BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
******************

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG KHÁNG THỂ VÀ MỘT SỐ
CHỈ TIÊU MÁU SAU KHI CHỦNG NGỪA VACCINE PHÒNG
HỘI CHỨNG CÒI CỌC TRÊN HEO SAU CAI SỮA (PMWS)

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Sinh viên thực hiện: NGUYỄN THỊ THU GIANG
Niên khóa: 2005 – 2009

Tháng 08/2009


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
******************

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
KHẢO SÁT HÀM LƯỢNG KHÁNG THỂ VÀ MỘT SỐ
CHỈ TIÊU MÁU SAU KHI CHỦNG NGỪA VACCINE PHÒNG
HỘI CHỨNG CÒI CỌC TRÊN HEO SAU CAI SỮA (PMWS)

Hướng dẫn khoa học
TS. NGUYỄN TẤT TOÀN

Sinh viên thực hiện

NGUYỄN THỊ THU GIANG

ThS. HỒ THỊ NGA

Tháng 08/2009


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất đến bố mẹ, người đã luôn yêu
thương, động viên tôi trong suốt những năm học vừa qua.
Tôi vô cùng biết ơn Phó Giáo Sư – Tiến Sĩ Trần Thị Dân, người đã mang cơ
hội tới cho tôi được tham gia đề tài này.
Tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến giáo viên hướng dẫn của tôi là Tiến Sĩ
Nguyễn Tất Toàn và Thạc Sĩ Hồ Thị Nga đã hết lòng hỗ trợ, dẫn dắt tôi hoàn thành
tốt đề tài.
Tôi cũng chân thành cảm ơn Kỹ Sư Lê Văn Huy, Kỹ Sư Nguyễn Minh Nam,
và các anh chị lớp DH04DY và DH04TY đã nhiệt tình giúp đỡ cho tôi hoàn thành tốt
công việc trong thời gian thực tập.
Xin gửi lời cảm ơn đến tất cả bạn bè của tôi, những người đã hết lòng động
viên tôi giúp tôi có nghị lực vượt qua những khó khăn.
Thành phố Hồ Chí Minh 15/ 07/ 2009
NGUYỄN THỊ THU GIANG

iii


TÓM TẮT
Đề tài “Khảo sát hàm lượng kháng thể và một số chỉ tiêu máu sau khi chủng
ngừa vaccine phòng hội chứng còi cọc trên heo sau cai sữa – PMWS” được thực hiện
từ tháng 2/2009 đến tháng 7/2009 tại hai trại chăn nuôi heo công nghiệp. Đề tài đã

thực hiện các kỹ thuật xét nghiệm chỉ tiêu máu như số lượng hồng cầu, bạch cầu, tiểu
cầu, hàm lượng hemoglobin, chỉ số hematocrit và xác định công thức bạch cầu trong
máu heo lô đối chứng không chủng vaccine và lô thí nghiệm được chủng vaccine
phòng PMWS. Bên cạnh đó chúng tôi còn tiến hành xét nghiệm hiệu giá kháng thể
trong huyết thanh ly trích từ máu của hai nhóm heo trên bằng kỹ thuật ELISA; tối ưu
hóa quy trình ELISA đã thực hiện để đưa ra quy trình hoàn thiện nhất cho người
nghiên cứu sau.
Mục đích của đề tài nhằm đánh giá hiệu quả của loại vaccine được sử dụng
trong nghiên cứu thông qua xác định hàm lượng kháng thể bằng kỹ thuật ELISA và
các chỉ tiêu sinh lý máu để đưa ra những khuyến cáo cho người chăn nuôi trong việc
sử dụng vaccine phòng bệnh PMWS.
Qua khảo sát các chỉ tiêu sinh lý máu giữa heo lô thí nghiệm được chủng ngừa
vaccine phòng PMWS và heo lô đối chứng không chủng ngừa cho thấy không có sự
khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê.
Trong nghiên cứu này, bằng kỹ thuật ELISA chúng tôi đã xét nghiệm hiệu giá
kháng thể trên nhóm heo được chủng ngừa vaccine và nhóm đối chứng không được
chủng ngừa từ đó rút ra được nhận xét đó là hiệu giá kháng thể ở nhóm được chủng
ngừa cao hơn có ý nghĩa so với nhóm heo đối chứng tại thời điểm tái chủng lần thứ
hai với P < 0,05.
Chúng tôi đã khảo sát những yếu tố có thể ảnh hưởng đến kết quả của thí
nghiệm như quy trình lấy mẫu, nhiệt độ phòng thí nghiệm, nhiệt độ ủ đĩa ELISA, thể
tích hóa chất sử dụng từ đó khuyến cáo quy trình ELISA tối ưu nhất.

iv


SUMMARY
“Evaluation of antibody titer and hematology in pigs after vaccination against
postweaning multisystemic wasting syndrome – PMWS”
This thesis was carried out from February to July, 2009 in two pig farms.

