BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
  

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
CHẨN ĐOÁN Mycoplasma hyopneumoniae
BẰNG KỸ THUẬT PCR VÀ ELISA

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Sinh viên thực hiện: TRẦN VĂN TRƯỜNG
Niên khóa: 2005 – 2009

Tháng 8/2009


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
  

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
CHẨN ĐOÁN Mycoplasma hyopneumoniae
BẰNG KỸ THUẬT PCR VÀ ELISA

Hướng dẫn khoa học:

Sinh viên thực hiện:

TS. NGUYỄN TẤT TOÀN

TRẦN VĂN TRƯỜNG

KS. NGUYỄN MINH NAM

Tháng 8/2009


LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên con xin ghi ơn chân thành nhất tới bố, mẹ đã lam lũ vất vả vì con, động
viên, tiếp sức và là chỗ dựa vững chắc nhất cho con! Xin chân thành cảm ơn hai em
Chiến, Bình và toàn thể đại gia đình, người thân đã động viên an ủi, tiếp thêm nghị lực
để tôi hoàn thành tốt khoá luận tốt nghiệp!
Tôi xin gửi lời chân thành cảm ơn đến:
Ban Giám hiệu trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, Ban Chủ
nhiệm Bộ môn Công nghệ Sinh học, cùng toàn thể Quý Thầy Cô đã tận tâm tạo điều
kiện thuận lợi nhất và truyền đạt kiến thức trong suốt quá trình học tập tại trường cũng
như thực hiện khoá luận!
TS. Nguyễn Tất Toàn và KS. Nguyễn Minh Nam đã hết lòng hướng dẫn, động
viên em trong suốt quá trình thực hiện khoá luận tốt nghiệp!
BSTY. Đỗ Tiến Duy và BSTY. Lâm Thị Tú Anh đã nhiệt tình giúp đỡ em hoàn
thành khoá luận!
Các anh chị cán bộ Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hoá Sinh trường Đại học
Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh; các anh chị và các bạn cùng thực tập đã tạo mọi điều
kiện và giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập tại trung tâm!
Các bạn Nguyễn Ngọc Hoa Xuân, Lương Văn Pháp, Lương Thị Hoài; chủ trại
heo Tuyết Trung và các anh chị công nhân đã nhiệt tình giúp đỡ tôi hoàn thành khoá
luận này!
Tập thể lớp DH05SH đã quan tâm, giúp đỡ, động viên, chia sẻ những buồn vui
cùng tôi trong suốt quá trình học tập cũng như thực hiện khoá luận!
Xin chân thành cảm ơn!

TRẦN VĂN TRƯỜNG

iii


TÓM TẮT
Mycoplasma hyopneumoniae gây bệnh viêm phổi mãn tính trên đường hô hấp của
heo và là một trong những loại bệnh phổ biến nhất có mặt ở hầu hết các đàn heo. Vi
khuẩn này là một mối quan tâm của ngành công nghiệp chăn nuôi vì gây thiệt hại
kinh tế rất lớn và là nguyên nhân gây nhiễm các bệnh kế phát nguy hiểm khác như:
Pasteurella multocida, Streptococcus, Staphylococcus, Bordetella bronchiseptica,
Actinomyces pyogenes và Salmonella. Heo con dễ bị cảm nhiễm với Mycoplasma
hyopneumoniae nhưng ít được nghiên cứu trong thực tế thú y hiện nay. Có nhiều kỹ
thuật để chẩn đoán nhưng kỹ thuật PCR và ELISA được sử dụng phổ biến hơn cả do
hai kỹ thuật này cho kết quả nhanh chóng, chính xác và đặc hiệu trong việc phát hiện
Mycoplasma hyopneumoniae.
Đề tài: “Chẩn đoán Mycoplasma hyopneumoniae (MH) bằng kỹ thuật PCR và
ELISA” được thực hiện từ tháng 2 năm 2009 đến tháng 7 năm 2009 tại trại heo công
nghiệp ở Đồng Nai và Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường thuộc
Trường Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh. Đề tài nhằm mục đích ứng dụng các kỹ
thuật chẩn đoán PCR và ELISA trên các loại mẫu bệnh phẩm khác nhau để phát hiện
bệnh do Mycoplasma hyopneumoniae hiệu quả nhất đối với mỗi loại mẫu bệnh phẩm.
Qua thực hiện kỹ thuật PCR để chẩn đoán tỷ lệ nhiễm trên 3 loại mẫu là mẫu dịch
hầu họng (dich mũi) trên heo con từ sơ sinh đến 60 ngày tuổi, mẫu phổi trên heo thịt
nghi ngờ nhiễm Mycoplasma hyopneumoniae, mẫu canh nuôi cấy phân lập từ mẫu
phổi nghi ngờ nhiễm Mycoplasma hyopneumoniae trên môi trường thạch Friis, kết quả
PCR cho thấy 100% mẫu dịch hầu họng (dịch mũi) âm tính, 12,5% mẫu phổi dương
tính, 80% mẫu canh nuôi cấy phân lập từ phổi trên môi trường thạch Friis dương tính
với Mycoplasma hyopneumoniae.
Trong nghiên cứu này, thực hiện kỹ thuật ELISA để phát hiện kháng thể chống

Mycoplasma hyopneumoniae, kết quả ELISA cho 10,53% mẫu huyết thanh dương tính.
Tối ưu hóa quy trình PCR và ELISA chúng tôi xác định được một số yếu tố ảnh
hưởng đến kết quả thí nghiệm, sau đó, chúng tôi đã khuyến cáo những quy trình chẩn
đoán thích hợp cho việc phát hiện Mycoplasma hyopneumoniae.

iv


SUMMARY
Mycoplasma hyopneumoniae is a species of bacteria known to cause the disease
Porcine Enzootic Pneumonia, a highly contagious and chronic disease affecting pigs
which is endemic worldwide and M. hyopneumoniae is present in almost every pig
herd. This bacterium is a concern in the livestock industry as it causes a significant
reduction in the growing weight of pigs and other infections dangerous disease like:
Pasteurella multocida, Streptococcus, Staphylococcus, Bordetella bronchiseptica,
Actinomyces pyogenes và Salmonella. There are many technologies to diagnosis
Mycoplasma hyopneumoniae but PCR and ELISA is the most population because it
makes result specificial and exactly.
The thesis entitled “Diagnosis of Mycoplasma hyopneumoniae by PCR and
ELISA”. This research was carried out from February to July, 2009 at the pig farms in
Dong Nai province and laboratory of Chemical and Biological Analysis and
Experiment Center, Nong Lam University, Ho Chi Minh City.
The aim of this study was to apply the methods of diagnosis such as PCR and
ELISA on many kinds of sample to detect MH infection in pig effectively.
By PCR method, the results showed that 100% nasal swabs sample were negative,
12,5% lung tissue sample were positive and 80% Friis isolated – broth were positive.
In this study, 10,53% serum samples were positive for MH.
To optimize the PCR and ELISA procedure, we determined some factors to affect
on the experimental results, then, we suggested the suitable procedures.


