thành prostaglandin, làm giảm bớt hàm lượng muxin trong dịch
mật), các chứng viêm nhiễm (do vi khuẩn), và đặc biệt là ức chế tế bào ung thư. Thành
phần hóa học trong củ gừng có các chất như: zingiberol, zingiberen, aldehyde có tác
dụng tiêu viêm, giảm đau và diệt khuẩn, cải thiện thành phần máu. Vì vậy, từ trước
đến nay gừng chiếm một vị trí khá quan trọng trong đời sống, sinh hoạt của con người.
( />Ở Việt Nam, cây gừng được trồng khá phổ biến, các giống được trồng nhiều
hiện nay là gừng Trâu hay gừng Dé, gừng Lai (Tiền Giang), gừng Tàu (nhập nội) và
đặc biệt là giống gừng (Long An). Nhưng chủ yếu được trồng với quy mô nhỏ, sản
lượng chưa cao nên chỉ đáp ứng được nhu cầu tại địa phương và trong nước. Vài năm
trở lại đây, gừng đã trở thành cây có giá trị kinh tế khá cao, diện tích trồng gừng đã
được mở rộng. Vấn đề dịch hại trước đây ít được quan tâm (do diện tích trồng nhỏ lẻ)
thì nay có dịp bộc phát, lây lan và gây hại nghiêm trọng, ảnh hưởng đến năng suất và
chất lượng gừng (ví dụ: bệnh thối củ có thể làm thất thu đến 100% năng suất). Hiện
nay, các tài liệu hướng dẫn kỹ thuật trồng và phòng trừ dịch bệnh cho gừng còn hạn
chế. Bên cạnh đó, việc tồn trữ giống với số lượng lớn gặp nhiều khó khăn và rất tốn
kém, số lượng chồi ngủ trên củ gừng không nhiều, để trồng được 1 ha gừng cần một
lượng giống khá lớn là 300 kg/1000 m2 đất. Đó là những khó khăn mà người trồng
gừng ở Việt Nam đang phải đối mặt và cần có giải pháp khắc phục
( />1


Hơn nữa với những công dụng mà gừng mang lại nên việc xây dựng quy trình
nhân giống cây gừng có chất lượng tốt, sức sống cao với số lượng lớn trong thời gian
ngắn, giá thành rẻ là một vấn đề cần thiết trong giai đoạn hiện nay. Đó là những lí do
để thực hiện đề tài “Hoàn thiện quy trình nhân giống gừng (Zingiber officinale Rose.)
bằng phương pháp nuôi cấy phôi soma”.
1.2 Yêu cầu

Xác được thời gian khử trùng thích hợp cho việc vô mẫu từ củ của cây gừng.
Nghiên cứu nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng thích hợp cho quá trình tạo seo, tạo
phôi, tạo chồi và tạo rễ. Xác định được giá thể thích hợp trong việc thuần hóa cây
ngoài vườn ươm.
1.3 Nội dung
Nội dung thực hiện gồm có các thí nghiệm:
Khảo sát ảnh hưởng của Ca(OCl)2 10% và HgCl2 0,1% đến hiệu quả khử trùng
mẫu cấy từ củ cây gừng.
Khảo sát ảnh hưởng của 2,4-D và BA lên khả năng tạo sẹo từ lá và bẹ lá của
cây gừng in vitro.
Khảo sát ảnh hưởng của BA lên khả năng tạo phôi soma từ mô sẹo cây gừng in vitro.
Khảo sát ảnh hưởng của BA và NAA lên khả năng tái sinh chồi và tạo rễ từ
phôi soma cây gừng in vitro.
Thí nghiệm thuần hóa cây gừng in vitro ngoài vườn ươm.

2


Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Giới thiệu về cây gừng (Zingiber officinale Rose.)
2.1.1 Phân loại học của cây gừng
Giới

: Plantae

Ngành

: Angiospermae

Lớp


: Monocots

Bộ

: Zingiberales

Họ

: Zingiberaceae

Chi

: Zingiber

Loài

: Officinale

Hình 2.1 Gừng trồng trong bao
( />
2.1.2 Đặc điểm sinh học của cây gừng
Gừng là cây thân thảo, cao từ 50 – 100 cm tùy theo đất, có nơi cao hơn 150 cm.
Gừng phát triển thân ngầm dưới đất, có nhiều đốt, mỗi đốt có mầm ngủ, khi gặp điều
kiện thuận lợi sẽ đâm chồi thành cây. Bẹ lá ôm sát nhau phát triển thành thân giả trên
mặt đất. Lá đơn mọc cách (so le), lá trơn, không có cuống, hình lưỡi mác, mặt bóng
nhẵn, mép lá phẳng, gân giữa hơi trắng nhạt. Trục hoa mọc từ gốc (củ gừng), dài
khoảng 20 cm, hoa tự tạo thành bông, mọc sát nhau, hoa dài khoảng 5 cm, rộng
khoảng 2 – 3 cm, lá bắc hình trứng, mép lưng màu vàng. Đài hoa dài khoảng 1 cm, có
3 răng ngắn và có 3 cánh hoa, màu vàng hơi nhạt, mép cánh hoa màu tím, nhị hoa

cũng màu tím. Tuy nhiên, ở nước ta gừng trồng ít ra hoa hoặc chưa ra hoa đã thu
hoạch củ để bán (Mai Văn Quyền và ctv, 2001).
2.1.3 Phân bố của cây gừng
Gừng là một trong những loài cây trồng phổ biến khắp thế giới, có nguồn gốc
từ trung tâm Châu Á, được trồng ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Gừng đã trở
thành cây trồng kinh tế cho nông dân ở Châu Mỹ, Châu Phi và Đông Nam Á. Gần
50% sản lượng gừng thu hoạch xuất xứ từ Ấn Độ, một phần từ Châu Phi, Brazil,
Jamaica. Trong vùng Đông Nam Á, Trung Quốc là nước có diện tích trồng gừng cao
nhất (50.000 đến 80.000 ha), kế đến là Thái Lan, Hàn Quốc và Việt Nam (Ravindran và
Nirmal Babu, 2005).
3


