VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH
THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

ĐỖ TIẾN MẠNH

NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN
CHỦNG NẤM CORDYCEPS TAKAOMONTANA
TỪ RỪNG TỰ NHIÊN VIỆT NAM CÓ KHẢ NĂNG TỔNG HỢP
MỘT SỐ HOẠT CHẤT SINH HỌC GIÁ TRỊ

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Hà Nội - 2015


VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH
THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

ĐỖ TIẾN MẠNH

NGHIÊN CỨU TUYỂN CHỌN
CHỦNG NẤM CORDYCEPS TAKAOMONTANA
TỪ RỪNG TỰ NHIÊN VIỆT NAM CÓ KHẢ NĂNG TỔNG HỢP MỘT SỐ HOẠT
CHẤT SINH HỌC GIÁ TRỊ

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS.

Nguyễn Thị Thanh Bình

Hà Nội - 2015

ii


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan các số liệu và kết quả nghiên cứu được trình bày trong
Luận văn này là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình
nghiên cứu nào khác.
Tôi xin cam đoan các thông tin trích dẫn trong Luận văn đã được chỉ rõ nguồn
gốc.
Tôi xin chịu trách nhiệm về nghiên cứu của mình.

Học viên

Đỗ Tiến Mạnh

i


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới Quý Thầy, Cô đã giảng dạy trong
chương trình Cao học khóa 17 - Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật - Viện Hàn lâm
Khoa học và Công nghệ Việt Nam, những người đã truyền đạt cho tôi kiến thức hữu
ích làm cơ sở giúp tôi thực hiện tốt luận văn này.
Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới PGS.TS. Nguyễn Thị Thanh Bình, người
Thầy luôn tận tình hướng dẫn, dìu dắt và tạo điều kiện thuận lợi để tôi có thể hoàn thành
luận văn thạc sĩ khoa học.

Tôi xin gửi lời cảm ơn đến các cô chú, anh chị đang làm việc tại Phòng Công nghệ
Gen Động vật – Viện Công nghệ Sinh học đã quan tâm và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình
thực tập tại phòng thí nghiệm của Viện.
Sau cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình và bạn bè đã tạo
điều kiện, động viên để tôi hoàn thành khóa học và thực hiện luận văn thạc sĩ
với kết quả tốt nhất.
Học viên

Đỗ Tiến Mạnh

ii


MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN .......................................................................................... i LỜI CẢM
ƠN............................................................................................... ii DANH MỤC BẢNG
....................................................................................
....................................................................................

vi

DANH
vii

MỤC
MỞ

HÌNH
ĐẦU


....................................................................................................... 1
MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU ......................................................................... 3
NỘI DUNG NGHIÊN CỨU .......................................................................... 4
CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU ............................ 4
1.1.
Tổng
quan
về
spp.........................................................................4
1.1.1.
Giới
thiệu
về
............................................................. 4

nấm

nấm

Cordyceps

Cordyceps

spp.

1.1.2. Quá trình xâm nhiễm của nấm Cordyceps spp. vào cơ thể côn trùng .... 6
1.1.3. Tình hình nghiên cứu chi Cordyceps trên thế giới .................................. 6
1.1.3.1. Đa dạng và phân bố ................................................................................ 6
1.1.3.2. Tình hình nhân nuôi nấm Cordyceps spp. trên thế giới.......................... 8
1.1.4. Tình hình nghiên cứu Cordyceps tại Việt Nam........................................ 9

1.1.4.1. Đa dạng và phân bố ................................................................................ 9
1.1.4.2. Tình hình nhân nuôi nấm Cordyceps spp. ở Việt Nam ......................... 12
1.1.5. Thành phần hóa học, hoạt chất sinh học và giá trị dược liệu của nấm
Cordyceps
.................................................................................................... 13

spp.

1.1.5.1. Thành phần hóa học và hoạt chất sinh học .......................................... 13
1.1.5.2. Giá trị dược liệu của nấm Cordyceps spp. ........................................... 14
1.2.
Sơ
lƣợc
về
Adenosine...........................................................................16

hoạt

chất

1.2.1. Cấu trúc hóa học của Adenosine ............................................................
16
1.2.2.
Ứng
dụng
của
.......................................................................... 16
1.3.
Sơ
lƣợc

về
hoạt
......................................................................17

chất

Adenosine
Beauvericine

1.3.1. Cấu trúc hóa học của Beauvericine ........................................................
17
1.3.2. Ứng dụng của Beauvericine ....................................................................
18
CHƢƠNG II: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ... 20
2.1.
Nguyên
liệu..............................................................................................................20

iii
iiii


2.1.1. Nguyên liệu
.............................................................................................. 20
2.1.2. Hóa chất sử dụng .....................................................................................
20
2.1.3. Thiết bị sử dụng .......................................................................................
21
2.1.4. Môi trường nuôi cấy ................................................................................
21