The aim of this study was to evaluate the effect in the use of vaccine against
PMWS by determination of the titer of antibodies by ELISA and hematological
examination in pigs. From that, we can recommend some suggestions to farmers for
using vaccine against PMWS.
The results of hematological examination showed that there was no significant
difference between immunized and control pigs groups.
In this study, with ELISA method we tested antibodies titer between pigs
immunized with vaccine against PMWS and control groups. We recognized that pigs
immunized with vaccine against PMWS induced significantly high serum antibodies
level response to PCV2 compared to control group after second boosting with P <
0.05.
To optimise the ELISA procedure, we conducted some factors that can
influence on the results such as: sampling process, lab temperature, incubation
temperature or volume of uesd chemical then, we suggested a suitable ELISA
procedure to ensure the precision of result.

v


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN.....................................................................................................................iii
TÓM TẮT........................................................................................................................... iv
SUMMARY......................................................................................................................... v
MỤC LỤC .......................................................................................................................... vi
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ............................................................................... ix
DANH SÁCH CÁC BẢNG ................................................................................................ x
DANH SÁCH CÁC HÌNH.................................................................................................. x
CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề..................................................................................................................... 1
1.2. Mục đích ....................................................................................................................... 2

1.3. Yêu cầu ......................................................................................................................... 2
1.4. Nội dung thực hiện ....................................................................................................... 2
CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu về hội chứng PMWS và PCV2.................................................................... 3
2.1.1. Lịch sử bệnh .............................................................................................................. 3
2.1.2. Hội chứng PMWS do PCV2...................................................................................... 4
2.1.3. Đặc điểm virus gây bệnh ........................................................................................... 4
2.1.4. Dịch tễ........................................................................................................................ 5
2.1.5. Cách sinh bệnh .......................................................................................................... 6
2.1.6. Triệu chứng................................................................................................................ 6
2.1.7. Một số bệnh thường nhiễm kèm với virus PCV2...................................................... 6
2.1.7.1. Hội chứng viêm da viêm thận - PDNS................................................................... 6
2.1.7.2. Hội chứng hô hấp phức tạp trên heo - PRDC......................................................... 7
2.1.7.3. Chứng run bẩm sinh - CT....................................................................................... 7
2.1.7.4. Virus gây cúm heo - SIV ........................................................................................ 7
2.1.8. Bệnh tích đại thể và vi thể ......................................................................................... 8
2.1.9. Chẩn đoán .................................................................................................................. 8
2.1.10. Phòng và điều trị bệnh do PCV2 ............................................................................. 8
2.1.10.1. Phòng bệnh ........................................................................................................... 8
vi


2.1.10.2. Điều trị.................................................................................................................. 9
2.2.10.3. Vaccine phòng hội chứng PMWS trên heo .......................................................... 9
2.2. Tổng quan về sinh lý máu heo.................................................................................... 12
2.2.1. Hồng cầu.................................................................................................................. 12
2.2.2. Bạch cầu .................................................................................................................. 13
2.2.3. Tiểu cầu ................................................................................................................... 13
2.2.4. Tỉ dung (Hematocrit)............................................................................................... 14
2.2.5. Công thức bạch cầu ................................................................................................. 14

