BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
PHÂN LẬP, CHỌN LỌC VÀ NHÂN SINH KHỐI
CÁC CHỦNG VI KHUẨN PHÂN GIẢI LÂN

Ngành học

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện

:PHẠM THỊ NGỌC NGA

Niên khóa

:2005 - 2009

Tháng 8/2009


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
PHÂN LẬP, CHỌN LỌC VÀ NHÂN SINH KHỐI

CÁC CHỦNG VI KHUẨN PHÂN GIẢI LÂN

Hướng dẫn khoa hoc

Sinh viên thực hiện

ThS. TRƯƠNG PHƯỚC THIÊN HOÀNG

PHẠM THỊ NGỌC NGA

KS. TĂNG THỊ ÁNH THƠ

Tháng 8/2009


LỜI CẢM ƠN
Khóa luận này được hoàn thành với sự quan tâm giúp đỡ rất nhiều của các thầy cô, các
anh chị và các bạn. Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến:
Thạc sĩ: Trương Phước Thiên Hoàng, người đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều
kiện cho em thực hiện khóa luận này. Em xin chân thành cảm ơn cô rất nhiều!
Kỹ sư: Tăng Thị Ánh Thơ: là người hết lòng tận truyền đạt những kinh nghiệm quí báu
trong suốt quá trình em làm đề tài. Em xin chân thành cảm ơn cô rất nhiều!
Em cảm ơn các quí thầy cô cùng ban lãnh đạo của viện Công Nghệ Sinh Học – Công
Nghệ Môi Trường - Trường đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh đã tạo mọi
điều kiện cho em trong suốt quá trình em thực hiện đề tài tại viện.
Gởi lời cảm ơn thân ái đến toàn thể các bạn lớp DH05SH đã luôn bên cạnh động viên,
an ủi và giúp đỡ tôi trong những lúc tôi gặp khó khăn nhất trong những học kì qua và
trong suốt quá trình làm đề tài.
Và trên hết, con xin chân thành gởi lời mến thương nhất đến ba má và các anh chị em
trong gia đình luôn là chỗ dựa vững chắc cho con trong suốt quãng đời sinh viên.

Không ai khác, con tự tin khẳng định rằng chính gia đình mình và sự nổ lực của con sẽ
là động lực mạnh mẽ nhất giúp con thành công trên con đường mà con đã chọn. Mến
thương đến gia đình rất nhiều!
Sinh viên thực hiện
Phạm Thị Ngọc Nga

iii


TÓM TẮT
Photpho là một nguyên tố cần thiết cho sự phát triển của cây trồng. Tuy nhiên photpho
tồn tại trong đất ở dạng khó tan, do vậy cây trồng khó hấp thụ để chuyển hoá thành
chất dinh dưỡng. Nguồn photpho trong đất vẫn chưa được cây trồng sử dạng một cách
hiệu quả. Trên cơ sở đó chúng tôi tiến hành đề tài “Phân lập, chọn lọc và nhân sinh
khối các chủng vi khuẩn phân giải lân” được thực hiện, tại viện Công Nghệ Sinh Học
– Công Nghệ Môi Trường - Trường đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh từ đầu
tháng 3/2009 đến cuối tháng 6/2009, nhằm mục đích tìm ra những chủng vi khuẩn có
khả năng chuyển hoá photpho khó tan trong đất thành dạng dễ hoà tan, từ đó bổ sung
sinh khối của chúng vào phân bón hữu cơ vi sinh để giúp cây trồng tăng hiệu quả sử
dụng photpho, mang lại hiệu quả kinh tế cho người làm nông.
Từ 40 mẫu đất trồng hoa màu ở 4 vùng Đồng Nai, Bình Dương, Hóc Môn, Củ
Chi, tiến hành sàng lọc và chọn ra 11 chủng phân giải lân vô cơ mạnh nhất, và được
chia thành 3 nhóm. Trong đó, nhóm 1 là trực khuẩn, G - gồm 5 chủng DN7, BD6,
DN2, BD4, HM1, nhóm 2 là trực khuẩn, G + sinh bào tử gồm 3 chủng HM2, BD10,
BD8, nhóm 3 là cầu khuẩn G + gồm 3 chủng BD1, DN1, BD9. Chủng DN7 và BD6 là
2 chủng tốt nhất được tiến hành nghiên cứu để tạo chế phẩm phân bón hữu cơ vi sinh
trên 2 môi trường Pikovskaya lỏng và nước bột thịt. Môi trường Pikovskaya lỏng là tốt
nhất cho nhân sinh khối của 2 chủng này, đối với chủng vi khuẩn DN7 trong thời gian
72 giờ tại pH 7 cho sinh khối cao nhất, chủng vi khuẩn BD6 trong thời gian 96 giờ tại
pH 8 cho sinh khối tối đa.


iv


SUMMARY
Phosphorus is one of the major nutrients for plant growth. However,
phosphorus is highly insoluble and unavailable to plant, amount available to plant is
usually a small proportion of this total. Thesis “Isolating, Selecting, and Increasing in
the mass of phosphate solubilizing bacterium” have been done from 1 March, 2009 to
30 June, 2009 at Reseach Institute Biological and Enviromental Technology, Nong
Lam University to find out different

bacterial strains to solubilize phosphate

compounds best application on organic fertilizer.
Phosphate solubilizing bacteria were isolated from four provinces Dong Nai,
Binh Duong, Hoc Mon and Cu Chi and were classified into three groups: group 1 is
Aerobic Rods and Cocci, G

-

bacteria inclusion DN7, BD6, DN2, BD4 and HM1,

group 2 is endospore-forming, Rods, G

+

bacteria inclusion HM2, BD10 and BD8,

group 3 is Cocci, G + bacteria inclusion BD1, DN1 and BD9.

Increasing in the mass with two media: Pikovskaya and beaf extract of DN7,
BD6 strains. Pikoskaya’s medium was consonant with the growth of DN7, BD6
strains. DN7 strain: mass reached maximum activity at 72 hours, optimal pH 7 and
BD6 strain: mass reached maximum activity at 96 hours, optimal pH 8.

v


MỤC LỤC
Trang
Lời cảm ơn .............................................................................................................iii
Tóm tắt ................................................................................................................... iv
Summary................................................................................................................... v
Mục lục .................................................................................................................... vi
Danh sách các chữ viết tắt .....................................................................................viii
Danh sách các bảng ................................................................................................ ix
Danh sách các hình ................................................................................................... x
Chương 1 MỞ ĐẦU ................................................................................................. 1
1.1. Đặt vấn đề.......................................................................................................... 1
1.2. Yêu cầu đề tài .................................................................................................... 1
1.3. Nội dung thực hiện ............................................................................................ 1
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU........................................................................ 2
2.1. Lân trong tự nhiên ............................................................................................. 2
2.2. Sự chuyển hóa photpho nguồn hữu cơ .............................................................. 3
2.3. Sự chuyển hóa các hợp chất vô cơ chứa photpho ............................................. 4
2.4. Nguồn phân lập vi khuẩn phân giải hợp chất vô cơ chứa photpho ................... 5
2.4.1. Bacillus ........................................................................................................... 6
2.4.2. Alcaligenes .................................................................................................... 6
2.4.3. Agrobacterium ................................................................................................ 6
2.5. Điều kiện ngoại cảnh ảnh hưởng đến vi khuẩn phân giải lân vô cơ ................. 7