v


MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................... iii
TÓM TẮT ......................................................................................................................iv
SUMMARY ....................................................................................................................v
MỤC LỤC......................................................................................................................vi
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT...........................................................................ix
DANH SÁCH CÁC BẢNG ............................................................................................x
DANH SÁCH CÁC HÌNH..............................................................................................x
1.1. Đặt vấn đề.................................................................................................................1
1.2. Mục đích và yêu cầu.................................................................................................2
1.2.1. Mục đích................................................................................................................2
1.2.2. Yêu cầu..................................................................................................................2
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU...............................................................................3
2.1. Tổng quan về bệnh do Mycoplasma hyopneumoniae gây ra trên heo .....................3
2.1.1. Lịch sử bệnh ..........................................................................................................3
2.1.2. Các đặc điểm của Mycoplasma hyopneumoniae...................................................3
2.1.3. Dịch tễ học.............................................................................................................4
2.1.4. Cơ chế sinh bệnh ...................................................................................................4
2.1.5. Triệu chứng ...........................................................................................................5
2.1.5.1. Thể mãn tính.......................................................................................................5
2.1.5.2. Thể mang trùng ..................................................................................................5
2.1.5.3. Thể viêm phổi phức hợp.....................................................................................6
2.1.6. Bệnh tích................................................................................................................6
2.1.7. Thiệt hại do MH gây ra .........................................................................................7
2.1.8. Phòng bệnh và điều trị...........................................................................................8
2.1.8.1. Phòng bệnh .........................................................................................................8

2.1.8.2. Điều trị................................................................................................................8
2.2. Chẩn đoán MH .........................................................................................................8
2.2.1. Chẩn đoán lâm sàng ..............................................................................................9

vi


2.2.2. Chẩn đoán huyết thanh học ...................................................................................9
2.2.3. Chẩn đoán bằng việc nuôi cấy phân lập................................................................9
2.2.4. Chẩn đoán bằng kỹ thuật PCR ............................................................................10
2.3. Sơ lược về các phương pháp chẩn đoán sử dụng trong nghiên cứu.......................10
2.3.1. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)...............................................10
2.3.1.1. Giới thiệu sơ lược về PCR................................................................................10
2.3.1.2. Thành phần phản ứng PCR ..............................................................................11
2.3.1.3. Ưu, nhược điểm của kỹ thuật PCR...................................................................11
2.3.2. Quy trình ly trích DNA .......................................................................................12
2.3.3. Phương pháp điện di trên gel...............................................................................13
2.3.4. Phương pháp ELISA (Enzyme - Linked Immunosorbent Assay).......................13
2.3.4.1. Nguyên lý phản ứng ELISA.............................................................................13
2.3.4.2.Phản ứng ELISA gián tiếp.................................................................................14
2.4. Một số nghiên cứu trong và ngoài nước về MH ....................................................14
2.4.1. Nghiên cứu trong nước........................................................................................14
2.4.2. Nghiên cứu ngoài nước .......................................................................................16
Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......................................17
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu..........................................................................17
3.2. Đối tượng khảo sát .................................................................................................17
3.3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................................2
3.4. Vật liệu ...................................................................................................................17
3.4.1. Dụng cụ thu thập mẫu .........................................................................................17
3.4.2. Dụng cụ và vật liệu xử lý mẫu ............................................................................17

3.4.3. Hóa chất thí nghiệm ............................................................................................17
3.4.4. Trang thiết bị thí nghiệm .....................................................................................18
3.5. Phương pháp nghiên cứu........................................................................................18
3.5.1. Cách lấy mẫu xét nghiệm đối với các loại mẫu bệnh phẩm xét nghiệm.............18
3.5.1.1. Dịch mũi và dịch hầu họng ..............................................................................18
3.5.1.2. Mẫu bệnh phẩm phổi........................................................................................19
3.5.1.3. Mẫu canh nuôi cấy ...........................................................................................20
3.5.2. So sánh quy trình ly trích DNA các loại mẫu bệnh phẩm nghi ngờ nhiễm MH .20
3.5.2.1. Xử lý mẫu .........................................................................................................20

vii


3.5.2.2. Quy trình ly trích DNA ....................................................................................20
3.5.2.3. Kiểm tra hiệu quả ly trích DNA .......................................................................21
3.5.3. Thực hiện phản ứng PCR để phát hiện MH ........................................................22
3.5.4. Xác định tỉ lệ huyết thanh dương tính đối với MH bằng bộ kít ELISA..............22
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .....................................................................26
4.1. So sánh quy trình ly trích DNA các loại mẫu bệnh phẩm nghi ngờ nhiễm MH....26
4.2. Kết quả xác định MH bằng kỹ thuật PCR..............................................................28
4.2.1. Kết quả xác định MH trên dịch mũi bằng kỹ thuật PCR ....................................28
4.2.2.Kết quả PCR đối với mẫu canh nuôi cấy từ phổi nghi ngờ nhiễm MH ...............30
4.2.3. Kết quả chẩn đoán MH trên mẫu phổi bằng kỹ thuật PCR.................................32
4.3. Kết quả xác định tỷ lệ huyết thanh dương tính đối với MH bằng kỹ thuật ELISA33
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..........................................................................35
5.1. Kết luận ..................................................................................................................35
5.2. Đề nghị ...................................................................................................................35
TÀI LIỆU THAM KHẢO.............................................................................................36
PHỤ LỤC


viii


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
BHI:Brain Heart Infusion
bp: base pair
CWDS: CHEKIT – Washing – Dilution solution
CTAB: Cetyltrimethylammonium bromide
Ctv: cộng tác viên
dNTP: deoxyribonucleotide – 5 – triphosphate
EDTA: Ethylene Diamine Tetracetic Acid
ELISA: Enzyme - Linked Immunosorbent Assay
Kb: kilo base
MH: Mycoplasma hyopneumoniae
µm: micromol
µM: micromol/lít
µg: microgram
ng: nanogam
Nu: nucleotide
OD: optical density
PBS: Phosphate Buffered Saline
PCR: Polymerase Chain Reaction
pM: picomol/lít
PPLO: pleuropneumonia-like microorganism
SDS: Sodium dodecyl sulphate
TBE: Tris borate EDTA
Taq: Thermus aquaticus
TE: tris EDTA
Tm: melting temperature
TP.HCM: Thành phố Hồ CHí Minh

UI: unit international
UV: Ultraviolet

ix


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 3.1 Phân bố cách lấy mẫu dịch mũi và hầu họng ...............Error! Bookmark not
defined.18
Bảng 3.2 Chỉ tiêu theo dõi kết quả ELISA ...................................................................25
Bảng 4.1 Kết quả xác định MH từ mẫu khuẩn lạc nghi ngờ bằng kỹ thuật PCR .........30
Bảng 4.2 Kết quả chẩn đoán PCR trên mẫu phổi .........................................................32
Bảng 4.3 Kết quả chẩn đoán MH bằng kỹ thuật ELISA ..............................................34

DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 2.1 Heo con bị bệnh thở khó và ho........................................................................5
Hình 2.2 Heo bị bệnh lười vận động và thường nằm chụm vào nhau............................6
Hình 2.3 Bệnh tích trên phổi heo....................................................................................7
Hình 2.4 Bệnh tích nhục hóa đối xứng và viêm phổi dày đặc, cứng, nhạt màu.............7
Hình 2.5 Kỹ thuật ELISA gián tiếp ..............................................................................14
Hình 4.1 Kết quả điện di DNA tổng số các mẫu dịch mũi...........................................27
Hình 4.2 Kết quả điện di DNA tổng số mẫu phổi. .......................................................27
Hình 4.3 Kết quả điện di DNA tổng số các mẫu ..........................................................28
Hình 4.4 Kết quả điện di trên gel agarose sản phẩm PCR ...........................................31
Biểu đồ 4.1 Tỷ lệ MH trên môi trường thạch Friis.......................................................31
Biểu đồ 4.2 Tỷ lệ mẫu phổi phát hiện bằng kỹ thuật PCR ...........................................33

x



Chương 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Bệnh viêm phổi địa phương do Mycoplasma hyopneumoniae (MH) gây ra
nhiễm bệnh mãn tính trên đường hô hấp của heo. Và là một trong những loại bệnh
phổ biến nhất có mặt ở hầu hết các đàn heo. Vi khuẩn này là một mối quan tâm của
ngành công nghiệp chăn nuôi vì nó là nguyên nhân làm giảm tăng trọng đáng kể ở
heo từ 12 – 15% tốc độ tăng trưởng. Ở Mỹ nhiều tài liệu công bố trên 90% các trại
heo có bệnh viêm phổi do Mycoplasma và gây thiệt hại ước tính từ 200 triệu đến 1 tỷ
USD/ năm ( Bệnh làm
tăng tỷ lệ loại thải, giảm chỉ số chuyển hóa thức ăn, và tạo tiền đề cho sự kế phát các
vi sinh vật gây bệnh nguy hiểm khác như: Pasteurella multocida, Streptococcus,
Staphylococcus, Bordetella bronchiseptica, Actinomyces pyogenes và Salmonella…
(Nguyễn Ngọc Nhiên, 1996).
Heo con dễ bị cảm nhiễm với bệnh do Mycoplasma hyopneumoniae do nái truyền
sang con hoặc do sống chung đàn với heo bị nhiễm MH. Bệnh do MH là bệnh mãn tính
có thời gian ủ bệnh lâu khoảng 2 tuần, bệnh được ghi nhận vào 2 tuần tuổi nhưng lan
truyền rất chậm nên nhiều heo không có triệu chứng cho đến khi 3 – 6 tuần tuổi
(Holmgren, 1974; trích dẫn bởi Đặng Thị Thu Hường, 2005). Theo Trần Thị Dân và ctv
(2003), lượng kháng thể mẹ truyền cho heo con giảm dần khi heo được 21 ngày tuổi cho
đến 43 ngày tuổi thì hết hoàn toàn. Khi heo bắt đầu giai đoạn nuôi thịt (khoảng 60 – 65
ngày tuổi), giai đoạn quan trọng nhất của sự tăng trọng lượng cơ thể, lượng kháng thể
heo mẹ truyền giảm thấp nhất là lúc triệu chứng bệnh được biểu hiện rõ.
Việc phân lập MH tuy cho kết quả tin cậy hơn nhưng MH cần môi trường chuyên
biệt, đòi hỏi kỹ thuật phức tạp, khó mọc, mọc chậm, dễ bị vấy nhiễm, đặc biệt rất tốn
kém và hiện nay vẫn là một thách thức lớn cho Việt Nam. Chẩn đoán bằng kỹ thuật
PCR và ELISA cho kết quả nhanh chóng và chính xác; rất đặc hiệu cho việc phát hiện
MH; ít tốn kém, phù hợp với điều kiện nghiên cứu và ứng dụng ở nước ta. Các nghiên
cứu trước đây chủ yếu trên đối tượng heo đã trưởng thành và xác định thông qua bệnh
tích trên phổi của những heo được giết mổ (heo đã bị nhiễm bệnh). Tuy nhiên việc


1


chẩn đoán MH từ bệnh phẩm dịch hầu họng (dịch mũi) ít được nghiên cứu trong thực
tế thú y. Xuất phát từ thực tiễn đó chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Chẩn đoán
Mycoplasma hyopneumoniae bằng kỹ thuật PCR và ELISA”.
1.2. Mục đích và yêu cầu
1.2.1. Mục đích
Áp dụng kỹ thuật PCR và ELISA để chẩn đoán Mycoplasma hyopneumoniae, từ
đó khuyến cáo phương pháp chẩn đoán hiệu quả nhất trong việc phát hiện bệnh do
Mycoplasma hyopneumoniae gây ra.
1.2.2. Yêu cầu
Thu thập các loại mẫu bệnh phẩm nghi ngờ do MH gây ra bao gồm: mẫu dịch hầu
họng (dịch mũi) trên heo con từ sơ sinh đến 60 ngày tuổi, mẫu phổi trên heo thịt được giết
mổ, mẫu canh nuôi cấy phân lập từ phổi nghi ngờ nhiễm MH trên môi trường thạch Friis.
Ly trích DNA các loại mẫu đã thu thập được
Tiến hành phản ứng PCR để phát hiện Mycoplasma hyopneumoniae
Thực hiện phản ứng ELISA phát hiện kháng thể chống Mycoplasma hyopneumoniae
1.2.3. Nội dung nghiên cứu
- So sánh quy trình ly trích DNA các loại mẫu bệnh phẩm nghi ngờ nhiễm
Mycoplasma hyopneumoniae
- Xác định Mycoplasma hyopneumoniae bằng kỹ thuật PCR
- Xác định tỉ lệ huyết thanh dương tính đối với Mycoplasma hyopneumoniae
bằng quy trình ELISA