2.3. Tổng quan về ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) ............................... 14
2.3.1. Nguyên lý kỹ thuật ELISA ...................................................................................... 14
2.3.2. ELISA trực tiếp ....................................................................................................... 15
2.3.3. ELISA gián tiếp....................................................................................................... 16
2.3.4. Sandwich ELISA ..................................................................................................... 16
2.4. Một số công trình nghiên cứu trong và ngoài nước ................................................... 17
CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Thời gian và địa điểm thí nghiệm............................................................................... 19
3.2. Đối tượng thí nghiệm.................................................................................................. 19
3.3. Vật liệu và hóa chất sử dụng ...................................................................................... 19
3.4. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................................ 20
3.4.1. Bố trí thí nghiệm...................................................................................................... 20
3.4.2. Lấy mẫu xét nghiệm ................................................................................................ 20
3.4.3. Thực hiện các chỉ tiêu sinh lý máu.......................................................................... 21
3.4.3.1. Xác định số lượng hồng cầu ................................................................................. 21
3.4.3.2. Xác định số lượng bạch cầu ................................................................................. 21
3.4.3.3. Xác định công thức bạch cầu................................................................................ 22
3.4.3.4. Xác định hàm lượng hemoglobin ......................................................................... 22
3.4.3.5. Xác định chỉ số hematocrit ................................................................................... 22
3.4.4. Khảo sát hiệu quả chủng ngừa vaccine bằng phương pháp ELISA ........................ 22
3.4.4.1. Nguyên tắc bộ kit SERELISA.............................................................................. 22
3.4.4.2. Pha loãng mẫu ...................................................................................................... 23
3.4.4.3. Tiến hành phản ứng .............................................................................................. 24
3.4.5. Đánh giá quy trình ELISA....................................................................................... 25
vii


3.4.6. Xử lý số liệu ............................................................................................................ 26
CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Kết quả khảo sát các chỉ tiêu sinh lý máu .................................................................. 27

4.1.1. Số lượng hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu, hàm lượng Hb, chỉ số Ht .......................... 27
4.1.2. Công thức bạch cầu ................................................................................................. 29
4.1.3. Nhận xét quy trình thực hiện khảo sát các chỉ tiêu máu.......................................... 32
4.2. Kết quả khảo sát hiệu giá kháng thể bằng kỹ thuật ELISA........................................ 33
4.3. Đánh giá quy trình ELISA.......................................................................................... 36
CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ
5.1. Kết luận....................................................................................................................... 40
5.2. Đề nghị ....................................................................................................................... 40
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................. 41
PHỤ LỤC

viii


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
BC: Bạch cầu
CT: Congenital Tremor
CD: Conjugate Dilute
CJ: Conjugate
CV: Coefficient of Variation
EDTA: ethylenediamine tetraacetic acid
ELISA: Enzyme Linked Immunosorbent Assay
Eu: ELISA unit
Hb: Hemoglobin
Ht: Hematocrit
ISU - VDL: Iowa State University - Vet Diagnostic Lab
N: Negative
ORF: Open Reading Frame
P: Positive
PCV1: Porcine circovirus type 1

PCV2: Porcine circovirus type 2
PDNS: Porcine Dermatitis and Nephropathy Syndrome
PMWS: Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome
PRDC: Porcine Respiratory Disease Complex
PRV: Pseudorabies Virus
PS: Peroxidase
W: Washing
S: Subject
SD: Subject Dilute
USDA: United States Department of Agriculture

ix


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Trang
Bảng 2.1 Công thức bạch cầu máu heo.......................................................................15
Bảng 3.1 Nội dung bố trí thí nghiệm ở trại (A) và trại (B).........................................21
Bảng 3.2 Tiền pha loãng mẫu ở các nồng độ 1:10; 1:100; và 1:1000 ........................25
Bảng 3.3 Sơ đồ bố trí các mẫu thí nghiệm ELISA .....................................................26
Bảng 4.1 Hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu, hàm lượng Hb và chỉ số Ht heo trại (A)......28
Bảng 4.2 Hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu, hàm lượng Hb và chỉ số Ht heo trại (B) ......29
Bảng 4.3 Công thức bạch cầu heo trại (A) qua các lần khảo sát ................................31
Bảng 4.4 Công thức bạch cầu heo trại (B) qua các lần khảo sát.................................32
Bảng 4.5 Hiệu giá kháng thể heo ở trại (A) qua các lần khảo sát...............................35
Bảng 4.6 Hiệu giá kháng thể heo ở trại (B) qua các lần khảo sát ...............................36
Bảng 4.7 Kết quả giá trị CV qua 3 lần khảo sát và CV trung bình.............................38