2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
.....................................................................................22
2.2.1. Phương pháp vi sinh vật ..........................................................................
22
2.2.1.1. Phân lập và thuần khiết vi nấm............................................................. 22
2.2.1.2. Hoạt hóa giống...................................................................................... 22
2.2.1.3. Nghiên cứu khả năng tổng hợp các hoạt chất sinh học trên môi trường lỏng và
môi trường rắn của chủng nấm nghiên cứu ........................................... 23
2.2.2. Phương pháp sinh học phân tử...............................................................
24
2.2.2.1. Tách chiết DNA tổng số ........................................................................ 24
2.2.2.2. Định lượng DNA bằng quang phổ kế.................................................... 26
2.2.2.3. PCR ....................................................................................................... 26
2.2.2.4. Điện di kiểm tra DNA tổng số và sản phẩm PCR ................................. 27
2.2.2.5. Xác định trình tự gen ............................................................................ 27
2.2.3. Phương pháp phân tích hóa lý (HPLC).................................................. 28
2.2.4. Xử lý số liệu
.............................................................................................. 29
CHƢƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................... 30
3.1. Thu thập, phân lập và tuyển chọn chủng nấm
................................................30
3.2. Đánh giá khả năng tạo thể quả của các chủng nấm phân lập.....................33
3.3. Xác định tên khoa học của chủng nấm phân lập bằng trình tự ITS ...........34
3.4. Lựa chọn môi trƣờng thạch thích hợp cho nhân giống ................................36
3.5. Lựa chọn môi trƣờng lỏng thích hợp cho nhân giống...................................38
3.6. Nghiên cứu nhân nuôi sinh khối tạo hoạt chất sinh học
................................40
3.6.1. Nhân nuôi trên môi trường lỏng tĩnh .....................................................
40
3.6.2. Nhân nuôi trên môi trường rắn ..............................................................

42
3.7. Nghiên cứu khả năng tổng hợp Adenosine và Beauvericine trong môi
trƣờng lỏng tĩnh và môi trƣờng
rắn............................................................................44

iv


3.7.1. Kết quả trên hệ thống LC/MS..................................................................
44

v


3.7.1.1. Định lượng Adenosine............................................................................ 44
3.7.1.2. Định lượng Beauvericine ....................................................................... 47
3.7.2. Nghiên cứu khả năng tổng hợp Adenosine và Beauvericine trong môi
trường lỏng tĩnh và môi trường rắn ..................................................................
48
3.7.2.1. Trong môi trường lỏng tĩnh.................................................................... 48
3.7.2.1. Trong môi trường rắn ............................................................................ 49
CHƢƠNG IV: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................... 52
4.1. Kết luận
.....................................................................................................................52
4.2. Kiến nghị
...................................................................................................................52
PHỤ LỤC .................................................................................................... 53
Tài liệu tham khảo ....................................................................................... 54

vi



DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1. Các hóa chất sử dụng ................................................................... 20
Bảng 2.2. Các thiết bị chính được sử dụng trong nghiên cứu ....................... 21
Bảng 2.3. Thành phần các môi trường sử dụng trong nghiên cứu (g/l) ......... 21
Bảng 2.4. Thành phần PCR .......................................................................... 27
Bảng 2.5. Chu trình nhiệt PCR ..................................................................... 27
Bảng 2.6. Gradient nồng độ thiết lập ............................................................ 28
Bảng 3.1. Khả năng tạo thể quả của các chủng nấm đã phân lập .................. 33
Bảng 3.2. Khả năng sinh bào tử của chủng A9 trên các môi trường hoạt hóa lỏng . 39
Bảng 3.3. Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng lên sinh khối lỏng tĩnh ......... 41
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng lên quá trình tạo thể quả .... 42
Bảng 3.5. Các nồng độ Adenosine sử dụng trong xây dựng đường chuẩn định
lượng............................................................................................................ 46
Bảng 3.6. Các nồng độ Beauvericine sử dụng trong xây dựng đường chuẩn
định lượng.................................................................................................... 48
Bảng 3.7. Hàm lượng Adenosine, Beauvericine trong sinh khối lên men lỏng
tĩnh............................................................................................................... 49
Bảng 3.8. Hàm lượng Adenosine và Beauvericine trong sinh khối lên men
rắn................................................................................................................ 50

vi
i


DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1. Nấm C.takaomontana /thể vô tính và hữu tính ............................... 5
Hình 1.2. Nấm Isaria tenuipes / thể vô tính của C.takaomontana .................. 5
Hình 1.3. Nấm Cordyceps crinalis. ................................................................ 7

Hình 1.4. Nấm Cordyceps sinensis (Beck). .................................................... 7
Hình 1.5. Nấm Cordyceps militaris ................................................................ 8
Hình 1.6. Nấm C.nutans............................................................................... 11
Hình 1.7. Nấm C.sphecocephala. ................................................................. 11
Hình 1.8. Nấm Cordyceps prolifca.............................................................. 12
Hình 1.9. Nấm Cordyceps pseudomilitaris. .................................................. 12
Hình 1.10. Cấu trúc hóa học của Adenosine ...................................................... 16
Hình 1.11. Cấu trúc hóa học của Beauvericin .............................................. 17
Hình 3.1. Mẫu VN3...................................................................................... 30
Hình 3.2. Mẫu VN4...................................................................................... 30
Hình 3.3. Mẫu VN6...................................................................................... 30
Hình 3.4. Mẫu VN7...................................................................................... 30
Hình 3.5. Mẫu VN8...................................................................................... 30
Hình 3.6. Mẫu VN9...................................................................................... 30
Hình 3.7. Đĩa khuẩn lạc ria và khuẩn lạc chấm điểm chủng A3 ................... 32
Hình 3.8. Đĩa khuẩn lạc ria và khuẩn lạc chấm điểm chủng A6 ................... 32
Hình 3.9. Đĩa khuẩn lạc ria và khuẩn lạc chấm điểm chủng A7 ................... 32
Hình 3.10. Đĩa khuẩn lạc ria và khuẩn lạc chấm điểm chủng A8 ................. 32
Hình 3.11. Đĩa khuẩn lạc ria và khuẩn lạc chấm điểm chủng A9 ................. 33
Hình 3.12. Ảnh điện di DNA của chủng A9 ................................................. 34
Hình 3.13. Ảnh điện di sản phẩm PCR ......................................................... 35
Hình 3.14. Trình tự ITS của chủng A9 ......................................................... 35
Hình 3.15. Sơ đồ cây phân loại chủng C.takaomontana A9 ......................... 36
Hình 3.16. Bi ểu đồ tốc độ tăng trưởng đường kính khu ẩn lạc của

chủng

C.takaomontana A9 ................................................................................... 37
vii