Cây gừng được trồng phổ biến ở vùng khí hậu nhiệt đới ẩm, có nhiệt độ trung
bình hàng năm từ 21 – 27 0C, lượng mưa từ 1500 – 2500 mm/năm, từ độ cao vài mét
đến 1500 m trên mặt nước biển. Ở các vùng núi cao, khí hậu lạnh, nhiều sương không
thích hợp đối với cây gừng (Nguyễn Ngọc Bình và Phạm Đức Tuấn, 2001).
2.1.4 Thành phần hóa học của cây gừng
Thành phần hóa học của gừng rất phong phú: chứa 2 – 3% tinh dầu, 5% nhựa
cây, 3,7% chất béo, ngoài ra còn có tinh bột, chất cay và các vitamin như C, B1, B2,
B6. Tinh dầu chứa các thành phần như β-zingiberin (35%), ar-curcumen (17%), βfarnesen (10%) và một lượng nhỏ hợp chất alcol. Trong nhựa cây còn chứa 20 – 25%
tinh dầu, 20 – 30% chất cay.
Thành phần chất cay là zingeron, shogaol và zingerol. Ngoài ra, trong tinh dầu gừng
còn chứa α-complen, β-phelandren, eucalyptol và các gingerol. Có thể chưng cất tinh dầu
từ gừng với hiệu suất 1 – 2,7% hoặc điều chế nhựa dầu gừng từ bột gừng khô với các
dung môi hữu cơ, hiệu suất 4,2 – 6,5 (Nguyễn Thị Kim Phương, 2011).
2.1.5 Bệnh hại trên củ gừng
Bệnh thối củ gừng do vi khuẩn Pseudomonas solanascerum và Ewinia sp
gây ra. Cây gừng đang xanh tốt bổng dưng bị héo đột ngột vào giữa trưa, vài ngày sau
toàn bộ cây bị vàng, khi nhổ lên thấy đỉnh sinh trưởng của gừng có nhựa đục. Phần củ

bị nhiễm bệnh nhũn nước, có màu đen, dịch trắng sữa tiết ra trên bề mặt cắt. Đây là
bệnh rất nguy hiểm và gây thiệt hại lớn đến năng suất gừng thương phẩm cũng như
gừng giống vì vi khuẩn gây bệnh này lưu tồn lâu dài trong đất và là nguồn lây nhiễm
giữa các củ gừng (Chi cục bảo vệ thực vật An Giang, 1998)
Bệnh thối vàng do nấm Fusarium gây ra. Bệnh thường gây hại ở phần củ
dưới đất nên khó phát hiện, trên thân gừng không có biểu hiện gì khi củ bị thối, chỉ khi
củ bị thối nhũn hoàn toàn cây bị gãy gục hoặc bị héo nhẹ khi trời nắng. Bệnh thường ít
hoặc không gây hại trên thân gừng, chỉ khi bụi gừng nào dày đặc thì bệnh mới gây hại
đến phần thân (Trần Văn Hòa và ctv, 2000).
Theo Nguyễn Bá Linh (2006), Nguyễn Phú Dũng (2008), kết quả điều tra
nông dân trồng gừng tại Chợ Mới – An Giang, 100% hộ điều tra đều xuất hiện bệnh
thối củ gừng. Mức độ gây hại bệnh rất cao và rất nguy hiểm khi gặp điều kiện thời tiết
bất lợi, vì tốc độ lây lan rất nhanh, có thể làm nông dân mất trắng. Tuy nhiên, bệnh
thối củ hiện nay chưa có thuốc đặc trị, chỉ phòng bệnh là chính.
4


2.1.6 Công dụng của cây gừng
Gừng được sử dụng trong thực phẩm cũng như là một vị thuốc rất tốt cho sức
khỏe. Trong thực phẩm, gừng được sử dụng từ củ giã nhuyễn hoặc cắt lát ướp vào làm
gia vị khi chế biến món ăn. Nhờ vào vị cay, mùi thơm đặc trưng dùng trong chế biến
các món ăn như cá, hải sản nấu với cải xanh, nấu chè khoai lang, tàu hủ…Ướp gừng
trong 30 phút trước khi kho thịt, cá (nhất là cá biển như cá ngừ, cá nục) không chỉ làm
tăng mùi thơm mà còn giúp giải độc, triệt tiêu tính gây dị ứng của cá, thịt. Đó là do
trong gừng có một enzyme phân giải protein. Làm bánh, mứt, kẹo, rượu bia (Châu Âu,
Châu Mỹ). Có tác dụng chống oxy hóa. Khi nấu thức ăn có gừng tươi sẽ làm chậm sự
biến chất của thức ăn.
Trong y học, gừng có những dược tính sau: ngăn chặn sự tạo thành cục máu
đông, nhờ đó có thể ngăn ngừa chứng đau thắt ngực, nhồi máu cơ tim (tác dụng này
tương tự aspirin nhưng không gây viêm loét và xuất huyết dạ dày), người bị bệnh tim