2


Chương 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Tổng quan về bệnh do Mycoplasma hyopneumoniae gây ra trên heo
Bệnh viêm phổi do Mycoplasma, còn gọi là bệnh suyễn heo do vi khuẩn
Mycoplasma hyopneumoniae (MH) gây ra. Đặc điểm của bệnh là ho kéo dài nhiều
tuần, heo chậm lớn, sức kháng bệnh yếu. Nếu kết hợp với các vi trùng gây viêm phổi
khác sẽ tạo nên tình trạng viêm phổi nặng với triệu chứng sốt cao, ho nhiều, khó thở.
Mycoplasma được coi là nguồn gốc gây viêm đường hô hấp trên heo ở nước ta và các
nước trên thế giới.
2.1.1. Lịch sử bệnh
Bệnh được phát hiện đầu tiên hiện thế giới vào năm 1907 và sau đó lan tràn
nhanh. Hiện nay, bệnh hầu như xuất hiện khắp nơi. Năm 1933, Kobe (người Đức) phát
hiện bệnh viêm phổi mãn tính trên heo và ông gọi là bệnh cúm heo. Nghiên cứu của
Pullar (1948), Gulrajani và Beveridge (1951) đã mô tả đặc điểm của bệnh viêm phổi
địa phương và phân biệt với bệnh cúm heo. Sau đó bệnh xuất hiện ở khắp các nước
như Mỹ, Pháp, Thụy Sĩ, Hungari, Bỉ, Phần Lan, Trung Quốc, Nhật Bản và châu Phi
(trích dẫn bởi Đỗ Tiến Duy, 2005).
Mare và Switzer (1965) đã phân lập một loài Mycoplasma trên phổi heo bị viêm
qua việc quan sát được sự hình thành khuẩn lạc trên môi trường nuôi cấy đặc biệt. Các
tác giả này cũng thành công trong việc gây bệnh trên thú thí nghiệm. Từ đó các tác giả
đặt tên cho loài Mycoplasma này là Mycoplasma hyopneumoniae.
Ở Việt Nam, bệnh được phát hiện vào những năm 1957 từ đàn heo ngoại nhập
vào miền Bắc, sau đó lan tràn nhanh, tuy nhiên vào thời điểm đó chưa xác định được
nguyên nhân gây bệnh.
2.1.2. Các đặc điểm của Mycoplasma hyopneumoniae
Mycoplasma hyopneumoniae thuộc bộ Mycoplasmatales, họ Mycoplasmataceae,
giống Mycoplasma. Kích thước khá nhỏ bằng khoảng 1/5 vi trùng (400 – 1200nm, bộ
gene khoảng 893 – 920 kb (Tajima và Yagihashi, 1982). Tế bào vi khuẩn không có
vách chỉ có một lớp màng rất linh động, đây là đặc điểm gây nhiều khó khăn trong sản

3



xuất vaccin. Vi khuẩn sống ký sinh ngoại bào lẫn nội bào, thuộc loại Gram âm, tuy
nhiên không thể quan sát dưới kính hiển vi quang học.
Sức đề kháng: MH bị bất hoạt sau 48 giờ trong điều kiện khô, nhưng có thể tồn tại
đến 17 ngày trong môi trường nước mưa ở nhiệt độ 2 – 7oC. Trong phổi tồn tại 2 tháng ở
âm 25oC và từ 9 - 11 ngày ở nhiệt độ l – 6oC và chỉ 3 - 7 ngày ở nhiệt độ 17 – 25oC.
2.1.3. Dịch tễ học
Bệnh chủ yếu lây qua đường không khí qua các con đường sau:
Tiếp xúc trực tiếp giữa mẹ và heo con (mũi và mũi) thường heo mẹ là những thú
mang trùng (carrier swine) mầm bệnh khu trú trong đường hô hấp, dễ dàng truyền lây
sang heo con. Trên heo nuôi thịt, sự lây lan bệnh xảy ra trong đàn có heo mắc bệnh,
sau cơn ho có rất nhiều hạt nhỏ, chất tiết lơ lửng trong không khí, heo khỏe mạnh hít
phải sẽ mắc bệnh (Robert, 2003; trích dẫn bởi Đặng Thị Thu Hường, 2005).
Mầm bệnh có thể phát tán qua không khí với đường kính lên đến 3 - 3,5 km. Đây
là lý do chính gây nên sự nhiễm bệnh từ trại có bệnh sang trại chưa có bệnh. Bệnh do
MH được xem là một bệnh có thời gian ủ bệnh khá dài (2 tuần) và sự truyền lây khá
chậm. Tuy nhiên tỉ lệ nhiễm sẽ tăng theo độ tuổi. Khi được 20 tuần tuổi tỉ lệ nhiễm
bệnh có thể lên tới 100% (Robert, 2003; trích dẫn bởi Đặng Thị Thu Hường, 2005).
2.1.4. Cơ chế sinh bệnh
Sau khi theo đường hô hấp vào trong phế quản và tiểu phế quản, Mycoplasma
hyopneumoniae bám lên tế bào lông rung nhờ vào protein 97 kDa, xâm lấn bề mặt tế
bào biểu mô của lông rung (không xâm lấn vào tế bào chất) và phế nang làm phá hỏng
hệ thống tiết dịch nhày, hư hại lông rung và biểu mô đường hô hấp. Kwon và ctv
(2002) cho biết khi đã tìm thấy sự hiện diện của MH ở bề mặt tế bào biểu mô (kể từ
ngày thứ 7 sau khi gây bệnh), phế nang và đại thực bào (kể từ ngày thứ 14 sau khi gây
bệnh). Chính những tổn thương ở hệ thống lông rung và biểu mô tạo điều kiện cho sự
kế phát các vi sinh vật khác. Sau đó MH phân tán độc tố làm ức chế đại thực bào ở phế
nang (Robert, 2003; trích dẫn bởi Đặng Thị Thu Hường, 2005). Độc tố còn tác động
lên hệ thống miễn dịch đưa đến sự tăng sinh hạch bạch huyết quanh phế quản và tiểu

phế quản. Tuy nhiên không có bằng chứng cho thấy sự xâm nhập của MH vào các tế
bào lympho quanh tiểu phế quản (Kwon và ctv, 2002).
MH chỉ gây những tổn thương nhỏ và những biểu hiện cận lâm sàng khi nhiễm
đơn độc nhưng khi kế phát các bệnh đường hô hấp khác triệu chứng và biểu hiện của

4


bệnh kế phát sẽ trở lên trầm trọng hơn. Theo Amass và ctv (1994), khi nhiễm MH heo
con sẽ trở lên nhạy cảm hơn với sự tấn công của Pasteurella multocida. Heo nhiễm kế
phát virus PRRS (Porcine reproductive and respiratory syndrome) gây hội chứng rối
loạn hô hấp và sinh sản trên heo sau khi nhiễm nguyên phát MH thì tổn thương ở phổi
sẽ trầm trọng hơn so với heo nhiễm nguyên phát virus PRRS (Thacker và ctv, 1999).
Yazawa và ctv (2004) cho biết tổn thương ở phổi của heo nhiễm MH và virus cúm heo
sẽ trầm trọng hơn so với heo chỉ nhiễm MH (trích dẫn bởi Marois, 2007).
2.1.5. Triệu chứng
Thời kỳ nung bệnh thay đổi từ l - 2 hoặc 3 tuần, trung bình từ 10 - 16 ngày trong
thiên nhiên, 5 - 12 ngày trong phòng thí nghiệm với 3 thể bệnh sau đây:
2.1.5.1. Thể mãn tính
Là thể bệnh chủ yếu, thường xuất hiện trên heo nuôi thịt. Triệu chứng chính là ho
nhiều, với đặc điểm là ho khan, kéo dài trong nhiều tuần, không thấy có dấu hiệu chảy
nước mũi và sốt. Thú tăng trọng hơi chậm, tăng chỉ số biến chuyển thức ăn. Thể mãn
tính ít gây các triệu chứng điển hình do đó ít được các nhà chăn nuôi lưu ý, tuy nhiên
thể bệnh này gây thiệt hại kinh tế lớn nhất do heo chậm lớn và tiêu tốn thức ăn cao.
2.1.5.2. Thể mang trùng

Hình 2.1 Heo con bị bệnh thở khó và ho khi vận động nhiều.
( />id=269&detail=16&ucat=42).
Thường xảy ra trên heo giống (heo nái, heo nọc) hoặc heo nuôi thịt có thời gian
nuôi trên 6 tháng tuổi. Nguyên nhân dẫn đến tình trạng mang trùng là do giai đoạn


5


nuôi hậu bị các heo này đã nhiễm bệnh thể mãn tính. Khi heo lớn dần, vai trò gây bệnh
của Mycoplasma cũng giảm bớt, từ đó dẫn đến hiện tượng mang trùng.