Hình 3.17. Hình ảnh khuẩn lạc chủng A9 trên các môi trường ..................... 38
Hình 3.18. Hình ảnh bào tử của chủng C.takaomontana A9 dưới kính hiển vi quang
học (độ phóng đại 400 lần) ................................................................ 40
Hình 3.19. Hình ảnh bào tử của chủng C.takaomontana A9 dưới kính hiển vi quang
học (độ phóng đại 400 lần) ................................................................ 40
Hình 3.20. Chủng nấm A9 nuôi lỏng tĩnh trên các môi trường ..................... 42
Hình 3.21. Sinh khối tươi của chủng A9 trên các môi trường....................... 42
Hình 3.22. Chủng C.takaomontana A9 nảy mầm trên các môi trường DD ...... 43
Hình 3.23. Thể quả tươi của chủng A9 trên các môi trường DD .................. 44
Hình 3.24. Sắc kí đồ HPLC UV 260 nm của chất chỉ thị Adenosine (A) và của mẫu (B)
........................................................................................................ 45
Hình 3.25. Sắc kí đồ MS ESI Positive của chất chỉ thị Adenosine ............... 46
H ì n h 3 . 2 6 . S ắ c k í đ ồ S i m 8 0 6 , 0 c ủ a c h ấ t c h ỉ th ị B e a u v e r i c i n e (
A ) v à c ủ a mẫ u ( B ) ...............................................................................................
47
Hình 3.27. Sắc kí đồ MS - ESI Positive của chất chỉ thị Beauvericine .... 48

viii
viiiv


DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT

MT
:

:
Lỏng tĩnh HHL


Môi trường LT
:

Hoạt

hóa lỏng
VN3,4,6,7,8,9

:

A3,6,7,8,9

Các mẫu thu thập tại Việt Nam
:

Các chủng nấm đã phân lập

DD

:

Môi trường dinh dưỡng

OD

:

Opfical Density

PCR


:

Polymerase Chain Reaction

ITS

:

Internal transcribed spacer

HPLC

:

High-performance liquid chromatography

ix


MỞ ĐẦU
Cordyceps spp. là nhóm các loài nấm gây bệnh ở côn trùng, còn được gọi là Đông
trùng Hạ thảo dựa vào đặc điểm sinh trưởng và phát triển của chúng, theo đó mùa đông
nấm ký sinh trên vật chủ ở giai đoạn hệ sợi, mùa hè mọc thành cây nấm.
Cordyceps spp. được biết đến là dược liệu quý sử dụng trong y học cổ truyền
Trung Hoa. Đông trùng hạ thảo có nhiều hoạt chất sinh học có giá trị quý như Adenosine,
Cordycepin, Cordyceptic acid, D manitol, Beauvericin, nhóm hoạt chất HEAA (Hydroxy
Ethyl Adenosine Analogs)… với tác dụng tăng cường miễn dịch, hỗ trợ điều trị ung
thư, điều trị hen suyễn, viêm phế quản, hạn chế khả năng suy thận, tiêu viêm, ức chế
nhiều loại vi sinh vật có hại… Không chỉ được sử dụng trong dược phẩm, Đông Trùng

Hạ thảo còn được dùng làm thực phẩm chức năng hỗ trợ điều trị một số bệnh trong đó
có ung thư và tăng cường sức khỏe.
Trên thị trường Việt Nam hiện đang lưu hành một số sản phẩm Đông trùng Hạ thảo
như Cordyceps sinensis, Cordyceps militaris, Cordyceps takaomontana xuất xứ Hàn Quốc,
Thái Lan, Nhật Bản nhưng đa phần là của Trung Quốc.
Trong thực tế, C.sinensis mới chỉ tìm thấy ở Tây Tạng, việc nghiên cứu nhân nuôi
nhân tạo cho đến nay chưa hiệu quả, sản phẩm vẫn phải khai thác từ tự nhiên nên
giá thành rất cao. C.militaris đã được nghiên cứu nuôi nhân tạo trên nhiều quy mô từ
nhỏ đến lớn ở Trung Quốc, Thái Lan, Nhật Bản, Hàn Quốc… Việt Nam cũng đã tiến
hành nhân nuôi ở quy mô nhỏ, nhưng chưa chủ động được giống, còn phụ thuộc vào
nước ngoài, nên không chủ động và khó kiểm soát được chất lượng của giống cũng như
sản phẩm tạo ra.
Trong khi đó, các nghiên cứu cho thấy, C.takaomontana có gần như đầy đủ các hợp
chất sinh học quý như C.militaris và C.sinensis tuy hàm lượng thấp hơn. Đặc biệt, dẫn
xuất nhóm acetoxyscirpenol chỉ có trong C.takaomontana có tác dụng diệt nhiều
loại tế bào ung thư với giá trị IC50 ở mức mg/ml [20,30], mạnh hơn so với thuốc
chữa ung thư cisplatin từ 4 đến 6,6 lần [36] và

1


Beauvericin với 12 tác dụng gây độc nhiều dòng tế bào ung thư người với các liều gây độc
khác nhau, kháng được 10 loại vi khuẩn gram dương và 9 loại vi khuẩn gram âm gây
bệnh trên người... [42].
Ở Việt Nam, Phạm Quang Thu và cộng sự năm 2009 và 2010 đã phát hiện
C.takaomotana tại vườn Quốc gia Tam Đảo. Ở khu bảo tồn tự nhiên Pù Huống, Nghệ An
cũng thu thập được 29 mẫu, trong đó có C.takaomontana. Trần Ngọc Lân và cộng sự năm
2008 đã xác định được trong hơn 200 mẫu có chi nấm Cordyceps gồm 15 loài, đặc
biệt chi