mạch nên dùng gừng tươi hằng ngày vào sáng, trưa, tối, mỗi lần 1 lát mỏng (khoảng 2
g), sẽ không phải dùng aspirin. Tác dụng ngăn cản sự tăng cholesterol trong máu, có
tác dụng với các bệnh tăng mỡ máu, nhiễm mỡ gan, huyết áp cao. Giúp cho hệ thống
miễn dịch làm việc có hiệu quả, tăng khả năng chống lạnh, chịu lạnh và hạn chế các
bệnh viêm nhiễm. Ức chế thần kinh trung ương, ức chế hoạt tính của histamin, dẫn đến
giảm co thắt cơ trơn, giảm cơn dị ứng. Gừng còn có tác dụng tốt trong việc chữa nôn
mửa (do thai nghén, say tàu xe hay do hóa trị, xạ trị) mà không gây phản ứng phụ như
các thuốc chống nôn hóa dược. Giúp hệ thống tiêu hóa làm việc tốt hơn nhờ khả năng
kích thích tiết nước bọt, dịch mật, kích thích sự vận chuyển trong đường tiêu hóa. Kích
thích sự sinh trưởng các loại vi khuẩn có ích trong hệ tiêu hóa, có tác dụng chống rối
loạn tiêu hóa do kháng sinh. Gừng cũng làm giảm bài tiết dịch vị, ức chế sự co bóp dạ
dày, ức chế sự phát triển của các loại vi trùng gây bệnh dạ dày. Chống phù nề, giảm
đau, chống hen. Gừng được dùng để điều trị có hiệu quả các chấn thương phần mềm
(thuốc đắp và uống) bong gân, hen, ho lâu không khỏi, đau răng, thấp khớp. Ngoài ra,
gừng còn có tác dụng phòng sỏi mật, phòng chống các bệnh ung thư, chống lão hóa,
giảm sốt, chống nhiễm độc gan (Nguyễn Thị Kim Phương, 2011).

5


2.2 Phương pháp nhân giống gừng
2.2.1 Phương pháp truyền thống
Hiện nay, gừng được trồng phổ biến bằng cách tách củ (gừng giống) có chứa chồi
ngủ (mắt mầm) và đem giâm xuống đất. Sau một thời gian sẽ ra rễ, chồi phát triển
sống thành cây độc lập và hoàn chỉnh. Tuy nhiên, số lượng chồi ngủ không nhiều, nếu
trồng gừng tập trung trên phạm vi lớn thì phải dự trữ lượng gừng giống khá lớn (1 ha
cần khoảng 3 tấn củ gừng giống hoặc có thể trữ lại 20 – 25% sản phẩm thu hoạch để
làm giống). Hơn nữa, cây gừng hiếm khi ra hoa, nếu có hoa thì cũng khó có hạt hoặc
hạt lép không thể nảy mầm, cho nên không thể nhân giống gừng từ hạt (Huỳnh Trường
Huê, 2009)

2.2.2 Phương pháp nuôi cấy tế bào thực vật
Nhân giống gừng bằng phương pháp nuôi cấy mô sẽ tạo ra được số lượng lớn
cây con đồng nhất và sạch bệnh, ít tốn kém chi phí và không gian tồn trữgiống. Nhân
giống gừng bằng phương pháp nuôi cấy mô đã được thực hiện bởi Lâm Ngọc Phương
(1997), Nguyễn Thị Kim Phương (2011), Huỳnh Trường Huê (2009), Palai (1997),
Anjumanara và ctv (2003), Rajani (2006).
Theo kết quả nghiên cứu của Lâm Ngọc Phương (1997), sử dụng môi trường
MS có bổ sung kích thích tố BA 1 – 3 mg/l thích hợp cho nhân chồi và bổ sung vào
môi trường nhân chồi 0,5 mg/l NAA để tạo cây hoàn chỉnh có bộ rễ khỏe mạnh. Danh
Giàu (2003) sử dụng BA trong khoảng 2 – 2,5 mg/l cho chồi phát triển tốt.
Theo Huỳnh Trường Huê (2009), khử trùng mẫu gừng với hóa chất Ca(OCl)2
cho kết quả mẫu sống vô trùng cao (70%) trong thời gian 25 – 30 phút ở nồng độ 10%.
Nhân chồi trên môi trường MS bổ sung chất điều hòa sinh trưởng BA 2 mg/l, chồi
gừng tăng trưởng và phát triển nhanh.
Theo Palai (1997), khi nuôi cấy gừng trên môi trường MS bổ sung nồng độ cao
BA (6 – 8 mg/l) làm giảm hệ số nhân chồi. Pandey (1997), quan sát thấy rằng khi nuôi
cấy đỉnh chồi gừng trên môi trường MS bổ sung BA 5 mg/l + NAA 0,5 mg/l đạt số
chồi là 5,33 chồi/mẫu cấy sau 5 tuần nuôi cấy.
Anjumanara và ctv (2003), khi kết hợp các nồng độ khác nhau khi nuôi cấy trên
môi trường MS bổ sung chất điều hòa sinh trưởng BAP, kinetin và 2,4-D. Số lượng
chồi đạt tối đa 22 – 25 chồi/mẫu cấy khi MS bổ sung BAP 2,5 mg/l + kinetin 0,5 mg/l.
Khi kết hợp 2,4-D (0,5 – 3 mg/l) và BAP (0,5 – 1,5 mg/l) thì MS + BAP 1,0 mg/l +
6