Hình 2.2 Heo bị bệnh lười vận động và thường nằm chụm vào nhau.
(Trại chăn nuôi heo công nghiệp tại tỉnh Đồng Nai).
Hiện tượng mang trùng trên heo có thể kéo dài rất lâu: từ nhiều tháng đến nhiều
năm (Goodwin, 1973) và là nguồn bệnh chính lây lan giữa nọc – nái hoặc giữa heo nái
với heo con. Trên lâm sàng không thấy rõ các triệu chứng, thỉnh thoảng có những cơn
ho nhẹ, thành tích sinh sản có xu hướng giảm thấp, tốc độ tăng trọng giảm thấp đến 15%.
2.1.5.3. Thể viêm phổi phức hợp
Thường xảy ra trên heo con giai đoạn sau cai sữa, sau khi đã nhiễm Mycoplasma
vài tuần và điều kiện nuôi dưỡng không tốt, các vi khuẩn khác trong đường hô hấp
phát triển gây phụ nhiễm làm trầm trọng thêm tình trạng viêm phổi với các triệu
chứng: ho nhiều, thở nhanh, rất khó thở sau cơn ho, bệnh tiến triển trong 2 - 3 tuần thì
giảm dần, tỉ lệ chết thấp nhưng tốc độ tăng trưởng rất chậm. Nếu cảm nhiễm nặng heo
sẽ sốt cao, bỏ ăn, rất khó thở, tỉ lệ chết khoảng 20 – 25%. Các heo được chữa khỏi
thường bị còi, bệnh tích viêm phổi tồn tại đến lúc giết mổ.
2.1.6. Bệnh tích
Kwon và ctv (2002) mô tả bệnh tích đại thể trên heo bệnh viêm phổi địa phương
gồm những vùng rắn chắc màu đỏ sậm đến tím. Bệnh tích thường xuất hiện ở vùng
trung gian của thùy giữa và thùy đỉnh, thùy phụ và phần đỉnh của thùy hoành cách mô.
Các vùng tổn thương có ranh giới rất rõ với các vùng khác (Robert, 2003; trích dẫn bởi
Đặng Thị Thu Hường, 2005). Trên những heo khác nhau mức độ và phạm vi tổn

6



thương ở phổi cũng khác nhau. Dịch nhày trắng được tìm thấy ở khí quản, phế quản và
tiểu phế quản, hạch lympho quanh phế quản, tiểu phế quản và quanh mạch máu triển dưỡng.

Hình 2.3 Bệnh tích trên phổi heo. (a) Phổi heo thịt; (b) Phổi heo con.

(Trại chăn nuôi heo công nghiệp tại tỉnh Đồng Nai).

Hình 2.4 Bệnh tích nhục hóa đối xứng và viêm phổi dày đặc, cứng, nhạt màu.
(a) Viêm phổi đối xứng; (b)Viêm phổi dày đặc, cứng, nhạt màu.

( />Khảo sát bệnh tích vi thể trên heo viêm phổi địa phương cho thấy một lượng lớn
bạch cầu đơn nhân, bạch cầu đa nhân và dịch phù tích trong phế nang và đường thở
(Kwon và ctv, 2002). Có sự xâm nhiễm tế bào lympho các tiểu động mạch và tiểu tĩnh
mạch (Whilestone, 1972; trích dẫn bởi Đặng Thị Thu Hường, 2005).
2.1.7. Thiệt hại do MH gây ra
Do tỉ lệ mắc bệnh quá cao trong đàn với nhiều thể bệnh khác nhau, đặc biệt phổ
biến là thể mãn tính. Ở Mỹ nhiều tài liệu công bố trên 90% các trại chăn nuôi có bệnh

7


viêm phổi do Mycoplasma, tại các trại này có trên 30% heo nhiễm bệnh thể mãn tính,
do ở thể này người chăn nuôi ít quan tâm đến việc phòng trị.
MH gây thiệt hại kinh tế rất lớn do:
Tăng chỉ số chuyển hóa thức ăn khoảng 10% (Muirhead, 1989; trích dẫn bởi
Desrosiers, 2001). Trên nhiều đàn heo nhiễm bệnh chỉ số chuyển hóa thức ăn thực tế
lên đến 3 so với đàn heo khỏe mạnh chỉ có 2,4 – 2,6.
Giảm tốc độ tăng trọng từ 12 – 15% (Pointon và ctv, 1985). Qua các tính toán về
mối tương quan giữa các bệnh tích trên phổi với tăng trọng ngày, nhiều tài liệu công

bố cứ bệnh tích phổi tăng lên 10% thì tăng trọng ngày giảm xuống 37,3 gam. Điều này
làm kéo dài thời gian nuôi thịt hơn gần một tháng gây tốn kém tiền thuốc điều trị.
2.1.8. Phòng bệnh và điều trị
2.1.8.1. Phòng bệnh
Hiệu quả của các biện pháp phòng bệnh viêm phổi do Mycoplasma phụ thuộc rất
nhiều vào các biện pháp quản lý đàn heo. Cần phải tạo được môi trường thuận lợi cho
đàn heo như không khí sạch sẽ, thông gíó thường xuyên, nhiệt độ ấm áp và mật độ heo
trong chuồng vừa phải. Trong dãy chuồng không nên nuôi lẫn lộn các đàn heo có lứa
tuổi cách nhau quá 3 tuần.
Ở các trại heo cung cấp giống, để xây dựng đàn heo không nhiễm Mycoplasma
cần sử dụng kháng sinh liên tục cho con nái từ giai đoạn cuối quá trình mang thai cho
đến khi cai sữa. Cai sữa sớm và nuôi cách ly những đàn con này trong điều kiện vệ
sinh và nuôi dưỡng tốt. Trong quá trình nuôi cho đến khi trưởng thành phải kiểm tra
thường xuyên bằng cách mổ khám kiểm tra bệnh tích phổi hoặc bằng huyết thanh học.
Thực hiện thường xuyên biện pháp này sẽ tạo ra đàn heo giống không có bệnh viêm
phổi do Mycoplasma gây ra.
2.1.8.2. Điều trị
Những kháng sinh có hiệu lực điều trị với Mycoplasma là tetracycline, tylosin và
tiamulin. Gần đây các chế phẩm của nhóm quinolone như norfloxaxin, daofloxaxin và trị
bệnh viêm phổi do Mycoplasma. Nếu điều trị sớm thì đạt được hiệu quả chữa bệnh cao.
Vaccine đã được tìm thấy để giảm mức độ nghiêm trọng của bệnh, nhưng không
ngăn chặn các bệnh xảy ra từ trong toàn bộ số lợn mắc bệnh (Haesebrouck và ctv,
2004, trích bởi Carlton, 2004).