C.takaomontana

có 11 loài, trong đó Isaria tenuipes (thể vô tính của

C.takaomontana) là loài phổ biến ở vườn Quốc gia Pù Mát [12].
Có thể thấy rằng, nguồn gen nấm C.takaomontana ở Việt Nam rất phong phú, có
thể khai thác nên chủ động được giống. Ngoài ra, thời gian nhân nuôi ngắn, nguồn
nguyên liệu cho nghiên cứu và sản xuất loại nấm này như gạo, nhộng tằm... ở Việt Nam
rất

dồi

dào.

Vì

vậy,

việc

nghiên

cứu

khai

thác, phát

triển nguồn gen nấm


C.takaomontana chứa hoạt chất sinh học quý làm dược liệu có tính khả thi, có ý nghĩa
khoa học và giá trị thực tiễn, góp phần nâng cao sức khỏe cộng đồng, mở ra khả năng
phát triển một số ngành nghề mới, đầy tiềm năng.
Với những lý do như trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Nghiên cứu tuyển
chọn chủng nấm Cordyceps takaomontana từ rừng tự nhiên Việt Nam có khả
năng tổng hợp một số hoạt chất sinh học giá trị”.

2


MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU
Nghiên cứu tuyển chọn được chủng nấm Cordyceps takaomontana từ rừng tự
nhiên Việt Nam có khả năng tổng hợp một số hoạt chất sinh học giá trị.
NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
- Thu thập, mô tả đặc điểm hình thái mẫu nấm, thuần khiết một số chủng nấm
C.takaomontana.
- Nghiên cứu đặc điểm sinh trưởng và phát triển của chủng thuần khiết ( hệ sợi, khả
năng sinh bào tử).
- Nghiên cứu trình tự ITS của chủng nấm C.takaomontana tuyển chọn.
- Nghiên cứu môi trường thạch thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của nấm
C.takaomontana.
- Nghiên cứu môi trường lỏng thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của nấm
C.takaomontana.
- Nghiên cứu khả năng tổng hợp một số hoạt chất sinh học có giá trị

3


CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU NGHIÊN CỨU
1.1. Tổng quan về nấm Cordyceps spp.

1.1.1. Giới thiệu về nấm Cordyceps spp.
Cordyceps spp. (tên gọi khác là Đông trùng Thảo, Trùng thảo hay Hạ thảo Đông
trùng), là các loài nấm ký sinh trên sâu non, nhộng hoặc sâu trưởng thành của một số
loài côn trùng. Vào mùa đông, sâu non, sâu trưởng thành của một số loài nằm dưới đất
hoặc ở trên mặt đất, bị nấm ký sinh côn trùng xâm nhiễm, gây chết và sử dụng các chất
trong cơ thể côn trùng làm nguồn dinh dưỡng để nấm phát triển. Ở giai đoạn này, nhiệt
độ và ẩm độ không khí thấp, nấm ký sinh ở dạng hệ sợi. Đến mùa hè, nhiệt độ và ẩm độ
không khí cao, nấm chuyển giai đoạn, hình thành thể quả và nhú lên khỏi mặt đất nhưng
gốc vẫn dính liền vào thân sâu.
Theo hệ thống phân loại, Cordyceps spp. thuộc chi Cordyceps, họ Clavicipataceae,
bộ Hypocreales, lớp nấm Ascomycotes, ngành Ascomycota [52]. Cordyceps spp. là
loại nấm dược liệu quý và được sử dụng rộng rãi trong y học cổ truyền. Hiện nay,
Cordyceps có hơn

400 loài khác nhau, tính riêng ở Trung Quốc đã tìm thấy khoảng 60

loài Đông Trùng Hạ Thảo như Cordyceps liangshanensis Zhang, Cordyceps gansuensis
Zhang, C. Shanxiensis Liu,… Ngoài
Cordyceps

nutans

ra,

còn

có

các


chủng

Cordyceps

militaris,

Pat, C.tricentri Yasuda, C.gunnii Berk. Tuy nhiên cho đến nay, các

nước trên thế giới, mới chỉ nghiên cứu và đưa vào nuôi trồng nhân tạo một số loại
nấm

như Cordyceps sinensis, Cordyceps militaris, Cordyceps takaomontana,…Theo

một số nghiên cứu cho thấy, các chủng nấm Cordyceps spp. khác cũng được tìm thấy tại
một số nước châu Âu ( Pháp, Nga, Đức), và một số nước Châu Á khác (Nhật Bản, Hàn
Quốc, Thái Lan, Việt Nam).
Cordyceps takaomontana được phát hiện và mô tả lần đầu tiên bởi Yakush. và
Kumaz. (1941) tại đảo Honshu - tỉnh Musashi (nay là quận Saitm và Kanagawa
- Tokyo - Nhật Bản). C.takaomontana tồn tại ở 2 thể hữu tính và vô tính (hình 1.1), còn
được gọi bằng nhiều tên khác là Paecilomyces tenuipes hoặc Isaria japonica [9].