2,4-D 0,5 mg/l cho số lượng chồi cao nhất là 15 chồi/mẫu cấy. Với môi trường MS bổ
sung BA 0,5 mg/l thì có số lượng chồi thấp nhất là 2 chồi/mẫu cấy.
Trong nghiên cứu của Rajani (2006), sử dụng đỉnh chồi gừng nuôi cấy trên môi
trường MS bổ sung BAP (0,5 – 2,0 mg/l) hoặc kinetin (0,5 – 2,0 mg/l) thì BAP 2 mg/l
cho số lượng chồi cao (5,1 chồi/mẫu cấy) và số chồi tối thiểu với kinetin 0,5 mg/l (1,1

chồi/mẫu cấy). Rajani (2006), cũng đã sử dụng HgCl2 và NaOCl để khử trùng đỉnh
sinh trưởng với khoảng thời gian và nồng độ khác nhau để tìm ra nồng độ khử trùng
mẫu tốt nhất. Tỷ lệ cao nhất đạt 90% mẫu khỏe và sạch nấm khuẩn khi sử dụng chất
khử trùng là 0,1% HgCl2 trong 12 phút, tỷ lệ đạt 70% khi khử trùng 0,1% HgCl2 với
thời gian 10 phút, tỷ lệ thấp nhất (37%) khi khử trùng 0,5% NaOCl trong thời gian 10
phút, khử trùng chỉ đạt 24% mẫu sạch nấm khuẩn nhưng 33% mẫu đã bị chết khi khử
trùng mẫu gừng với HgCl2 0,1% trong 15 phút.
2.3 Phương pháp nuôi cấy tế bào thực vật
2.3.1 Giới thiệu phương pháp nuôi cấy tế bào thực vật
Theo Nguyễn Đức Lượng (2002), nuôi cấy tế bào thực vật là kĩ thuật cho phép
nuôi cấy dễ dàng những tế bào thực vật hay mô phân sinh sạch bệnh trong môi trường
nhân tạo thích hợp để tạo ra những khối tế bào hay những cây hoàn chỉnh trong ống
nghiệm. Cơ sở sinh lí của nuôi cấy mô – tế bào đó là tính toàn năng, là khả năng của tế
bào hình thành cây hoàn chỉnh trong điều kiện nuôi cấy thích hợp, do trong tế bào có
chứa bộ nhiễm sức thể hoàn chỉnh của loài.
Các nhân tố đảm bảo thành công trong nuôi cấy mô tế bào thực vật: đảm bảo
điều kiện vô trùng, phòng thí nghiệm phải chuyên hóa cao, chọn đúng môi trường và
chuẩn bị môi trường đúng cách, chọn mô cấy, xử lí mô thích hợp trước và sau khi cấy.
2.3.2 Sơ lượt về lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật
Theo Phạm Thành Hổ (2006), sự phát triển của nuôi cấy mô thực vật có thể
chia làm 4 giai đoạn chính:
Giai đoạn I (1902 - 1930): với những thử nghiệm ban đầu.
Giai đoạn II (1934 - 1954): năm 1937, Gautheret đã nuôi cấy thành công mô tế
bào cà rốt. Phát hiện vai trò các vitamin, chất kích thich sinh trưởng auxin, cytokinin.
Giai đoạn III (1957 – 1992): thực hiện tách và nuôi tế bào đơn. Biết vai trò tỉ lệ
cytokinin/auxin, tạo protoplast và tái sinh cây, tạo cây đơn bội từ nuôi cấy túi phấn và
từ những năm 1980 là sự phát triển công nghệ gen thực vật.
7