DANH SÁCH CÁC HÌNH
Trang

Hình 2.1 Porcine Circovirus type 2 nhìn dưới kính hiển vi điện tử ...........................4
Hình 2.2 Vaccine Circumvent™ PCV........................................................................11
Hình 2.3 Vaccine Circovac®......................................................................................12
Hình 2.4 Phương pháp Sandwich ELISA ...................................................................18
Hình 3.1 Bộ kit SERELISA® PCV2 Ab Mono Blocking..........................................24
Hình 4.1 Lâm ba cầu (1) và bạch cầu đơn nhân (2)....................................................31
Biểu đồ 4.2 Hiệu giá kháng thể heo ở trại (A)............................................................35
Biểu đồ 4.3 Hiệu giá kháng thể heo ở trại (B) ............................................................36

x


Chương 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Trong những năm gần đây, với chính sách mở cửa hòa nhập với khu vực và thế
giới, nền kinh tế Việt Nam được thúc đẩy và phát triển không ngừng trên mọi lĩnh vực
đặc biệt là ngành nông nghiệp, trong đó ngành chăn nuôi heo đóng một vai trò hết sức
quan trọng. Ngày nay nhiều thành tựu khoa học kỹ thuật đã được ứng dụng rộng rãi
giúp cải thiện năng suất một cách đáng kể.
Bên cạnh những thuận lợi trên thì ngành chăn nuôi heo vẫn còn tồn tại một số
khó khăn nhất định, đáng quan tâm hơn cả là việc phòng ngừa và kiểm soát dịch bệnh.
Một trong những bệnh ảnh hưởng đến năng suất chăn nuôi heo là hội chứng còi cọc
trên heo sau cai sữa (Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome – PMWS). Hội
chứng này do virus PCV2 (Porcine Circovirus type 2) gây ra. Heo mắc hội chứng
PMWS thường bị phụ nhiễm với các mầm bệnh khác.
Gần đây, nhiều trại chăn nuôi heo trong nước đang gặp phải tình trạng tỷ lệ heo
còi tăng lên đáng kể (trích dẫn bởi Lê Nguyễn Phương Khanh, 2006). Vì vậy để góp
phần cải thiện tình hình nhằm hạn chế hội chứng PMWS, nhiều nhà chăn nuôi đã và
đang áp dụng chương trình chủng ngừa cho heo con. Tuy nhiên việc sử dụng vaccine

có đạt hiệu quả tốt hay không vẫn còn đang là vấn đề cần được quan tâm. Hơn nữa
việc khảo sát cơ thể thú sau khi chủng ngừa vaccine có làm thay đổi các chỉ tiêu sinh
lý hay không là cần thiết. Xuất phát từ tình hình trên, nhằm mục đích đưa ra những
khuyến cáo cần thiết cho người chăn nuôi trong việc phòng ngừa và ngăn chặn hội
chứng PMWS; chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Khảo sát hiệu giá kháng thể và
một số chỉ tiêu máu sau khi chủng ngừa vaccine phòng hội chứng còi cọc trên heo sau
cai sữa (Postweaning Multisystemic Wasting Syndrome - PMWS)”.

1


1.2. Mục đích
Đánh giá hiệu quả sử dụng của vaccine thông qua việc xác định hiệu giá kháng
thể và các chỉ tiêu sinh lý máu để đưa ra những khuyến cáo cho người chăn nuôi trong
việc ngăn chặn và phòng ngừa bệnh PMWS.
1.3. Yêu cầu
- Bố trí thí nghiệm trên hai trại heo công nghiệp: lô thí nghiệm được tiêm vaccine
phòng hội chứng còi cọc trên heo sau cai sữa và lô đối chứng không được tiêm
vaccine.
- Thu thập mẫu máu của heo ở các lô
- Tiến hành khảo sát các chỉ tiêu sinh lý máu
- Ly trích huyết thanh từ máu không kháng đông của các nhóm heo trên
- Xác định hiệu giá kháng thể trong huyết thanh bằng phương pháp ELISA
- Đánh giá quy trình ELISA đã thực hiện
1.4. Nội dung thực hiện
- Khảo sát một số chỉ tiêu sinh lý máu: số lượng hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu, hàm
lượng hemoglobin, chỉ số hematocrit, công thức bạch cầu.
- Khảo sát hiệu giá kháng thể kháng PCV2 sau khi chủng ngừa vaccine
- Đánh giá quy trình kỹ thuật ELISA