4


Hình 1.1. Nấm C.takaomontana/ thể vô tính và hữu tính
(nguồn: Cordyceps.us)
+ Thể hữu tính: Nấm (stromata) mọc đơn lẻ hoặc mọc thành cụm, chùm trên
nhộng thuộc bộ Cánh vảy, nấm màu vàng chanh nhạt, cuống nấm hình trụ, kích thước 10
- 45 x 1 - 1,5mm. Thể quả dạng chai (perithecia), có hình dạng bình nổi trên bề nặt
của phần chóp nấm. Túi bào tử hình chùy, kích thước 1100 1200 x 2,2 - 3,0µm, phần mũ của túi bào tử có hình trứng đến gần cầu, kích thước

2,5 x 3,0µm. Bào tử túi dài, mảnh và dễ bị gãy thành đoạn bào tử, đoạn bào tử có kích
thước 6 - 8 x 0,5 - 0,8µm [9].
+ Thể vô tính: Hình thái của thể quả nấm (synnemata) bao gồm 2 phần chính:
Cuống nấm và tế bào sinh bào tử vô tính (conidiogenous structure). Cuống của nấm màu
vàng chanh, kích thước rất biến động tùy thuộc vào điều kiện mọc và số lượng thể quả
có trên một ký chủ, thường có chiều dài từ 0,5 đến 4,5cm. Phía trên của cuống nấm
là các tế bào sinh bào tử vô tính được phân thành nhiều nhánh và căng phồng chứa
đầy bào tử bụi màu trắng, khô và rất dễ rời khỏi tế bào sinh bào tử. Bào tử vô tính có
hình hạt đậu, hơi cong ở giữa, có kích thước nhỏ 0,5 - 1,0 x 2,5 - 3,0µm [9] (hình 1.2).

Hình 1.2. Nấm Isaria tenuipes/ thể vô tính của C.takaomontana
(nguồn: Daniel Guez, 1989)

5


1.1.2. Quá trình xâm nhiễm của nấm Cordyceps spp. vào cơ thể côn trùng
Quá trình xâm nhiễm nấm vào côn trùng trải qua 3 giai đoạn:
Giai đoạn xâm nhập: Bắt đầu từ khi bào tử nấm nảy mầm đến lúc kết thúc việc
xâm nhập vào trong cơ thể côn trùng. Bào tử nấm sau khi mọc mầm, phát sinh mầm
bệnh, giải phóng các enzyme ngoại bào tương ứng với các thành phần chính của lớp vỏ
cuticun của côn trùng để phân hủy lớp vỏ này như protease, chitinase,
aminopeptidase, carboxypeptidase A, esterase,

lipase,

cenlulolase. Các enzyme nay được tạo

ra một cách nhanh chóng, liên tục với mức độ khác nhau giữa các loài và ngay cả trong
một loài. Enyzm protease và chitinase hình thành trên cơ thể côn trùng, tham gia phân

hủy lớp da côn trùng và lớp biểu bì (thành phần chính là protein). Quan trọng nhất là
enzyme

phân

hủy protein (protease) và enzyme phân hủy chitin (chitinase) của côn

trùng. Hai enzyme này có liên quan trực tiếp đến hiệu quả diệt côn trùng của nấm ký sinh
côn trùng.
Giai đoạn sống ký sinh của nấm: Hệ sợ nấm trong khoang cơ thể tiếp tục phát
triển, hình thành nhiều sợi nấm ngắn. Khi hệ sợi hình thành trong cơ thể, nó phân tán
khắp nơi, theo dịch máu, phá hủy và làm giảm tốc độ lưu thông máu. Toàn bộ các bộ
phân nội quan bị xâm nhiễm.nấm thường xâm nhiễm vào hệ hô hấp, làm giảm khả năng
hô hấp của ấu trùng khiến hoạt đông của côn trùng trở nên chậm chạp và phản ứng kém
với các tác nhân kích thích bên ngoài. Kết quả làm vật chủ mất khả năng kiếm soát hoạt
động sống và dẫn đến chết [41].
Ở giai đoạn cuối cùng (sau khi vật chủ chết), sợi nấm phát triển rất nhanh đồng
thời tiết độc tố phá hủy hệ thống miễn dịch của côn trùng. Trong giai đoạn gây độc vật
chủ, một số loài nấm giết chết vật chủ trước khi gây độc toàn bộ cơ thể côn trùng [12].
1.1.3. Tình hình nghiên cứu chi Cordyceps trên thế giới
1.1.3.1. Đa dạng và phân bố
Tsuguo Hongo và Masana Izawa (1994) đã mô tả 33 loại nấm Đông Trùng Hạ Thảo
tại Nhật Bản gồm: C.arigota, C.Longissisma, C.yakushimensis, C.sobolifera, C.heteropoda,
C.tricentri, C.coccidiicola, C.nutans, C.ruinosa, C.crilalis, C.militaris, C.takaomontana,
C.neovolkiana,

C.nakazawai,

C.purpureostroma,


6

C.ferruginosa,


C.annullata,

C.clavata,

C.discoideocapitata,

C.atrovirens,

C.spheciceophala,

C.gracilioides,
C.japonensis,

C.stylophora,
C.japonica,

C.macularis,

C.ophioglossoides,

C.capita, C.nigripoda, C.roeostroma, C.michiganensis, C.subbssesilli [54].

Hình 1.3. Nấm Cordyceps crinalis (nguồn: cordyceps.us)
Năm 2000, Mao X.L và cộng sự đã mô tả đặc điểm hình thái, ảnh minh họa và công
dụng cho 13 loài nấm thuộc chi Cordyceps phân bố ở Trung Quốc, gồm các loài

C.hawkesii Gray, Cordyceps barnesii Thwaites, C.nutans Pat, C.capiata (Holmsk; Fk) Link,
C.crassiora Zang, Yang et Li, C.gunii (Berk), C.kyushensis Kobayasi, C.martialis Gray,
C.tubeculata (Leb), C.ophoglossoides (Ehrenb) Link, C.sobolifera (Hill).Berk, C. sinensis
(Beck) Sacc, C.militaris Link [35].