Giai đoạn IV: ứng dụng các thành tựu vào sản xuất quy mô lớn và diện rộng.
Năm 1838 hai nhà sinh học người Đức là Schleiden và Schwann đã đề xướng
thuyết tế bào và nêu rõ: mọi cơ thể sinh vật phức tạp đều gồm nhiều đơn vị nhỏ, các tế
bào hợp thành.
Năm 1902, Haberlandt là người đầu tiên đưa ra thuyết của Schleiden và
Schwann vào thực nghiệm. Ông cho rằng, bằng cách nuôi cấy người ta có khả năng tạo
thành công các phôi nhân tạo từ các tế bào sinh dưỡng, tuy nhiên ông đã không thành
công.
Năm 1922, Kotte – học trò của Haberlandt, và Robbins – người Mỹ lặp lại thực
nghiệm của Haberlandt với đỉnh sinh trưởng tách từ đầu rễ một cây hòa thảo. Trong
môi trường lỏng gồm có muối khoáng và glucose, đầu rễ sinh trưởng khá mạnh, tạo
nên một hệ rễ nhỏ có cả rễ phụ. Tuy nhiên, sự sinh trưởng như vậy chỉ tồn tại một thời
gian, sau đó chậm dần và ngừng lại, mặc dù tác giả đã chuyển qua môi trường mới.
Năm 1934, bắt đầu giai đoạn 2 trong lịch sử nuôi cấy mô thực vật, khi White –
người Mỹ nuôi cấy thành công trong một thời gian dài đầu rễ cây cà chua
(Lycopersicum esculentum) với môi trường lỏng chứa muối khoáng, glucose và nước
chiết nấm men. Sau đó, White chứng minh là có thể thay thế nước chiết nấm men bàng
ba loại vitamin nhóm B: B1 (thiamin), B6 (pyridoxine) và acid nicotinic. Từ đó, việc
nuôi cấy đầu rễ đã được tiến hành ở nhiều nơi khác nhau.
Năm 1954, Skoog ở Mỹ tình cờ thấy nếu thêm 1 lít chế phẩm để lâu của acid
deoxyribonucleic (DNA) lấy từ tinh dịch cá bẹ vào môi trường nuôi cấy các mảnh mô
thân cây thuốc lá thì tác dụng kích thích sinh trưởng trở nên rõ rệt. Năm 1955, chất nầy
được xác lập là 6-furfurylaminopurine và được Skoog đặt tên là kinetin do có tác dụng
kích thích sự phân bào.
Năm 1957, Skoog và Miller công bố kết quả nghiên cứu về ảnh hưởng của tỉ lệ
kinetin/auxin trong môi trường nuôi cấy đối với sự hình thành cơ quan của mô sẹo
thuốc lá. Khi giảm thấp tỉ lệ kinetin/auxin thì mô sẹo có khuynh hướng phát triển rễ,
ngược lại nếu tỉ lệ kinetin/auxin tăng thì dẫn đến khuynh hướng tạo chồi ở mô sẹo
(Rhitu Rai, 2007).


8


2.3.3 Tầm quan trọng của phương pháp nuôi cấy mô - tế bào thực vật
Theo Nguyễn Đức Lượng (2002), phương pháp nuôi cấy mô tế bào thực vật có
ý nghĩa vô cùng to lớn đối với việc nghiên cứu lý luận sinh học cơ bản, đồng thời nó
có giá trị đóng góp trực tiếp cho thực tiễn sản xuất và đời sống.
Về mặt lý luận sinh học cơ bản, đã mở ra khả năng to lớn cho việc tìm hiểu sâu
sắc về bản chất của sự sống. Thông qua nuôi cấy tế bào, chúng ta có thể tiến hành so
sánh đặc tính của cơ thể với các hợp phần của chúng khi tách khỏi cơ thể, từ đó rút ra
quy luật về các bộ phận trong cây. Thực tế đã cho phép tách và nuôi cấy trước hết là
mô phân sinh, từ đó tạo ra tế bào không chuyên hóa gọi là mô sẹo, và từ mô sẹo có thể
kích thích để tái sinh cây hoàn chỉnh. Đây là ưu thế mà các nhà sinh lý, sinh hóa và di
truyền học dễ dàng sử dụng trong công tác của mình.
Về mặt thực tiễn sản xuất: phương pháp nuôi cấy tế bào thực vật được sử dụng
để phục tráng và nhân nhanh các giống cây trồng quý, có giá trị kinh tế cao. Hiện nay,
nó đã trở thành kĩ thuật nông nghiệp phổ biến và sử dụng trong công tác chọn giống
cây trồng. Phương pháp nuôi cây tế bào thực vật còn được sử dụng rộng rãi trong công
nghệ sinh học. Chỉ trong một thời gian ngắn có thể tạo một sinh khối lớn có hoạt chất
như alkaloid, glycoside, các steroid (dùng trong y học). Những lợi ích trong việc áp
dụng nuôi cấy tế bào thực vật được tóm tắt như sau: kiểm soát được dịch bệnh cây
trồng, loại bỏ được những cá thể nhiễm bệnh hay mang mầm bệnh, chất lượng giống
thông qua kiểm soát kiểu gen của giống đem vào sản xuất, kiểm soát được toàn bộ kĩ
thuật từ khâu nhân giống đến khâu thu hoạch, tạo ra sự đồng loạt về giống, từ đó tạo ra
sự đồng loạt của cac sản phẩm cuối cùng.
2.3.4 Các kĩ thuật của phương pháp nuôi cấy tế bào thực vật
Nuôi cấy đỉnh sinh trưởng Limmasets và Cornuet (1949), đã phát hiện rằng ở
các cây nhiễm bệnh virus, virus phân bố không đồng nhất trên cây và thường không
thấy chúng ở vùng đỉnh sinh trưởng. Phát hiện đó là cơ sở để Morel và Martin (1952)
chứng minh giả thuyết trên bằng cách tạo được cây sạch bệnh virus từ 6 giống khoai tây

qua nuôi cấy đỉnh sinh trưởng. Ngày nay, kỹ thuật này cùng với một số cải tiến đã trở
thành phương pháp loại trừ bệnh virus được sử dụng rộng rãi đối với nhiều loài cây
trồng khác nhau.
Kích thước mẫu nuôi cấy càng lớn, tỷ lệ tái sinh và sống sót của mẫu càng cao,
tuy nhiên mẫu càng nhỏ thì khả năng sạch bệnh virus lại cao hơn. Do vậy, kích thước
9