8


2.2. Chẩn đoán MH
2.2.1. Chẩn đoán lâm sàng
Do biểu hiện bệnh không rõ ràng nên việc chẩn đoán dựa trên các dấu hiệu lâm

sàng khá khó khăn. Bệnh tích nhục hóa đối xứng ở phổi khá đặc trưng nhưng không
chuyên biệt vì cũng có thể do các tác nhân khác gây lên bệnh tích tương tự. Chẩn đoán
bệnh cần phải phối hợp giữa quan sát lâm sàng, mổ khám và khảo sát bệnh lý giải
phẫu tổ chức học và xét nghiệm kháng thể huỳnh quang.
Thông thường nếu đàn heo bị ho nhưng không sốt, ăn uống bình thường mà vẫn
chậm lớn và khi mổ khám thấy hạch phổi sưng to, có bệnh tích viêm phổi dạng gan
hóa xám một cách đối xứng ở rìa thùy tim và thùy đỉnh thì chúng ta có thể kết luận sơ
bộ đó là viêm phổi do Mycoplasma gây ra. Do đó cần chẩn đoán phân biệt với các
bệnh tụ huyết trùng, cúm heo và giun phổi. Hai bệnh đầu thường có sốt cao và kèm
theo các triệu chứng khác.
2.2.2. Chẩn đoán huyết thanh học
Có thể các biện pháp chẩn đoán huyết thanh học như phản ứng ngưng kết hồng
cầu gián tiếp hay còn gọi là phản ứng IHA (Indirect Haemagglutination Test) nhưng
theo Freeman (1984) thì độ tin cậy không cao do độ nhạy cảm thấp, phản ứng kết hợp
bổ thể và ELISA (trích dẫn bởi Nguyễn Thị Phước Ninh, 2006). Phản ứng kết hợp bổ
thể (Complement fixation – CF) được dung để xác định kháng thể trong giai đoạn
sớm. Tuy nhiên phản ứng này có hạn chế, không phải là phương pháp tối ưu cho việc
kiểm tra bệnh viêm phổi địa phương do thỉnh thoảng xảy ra dương tính không đặc hiệu
hay âm tính giả (Nguyễn Thị Phước Ninh và ctv, 2006). Phương pháp ELISA gián tiếp
với Tween 20 được thực hiện bởi Bommeli và Nicolet (1983) tỏ ra khá hữu hiệu khi
loại trừ được phản ứng chéo với M. flocculave. Ngoài ra Okada và ctv (2004) đã đề
nghị phương pháp double – sandwich ELISA bằng cách sử dụng kháng thể đơn dòng
và kháng nguyên tái tổ hợp P46 của MH (trích dẫn bởi Nguyễn Thị Phước Ninh,
2006). Trần Thị Dân và ctv (2003) dùng kỹ thuật ELISA để xác định tuổi nhiễm MH
và PRRS ở trại chăn nuôi heo đã chỉ ra rằng tuổi nhiễm MH và virus PRRS xảy ra ở
heo con sau 21 ngày tuổi khi heo mẹ có hoặc không nhiễm hai vi sinh vật này.
2.2.3. Chẩn đoán bằng việc nuôi cấy phân lập
Theo Trần Thanh Phong (1996), việc nuôi cấy Mycoplasma vô cùng khó khăn,
do nó đòi hỏi môi trường giàu dinh dưỡng, điều kiện nuôi cấy vô trùng nghiêm ngặt,


9


khó mọc, mọc chậm và thường bị vấy nhiễm bởi các vi trùng khác hiện diện trên phổi.
Tuy nhiên việc phân lập MH trên môi trường thạch Friis là việc làm vô cùng cần thiết
và được xem là “tiêu chuẩn vàng” cho việc kết luận sự hiện diện của MH trên heo.
2.2.4. Chẩn đoán bằng kỹ thuật PCR
Kỹ thuật PCR cũng được nhiều nhà khoa học quan tâm. Người đặt nền móng
trong việc ứng dụng kỹ thuật PCR chẩn đoán MH là Kary Mullis (1985). Tiếp theo đó
là Mattson và ctv (1995) dùng kỹ thuật PCR để phát hiện nhanh chóng MH và đặc
hiệu trong dịch mũi và nước rửa khí phế quản của phổi bệnh. Calsamiglia (1998) cho
rằng phương pháp PCR có độ chính xác cao, ít tốn kém thời gian, và không phụ thuộc
vào sự sống hay chết của MH (trích dẫn bởi Nguyễn Tất Toàn, 2004). Phương pháp
nested PCR do Verdin và ctv (2000) đề nghị cho phép phát hiện và định lượng được
MH bằng cách tiến hành đồng thời 2 phương pháp realtime – PCR và PCR (trích dẫn
bởi Đặng Thị Thu Hường, 2005).
2.3. Sơ lược về các phương pháp chẩn đoán sử dụng trong nghiên cứu
2.3.1. Phương pháp PCR (Polymerase Chain Reaction)
2.3.1.1. Giới thiệu sơ lược về PCR
Kỹ thuật PCR là một phương pháp in vitro để tổng hợp DNA dựa trên khuôn là
một trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân số lượng bản sao của khuôn này
thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme polymerase và một cặp primer đặc
hiệu cho đoạn DNA này. Hiện nay, kỹ thuật này được sử dụng rộng rãi để phát hiện,
tạo ra các đột biến gen, chẩn đoán bệnh, biện pháp phát hiện sớm nhằm cắt mầm bệnh
trên người, vật nuôi và thực phẩm.
Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lặp lại nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm ba bước
như sau:
Bước 1: Biến tính DNA (denaturation): ở điều kiện nhiệt độ cao phân tử DNA từ
mạch đôi tách ra thành dạng mạch đơn, thường là 94oC – 95oC trong vòng 30 giây – 4 phút.
Bước 2: Bắt cặp (anealation): trong bước này, ở nhiệt độ nhỏ hơn nhiệt độ nóng

chảy Tm (melting temperature) của các primer cho phép các mồi bắt cặp với mạch
khuôn. Trong thực nghiệm nhiệt độ này dao động trong khoảng 40oC – 70oC tuỳ thuộc
Tm của các mồi sử dụng và kéo dài từ 30 – 60 giây tuỳ thuộc vào kích thước sản
phẩm khuếch đại.