Hình 1.4. Nấm Cordyceps sinensis (Beck) (nguồn: nepl.com.np)
Tại Hàn Quốc, Sung Jae Mo và cộng sự (2000) đã mô tả đặc điểm hình thái của 25
loài nấm thuộc chi Cordyceps gồm các loài: C.adaesanensis, C.agriota Kawamura,
C.bifisispora,

C.crassispora,

C.scarabaeicola,

C.sinensis,

C.discoideocapiata,

C.formicarum, C.gemiculata, C.gracilis, C.heteropoda, C.ishikariensis, C,kyushuensis,
C.yongmoones, C.nutans, C.ochraceostroma, C.ophoglossoides, C.pentatoni, C.pruinosa,
C martialis, C.militaris, C.resea, C.sphecocephala, C.tricentri [50].

7


Hình 1.5. Nấm Cordyceps militaris (nguồn: Daniel Winkler, 2013)
1.1.3.2. Tình hình nhân nuôi nấm Cordyceps spp. trên thế giới
Nghiên cứu nuôi trồng thể quả nấm Cordyceps spp. được tiến hành ở nhiều nước
trên thế giới như Trung Quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản, Mỹ,… Tại Hàn Quốc, một số phòng thí
nghiệm đã sử dụng giá thể là tằm, nhộng để nuôi trồng thể quả [27]. Tại thành phố

Hayward, Bang California, Mỹ, Công ty Công nghệ sinh học BIOKEN đã nuôi trồng quy mô
công nghiệp C.militaris trên giá thể gạo. Sản phẩm của các khu nuôi của các nước được
tiêu thụ tại nội địa và xuất ra nước ngoài.
Tại Trung Quốc, thủ phủ của Đông trùng hạ thảo, hình thành một số khu nuôi
chuyên biệt cho loại nấm Cordyceps tại một số tỉnh như: Thượng Hải, Quảng Châu, Vân
Nam…và cho ra thị trường mỗi năm hàng trăm kilogram sản phẩm.
Năm 2005, Dong và cộng sự tiến hành nghiên cứu thành phần môi trường nhân
giống lỏng tĩnh cho sự phát triển của sợi nấm C.sinensis. Các tác giả đã chỉ ra rằng, điều
kiện môi trường tối ưu để thu được sinh khối sợi nấm cao nhất gồm
5% đường sucrose, 1% peptone và 0.3% cao nấm men. Sau 40 ngày nuôi cấy
trên môi trường tối ưu, sinh khối nấm tươi thu được đạt trên 20 mg/l [21].
Đã có nhiều công trình công bố trên thế giới về lựa chọn môi trường tối ưu cho
nhân giống cấp I nấm Cordyceps spp.. Trong nghiên cứu của mình, Bhushan kết luận
chủng nấm C.militaris được tối ưu trên các môi trường giàu dinh dưỡng như SDAY, SMAY,
CZYA có thể đảm bảo được các yêu cầu về sinh trưởng của sợi nấm. Năm 2013,
Rupesh tiến hành so sánh môi trường SDAY với các môi trường khác nhằm tìm được
môi trường nhân giống tối ưu cho sợi nấm C.sinensis [43]. Kết quả của nghiên cứu chỉ ra
rằng, trong tổng số 6 môi trường nghiên cứu, khuẩn lạc của chủng C.sinensis đạt tốc độ
sinh trưởng lớn nhất trên môi trường SDAY (tốc độ sinh trưởng 3.74mm/ngày). Tác
giả

8


cũng nghiên cứu các mức nhiệt độ và pH khác nhau đối với tốc độ sinh trưởng của nấm
trên môi trường SDAY. Kết quả nghiên cứu khẳng định SDAY có tác dụng hỗ trợ tối đa cho
sự sinh trưởng của sợi nấm C.sinensis [43].
1.1.4. Tình hình nghiên cứu Cordyceps tại Việt Nam
1.1.4.1. Đa dạng và phân bố
Kết quả nghiên cứu của Trịnh Tam Kiệt và cộng sự cho thấy, ở Việt Nam có 3 loài

thuộc chi Cordyceps đó là Cordyceps marialis Speg., Cordyceps sinensis (Berk) Sacc. và
loài C.sobolifera (Hill) Berk & Br. Kết quả nghiên cứu của nhóm tác giả cũng chỉ ra rằng,
có 21 tỉnh của Việt Nam có sự phân bố của nấm Đông trùng Hạ thảo gồm: Lai Châu, Lào
Cai, Yên Bái, Tuyên Quang, Bắc Cạn, Thái Nguyên, Lạng Sơn, Quảng Ninh, Bắc Giang, Hà
Nội, Ninh Bình, Thanh Hóa, Nghệ An, Hà Tĩnh, Đà Nẵng, Quảng Nam, Lâm Đồng, Khánh
Hòa, Ninh Thuận, Bình Thuận, Tây Ninh [15,16].
Năm 2009, Phạm Quang Thu đã phát hiện ở 2 tỉnh Vĩnh Phúc và Bắc Giang có sự
xuất hiện của 2 loài nấm Đông trùng hạ thảo mới, đó là Cordyceps nutants và Cordyceps
gunnii [6,7].
Phạm Thị Thùy (2009) tiến hành thu thập nấm Cordyceps ở vườn quốc gia Cúc
Phương, tỉnh Ninh Bình. Kết quả đã phát hiện được loài Đông trùng Cordyceps militaris loài lần đầu tiên được phát hiện và mô tả ở Việt Nam. Loài nấm này phân bố ở rừng tự
nhiên có độ cao từ 1.900m đến 2.100m so với mực nước biển. Ký chủ của loài này là
nhộng thuộc bộ cánh vẩy Lepidoptera, nấm dài 2 - 6,5cm, hình chùy, phần thân và
cuống nhỏ, phần đầu phình to có chiều rộng đến 0,6cm. Màu sắc của phần cuống nấm và
phần sinh sản khác nhau, phần cuống nấm nhẵn và có màu da cam nhạt, phần sinh sản
có màu da cam đậm và có nhiều mụn nhỏ. Thể quả dạng chai được cắm rất lỏng lẻo hoặc
cắm sâu một phần vào mô của nấm ở phần sinh sản. Túi bào tử có kích thước 300 510µm x 3,50 5µm, phần mũ gắn trên túi thể quả có kích thước 3,50 - 5µm [10].
Năm 2010, nấm Cordyceps takaomontana được phát hiện và ghi nhận lần đầu tiên
tại Việt Nam bởi Phạm Quang Thu và Nguyễn Mạnh Hà. Trong nghiên cứu của mình, các
tác giả đã mô tả đặc điểm hình thái và sự phân bố của nấm