mẫu nuôi cấy cần phải xác định bằng thực nghiệm đối với mỗi loài. Mẫu nuôi cấy nhỏ
nhất chỉ có chóp sinh trưởng và 2 – 3 mầm lá sẽ là lý tưởng để tạo giống sạch bệnh do
mô phân sinh đỉnh nằm ở chóp đỉnh chồi, là trung tâm hoạt động sinh trưởng, phân
hóa và phát triển của thực vật, ngay dưới mô phân sinh này là các mầm lá. Theo Vine
và Jones (1969), đôi khi kích thước mẫu lớn hơn vẫn đảm bảo sạch bệnh virus (Lê Văn
Hoàng, 2008).
Quak (1966) cho rằng trong đỉnh sinh trưởng có một sự cạnh tranh giữa sự sinh
sản của virus và sự phân chia tế bào mô phân sinh để tạo ra các tế bào con. Ở trong mô
phân sinh, trong suốt quá trình phân chia của tế bào, khả năng sinh tổng hợp acid
nucleic được tận dụng để phân chia tế bào nên sẽ gây bất lợi cho sự tăng sinh của
virus. Quak còn cho rằng trong đỉnh sinh trưởng không có sự hiện diện của bó mạch và
cầu liên bào nên đã gây trở ngại cho sự chuyển động của virus. Chính sự không có liên
bào và bó mạch trong đỉnh sinh trưởng đã giải thích cho nguyên nhân vì sao ít có sự
hiện diện của virus ở vị trí này (Nguyễn Đức Lượng, 2002).
Nuôi cấy mô sẹo là một khối tế bào không có tổ chức, hình thành từ các mô và
các cơ quan phân hóa dưới các điều kiện đặc biệt (có vết thương, xử lý các chất điều
hoà sinh trưởng thực vật). Các tế bào thuộc các mô hoặc cơ quan này phải chịu một sự
phản phân hóa trước lần phân chia đầu tiên. Theo Hanlperrin (1969), mô sẹo là nguyên
liệu khởi đầu cho các nghiên cứu quan trọng khác như: phân hóa mô và tế bào, chọn
dòng tế bào, nuôi cấy tế bào trần, nuôi cấy tế bào đơn, nuôi cấy phôi soma, sản xuất
các chất thứ cấp có hoạt tính sinh học (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên,
2002). Chất điều hòa sinh trưởng có vai trò quan trọng trong sự hình thành và phát

sinh mô sẹo, đặc biệt là auxin và cytokinin. Auxin cần thiết cho quá trình cảm ứng mô
sẹo từ mẫu cấy ban đầu, để đáp ứng lại việc cảm ứng với auxin, tế bào chuyển sang
trạng thái phản phân hóa và bắt đầu hình thành khối mô không tổ chức. Cytokinin có
vai trò quan trọng trong sự phân chia các tế bào không tổ chức này. Tác động của
cytokinin lên sự tăng trưởng của tế bào trong môi trường nuôi cấy mô phụ thuộc vào
sự hiện diện đồng thời của auxin.
Nuôi cấy huyền phù thường được khởi đầu bằng cách nuôi khối mô sẹo cắt nhỏ
trong môi trường lỏng lắc. Sau một thời gian ngắn, các tế bào sẽ dần dần tách ra khỏi
khối mô và tạo thành các tế bào đơn. Mứa độ tách rời của tế bào phụ thuộc vào đặc
tính các khối tế bào xốp và có thể điều chỉnh bằng cách thay đổi thành phần môi
10


trường (Misawa, 1994). Vì thế, nuôi cấy tế bào huyền phù thích hợp hơn cho việc sản
xuất sinh khối tế bào thực vật vì có thể duy trì và thao tác tương tự như các hệ thống
lên men vi sinh vật chìm trong môi trường lỏng.
2.3.5 Môi trường nuôi cấy
Môi trường sử dụng trong các thí nghiệm là môi trường MS (Murashige và
Skoog,1962) với đầy đủ các thành phần dinh dưỡng, khoáng, thuận lợi cho mẫu nuôi cấy.
Môi truờng ½MS, ¼MS là môi trường có hàm lượng khoáng đa lượng giảm ½, ¼.
Môi trường có 8 g/l agar và bổ sung đường, chất điều hòa sinh trưởng,than hoạt
tính với các nồng độ khác nhau tùy theo từng thí nghiệm cụ thể. Môi trường có pH 5.5
– 6 được hấp khử trùng ở nhiệt độ 121oC, áp suất 1 atm trong thời gian 25 phút.
2.3.6 Các chất điều hòa sinh trưởng thường được dùng trong nuôi cấy mô
 Auxin
Auxin lần đầu tiên được phát hiện đó là hợp chất đơn giản: acid indol-3-acetic
là tac nhân của sự sinh trưởng kéo dài miền cận dưới đỉnh của bao lá mần và thân cây.
Hiện nay các auxin được đưa vào môi trường nuôi cấy nhằm thúc đẩy sự sinh trưởng
và giãn nở của tế bào, tăng cường các quá trình sinh tổng hợp và trao đổi chất, kích
thich quá trình sinh tổng hợp và trao đổi chất, kích thích quá trình hình thành rễ và