2.6. Phân hữu cơ vi sinh ........................................................................................... 7
2.7. Đường cong sinh trưởng của vi khuẩn .............................................................. 8
Chương 3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................................................... 10
3.1. Thời gian và địa điểm...................................................................................... 10
3.2. Vật liệu ............................................................................................................ 10
3.2.1. Mẫu đất phân lập .......................................................................................... 10
3.2.2. Thiết bị và dụng cụ ....................................................................................... 12
2.2.3. Hóa chất........................................................................................................ 12
3.3. Phương pháp thí nghiệm.................................................................................. 13
vi


3.3.1. Phân lập và làm thuần................................................................................... 13
3.3.2. Lấy mẫu và tăng sinh mẫu............................................................................ 13
3.3.3. Phân lập chọn lọc.......................................................................................... 13
3.3.4. Làm thuần vi khuẩn ...................................................................................... 13
3.3.5. Bảo quản giống vi khuẩn.............................................................................. 13
3.3.6. Khảo sát khả năng phân giải lân vô cơ......................................................... 14
3.3.7. Quan sát hình thái......................................................................................... 14
3.3.8. Định danh vi khuẩn ...................................................................................... 14
3.3.8.1. Khảo sát đặc điểm hình thái ...................................................................... 15
3.3.8.2. Khảo sát đặc điểm sinh hóa ....................................................................... 16
3.3.9. Khảo sát ảnh hưởng của (thời gian, pH)....................................................... 18
3.4. Phương pháp xử lý số liệu ............................................................................... 18
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN............................................................... 19
4.1. Kết quả phân lập và làm thuần ........................................................................ 19
4.2. Kết quả phân nhóm vi khuẩn........................................................................... 24
4.3. Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian ...................................................... 32
4.3.1. Kết quả khảo sát ảnh hưởng thời gian và pH đối với chủng DN7 ............... 32
4.3.2. Kết quả khảo sát ảnh hưởng thời gian và pH đối với chủng BD6................ 37

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................... 42
5.1. Kết luận............................................................................................................ 42
5.2. Đề nghị ............................................................................................................ 42
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 43
PHỤ LỤC
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO....................................................................................3
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ......................................................................................3
Ngành học
: CÔNG NGHỆ SINH HỌC ...............................................................3
Sinh viên thực hiện :PHẠM THỊ NGỌC NGA.......................................................3
Niên khóa
:2005 - 2009 ..........................................................................................3
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO...................................................................................iv
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP .....................................................................................iv
LỜI CẢM ƠN .............................................................................................................. iii
Khóa luận này được hoàn thành với sự quan tâm giúp đỡ rất nhiều của các thầy cô, các
anh chị và các bạn. Em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến: ......................................... iii

vii


Thạc sĩ: Trương Phước Thiên Hoàng, người đã tận tình hướng dẫn và tạo mọi điều
kiện cho em thực hiện khóa luận này. Em xin chân thành cảm ơn cô rất nhiều!.......... iii
Kỹ sư: Tăng Thị Ánh Thơ: là người hết lòng tận truyền đạt những kinh nghiệm quí báu
trong suốt quá trình em làm đề tài. Em xin chân thành cảm ơn cô rất nhiều!............... iii
Em cảm ơn các quí thầy cô cùng ban lãnh đạo của viện Công Nghệ Sinh Học – Công
Nghệ Môi Trường - Trường đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh đã tạo mọi
điều kiện cho em trong suốt quá trình em thực hiện đề tài tại viện............................... iii
Gởi lời cảm ơn thân ái đến toàn thể các bạn lớp DH05SH đã luôn bên cạnh động viên,
an ủi và giúp đỡ tôi trong những lúc tôi gặp khó khăn nhất trong những học kì qua và

trong suốt quá trình làm đề tài....................................................................................... iii
Và trên hết, con xin chân thành gởi lời mến thương nhất đến ba má và các anh chị em
trong gia đình luôn là chỗ dựa vững chắc cho con trong suốt quãng đời sinh viên.
Không ai khác, con tự tin khẳng định rằng chính gia đình mình và sự nổ lực của con sẽ
là động lực mạnh mẽ nhất giúp con thành công trên con đường mà con đã chọn. Mến
thương đến gia đình rất nhiều! ...................................................................................... iii
TÓM TẮT...................................................................................................................iv
Photpho là một nguyên tố cần thiết cho sự phát triển của cây trồng. Tuy nhiên
photpho tồn tại trong đất ở dạng khó tan, do vậy cây trồng khó hấp thụ để chuyển
hoá thành chất dinh dưỡng. Nguồn photpho trong đất vẫn chưa được cây trồng sử
dạng một cách hiệu quả. Trên cơ sở đó chúng tôi tiến hành đề tài “Phân lập, chọn
lọc và nhân sinh khối các chủng vi khuẩn phân giải lân” được thực hiện, tại viện
Công Nghệ Sinh Học – Công Nghệ Môi Trường - Trường đại học Nông Lâm thành
phố Hồ Chí Minh từ đầu tháng 3/2009 đến cuối tháng 6/2009, nhằm mục đích tìm ra
những chủng vi khuẩn có khả năng chuyển hoá photpho khó tan trong đất thành
dạng dễ hoà tan, từ đó bổ sung sinh khối của chúng vào phân bón hữu cơ vi sinh để
giúp cây trồng tăng hiệu quả sử dụng photpho, mang lại hiệu quả kinh tế cho người
làm nông. ....................................................................................................................iv
Từ 40 mẫu đất trồng hoa màu ở 4 vùng Đồng Nai, Bình Dương, Hóc Môn, Củ Chi,
tiến hành sàng lọc và chọn ra 11 chủng phân giải lân vô cơ mạnh nhất, và được chia
thành 3 nhóm. Trong đó, nhóm 1 là trực khuẩn, G - gồm 5 chủng DN7, BD6, DN2,
BD4, HM1, nhóm 2 là trực khuẩn, G + sinh bào tử gồm 3 chủng HM2, BD10, BD8,
nhóm 3 là cầu khuẩn G + gồm 3 chủng BD1, DN1, BD9. Chủng DN7 và BD6 là 2
chủng tốt nhất được tiến hành nghiên cứu để tạo chế phẩm phân bón hữu cơ vi sinh
trên 2 môi trường Pikovskaya lỏng và nước bột thịt. Môi trường Pikovskaya lỏng là
tốt nhất cho nhân sinh khối của 2 chủng này, đối với chủng vi khuẩn DN7 trong thời
gian 72 giờ tại pH 7 cho sinh khối cao nhất, chủng vi khuẩn BD6 trong thời gian 96
giờ tại pH 8 cho sinh khối tối đa. ...............................................................................iv
SUMMARY.................................................................................................................v
DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT..........................................................................x