2


Chương 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu về hội chứng PMWS và PCV2
Từ khoảng 5 năm trở lại đây, ngành chăn nuôi heo tại Bắc Mỹ đã phải gánh
chịu nhiều thiệt hại quan trọng gây nên bởi Porcine Circovirus type 2 (PCV2). Heo
con sau thời gian dứt sữa bị èo uột, ốm o gầy còm, nuôi không lớn, không tăng trọng,
khi thì trắng bạch, khi thì vàng da. Người ta gọi đây là hội chứng còi cọc trên heo sau
cai sữa (Postweaning multisystemic wasting syndrome – PMWS). Hiện nay Circovirus
cũng được báo cáo đang có mặt tại Việt Nam. Đây là một bệnh rất phức tạp và thường
kết hợp với nhiều bệnh lý khác (Nguồn: www.khoahoc.net).
Nhiều nghiên cứu còn cho biết PCV2 có liên quan đến các hội chứng khác trên
heo như: hội chứng viêm da viêm thận trên heo (PDNS – Porcine Dermatitis and
Nephropathy Syndrome), hội chứng hô hấp phức tạp trên heo (PRDC – Porcine
Respiratory Disease Complex), chứng run bẩm sinh trên heo (CT – Congenital
Tremor). Những hội chứng này có thể xuất hiện cùng với PMWS, gây khó khăn cho
việc chẩn đoán (Chae, 2005).
2.1.1. Lịch sử bệnh PMWS
Porcine Circovirus được phân lập lần đầu tiên vào năm 1974 bởi Tischer và ctv.
Virus này có khả năng gây nhiễm trên tế bào thận heo PK-15 (Weingartl, 2002).
Bệnh được báo cáo xuất hiện ở miền Tây Canada vào năm 1991 (Neumann và
ctv, 2002) và lần đầu tiên được chẩn đoán ở Đan Mạch vào năm 2000. Vào tháng
4/2005, ở Đan Mạch đã có 541 ca bị nhiễm (Baekbo, 2005). Năm 1997, một loại
Circovirus mới (PCV2) đã được phân lập. Từ đó đến nay, các nhà nghiên cứu đã tái
gây nhiễm thành công bằng cách tiêm PCV2 cho heo trong phòng thí nghiệm. Các
trường hợp gây bệnh đã gia tăng từ 37 vào năm 1997 lên đến 1.116 vào năm 2002 tại
phòng thí nghiệm Chẩn Đoán Thú Y Trường Đại Học Bang Iowa (ISU-VDL)
().

Cũng theo Neumann và ctv (2002) những mẫu huyết thanh heo tại Mỹ lưu trữ
từ năm 1969 khi đem xét nghiệm tìm kháng thể kháng PCV2 đã cho kết quả dương
tính. Hiện nay PMWS được báo cáo có ở hầu hết các nước nuôi heo trên toàn thế giới.
3


2.1.2. Hội chứng PMWS do PCV2
Cụm từ PMWS được dùng để chỉ căn bệnh thường thấy ở heo con từ 60 – 80
ngày tuổi với các dấu hiệu gầy yếu, tiêu chảy, da tái hoặc bị vàng da và tỷ lệ chết có
thể dao động từ 1 – 2% đến 10 – 25% (Nguyễn Ngọc Hải, 2007).
PMWS gây thiệt hại kinh tế đáng kể và ảnh hưởng đến sức khỏe đàn heo trong
ngành chăn nuôi heo công nghiệp của nhiều quốc gia. Ngày nay, Circovirus thường
được thấy kết hợp với những bệnh khác như viêm phổi, hội chứng bệnh ngoài da và
thận (Porcine Dermatitis - Nephropathy Syndrome), viêm ruột (Enteritis), xảo thai và
xáo trộn sinh sản (Abortion - Reproductive Failure) ở heo nái. Trên heo sau cai sữa thì
các biểu hiện như giảm cân, chậm lớn, viêm khớp và hô hấp có chiều hướng gia tăng
(www.khoahoc.net).
2.1.3. Đặc điểm virus gây bệnh
Theo Nguyễn Ngọc Hải (2007) virus gây PMWS là một DNA virus chuỗi đơn
dạng vòng, không vỏ bọc, đối xứng hai mươi mặt, thuộc họ Circoviridae, thường được
gọi là Porcine Circovirus (PCV). Khi nghiên cứu về Circovirus, người ta nhận thấy có
hai loại PCV: PCV1 và PCV2. PCV1 được phân lập vào năm 1974, thường nhiễm vào
môi trường nuôi cấy tế bào thận heo PK-15 và không gây bệnh trên heo. PCV2 mới
xuất hiện gần đây và gắn với PMWS.