tham gia và cảm ứng phát sinh phôi vô tính.
Ở nồng độ 0,1 – 5 mg/l, NAA và IBA thường được dùng để kích thích ra rể và
dùng phối hợp với cytokinin trong sự nhân chồi. 2,4-D rất hiệu quả trong việc tạo mô
sẹo (Nguyễn Đức Lượng, 2002).
Các auxin có hàm lượng sử dụng từ 0,1 - 2 mg/l (ngoại trừ IAA ít được sử dụng
do kém bền với nhiệt độ và ánh sáng). Chúng có hiệu quả sinh lý ở nồng độ thấp. Tùy
theo loại auxin, hàm lượng sử dụng và đối tượng nuôi cấy mà tác động sinh lý của
auxin kích thich sinh trưởng mô, hoạt hóa hình thành rễ hay thúc đẩy sự phân chia
mạnh mẽ của tế bào dẫn đến hình thành mô sẹo (callus) (Vũ Văn Vụ và ctv, 2006).
 Cytokinin
Kinetin được Skoog và Miller đặt tên sau khi tách ra từ 500 g DNA của tinh
dịch cá trích (clupea). Cytokinin nói chung là một nhóm chất tự nhiên và nhân tạo có
tác dụng kích thích sự phân chia tế bào, sự hình thành và sinh trưởng của chồi in vitro.
Các cytokinin có biểu hiện ức chế sự tạo rễ và sự sinh trưởng của mô sẹo nhưng có
biểu hiện dương tính rõ rệt đến sự sinh phôi vô tính của mẫu nuôi cấy, cảm ứng sự
11


hình thành chồi thông qua tác dụng của quá trình sinh tổng hợp các yếu tố tăng trưởng
(Vũ Văn Vụ và ctv, 2006).
Hàm lượng được sử dụng của các loại cytokinin dao động từ 0,1 – 2 mg/l. Ở
những nồng độ cao hơn, cytokinin có tác dung kích thích rõ rệ đến sự hình thành chồi bất
định, đồng thời ức chế mạnh sự tạo rễ của chồi nuôi cấy. Trong các loại cytokinin nói
trên, Kinetin và BA là 2 loại được sử dụng rộng rải hơn cả (Vũ Văn Vụ và ctv, 2006).
 Gibberellin
Là một nhóm chất điều hòa sinh trưởng ở thực vật gồm 80 hợp chất khác nhau.
Các hợp chất này có điểm giống nhau ở cấu trúc hóa học đó là sườn gibbane.
GA3 (acid gibberellic) là 1 loại gibberellin thường được dùng trong nuôi cấy mô
(Nguyễn Đức Lượng, 2002).
Hoạt động rõ ràng nhất của gibberellin kéo dài các đốt cây, kích thích sự nảy mầm

của hạt và củ, có tác dụng tốt lên sự đậu trái của các trái không hạt. Trong nuôi cấy in
vitro, gibberellin có tác dụng với đỉnh sinh trưởng. Nếu thiếu gibberellin, đỉnh sinh trưởng
thể hiện một dạng hình cầu, tạo nên các mắt cây (Dương Công Kiên, 2002).
2.3.7 Điều kiện nuôi cấy
 Ánh sáng
Mẫu cây được đặt trên môi trường chứa nguồi năng lượng sẵn sàng là đường, sẽ
ít phụ thuộc vào quang hơp. Tuy nhiên nghiên cứu cho thấy ánh sáng hấp thụ đóng vai
trò quan trọng đến hình dáng cây nuôi cấy mô.
 Nhiệt độ
Ngoài ánh sáng, yếu tố môi trường khác ảnh hưởng rõ ràng là nhiệt độ. Tuy có
nhiều loại cây trồng có nhiệt độ tối ưu cho sự tạo hình cây khác nhau nhưng hầu hết
việc nuôi cấy thích hợp ở nhiệt độ 20 – 25oC.
 Môi trường in vitro
Môi trường in vitro là môi trường trên và dưới mặt thạch trong bình nuôi cấy.
Môi trường in vitro có ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát triển hình thái của
cây in vitro.
Một số vấn đề của môi trường in vitro là mức độ quang hợp thấp, không cân
bằng CO2, mức độ hấp thụ và vận chuyển các chất dinh dưỡng hạng chế, ... Vì vậy cây
con in vitro sinh trưởng chậm, mẫn cảm với stress ở giai đoạn thuần hóa.

12


Đặc tính của môi trường in vitro và phản ứng của cây con in vitro với môi
trường có mối tương quan. Do vậy việc kiểm soát môi trường in vitro rất quan trọng
(Dương Công Kiên, 2002).
2.3.8 Các yếu tố khác
 Nguồn Carbon
Các mẫu nuôi cấy mô thực vật không thể quang hợp, hoặc nến có quang hợp thì
cường độ cũng rất thấp do thiếu chlorophyll, nồng độ CO2 và nhiều điều kiện khác. Vì