Chương 4 .......................................................................................................................19
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.......................................................................................19
4.1. Kết quả phân lập và làm thuần ...........................................................................19
Từ 40 mẫu đất thu nhận ở 4 vùng Đồng Nai, Bình Dương, Hóc Môn, Củ Chi Chúng
tôi đã tiến hành phân lập và làm thuần trên môi trường PVK rắn. Kết quả chúng tôi
đã thu nhận được 50 chủng thuần và xác định được mật số vi khuẩn phân giải lân
vô cơ ở từng vùng......................................................................................................19

viii


Mật số vi khuẩn phân giải lân vô cơ cao nhất ở tỉnh Đồng Nai, mẫu đất thu được ở
Đồng Nai có sự đa dạng về chủng loại, tiếp đến là tỉnh Bình Dương, huyện Hóc
Môn, và mật số vi khuẩn phân giải lân vô cơ thấp nhất là ở huyện Củ Chi..............19
Bảng 4.1 Mật số vi khuẩn phân giải lân vô cơ ở tỉnh Đồng Nai ...............................19
Bảng 4.2 Mật độ vi khuẩn phân giải lân vô cơ ở tỉnh Bình Dương ..........................20
Bảng 4.4 Mật độ vi khuẩn phân giải lân vô cơ ở huyện Củ Chi ...............................22
Chương 5 ...................................................................................................................42
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .......................................................................................42
5.1. Kết luận...............................................................................................................42
Qua hệ thống phân lập trên môi trường chọn lọc PVK chúng tôi kết luận: ..............42
+ Mật số vi khuẩn phân giải lân vô cơ cao nhất ở đất trồng Chôm Chôm của xã
Quang Trung, huyện Thống Nhất, tỉnh Đồng Nai là 31,90 x 104 (CFU/g), đây là loại
đất thích hợp cho vi khuẩn phân giải lân vô cơ phát triển.........................................42
+ Chủng có khả năng phân giải lân vô cơ mạnh nhất là 2 chủng DN7 và BD6. ......42
Các chủng vi khuẩn phân giải lân vô cơ mạnh nhất được phân thành 3 nhóm:........42
+ Nhóm 1: Trực khuẩn, G -, nhóm này gồm các chủng: DN7, BD6, DN2, BD4,
HM1...........................................................................................................................42
+ Nhóm 2: Trực khuẩn G +, sinh bào tử, nhóm này bao gồm các chủng: HM2,
BD10, BD8. ...............................................................................................................42

+ Nhóm 3: Cầu khuẩn (xếp thành chuỗi), G+, nhóm này bao gồm các chủng: BD1,
DN1, BD9..................................................................................................................42
Môi trường PVK lỏng nhân sinh khối 2 chủng DN7 và BD6 tốt hơn môi trường
nước bột thịt...............................................................................................................42
+ Chủng BD6: Nhân sinh khối trong thời gian 96 giờ, ở pH 8 trên môi trường PVK
lỏng cho sinh khối cao nhất là 34,00 x 108 (CFU/ml)...............................................42
+ Chủng DN7: Nhân sinh khối trong thời gian 72 giờ, ở pH 7 trên môi trường PVK
lỏng cho sinh khối cao nhất là: 22,47 x 108 (CFU/ml)..............................................42
5.2. Đề nghị ...............................................................................................................42
Định danh đến giống và loài của 11 chủng vi khuẩn dựa trên sự phân nhóm đã có
bằng phương pháp PCR.............................................................................................42
Nhân sinh khối của 2 chủng DN7, BD6 trên nhiều môi trường khác nhau để tìm ra
môi trường thích hợp mang lại hiệu quả kinh tế cho quá trình nhân sinh khối bổ
sung vào phân hữu cơ vi sinh. ...................................................................................42
Trộn sinh khối của 2 chủng DN7, BD6 vào các loại phân bón khác nhau và thử
nghiệm trên đồng ruộng.............................................................................................42
13 />14 .................................................44
15 .....................................................44
16 www.humixvn.com.htm .....................................................................................44
Phụ lục 1 ......................................................................................................................1
Bảng 5 Bảng ANOVA của mật số vi khuẩn phân giải lân vô cơ ở tỉnh Bình Dương
số liệu trên bảng 4........................................................................................................3
Total (corrected) 1.7708E0009
29...............................................3
Bảng 6 Bảng trắc nghiệm phân hạng mật số vi khuẩn phân giải lân vô cơ ở tỉnh Bình
Dương số liệu trên bảng 4 ...........................................................................................3
Bảng 7 Mật số vi khuẩn phân giải lân vô cơ ở huyện Hóc Môn .................................4
Bảng 10 Mật số vi khuẩn phân giải lân vô cơ ở huyện Củ Chi...................................5
ix



DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
CDC

Nutrient Gelatin

G+

Gram dương

G-

Gram âm

LDC

Lysine Decarboxylase

MR

Thử nghiệm Methyl Red

PCR

Polymerase chain reaction

PVK

Pikovskaya


SCA

Môi trường Simmons Citrate Agar

TCVN

Tiêu chuẩn Việt Nam

TSI

Môi trường Sugar Ion Agar

V-P

Thử nghiệm Voges-Proskauer

VSV

Vi sinh vật

x


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Trang
Bảng 2.1 Lân tổng số và dễ tiêu trong đất Việt Nam............................................... 2
Bảng 2.2 Nhóm vi sinh vật phân giải 2 loại acid hữu cơ ......................................... 5
Bảng 3.1 Ký hiệu mẫu và nơi lấy mẫu đất ở Đồng Nai ......................................... 11
Bảng 4.1 Mật số vi khuẩn phân giải lân vô cơ ở tỉnh Đồng Nai .......................... 19
Bảng 4.2 Mật số vi khuẩn phân giải lân vô cơ ở tỉnh Bình Dương ....................... 20

Bảng 4.3 Mật số vi khuẩn phân giải lân vô cơ ở huyện Hóc Môn ....................... 21
Bảng 4.4 Mật số vi khuẩn phân giải lân vô cơ ở huyện Củ Chi ............................ 22
Bảng 4.5 Kích thước vòng phân giải lân vô cơ của 11 chủng vi khuẩn ................ 23
Bảng 4.6 Hình dạng và kích thước tế bào của vi khuẩn nhóm 1 ........................... 24
Bảng 4.7 Các đặc điểm sinh hoá của nhóm 1 ........................................................ 25
Bảng 4.8 Hình dạng và kích thước tế bào của vi khuẩn nhóm 2 ........................... 26
Bảng 4.9 Các đặc điểm sinh hóa của nhóm 2 ........................................................ 27
Bảng 4.10 Hình dạng và kích thước tế bào của vi khuẩn nhóm 3 ......................... 28
Bảng 4.11 Các đặc điểm sinh hóa của nhóm 3 ...................................................... 29
Bảng 4.12 Khảo sát thời gian 12, 24, 36 giờ trên PVK lỏng của DN7.................. 32
Bảng 4.13 Khảo sát thời gian 48, 60, 72 giờ trên PVK lỏng của DN7.................. 33
Bảng 4.14 Khảo sát thời gian 84, 96, 108 giờ trên PVK lỏng của DN7................ 33
Bảng 4.15 Khảo sát thời gian 12, 24, 36 giờ trên nước bột thịt của DN7 ............. 34
Bảng 4.16 Khảo sát thời gian 48, 60, 72 giờ nước bột thịt của DN7..................... 35
Bảng 4.17 Khảo sát thời gian 84, 96, 108 giờ trên nước bột thịt của DN7 ........... 35
Bảng 4.18 Khảo sát thời gian 12, 24, 36 giờ trên PVK lỏng của BD6 .................. 37
Bảng 4.19 Khảo sát thời gian 48, 60, 72 giờ trên PVK lỏng của BD6 .................. 38
Bảng 4.20 Khảo sát thời gian 84, 96, 108 giờ trên PVK lỏng của BD6 ................ 38