9


C.takaomontana. Kết quả chỉ ra rằng, loài nấm này phân bố ở rừng nhiệt đới lá rộng thường
xanh, ở độ cao từ 800 – 1000m so với mặt nước biển tại Vườn Quốc gia Ba Vì (Hà Nội) và
Vườn Quốc gia Tam Đảo (Vĩnh Phúc). C.takaomontana là loài nấm ưa ẩm, phân bố dọc
theo khe cạn, nấm hình thành quả thể trong điều kiện có ánh sáng tán xạ yếu, độ tàn che
thích hợp từ 0,7 - 0,8. Màu sắc và kích thước của thể quả thay đổi theo độ che phủ của
rừng. Ký chủ của nấm C.takaomontana


là nhộng của côn trùng thuộc bộ cánh vảy

Lepidoptera [9].
Trần Ngọc Lân và cộng sự (2011) đã nghiên cứu đặc điểm sinh học của nấm ký
sinh côn trùng Isaria tenuipes (Peck) Samson ở vườn Quốc gia Pù Mát và khu bảo tồn
thiên nhiên Pù Huống, Nghệ An. Kết quả cho thấy, sinh cảnh sống của I.tenuipes
thường là những nơi ẩm như trong tàn dư thực vật hay lớp đất mặt trong rừng tự nhiên.
Về hình thái synnema, kiểu hình hoa lục bình trắng là phổ biến nhất với tần suất bắt
gặp 52.85%. Tác giả cũng chỉ ra rằng, I.tenuipes sinh trưởng trên môi trường PDA,
khuẩn lạc đạt đường kính lớn nhất
23,66mm sau 10 ngày và độ dày đạt 2,09mm sau 6 ngày. Khuẩn lạc có màu trắng
đến vàng, sau 4 đến 7 ngày xuất hiện bào tử dạng bột, màu trắng [13].
Nguyễn Thị Thúy (2015) đã tiến hành nghiên cứu một số đặc điểm của loài nấm
ký sinh côn trùng Isaria javanica (Frider. & Bally) Samson & Hywel- Jone ở vườn Quốc gia
Pù Mát, Nghệ An. Sau 3 năm khảo sát (từ năm 2011 đến
2013) tại vườn Quốc gia Pù Mát, nhóm tác giả đã thu thập, phân lập và định loại
được 18 chủng nấm Isaria javanica, gồm 6 chủng ký sinh trên sâu non bộ Cánh vảy 8
chủng nấm ký sinh trên sâu trưởng thành bộ Cánh màng và 4 chủng ký sinh trên
sâu trưởng thành bộ Nhện lớn. Mẫu vật được tìm thấy trong tàn dư thực vật chiếm
66.67%, mặt dưới lá cây chiếm 33.33%. Nấm màu trắng sau chuyển sang màu xám
nhạt hoặc xám tro bao phủ một số phần hoặc toàn bộ cơ thể vật chủ. Cuống bào tử
đính dạng đơn hoặc phân nhánh, thể bình có dạng hình trụ, cổ thon dài; lích thước 8,40
– 14,20 x 2,20 – 2,80 μm; bào tử đính hình thoi, đôi khi hình trụ, trơn nhẵn, màu trong
suốt sau chuyển màu kem, khi thành thục có màu xám nhạt đến xám tro, kích thước 4,50
– 7,40 x 1,40 – 1,70 μm.
0
Khuẩn lạc trên môi trường PDA ở 25 C mọc tương đối nhanh, đường kính đạt

10



23,14 mm sau 9 ngày. Bào tử xuất hiện vào ngày thứ 3 sau nuôi cấy, màu trắng sau
chuyển sang màu kem đến xám nhạt hoặc xám tro khi thành thục [5].
Cordyceps nutans: nấm mọc ở phần đầu, ngực và phần cuối bụng bọ xít,
nhưng chủ yếu ở phần đầu và ngực. Ký chủ của nấm là bọ xít vẫn còn nguyên hình dạng
hoặc còn một phần nhưng rất dễ nhận dạng, nằm ngay dưới lớp thảm mục [11].

Hình 1.6. Nấm C.nutans (nguồn: Tô Quang Huyên, 2012)
Cordyceps sphecocephala: Nấm mọc từ phần đốt ngực trước của ký chủ. Nấm ký
sinh trên ong và phân bố ven đường mòn, đường lô trên rừng tự nhiên (độ cao 1200m),
dưới tán rừng cây gỗ lá rộng (thành ngạnh, chẹo, trám, lim, dẻ, gụ, sến). Sợi nấm mọc
nhô lên khỏi lớp lá khô, thảm mục, ký chủ của nấm nằm ngay dưới lớp thảm mục rừng
[11].