vậy cần đưa thêm những hợp chất hydratcarbon vào môi trường nuôi cấy.
Loại hydratcarbon được sử dụng phổ biến là đường saccharose với hàm lượng
2 – 6%. Những loại đường khác như fructose, glucose, maltose, lactose, rafinose,
sorbitol chỉ được sử dụng trong những trường hợp cá biệt (Vũ Văn Vụ và ctv, 2006).
 Tác nhân tạo gel (gelling agent)
Tác nhân tạo gel quyết định trạng thái vật lý của môi trường nuôi cấy. Các môi
trường đặc có chứa đủ hàm lượng chất tạo gel làm cho chúng chuyển sang dạng gel ở
nhiệt độ bình thường (25 – 30oC).
Chất tạo gel được sử dụng phổ biến là agar (thạch) gồm một số polysaccharide
có khối lượng phân tử cao, được lấy từ rong biển. Các polysaccharide kết hợp với
phân tử H2O tạo thành polymer và chuyển sang dạng gel ở nhiệt độ xấp xỉ 450C.
Trong thành phần của agar có chứa thành phần chất vô cơ: Cu, Fe, Mn, Mg, Cl,
Zn và một số thành phần hữu cơ: acid hữu cơ, acid béo .
Hàm lượng sử dụng của agar 0,5 – 10% tùy thuộc theo chất lượng của chúng và
loại môi trường sử dụng (Vũ Văn Vụ và ctv, 2006).
 pH môi trường
pH của một số môi trường nuôi cấy được điều chỉnh trong phạm vi 5,5 – 6,
dưới 5,5 làm agar khó chuyển sang dạng gel, còn pH lớn hơn 6 agar có thể rất cứng.
Trong quá trình nuôi cấy, pH môi trường có thể giảm xuống do một số mẫu thực vật
có thể sản sinh ra acid hữu cơ (Vũ Văn Vụ và ctv, 2006).
 Than hoạt tính (Activated charcoal)
Than hoạt tính dùng để hấp thụ các chất màu, các hợp chất phenol, các sản
phẩm trao đổi hợp chất thứ cấp trong trường hợp các chất đó có tác dụng gây ức chế
sinh trưởng của các mẫu nghiên cứu.
Than hoạt tính cũng hút các chất hữu cơ như phytohormone, vitamin, sắt chelat,
kẽm. Hàm lượng sử dụng than hoạt tính là 0,2 – 0,3% .
13


Than hoạt tính làm giảm hiệu quả của các chất điều hòa sinh trưởng, làm thay

đổi cuờng độ ánh sáng, do môi trường trở nên sẫm đi khi có than hoạt tính, có thể kích
thích sự hình thành, sinh trưởng của rễ và là một trong những chất chống oxy hóa tốt
(Vũ Văn Vụ và ctv, 2006).
 Tính thẩm thấu của môi trường
Trong môi trường nuôi cấy mô, hấp thụ nước vào tế bào, mô bị chi phối bởi thế
năng của nước trong dịch bào vào trong môi trường dinh dưỡng. Các thành phần chính
ảnh hưởng đến thế năng của nước trong môi trường bao gồm: hàm lượng đường, hàm
lượng agar và một số thành phần muối khoáng.
Đường vừa là nguồn cung cấp carbon cho mẫu cấy đồng thời tham gia điều
chỉnh khả năng thẩm thấu của môi trường. Hàm lượng đường cao môi trường nuôi cấy
khó hút được nước, còn hàm lượng đường quá thấp là một trong những nguyên nhân
gây ra hiện tượng thủy tinh thể. Đây là trở ngại chính cho việc chuyển cây từ ống
nghiệm ra ngoài vườn ươm.
Theo Trigiano và Gray (2000), hydratcarbon đóng góp khoảng 50 – 60% và khả
năng thẩm thấu của môi trường, phần còn lại do các muối dinh dưỡng và thành phần
khác gây ra. Vì thế có thể thay đổi thẩm thấu của môi trường thông qua thành phần
hydratcarbon (Vũ Văn Vụ và ctv, 2006).
 Aminoacid
Đối với nhiều mẫu nuôi cấy, môi trường phải được bổ sung các aminoacid vì
chúng giữ vai trò quan trọng trong phát sinh hình thái. Tất cả các dạng tự nhiên của
aminoacid (dạng L) dễ dàng được mô nuôi cấy hấp thụ. Trong đó, glycine là
aminoacid đơn giản nhất, nhưng là nguồn tổng hợp purin và một số thành phần cấu
trúc của vòng porphyrin trong các phân tử chlorophull (Vũ Văn Vụ và ctv, 2006).

14


Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Thời gian và địa điểm
Thí nghiệm được tiến hành từ tháng 12 năm 2012 đến tháng 6 năm 2013 tại

phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ Sinh học, Trường Đại Học Nông Lâm TPHCM.
3.2. Vật liệu
3.2.1 Đối tượng

Hình 3.1 Cây gừng được sử dụng làm vật liệu

Gừng giống lấy tại hai tỉnh là Bến Tre và Long An đuợc trồng tại vườn ươm
của Bộ môn Công nghệ Sinh học trên giá thể tro trấu và xơ dừa.
3.2.2 Môi trường nuôi cấy
Môi trường nuôi cấy được sử dụng là môi trường MS (Murashige và Skoog,
1962) có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng thực vật như BA, Kinetin, 2,4-D, NAA tùy
theo mỗi nghiệm thức. Môi trường được hấp khử trùng bằng autoclave ở nhiệt độ
121oC, 1 atm trong 20 phút.
3.2.3 Điều kiện thí nghiệm
Việc nuôi cấy duy trì trong chu kỳ chiếu sáng 16 giờ.
Cường độ chiếu sáng là 3000 – 6000 lux ở nhiệt độ 24 ± 2oC.
Ẩm độ: 60 – 70%.

15