Hình 2.1 Porcine Circovirus type 2 nhìn dưới kính hiển vi điện tử
(www.khoahoc.net).

4



PCV1 không gây ngưng kết hồng cầu ở thú và có tỷ trọng trong CsCl là 1,37
g/ml. PCV1 chịu được sự bất hoạt ở pH = 3 và chloroform, ổn định ở 70oC trong 15
phút. (Barbara và ctv, 2006). Bộ gene DNA của PCV1 gồm 1759bp và của PCV2 là
1768bp (Meehan và ctv, 1997).
Bộ gene của PCV1 và PCV2 gồm hai khung đọc mở chính (Open Reading
Frame - ORF1 và ORF2) theo hướng trực tiếp đối diện nhau. Tuy nhiên các kết quả
nghiên cứu về gene của hai loại virus này cho thấy hai loại virus này rất khác nhau về
mặt di truyền với bộ nhiễm sắc thể chỉ tương đồng 68 – 76%, trong đó ORF1 chỉ
tương đồng khoảng 83% về trình tự nucleotide và 86% amino acid; ORF2 chỉ tương
đồng khoảng 67% về trình tự nucleotide và 65% amino acid. Khi giải mã trình tự gene
khung đọc mở ORF2 của vỏ capsid virus, những phân lập PCV2 ở Châu Mỹ có tính
tương đồng rất cao với các phân lập PCV2 trên thế giới. Mặc dù có một số khác biệt
về gene của ORF2 nhưng vùng gene mã hóa đầu N cuối (N-terminal region) của ORF2
gần như không thay đổi ở tất cả các phân lập virus được nghiên cứu (Nguyễn Ngọc
Hải, 2007). Kích thước bộ gene của ORF1 là 942bp và ORF2 mã hóa cho protein
capsid là 699bp (Kim và ctv, 2002).
2.1.4. Dịch tễ bệnh PMWS
Những cuộc khảo sát huyết thanh ở Châu Âu và Bắc Mỹ đã chỉ ra rằng quá
trình xâm nhiễm trải rộng trong nhiều đàn heo nhưng chỉ một phần nhỏ các đàn dương
tính huyết thanh học là có lịch sử bệnh. Heo con cũng có thể bị nhiễm bệnh trước khi
cai sữa ().
Trong các trại chăn nuôi, hội chứng PMWS có thể tồn tại rất dai dẳng từ 4 đến
hơn 18 tháng. Sự phân bố bệnh PMWS trong đàn heo nhiễm cũng rất thay đổi. PCV2
có thể lan truyền giữa các đàn khi chuyển heo từ đàn này sang đàn khác hoặc thông
qua những động vật trung gian mang mầm bệnh, dụng cụ, quần áo công nhân.
Thực nghiệm gây nhiễm PCV2 cho heo nuôi thí nghiệm lúc 1 ngày tuổi,
Krakowka và ctv (2001) đã phát hiện acid nucleic của PCV2 có trong phân, nước bọt
và nước mắt của heo sau 31 ngày gây nhiễm. Ngoài ra PCV2 cũng được tìm thấy trong
tinh dịch của những heo đực nhiễm bệnh và sẽ lây truyền virus qua giao phối (Kim và

ctv, 2002).