xi


Bảng 4.21 Khảo sát thời gian 12, 24, 36 giờ trên nước bột thịt của BD6.............. 39
Bảng 4.22 Khảo sát thời gian 48, 60, 72 giờ trên nước bột thịt của BD6.............. 40
Bảng 4.23 Khảo sát thời gian 84, 96, 108 giờ trên nước bột thịt của BD6............ 40

DANH SÁCH CÁC HÌNH
Trang
Hình 3.1 Các mẫu đất phân lập.............................................................................. 10
Hình 4.1 Nhuộm Gram của vi khuẩn nhóm 1........................................................ 24

Hình 4.2 Phản ứng sinh hóa của 2 chủng nhóm 1 ................................................. 25
Hình 4.3 Nhuộm Gram của vi khuẩn nhóm 2........................................................ 26
Hình 4.4 Phản ứng sinh hóa của 2 chủng nhóm 2 ................................................. 27
Hình 4.5 Nhuộm Gram của vi khuẩn nhóm 3........................................................ 28
Hình 4.6 Phản ứng sinh hóa của 2 chủng nhóm 3 ................................................. 29
Hình 4.7 Khuẩn lạc sau 24 giờ của nhóm 1........................................................... 30
Hình 4.8 Khuẩn lạc của HM2 và BD4................................................................... 31
Hình 4.9 Khuẩn lạc sau 24 giờ của nhóm 3........................................................... 31
Sơ đồ 2.1 Sự chuyển hóa nucleoprotein .................................................................. 4
Sơ đồ 2.2 Vòng tuần hoàn photpho trong tự nhiên ................................................. 8

xii


Chương 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Từ xưa đến nay, năng suất cây trồng luôn là vấn đề quan tâm hàng đầu của mọi
nền nông nghiệp. Do đó đã có rất nhiều phương pháp được sử dụng nhằm cải thiện
năng suất cũng như tăng cường sức đề kháng của cây trồng với mầm bệnh trong đó
phổ biến nhất là sử dụng thuốc trừ sâu và phân bón hoá học. Tuy nhiên các biện pháp
này còn rất nhiều hạn chế như: gây ô nhiễm môi trường, thoái hoá đất và ảnh hưởng
xấu đến sức khoẻ con người. Cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, các biện
pháp và xu hướng mới đã ra đời với mục tiêu xây dựng một nền nông nghiệp bền
vững, thân thiện với môi trường mà vẫn đạt năng suất cao. Photpho là nguyên tố rất
cần thiết đối với cây trồng, có ý nghĩa về mặt dinh dưỡng cũng như về mặt khắc phục
yếu tố độc hại của đất. Tuy nhiên Photpho tồn tại trong đất ở dạng khó tan nên cây
trồng khó có thể hấp thụ photpho dễ dàng. Do vậy việc tuyển chọn và nhân sinh khối
các chủng vi khuẩn có khả năng phân giải lân trong tự nhiên để bổ sung vào phân hữu
cơ vi sinh, giúp cây trồng hấp thụ lân tốt hơn, mang lại hiệu quả kinh tế cho người

nông dân là vấn đề cần được giải quyết. Trên những cơ sở đó tiến hành đề tài: “Phân
lập, chọn lọc và nhân sinh khối các chủng vi khuẩn phân giải lân”.
1.2. Yêu cầu đề tài
Chọn lọc và bước đầu phân nhóm các chủng vi khuẩn phân giải lân mạnh nhất,
khảo sát ảnh hưởng của yếu tố (thời gian, pH) đến quá trình nhân sinh khối của một
số chủng vi khuẩn tiêu biểu.
1.3. Nội dung thực hiện
Phân lập, làm thuần và làm thuần các chủng vi khuẩn phân giải lân.
Khảo sát khả năng phân giải lân trên môi trường chọn lọc để chọn ra những chủng
có khả năng phân giải lân mạnh.
Phân nhóm các chủng vi khuẩn phân giải lân vô cơ dựa vào các đặc điểm hình thái,
nhuộm Gram và sinh hoá.
Tiến hành khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố: thời gian, pH và môi trường nuôi cấy
đến quá trình nhân sinh khối của các chủng vi khuẩn phân giải lân.
1


Chương 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 . Lân trong tự nhiên
Photpho là một thành phần khoáng rất quan trọng trong tế bào của vi sinh vật và
là yếu tố dinh dưỡng không thể thiếu được trong sự phát triển của thực vật và động
vật. Đối với nhiều loài vi sinh vật, lượng photpho trong tế bào chiếm 50% tổng lượng
khoáng. Photpho có mặt trong nhiều thành phần quan trọng của tế bào như chúng có
mặt trong acid nucleic, photpho protein, photpholipid ở các hợp chất cao năng và các
coenzyme quan trọng như flavin, tiamin, biotin. Do đó, việc phân hủy các hợp chất vô
cơ và hữu cơ chứa photpho đối với vi sinh vật có ý nghĩa quan trọng như việc được
cung cấp nguyên liệu cho quá trình tạo ra những chất trên cho cơ thể (Nguyễn Đức
Lượng, 2002). Hình thành trong vùng nhiệt đới ẩm Việt Nam có mức độ phân hoá sâu
sắc, hàm lượng lân tổng số và dễ tiêu trong đất nói chung không cao trừ một vài

trường hợp đặc biệt.
Bảng 2.1 Lân tổng số và dễ tiêu trong đất Việt Nam
Loại đất

Lân tổng số (%)

Lân dễ tiêu (mg/100g đất)

Đất cát biển

0,03 – 0,05

1–5

Đất xám bạc màu

0,03 – 0,08

3–5

Đất đỏ vàng trên đá sét

0,02 – 0,06

2–4

Đất đỏ nâu trên đá vôi

0,10 – 0,20


5 – 10

Đất nâu đỏ trên đá bazan

0,20 – 0,30

3 – 10

Đất vàng nhạt trên đá cát

0,04 – 0,06

1 – 1,5

Đất phù sa hệ thống sông Hồng

0,08 – 0,15

10 – 15

Đất phù sa hệ sông Cửu Long

0,05 – 0,10

1-8

(Nguyễn Tử Siêm và Trần Khải, 1995)