Hình 1.7. Nấm C.sphecocephala (nguồn: Tô Quang Huyên, 2012)
Cordyceps elongatostromata: Nấm có màu vàng, thuôn dài, chiều dài 60 130mm, chiều ngang thân nấm từ 1 - 2,50mm. Nấm ký sinh trên ong và được tìm thấy
trong rừng tự nhiên (độ cao từ 900m), độ ẩm cao, độ tàn che chủ yếu từ
0,7-0,8; sinh cảnh gồm: rừng gỗ lá rộng trám, chẹo, ngát. Nấm mọc lên khỏi lớp thảm
mục rừng, nổi trên lớp lá khô, thảm mục [11].

11


Cordyceps prolifca: Nấm dài và mảnh, mọc thành cụm trên ký chủ và trên mỗi
một cây lại phân thành nhiều nhánh nhỏ. Nấm ký sinh trên sâu non vủa ve và được tìm
thấy ven đường mòn, dưới đất xen lẫn với lớp thảm khô trên rừng tự nhiên (đô cao
1000m), dưới tán rừng cây gỗ lá rộng (chẹo, trám, lim, sến, giổi); độ ẩm cao, độ tàn che
0,8. Nấm mọc nhô lên khỏi lớp thảm mục rừng, trong lớp thảm mục [11].


Hình 1.8. Nấm Cordyceps prolifica (nguồn: Tô Quang Huyên, 2012)
Cordyceps pseudomilitaris: Nấm có màu đỏ da cam, phía dưới gốc nấm sát với
ký chủ có màu trắng, xung quanh gốc nấm với ký chủ có một lớp màu trắng (dày khoảng
1-3mm) bao phủ lên ký chủ. Nấm ký sinh trên nhộng, được tìm thấy trong rừng tự nhiên
(độ cao từ 950-1100m), dưới tán rừng hỗn giao cây gỗ lá rộng, xen lẫn nứa, vầu, giàng.
Ký chủ của nấm nămg trong thân nứa, lá mục, một phần thân nấm và thể quả màu đỏ da
cam nối lên khỏi lớp lá khô [11].

Hình 1.9. Nấm Cordyceps pseudomilitaris (nguồn: Tô Quang Huyên, 2012)
1.1.4.2. Tình hình nhân nuôi nấm Cordyceps spp. ở Việt Nam
Năm 2012, Trung tâm Nghiên cứu thực nghiệm Nông Lâm nghiệp Lâm Đồng
đã nghiên cứu nhân nuôi thành công nấm đông trùng hạ thảo tằm dâu (Paeclomyces

12


tenuipes hay Cordyceps takaomontana) chủng Hàn Quốc và chế biến một số sản phẩm
như rượu, viên nang, viên nén.
Lê Văn Vẻ và cộng sự (2015) đã tiến hành nghiên cứu công nghệ nuôi trồng
nhộng trùng thảo (Cordyceps militaris L.ex Fr.) ở Việt Nam. Tác giả tiến hành nuôi trồng
nấm C.militaris trên 4 môi trường MT1, MT2, MT3, MT4, kết quả cho thấy môi trường MT4
là môi trường có năng suất sinh học cao nhất (11.36 ± 1.34%). Kết quả cũng chỉ ra
rằng, trong bốn loại cơ chất nền (3 loại gạo lứt A, B, C và thóc D) được đánh giá với
năng suất sinh học đạt 10,92 ±
1,96%, gạo B được xem là cơ chất nền phù hợp nhất để nuôi trồng C.militaris. Ảnh
hưởng của số lần nuôi cấy đến thoái hóa giống cho thấy F1 vẫn có các tính trạng
tương tự F0, F5 bắt đầu có hiện tượng thoái hóa giống, F8 có các dấu hiệu thoái hóa
giống rõ ràng như màu sắc quả thể thay đổi, mật độ hệ sợi thưa, số mầm quả thể ít và
năng suất sinh học chỉ đạt 0,95 ± 0,14% [1].
1.1.5. Thành phần hóa học, hoạt chất sinh học và giá trị dược liệu của nấm

Cordyceps spp.
1.1.5.1. Thành phần hóa học và hoạt chất sinh học
Các phân tích hoá học cho thấy, trong sinh khối (biomass) của Đông trùng Hạ thảo
chứa 17 loại acid amin khác nhau. Ngoài ra còn có D-mannitol, lipid và nhiều nguyên tố vi
lượng (Al, Si, K, Na...). Quan trọng hơn là trong Đông trùng Hạ thảo có nhiều chất mang
hoạt tính sinh học cao đang được các nhà khoa học dần khám phá ra nhờ các tiến bộ của
ngành hoá học các hợp chất tự nhiên. Nhiều hoạt chất trên được chứng minh là có giá trị
dược liệu thần kỳ. Trong đó phải kể đến cordiceptic acid, cordycepin, adenosine và nhóm
hoạt chất HEAA (Hydroxy - Ethyl - Adenosine - Analogs).
Năm 2007, In - Pyo Hong tiến hành nghiên cứu xác định các hợp chất của chủng
Paecilomyces tenuipes (Peck) Samson. Kết quả cho thấy, các đường hòa tan được tìm
thấy là glycerol, glucose, mannitol, sucrose với hàm lượng 24 mg/g khô. Arginine,
glycine, proline và tyrosine là các axit amin chính được phát hiện. Kết quả nghiên
cứu còn chỉ ra rằng quả thể của P.tenuipes là nguồn cung

13