10


Bước 3: Kéo dài (extension): dưới tác động của DNA polymerase, các nucleotide
lần lượt gắn vào mồi theo nguyên tắc bổ sung với mạch khuôn. Mạch mới được tạo
thành từ mồi được nối dài. Nhiệt độ phản ứng là 72oC.
Trong phản ứng PCR một chu kỳ bao gồm 3 bước trên sẽ được lập lại nhiều lần,
làm gia tăng số lượng sản phẩm theo cấp số nhân. Theo tính toán sau 30 đến 40 chu
kỳ, sự khuếch đại sẽ cho ra khoảng 106 bản sao. Sau phản ứng PCR, các DNA sản
phẩm được nhuộm bởi ethidium bromide và có thể quan sát thấy thông qua việc điện
di sản phẩm PCR trong gel agarose và quan sát dưới tia UV (bước sóng 312 nm).
2.3.1.2. Thành phần phản ứng PCR
Taq DNA polymerase: là enzyme chịu nhiệt để xúc tác tổng hợp đoạn DNA mục
tiêu từ khuôn mẫu.
Primer: là yếu tố quyết định đến tính hiệu quả và chuyên biệt của phản ứng
khuếch đại. Primers là yếu tố ảnh hưởng mạnh nhất đến sự thành công hay thất bại của
quy trình phản ứng PCR.
Bốn loại nucleotide (dNTP): thường được sử dụng ở nồng độ là 200 µM/mỗi
loại nucleotide. Nếu nồng độ cao hơn dễ dẫn đến sự khuếch đại sản phẩm dương tính
giả hay tạp nhiễm. Sự mất cân bằng trong thành phần các nucleotide lại làm tăng các
lỗi sao chép của polymerase.
Nồng độ Mg2+: cũng là một nhân tố ảnh hưởng đến quá trình khuếch đại, nồng
độ MgCl2 càng cao càng làm giảm độ đặc hiệu của Taq DNA polymerase. Nồng độ tối
ưu của ion này không tuân theo một quy luật chung, thông thường nồng độ tối ưu này
phải được xác định riêng cho từng phản ứng.

Buffer: để duy trì pH: Tris- Cl, điều chỉnh pH giữa 8,3 – 8,8 ở nhiệt độ phòng,
có nồng độ 10 mM trong phản ứng, khi ủ ở 72oC (nhiệt độ ở pha kéo dài), pH của toàn
bộ hỗn hợp phản ứng là khoảng 7,2.
Nước free nuclease
DNA mẫu: Chứa trình tự mục tiêu, có thể được thêm vào hỗn hợp dưới dạng
chuỗi đơn hay chuỗi đôi. DNA dạng vòng thì không hiệu quả bằng DNA ở dạng thẳng.
Nồng độ DNA mẫu ở khoảng 50 ng/µl là thích hợp cho một phản ứng PCR.

11


2.3.1.3. Ưu, nhược điểm của kỹ thuật PCR
Ưu điểm: kỹ thuật PCR được sử dụng trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu quan
trọng do các ưu điểm sau: độ nhạy rất cao, thao tác đơn giản, thời gian thực hiện
nhanh, độ tinh sạch của mẫu không cần cao, lượng mẫu cần ít.
Nhược điểm: phương pháp này có nhiều mặt hạn chế và đòi hỏi sự thận trọng
đặc biệt khi tiến hành thí nghiệm cũng như khi phân tích kết quả chẳng hạn trong thực
nghiệm, kích thước của trình tự cần khuếch đại là giới hạn đầu tiên. Trừ vài trường
hợp rất cá biệt, phương pháp PCR không hoạt động được với những đoạn DNA lớn
hơn 3000 bp. Việc sử dụng PCR với các độ dài dưới 1500 bp cho kết quả tốt. Với
những độ dài lớn hơn, điều kiện tối ưu cho phản ứng phải được xác định qua thực
nghiệm. Tiếp đó sự ngoại nhiễm là vấn đề lớn nhất đặt ra đối với PCR.
2.3.2. Quy trình ly trích DNA
Bước 1: Phá vỡ màng tế bào
Thông thường người ta nghiền tế bào hoặc mô trong một hỗn hợp dung dịch đệm
chiết gồm Tris – HCl 1M (pH 7,5), NaCl 5M, EDTA 0,5M, sodium dodecyl sulfat
10% (SDS). Hỗn hợp này sẽ phá vỡ vách tế bào và màng nhân, giải phóng DNA ra
môi trường đồng thời phân hủy các protein liên kết với DNA. Ngoài ra trong thành
phần dịch trích còn có mercaptoethanol có tác dụng bảo vệ DNA trong quá trình ly trích.
Bước 2: Loại bỏ các thành phần không mong muốn trong mẫu chủ yếu là các protein

Loại bỏ protein và phức hợp CTAB – polysaccharide – protein bằng hỗn hợp
phenol / chloroform / isoamyl alcohol (25 : 24 : 1). Phenol và chloroform sẽ làm biến
tính protein. Ngoài ra chloroform còn làm cho pha nước và pha hữu cơ dễ tách rời
nhau. Isoamyl alcohol hạn chế sự nổi bọt trong suốt quá trình ly trích. Sử dụng thêm
chloroform sẽ giúp loại bỏ tất cả các dấu vết còn sót lại của phenol trong nucleic acid.
Protein bị biến tính sẽ không hòa tan trong pha nước có chứa nucleic acid và sau khi ly
tâm sẽ tủa thành một lớp nằm giữa pha nước và pha hữu cơ. Pha nước có chứa nucleic
acid được thu nhận lại.
Bước 3: Tủa nucleic acid trong isopropanol
Các DNA có trọng lượng phân tử thấp không bị tủa nên có thể loại bỏ chúng
bằng tủa trong isopropanol. Acid nucleic sẽ được thu nhận lại bằng ly tâm. Sau đó, cặn
tủa phải được rửa trong ethanol 70% để loại bỏ các muối hoặc các dấu vết của
isopropanol còn dính lại.

12


2.3.3. Phương pháp điện di trên gel
Mục đích: kiểm tra sự hiện diện của DNA
Nguyên tắc của kỹ thuật điện di:
Trong một điện trường, các phân tử sẽ di chuyển với vận tốc tùy thuộc vào điện
tích và kích thước của chúng. Nếu hai phân tử có cùng khối lượng thì phân tử nào có
điện tích lớn hơn sẽ di chuyển về điện cực ngược dấu nhanh hơn. Những phân tử nào
có kích thước nhỏ hơn sẽ di chuyển nhanh hơn, những phân tử có kích thước lớn hơn
sẽ di chuyển chậm hơn.
Đối với phân tử DNA, việc điện di được thực hiện trên giá thể bán rắn dạng gel.
Gel là môi trường xốp với các lỗ nhỏ cho phép các phân tử acid nucleotide đi
qua. Kích thước phân tử càng lớn thì việc di chuyển qua gel càng chậm. Có hai loại gel
được sử dụng tùy theo kích thước và mức độ phân tách của phân tử acid nucleotide: đó
là gel agarose và gel polyacrylamide.