2



Đá mẹ và mẫu chất là yếu tố độ phì nhiêu về tiềm năng lân. Phần lớn các đất núi
có hàm lượng photpho tổng số cao như đất đen nhiệt đới trên macgalit, đất feralit có
mùn trên núi, đất nâu đỏ bazan, tỉ lệ lân tổng số có thể đạt tới 0,3 – 0,5% P2O5. Đất
phát triển trên đá macma chua, như đất đỏ vàng trên phiến thạch, phù sa cổ, có lân
tổng số thấp hơn. Đất đồng bằng phù sa sông Hồng, mặn trung tính kiềm có tỉ lệ lân
trung bình (0,1%), đất ở hệ thống sông suối khác nghèo lân, phần nhiều < 0,05% P2O5 .
Xét về độ phì nhiêu thì thực tế lân tổng số không có ý nghĩa gì nhiều, vì đại bộ
phận lân tổng số ở dạng khó tiêu đối với thực vật. Thành phần các nhóm photphat
phản ứng trung thực tình trạng cung cấp lân của các loại đất và cho những gợi ý về giá
trị khai thác lân trong đất và quản lý lượng bón lân vào đất. Lân hữu cơ trong đất biến
động từ 10 – 15% lân tổng số gồm các phytin, nucleoprotein, leucytin, hợp chất mùn
và các acid hữu cơ chứa lân. Các acid mùn chứa 4 – 5% photpho, trong điều kiện
thuận lợi giải phóng 15 – 20 kg P/ha/năm. Song hầu hết hệ thống cây trồng cân bằng
lân hữu cơ thường bằng không hoặc âm, vì chỉ riêng vi sinh vật đã tiêu tốn hết 10 g
P2O5 để tiêu hủy 1 g cellulose (Nguyễn Tử Siêm và Trần Khải, 1995).
2.2. Sự chuyển hóa photpho nguồn hữu cơ
Các dạng lân hữu cơ thường gặp: phytin, acid nucleic, nucleoprotein,
phospholipid. Sự chuyển hóa này đã được nghiên cứu từ 1911 bởi J.Stoklasa. Những
nghiên cứu đầu tiên này không gây sự chú ý đến nhiều nhà khoa học đương thời. Mãi
cho đến năm 1952 các nhà khoa học mới quan tâm và nghiên cứu khá kỹ khả năng
chuyển hóa các hợp các hợp chất hữu cơ chứa photpho bởi các loại vi sinh vật.
Các kết quả nghiên cứu cho thấy các vi khuẩn Bacillus và Pseudomonas là những
loài vi sinh vật đóng vai trò chủ yếu trong sự chuyển hóa các hợp chất hữu cơ chứa
photpho trong nước và trong đất. Trong loài Baciluss có nhiều giống như Bacillus
mycoides và Bacillus megatherium var. photphotium là những giống có khả năng
chuyển hóa mạnh nhất. Ngoài ra, còn có các giống khác như Bacillus cereus và
Bacillus asterosporus cũng có khả năng chuyển hóa tốt. Quá trình chuyển hóa các hợp
chất hữu cơ chứa photpho thường giải phóng ra acid phosphoric.


3


Nucleoprotein

Nucllin

Protein

Acid nucllin

Các acid amin

Đường Adenin Guamin Timin Cytosine H3PO4 NH3 CO2 H2O H2S Một số chất khác
Sơ đồ 2.1 Sự chuyển hóa nucleoprotein. (Trần Linh Phước, 2002).
Sự chuyển hóa leucytin thành H3PO4 theo cơ chế sau:
Leucytin

Glycerophotphate

H3PO4

Nhờ VSV mà lân hữu cơ được vô cơ hoá thành muối của acid phosphoric. Các
dạng lân này một phần được sử dụng biến thành lân hữu cơ, một phần bị cố định dưới
dạng lân khó tan như Ca3(PO2)2, FePO4, AlPO4. Những dạng lân khó tan này trong
những môi trường có pH thích hợp sẽ chuyển hóa thành dạng dễ tan và vi sinh vật
đóng vai trò quan trọng trong quá trình này.
2.3. Sự chuyển hoá các hợp chất vô cơ chứa photpho
Lân vô cơ thường ở dạng khoáng như: apatit, phosporic, phosphat sắt, phosphat
nhôm. Muốn cây trồng sử dụng được phải chuyển hoá thành dạng dễ tan.

Nghiên cứu sự chuyển hoá các hợp chất vô cơ chứa photpho bắt đầu từ năm 1900
do J.Stokolasa. Ông đã sử dụng giống Bacillus buytrieus để nghiên cứu, ngoài ra ông
còn phát hiện Pseudomonas fluorescens vi khuẩn nitrat hoá, nấm sợi, xạ khuẩn cũng
có khả năng phân giải Ca3(PO4)2 và bột apatit. Các nghiên cứu sau này cho thấy các vi
khuẩn lên men butyric, vi khuẩn lên men lactic, vi khuẩn lên men acetic cũng có khả
năng phân giải Ca3(PO4)2.
Các nhà khoa học cho biết, sự phân giải hợp chất vô cơ có chứa photpho có liên
quan nhiều đến sự tạo acid hữu cơ của giống vi sinh vật, trong đó có sự hình thành
acid carbonic. Acid này đóng vai trò rất quan trọng trong sự chuyển hóa các hợp chất
vô cơ chứa photpho.

4


Quá trình phân giải hợp chất vô cơ chứa photpho trong đất diễn ra như sau:
Ca3(PO4)2 + 4H2CO3 +H2O = Ca(PO4)2H2O + 2Ca(HCO3)2
Trong đất các vi khuẩn nitrat hóa và vi khuẩn lưu huỳnh cũng đóng vai trò rất to
lớn trong quá trình chuyển hóa photpho. Trong quá trình sống của những vi khuẩn này
sẽ tích lũy trong môi trường HNO3 và H2SO4, các acid này đóng vai trò hòa tan
photpho. Quá trình hòa tan này được biểu hiện theo phương trình sau:
Ca3(PO4)2 + 4HNO3 = Ca(H2PO4)2 + 2Ca(NO3)2
Ca3(PO4)2 + 2H2SO4 = Ca(H2PO4)2 + 2CaSO4
Trong thiên nhiên photpho được thực vật hấp thụ thường ở dạng pyrophotphat và
được chuyển hóa thành các hợp chất hữu cơ chứa photpho, từ những chất này nó sẽ
được giải phóng ở dạng photphat.
2.4. Nguồn phân lập vi khuẩn phân giải hợp chất vô cơ chứa photpho
Các nghiên cứu gần đây càng khẳng định rõ vai trò quan trọng của vi sinh vật rễ
trong qua trình thúc đẩy sự phát triển của đất và cây trồng. Nhóm vi sinh vật này bao
gồm các chủng: Alcaligenes, Agrobacterium, Acinetobacter, Azospirillum, Bacillus,
Burkholderia, Enterobacter, Erwinia, Flavobacterium, Paenibacillus, Pseudomonas,