5


2.1.5. Cách sinh bệnh PMWS
Hiện nay vẫn chưa có những nghiên cứu chính xác nào về cơ chế gây bệnh của
PCV2. Sau khi gây bệnh thực nghiệm qua đường mũi hoặc tiêm tĩnh mạch, người ta
nhận thấy có sự hiện diện của virus trong bạch cầu đơn nhân và đại thực bào ở phổi,
hạch hạnh nhân, lách, hạch lympho và những cơ quan khác trong hệ thống miễn dịch
(trích dẫn bởi Lê Nguyễn Phương Khanh, 2006). PCV2 có thể làm hư hại hệ thống
miễn dịch bằng cách ức chế miễn dịch. Ngoài ra virus PCV2 còn tác động làm giảm
tiểu cầu nghiêm trọng gây xuất huyết mô kéo dài. Sự tấn công virus vào gan làm các tế
bào gan, tế bào Kupffer, tế bào nội mô bị sưng và triển dưỡng nên gan to ra; sau đó các
tế bào này sẽ bị dung giải nên giảm số lượng và kích thước gan teo lại, đồng thời mật
có thể bị ứ lại trong ống mật làm gan bị vàng (Neumann và ctv, 2002). Một số báo cáo
chỉ ra rằng số lượng lympho bào bị giảm trong những con heo nhiễm PMWS.
2.1.6. Triệu chứng của bệnh PMWS
Thời gian ủ bệnh của heo kéo dài từ 8 – 14 ngày, tỷ lệ bệnh và chết do PMWS
rất khác nhau. Ở những ổ dịch tỷ lệ chết có thể lên đến 10% - 20%. Tuy nhiên, khoảng
50% heo bệnh có thể sống trong nhiều tuần với thể trạng yếu (Trần Thị Bích Liên và
ctv, 2001). Triệu chứng đầu tiên là gầy còm trên heo. Trong vòng 3 – 7 ngày, tăng
trọng giảm đáng kể, ốm trơ xương. Heo bệnh bỏ ăn, da nhợt nhạt, khó thở, tăng sinh
hạch lympho đặc biệt là hạch bẹn; ngoài ra heo có thể bị ho, loét dạ dày và có triệu
chứng thần kinh. Do thiếu sức đề kháng nên heo thường có những biến chứng như
viêm phổi có mủ, áp xe.
PMWS thường đi kèm với một số bệnh khác như viêm phổi, viêm phổi – màng
phổi, bệnh Glassers, Salmonellosis.
2.1.7. Một số bệnh thường nhiễm kèm với virus PCV2
2.1.7.1. Hội chứng viêm da viêm thận (Porcine dermatitis and nephropathy

syndrome – PDNS)
PDNS gây tổn thất ở một mức khá cao. Sau hơn một tháng bị bệnh thì tỷ lệ chết
của các đợt riêng rẽ là khoảng 60%. PDNS ghi nhận đầu tiên vào năm 1993 tại
Scotland, từ đó nó được phát hiện ở nhiều nơi trên thế giới, nhưng gần đây chúng được
phát hiện là có thể kết hợp với hội chứng PMWS.
Khi PDNS bùng phát cùng với PMWS, những nguyên nhân gây bệnh mãn tính
của hai hội chứng này khó tách rời. Trong một vài trường hợp, bệnh chuyển biến thành
6


căn bệnh hệ trọng, có khả năng lây nhiễm trên nhiều heo cùng một lúc
(). Những dấu hiệu đầu tiên là sự thương tổn da, xuất hiện đốm
tròn đỏ có đường kính 1 – 20mm. Một thời gian ngắn sau khi xuất hiện tổn thương da,
heo bị sốt, chán ăn, sụt cân trầm trọng (Chae và ctv, 2004).
2.1.7.2. Hội chứng hô hấp phức tạp trên heo (Porcine Respiratory Disease
Complex - PRDC)
Hội chứng hô hấp phức tạp trên heo là một bệnh nghiêm trọng đối với heo từ 16
– 22 tuần tuổi. Bệnh gây ra sự chậm lớn, chán ăn, lờ đờ, sốt và ho. Bệnh viêm phổi ở
heo cùng với PRDC là do sự kết hợp của nhiều tác nhân virus ví dụ như PCV2, virus
cúm heo SIV, Mycoplasma hyopneumoniae. Sự đồng xâm nhiễm PCV2 và PRDC
cũng gây ra những dấu hiệu hô hấp trầm trọng và suy gây tổn thương phổi. Những dấu
hiệu này không đặc hiệu và rất đa dạng. Trong quá trình phát triển, PCV2 kết hợp với
PRDCV sẽ làm cho heo chậm lớn, ho kéo dài. PRDC khi kết hợp với PCV2 sẽ gây ra
viêm phổi kẽ cùng với sự xơ hóa quanh phế quản. Ngược lại, PMWS được xác định
thông qua sự viêm hạt diện rộng, các tế bào đa nhân và một số lượng thể vùi ưa kiềm
của virus có trong các đại thực bào (Chae và ctv, 2004).
2.1.7.3. Chứng run bẩm sinh (Congenital tremor – CT)
Congenital tremors (CT) type A2 có liên quan với PCV dẫn đến sự thiếu hụt
myelin. Hầu hết các heo bị hội chứng CT có tỷ lệ tế bào bị nhiễm PCV cao hơn so với
heo bình thường, PCV được tìm thấy trong các mô gan và hệ thần kinh trung ương của