- Gel agrose: Lỗ có đường kính trung bình cho phép phân tách các phân tử DNA
sợi đôi, kích thước 300 - 10000 bp. Các nồng độ agarose khác nhau cho phép tăng hiệu
quả phân tách các nhóm phân tử có kích thước khác nhau.
- Gel polyacrylamide: Cho những lỗ nhỏ, thích hợp để phân tách những đoạn
DNA có kích thước dưới 500bp, hiệu quả phân tách có thể đạt 1 nucleotide. Gel
polyacrylamide ở dạng lỏng là chất gây độc cho hệ thần kinh nên phải cẩn thận khi sử dụng.
Dựa vào kết quả điện di, chúng ta có thể biết được chất lượng của DNA ly trích
có tinh sạch (sản phẩm cho vạch DNA rõ nét không có vạch phụ) hay không tinh sạch
(xuất hiện nhiều vạch phụ, bị gẫy, lẫn tạp).
2.3.4. Phương pháp ELISA (Enzyme - Linked Immunosorbent Assay)
2.3.4.1. Nguyên lý phản ứng ELISA
Một số enzyme như alkaline phosphatase hay peroxidase có thể gắn kết với
kháng thể một cách không đặc hiệu. Các enzyme này có thể được nhận biết nhờ vào
phản ứng của chúng với cơ chất tương ứng, nhờ vậy có thể thông qua các enzyme nói
trên sẽ có thể phát hiện ra kháng thể gắn kết với chúng. Kỹ thuật ELISA đã được sử
dụng rộng rãi trong chẩn đoán các tác nhân vi khuẩn, virus và cả ký sinh trùng. Kỹ
thuật ELISA được chia thành 2 loại: ELISA trực tiếp nhằm tìm kiếm kháng nguyên
(ELISA capture hoặc sandwich) và ELISA gián tiếp nhằm tìm kiếm kháng thể
(indirect hoặc ELISA cạnh tranh = competitive ELISA) (Nguyễn Ngọc Hải, 2007).

13


2.3.4.2.Phản ứng ELISA gián tiếp
Phương pháp truyền thống trước đây để chẩn đoán MH là phản ứng kết hợp bổ
thể, phản ứng ngưng kết hồng cầu gián tiếp và gần đây hơn là phản ứng ELISA gián
tiếp. Bộ kít HerdChek* M hyo enzyme immunoassay (EIA) dựa trên kỹ thuật ELISA
gián tiếp phát hiện kháng thể chống MH trong huyết thanh heo một cách nhanh chóng,
đơn giản, độ nhạy và độ đặc hiệu cao do sử dụng kháng thể đơn dòng.


Hình 2.5 Kỹ thuật ELISA gián tiếp
( />Trong kỹ thuật này các kháng nguyên đã biết trước được gắn trên giá thể (các
giếng của vỉ nhựa polystyrene hoặc màng lai…), dung dịch mẫu chẩn đoán và đối
chứng được cho vào các giếng, ủ trong điều kiện nhiệt độ và thời gian nhất định (tuỳ
theo bộ kít của nhà sản xuất), sau đó mẫu ủ được rửa và cho tác dụng với kháng kháng
thể có gắn enzyme, lại ủ mẫu trong điều kiện nhiệt độ và thời gian nhất định, rửa mẫu
và cuối cùng cơ chất tương ứng với enzyme được cho vào giếng chứa mẫu. Phản ứng
giữa enzyme và cơ chất tương ứng nếu xảy ra sẽ tạo màu và cường độ tạo màu sẽ tỷ lệ
thuận với lượng kháng thể có trong mẫu đặc hiệu với kháng nguyên đã biết. Kết quả
của phản ứng ELISA được đọc tuỳ theo loại tác nhân chẩn đoán và tuỳ theo hãng sản
xuất bộ hoá chất sử dụng (Nguyễn Ngọc Hải, 2007).
2.4. Một số nghiên cứu trong và ngoài nước về MH
2.4.1. Nghiên cứu trong nước
Trần Thị Dân và ctv (2003) dùng kỹ thuật khuếch đại gen (PCR) để phát hiện
MH ở phổi heo và kết luận rằng kết quả PCR giữa bộ kít và cặp mồi đặc hiệu là tương

14


đương. Trần Thị Dân và ctv (2005) xác định tuổi nhiễm và các phương pháp phát hiện
MH, virus PRRS ở trại nuôi heo đã đưa ra kết luận tuổi nhiễm MH xảy ra ở heo con
sau 21 ngày tuổi. Nguyễn Thị Phước Ninh (2003) nghiên cứu hiệu quả của vaccine
Respisure trong việc phòng bệnh viêm phổi địa phương do MH trên heo thịt (trích dẫn
bởi Quách Tuyết Anh, 2003). Nguyễn Tất Toàn (2004) thực hiện so sánh và đánh giá
các phương pháp chẩn đoán như phân lập, PCR, bệnh lý lâm sàng trên heo nhiễm MH
trong các trại chăn nuôi heo vùng Luzon, Philippines.
Nguyễn Thị Ngọc Hạnh (2002) điều tra tỷ lệ nhiễm MH trên heo bằng kỹ thuật
ELISA tại hai xí nghiệp chăn nuôi heo công nghiệp ở Thành phố Hồ Chí Minh và kết
luận rằng có tới 88,51% huyết thanh dương tính trên heo thịt. Quách Tuyết Anh (2003)
đưa ra một số kinh nghiệm trong việc ứng dụng kỹ thuật PCR để phát hiện MH trên

mẫu bệnh tích phổi nhục hóa, kết quả PCR cho 62,5% mẫu phổi dương tính với MH.
Đỗ Tiến Duy (2004) chẩn đoán MH dựa vào bệnh tích đại thể, vi thể, và kỹ thuật
ELISA trên heo thịt giết mổ tại xí nghiệp chế biến thực phẩm Nam Phong Tp. HCM
đưa ra kết luận kỹ thuật ELISA vẫn là kỹ thuật chẩn đoán nhanh, đặc hiệu và chính xác
khi có 78,95% huyết thanh dương tính. Vân Minh Tâm (2005) chẩn đoán MH trên heo
thịt được thu thập tại xí nghiệp chế biến thực phẩm Nam Phong Tp.HCM bằng kỹ
thuật ELISA, kết quả cho thấy có 84,48% huyết thanh dương tính với MH. Lê Văn
Thuận (2005) đánh giá hiệu quả sử dụng vaccine M+PAC trong việc phòng bệnh do
MH trên heo thịt. Nguyễn Thị Phước Ninh (2006) và ctv đã phân lập MH và một số vi
khuẩn liên quan đến bệnh hô hấp trên phổi heo. Đặng Thị Thu Hường (2005) nghiên
cứu

phát

hiện

nhiễm

Mycoplasma

hyopneumoniae

và

Actinobacillus

pleuropneumoniae ở heo bằng kỹ thuật PCR cho 67,5% dương tính và ELISA cho kết
quả 78,05% huyết thanh dương tính với MH.
Võ Thị Hoàng Sang (2006) thực hiện phân lập MH trên phổi heo được thu thập
tại xí nghiệp chế biến thực phẩm Nam Phong Tp.HCM. Kết quả PCR cho mẫu phổi là

50%, cho mẫu canh nuôi cấy phân lập từ phổi trên môi trường thạch Friis là 25%
dương tính với MH. Nguyễn Thành Lâm (2005) khảo sát bệnh tích trên phổi và ứng
dụng kỹ thuật PCR để phát hiện MH trên heo thịt tại xí nghiệp chế biến thực phẩm
Nam Phong Tp.HCM. Thí nghiệm của tác giả được tiến hành trên 3 loại mẫu và kết
quả PCR tương ứng cho 3 loại mẫu là: mẫu phổi 50%, mẫu hạch phổi là 15%, mẫu
dịch khí quản là 20% dương tính với MH.

15