Rhizobium, Serratia…. Chúng được sử dụng như là phân bón sinh học góp phần cải
thiện năng suất cây trồng và phục vụ cho các công trình nghiên cứu. Bản chất của sự
phân giải các hợp chất vô cơ chứa photpho có liên quan tới việc sản xuất ra acid hữu
cơ như: gluconic, 2- ketogluconic.
Bảng 2.2 Nhóm vi sinh vật phân giải 2 loại acid hữu cơ: gluconic, 2- ketogluconic
Acid hữu cơ
Acid Gluconic

Nhóm vi sinh vật
Pseudomonas sp, Erwinia herbicola, Pseudomonas cepacia

Acid 2- ketogluconic Rhizobium legumimosarum, Rhizobium meliloti, Bacillus

Trong đó Bacillus sản xuất ra các loại acid như: lactic, isovaleric, isobutyric và
acid acetic. Các loại acid hữu cơ khác như: glycolic, oxalic, malonic, succinic cũng
được tìm thấy trong quá trình phân giải lân. Nhóm, Bacillus, Agrobacterium,
Rhizobium, Pseudomonas được xem là phân giải lân mạnh nhất. Ngoài ra sự sản sinh
các loại acid vô cơ cũng được tìm thấy trong sự phân giải lân như: acid nitric, acid
5


carbonic, acid sulphideric. Tuy nhiên hiệu quả phân giải lân trong đất lại kém hơn so
với sự sản sinh hữu cơ (Trần Linh Phước, 2002).
2.4.1. Bacillus
Vi khuẩn hình, kích thước tế bào 0,5 – 2,5 x 1,2 – 10 (μm), các tế bào thường
xếp thành từng cặp hay chuỗi. Vách tế bào nhuộm G +, có khả năng di động, có 8-12
tiên mao, sinh bào tử hình bầu dục, nhỏ hơn tế bào vi khuẩn và nằm giữa tế bào.
Thường thì người ta quan sát thấy tập đoàn của giống sinh vật này rất rộng lớn, có
hình dạng bất định và đang phát triển lan rộng. Bacillus có ở mọi nơi trong tự nhiên và
khi điều kiện sống gay go, chúng có khả năng tạo ra bào tử gần như hình cầu, để tồn

tại trong trạng thái "ngủ đông" trong thời gian dài, loại sinh vật này có cực kỳ nhiều
loài khác nhau, trong đó đa số là vô hại. Bào tử Bacillus có dạng elip đến hình cầu,
kích thước chiều rộng 0,6-0,9 , phần lớn được tạo thành ở 48 giờ. Mỗi cá thể chỉ tạo
một bào tử, bào tử có khả năng chịu nhiệt, tia bức xạ, chất sát khuẩn. Bacillus có phản
ứng Catalase dương tính, sử dụng khí oxy làm chất nhận electron khi trao đổi khí trong
quá trình trao đổi chất (Holt, 1994).
2.4.2. Alcaligenes
Vi khuẩn hình que hoặc hình cầu, kính thước tế bào 0,5 – 1 x 0,5 – 2,6 (μm), các
tế bào thường xếp riêng lẻ thành từng que. Vi khuẩn này được tìm thấy nhiều trong đất
và môi trường thủy sản. Vách tế bào mỏng ít peptidoglycan, có nồng độ lipid cao nên
khi nhuộm Gram sẽ bắt màu hồng của thuốc thử Fuschin, do vậy mà vi khuẩn này
nhuộm Gram âm, có khả năng di động, có 1 – 8 tiên mao, hiếu khí bắt buộc, sử dụng
khí oxy làm chất nhận electron khi trao đổi khí trong quá trình trao đổi chất. Phản ứng
nitrate dương tính , phát triển tốt nhất ở 20 – 370C. Phản ứng Catalase dương tính,
oxdase dương tính, indol âm tính, không sử dụng cellulose, esculin, gelatin. Sử dụng
nguồn carbon từ các acid hữu cơ và các amino acid, các nguồn carbohydrates không
được sử dụng (Holt, 1994).
2.4.3. Agrobacterium
Vi khuẩn sống nhiều ở vùng rễ của cây trồng và mô thực vật, tế bào hình que với
kích thước 0,6- 1 x 1,5 – 3 (μm), tế bào thường tồn tại thành các cặp hoặc đứng riêng
rẽ, không sinh bào tử, vách tế bào mỏng ít peptidoglycan, có nồng độ lipid nên khi
nhuộm Gram sẽ bắt màu hồng của thuốc thử Fuschin, do vậy mà vi khuẩn này nhuộm
Gram âm, di động, có 1 – 6 tiên mao. Là nhóm vi khuẩn hiếu khí và sử dụng khí oxy
6


làm chất nhận electron khi trao đổi khí trong quá trình trao đổi chất, nhiệt độ phát triển
thích hợp nhất là 25 - 280C. Khuẩn lạc trên môi trường thạch dinh dưỡng có hình lồi
và tròn. Các phản ứng catalase, oxidase, urease đều dương tính, sử dụng nguồn cacbon
từ muối của acid hữu cơ, các amino acid, không sử dụng cellulose, tinh bột, glucose,

D-galactose và các carbohydrates khác (Holt, 1994).
2.5. Điều kiện ngoại cảnh ảnh hưởng đến sự phát triển vi khuẩn phân giải lân
Độ pH: nhìn chung pH ảnh hưởng không nhiều đến vi sinh vật phân giải lân. Tuy
nhiên ở pH 7,8 – 7,9 ảnh hưởng tốt đến sự phát triển của hệ vi sinh vật phân giải lân.
Độ ẩm: những nơi ngập nước làm tăng quá trình phân giải lân.
Hợp chất hữu cơ: hàm lượng chất hữu cơ mùn hóa không ảnh hưởng đến quá trình
phân giải lân. Hợp chất hữu cơ tươi làm tăng sự sinh trưởng của hệ vi sinh vật dẫn đến
tăng quá trình hòa tan hợp chất lân khó tan.
Hệ rễ: hệ rễ cây trồng kích thích sự phát triển của hệ sinh vật phân giải lân khó tan.
2.6. Phân hữu cơ vi sinh
Từ các mẫu đất, nước, rễ cây các chủng giống vi sinh vật được phân lập, tuyển
chọn, đánh giá và lưu giữ bảo quản tại các phòng thí nghiệm dưới dạng bộ sưu tập quỹ
gen. Các vi sinh vật sử dụng trong nghiên cứu và sản xuất phân bón bao gồm các sinh
vật cố định nitơ sống cộng sinh với cây bộ đậu (Rhizobium, Bzadyrhizobium), sống tự
do trong đất, nước (Azotobacter, Clostridium, Arthrobacter, Klebsiella, Serratia,
Pseudomonas, Bacillus, vi khuẩn lam...) hay sống hội sinh trong vùng rễ cây trồng
(Azospirillum), vi sinh vật phân giải lân (Bacillus, Pseudomonas, Penicillium,
Aspergillus, Fussarium, Candida), vi sinh vật phân giải xelluloza (Trichoderma,
Chetomium, Aspergillus, Gliogladium...), vi sinh vật sinh tổng hợp hoạt chất kích
thích sinh trưởng thực vật (Agrobacterium, Flavobacterium, Bacillus, Enterobacter,
Azotobacter, Gibberella...) và các vi sinh vật đối kháng vi sinh vật gây bệnh vùng rễ
cây.
Phân bón vi sinh vật (phân vi sinh) là sản phẩm chứa vi sinh vật sống, đã được
tuyển chọn có mật độ phù hợp với tiêu chuẩn ban hành, thông qua các hoạt động sống
của chúng tạo nên các chất dinh dưỡng mà cây trồng có thể sử dụng được như nitơ,
photpho, lưu huỳnh, sắt hay các hoạt chất sinh học, góp phần nâng cao năng suất, chất
lượng nông sản. Phân vi sinh vật phải bảo đảm không gây ảnh hưởng xấu đến người,
động, thực vật, môi trường sinh thái và chất lượng nông sản (TCVN 6168, 2002).
7



Cây xanh

Động vật
Ion PO4-3 trong dung dịch đất
Ion PO4-3 bị hấp thụ

Quá trình khoáng

Hòa tan

Quá trình cố định

Photpho vô cơ
Cố định tạm thời

Chất hữu cơ tươi và tế bào vi sinh vật
Chất hữu cơ mùn hóa
Sơ đồ 2.2 Vòng tuần hoàn photpho trong tự nhiên. (Nguyễn Xuân Thành, 2003)
2.7. Đường cong sinh trưởng của vi khuẩn
Người ta nghiên cứu sự sinh trưởng vi khuẩn bằng cách phân tích đường cong
sinh trưởng môi trường nuôi cấy vi khuẩn. Khi vi khuẩn được nuôi cấy trong môi
trường lỏng, được phát triển trong hệ thống kín, không được cung cấp chất dinh dưỡng
trong quá trình ủ, thì lượng cơ chất dinh dưỡng sẽ giảm và chất thải sẽ tăng. Sự sinh
trưởng của vi khuẩn theo hình thức trực phân sẽ được chia thành 4 giai đoạn.
Phase tiềm phục
Khi vi khuẩn đưa vào môi trường nuôi cấy mới, sẽ không có sự gia tăng ngay lập
tức số lượng hay sinh khối tế bào. Một phase tiềm phục trước khi tế bào bắt đầu phân
chia thì cần thiết bởi nhiều lý do sau: tế bào già và thiếu năng lượng, thiếu các
coenzyme cần thiết và thiếu ribosome. Môi trường nuôi cấy có thể khác với môi

trường trước đây mà vi khuẩn sống. Trong trường hợp này tế bào có thể cần những
enzyme mới để sử dụng được những cơ chất dinh dưỡng mới. Vi khuẩn có thể bị tổn
thương và đòi hỏi một thời gian để hồi phục.
8


Phase cấp số
Trong phase này vi khuẩn sẽ phân chia ớ mức cực đại, điều này phụ thuộc vào
khả năng di truyền của chúng, bản chất của môi trường và điều kiện nuôi cấy. Vận tốc
tăng trưởng không thay đổi trong phase cấp số, vi khuẩn phân chia và nhân đôi trong
một khoảng thời gian đều đặn.
Phase ổn định
Ở phase ổn định, mỗi loại vi khuẩn sẽ có mật độ tối đa khác nhau. Có nhiều lý
do khiến vi khuẩn đi vào phase ổn định là do sự giới hạn về chất dinh dưỡng. Sinh vật
hiếu khí thì bị giới hạn bởi O2, bởi vì O2 không dễ được hòa tan và được tiêu thụ
nhanh chóng nên chỉ có ở bề mặt canh trùng là có nồng độ O2 đủ cho dự tăng trưởng.
Sự tích lũy những chất độc hại cũng làm dừng sự tăng trưởng.
Phase tử vong
Một biến đổi có hại của môi trường là thiếu chất dinh dưỡng, tích tụ các chất
độc, sẽ làm giảm số lượng tế bào sống. Đây là nét đặc trưng của phase tử vong. Số
lượng tế bào trong phase này không thay đổi, vì tế bào không tự ly giải sau khi chết.

9


Chương 3
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Thời gian và địa điểm
Thời gian tiến hành thí nghiệm từ ngày 03/2009 đến cuối 06/2009
Tất cả các thí nghiệm được thực hiện tại viện Công Nghệ Sinh Học - Công Nghệ

Môi Trường - Trường đại học Nông Lâm Tp.Hồ Chí Minh.
3.2. Vật liệu
3.2.1. Mẫu đất phân lập
Mẫu đất phân lập được lấy từ 4 vùng Đồng Nai, Bình Dương, Hóc Môn, Củ Chi.
Ở mỗi vùng thu nhận 10 mẫu khác nhau, tổng số mẫu đất thu được là 40 mẫu.

Hình 3.1 Các mẫu đất thu nhận ở 4 vùng. a: mẫu đất Đồng Nai, b: mẫu đất Bình
Dương, c: mẫu đất Hóc Môn, d: mẫu đất Củ Chi.

10


Bảng 3.1 Ký hiệu các mẫu đất thu nhận được
Vị trí lấy mẫu, ấp, xã, huyện, tỉnh
Kí hiệu mẫu
(2)
(1)
DN 1
Vườn Bắp, Hưng Long, Hưng Thịnh, huyện Thống Nhất, Đồng Nai
DN2

Vườn Mía, Hưng Nghĩa, Hưng Lộc, huyện Thống Nhất, Đồng Nai

DN3

Vườn cây Nam Bộ, Hưng Lộc, Thống Nhất, Đồng Nai

DN4

Vườn Cà Phê, Quang Trung, Thống Nhất, Đồng Nai


DN5

Vườn Cao Su, Quốc lộ 1A, thị trấn Trảng Bom, Đồng Nai

DN6

Vườn Tiêu, Lê Lợi, Quang Trung, Thống Nhất, Đồng Nai

DN7

Vườn Chôm Chôm, Lê Lợi, Quang Trung, Thống Nhất, Đồng Nai

DN8

Vườn Cải Ngọt, Lê Lợi, Quang Trung, Thống Nhất, Đồng Nai

DN9

Vườn Xoài, đường Võ Thị Sáu, thành phố Biên Hòa, Đồng Nai

DN10

Vườn Bí Đỏ, Lê lợi, Quang Trung, Thống Nhất, Đồng Nai

BD1

Vườn Măng Cụt, Bình Đức, Bình Nhâm, Dĩ An, Bình Dương

BD2


Vườn Nhãn, Hưng Thọ, Hưng Định, Thuận An, Bình Dương

BD3

Vườn Bưởi, Chi Liêu, Tân Đông Hiệp, Dĩ An, Bình Dương

BD4

Vườn Đu Đủ, Bình Đức, Bình Nhâm, Thuận An, Bình Dương

BD5

Vườn Cà Pháo, Tân Long, Tân Đông Hiệp, Dĩ An, Bình Dương

BD6

Vườn Bòn Bon, Hưng Phước, Hưng Định, Thuận An, Bình Dương

BD7

Vườn Samboche, Hưng Thọ, Hưng Định, Thuận An

BD8

Vườn Xà Cừ, Tân Long, Tân Đông, Dĩ An, Bình Dương

BD9

Vườn Mít, Bình Đức, Bình Nhâm, thị trấn Lái Thiêu, Bình Dương


BD10

Vườn Bí Đỏ, Chi Liêu, Tân Đông Hiệp, Dĩ An, Bình Dương

HM1

Vườn Bông Cải, ấp 4, Xuân Thới Thượng, Hóc Môn

HM2
HM3

Vườn Cải, ấp 4, Xuân Thới Thượng, Hóc Môn
Vườn Đậu Bắp, ấp 4 , Xuân Thới Sơn, Hóc Môn

HM4

Vườn rau Bạc Hà, ấp 3, Xuân Thới Sơn, Hóc Môn

HM5

Vườn Bắp, ấp 4, Xuân Thới Thượng, Hóc Môn

HM6

Vườn Dưa Leo, ấp 2, Xuân Thới Thượng, Hóc Môn

HM7

Vườn Khổ Qua, ấp 4, Xuân Thới Thượng, Hóc Môn


11


(2)

(1)

Vườn Bí Đỏ, ấp 4, Xuân Thới Thượng, Hóc Môn

HM8
HM9

Vườn Đậu Bắp, ấp 5, Xuân Thới Thượng, Hóc Môn

HM10

Vườn Bí Chanh, ấp 4, Xuân Thới Thượng, Hóc Môn

CC1

Vườn Thanh Long, ấp Thượng, Tân Thông Hội, Hóc Môn

CC2

Vườn Cải, ấp Thượng, Tân Phú Trung, Hóc Môn

CC3

Vườn Tràm, ấp Thượng, xã Tân Thông Hội, Hóc Môn


CC4

Vườn rau Muống, ấp Trạm Bơm, Tân Phú Trung, Hóc Môn

CC5

Vườn Na, ấp Thượng, Tân Thông Hội, Hóc Môn

CC6

Vườn rau Thơm, ấp Tân Tiến, Tân Thông Hội, Hóc Môn

CC7

Vườn Thơm, ấp Chợ, Tân Phú Trung, Hóc Môn

CC8
CC9

Vườn Mía, ấp Tân Tiến, Tân Thông Hội, Hóc Môn

CC10

Vườn Bí Đỏ, ấp Tân Tiến, Tân Thông Hội, Hóc Môn

Vườn Xoài, ấp Trạm Bơm, Tân Phú Trung, Hóc Môn

3.2.2. Dụng cụ và thiết bị
+ Lò Microwave + Kính hiển vi

+ Máy lắc + Màng lọc vô trùng
+ Tủ sấy

+ Nồi hấp vô trùng autoclave

Và một số dụng cụ cơ bản khác của phòng thí nghiệm vi sinh
3.2.3. Hóa chất
 Môi trường phân lập vi khuẩn phân giải lân vô cơ là môi trường PVK (TCVN
6167,1996).
 Môi trường nước bột thịt (nhân sinh khối vi khuẩn).
 Môi trường PGA( giữ giống vi khuẩn).
 Môi trường TSI để thử nghiệm phản ứng TSI.
 Môi trường SCA để thử nghiệm khả năng biến dưỡng Citrate.
 Môi trường Urea Broth Rustigian – Stuart.
 Môi trường nước trypton đểt thử nghiệm khả năng sinh Indol.
 Môi trường MR – VP Broth để thử nghiệm phản ứng Methyl Red.
 Môi trường lỏng Clark – Lub (môi trường MR – VP)

12


3.3. Phương pháp thí nghiệm
3.3.1. Phân lập và làm thuần
Vi sinh vật hiện diện trong tự nhiên ở các dạng quần xã gồm nhiều quần thể.
Việc nghiên cứu một quần thể VSV nhất định (tập hợp các tế bào cùng loài) sẽ phụ
thuộc nhiều vào khả năng phân lập, làm thuần tế bào của quần thể, khả năng giữ giống.
Hầu hết các nghiên cứu đều thực hiện trên chủng thuần. Phần lớn các phương pháp
phân lập và làm thuần các chủng VSV đều dựa trên một số kỹ thuật pha loãng kết hợp
với điều kiện nuôi cấy chọn lọc tạo ưu thế cho chủng quan tâm. Môi trường cần phân
lập và làm thuần vi khuẩn phân giải lân vô cơ là môi trường PVK.

3.3.2. Lấy mẫu
Mẫu đất được lấy ở các vùng trồng hoa màu ở Hóc Môn, Củ Chi, Bình Dương,
mỗi vùng lấy 10 mẫu. Đối với mỗi tỉnh vùng lấy 10 loại đất khác nhau nhằm mục đích
xác định mật số vi khuẩn phân giải lân vô cơ trên từng vùng, từng loại cây từ đó đánh
giá được loại đất và cây trồng nào thích hợp cho chủng vi khuẩn phân giải lân vô cơ
phát triển. Mẫu được lấy bằng cách: cào lấy phần đất cách mặt đất khoảng 2cm (lấy
gần ở phần có rễ cây vì đó là nơi có chứa nhiều loại vi khuẩn sống có lợi).
3.3.3. Phân lập và chọn lọc
Phơi 10 g đất tươi ở nhiệt độ phòng (để loại bỏ bớt những vi sinh vật tạp). Cho
10 g đất đã phơi khô và 90 ml nước cất vô trùng vào bình tam giác 250ml, bỏ vào máy
lắc để đồng nhất mẫu trong 15 phút, để yên vài phút sau khi lắc, sau đó hút 1 ml mẫu
và tiến hành pha loãng mẫu thành các nồng độ 10-2, 10-3, 10-4, 10-5. Hút 0,1 ml mẫu
lần lượt ở các nồng độ 10-2, 10-3, 10-4, 10-5 trải lên môi trường rắn PVK tương ứng và
ủ ở nhiệt độ phòng.
3.3.4. Làm thuần vi khuẩn
Sử dụng môi trường PVK để làm thuần bằng 2 phương pháp: cấy ria và chấm
thành từng điểm, thực hiện liên tiếp 3 – 4 lần
3.3.5. Bảo quản giống vi khuẩn
Sau khi giống vi khuẩn được làm thuần 3- 4 lần trên môi trường PVK tiến hành
giữ giống trên môi trường PGA, môi trường này sau 3 tháng phải cấy chuyển một lần.
Ngoài ra chủng thuần còn được giữ trong Glycerol 35-50%, bảo quản trong điều
kiện -20oC . Thực hiện bằng cách: cắt 2 miếng thạch trên môi truờng PVK chứa 2

13