heo bị nhiễm bệnh, não và tủy sống bị nhiễm PCV nhiều hơn so với các mô không
thuộc hệ thần kinh. Trong các mô không thuộc hệ thần kinh, đại thực bào là loại tế bào
dễ dàng bị xâm nhiễm nhất. Phân tích PCR cho thấy chỉ có PCV2 mà không thấy
PCV1 trên các nhóm heo khảo sát (Stevenson và ctv, 2001).
2.1.7.4. Virus gây cúm heo (Swine Influenza Virus – SIV)
Hiện nay người ta phát hiện virus này có thể kết hợp với PCV2 và làm tăng
biểu hiện bệnh của PCV2. Theo Harm và ctv (2001) tỷ lệ PCV2 nhiễm ghép với SIV
là 19,3%. Bằng kỹ thuật PCR kết hợp phân lập virus và kỹ thuật miễn dịch huỳnh
quang, Choi và ctv (2003) ghi nhận có 54 trong 636 heo nhiễm ghép SIV và PCV2
(8,49%) khi phân tích các căn bệnh trên đường hô hấp của heo.

7


2.1.8. Bệnh tích đại thể và vi thể
Bệnh tích đại thể chủ yếu là tổn thương mô, nhất là mô bạch huyết và mô phổi;
hạch bạch huyết sưng to. Phổi bị xơ cứng, dai, nặng, không xẹp khi bị bóp mạnh. Lách
cũng sưng lớn nhưng không sung huyết. Vùng nối thực quản với dạ dày bị loét, vách
dạ dày sưng phù. Ruột viêm, thành ruột mỏng, màng treo ruột và manh tràng phù
thủng. Bệnh tích viêm gan, thận sưng lớn đồng thời phù thủng cũng có thể được nhìn
thấy. Ngoài ra, tuyến ức kém phát triển, các mô liên kết phù thủng và tích dịch trong
xoang ngực, xoang bụng và bao tim.
Sự phân bố và mức độ bệnh tích vi thể tại các cơ quan tùy thuộc vào từng giai
đoạn bệnh. Bệnh tích đặc trưng tại các cơ quan lympho là sự suy giảm tế bào lympho.
Đại thực bào đa nhân thường xuất hiện, đặc biệt tại mảng Peyer’s và hạch bạch huyết.
Thể vùi trong bào tương và lympho bào hoại tử cũng hiện diện tại mảng Peyer’s và
hạch hạnh nhân (trích dẫn bởi Lê Nguyễn Phương Khanh, 2006).
2.1.9. Chẩn đoán bệnh do PCV2 gây ra
Trong chẩn đoán xác định nguyên nhân gây PMWS cần phải sử dụng các kỹ
thuật thể hiện liên quan trực tiếp giữa virus và bệnh tích mô vì vậy các kỹ thuật hóa

mô miễn dịch, lai tại chỗ được khuyến khích sử dụng. DNA hoặc kháng nguyên của
PCV2 có thể được phát hiện trong các mô bệnh bằng kỹ thuật hóa mô miễn dịch hoặc
lai tại chỗ. Do sự khác biệt về gene của ORF2 nhiều hơn so với ORF1 nên các đoạn dò
thường được thiết kế dựa trên sự khác biệt gene của ORF2 nhằm chẩn đoán phân biệt
PCV1 và PCV2. Phương pháp PCR có độ nhạy cao, cho phép phát hiện dễ dàng PCV2
trong các mẫu cố định bằng formol, đơn giản trong thực hiện, việc ly trích DNA PCV2
trong mẫu đã trở thành quy trình chặt chẽ nên PCR vẫn đang là kỹ thuật phổ biến trong
xét nghiệm PCV2. Ngoài ra có thể sử dụng các kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang gián
tiếp hoặc ELISA để xét nghiệm kháng thể kháng PCV2 (Nguyễn Ngọc Hải, 2007).
2.1.10. Phòng và điều trị bệnh do PCV2 gây ra
2.1.10.1. Phòng bệnh do PCV2 gây ra
Các bác sĩ thú y và các nhà chăn nuôi đang cố gắng tìm tòi những biện pháp
nhằm ngăn chặn và kiểm soát các bệnh liên quan đến PCV2. Bởi vì PCV2 là một loại
virus, nên giải pháp sử dụng kháng sinh không giúp ngăn ngừa và xử lý bệnh. Một số
báo cáo gợi ý rằng khi vi khuẩn xâm nhiễm đồng thời với PCV2 thì việc sử dụng
kháng sinh mới đạt hiệu quả cao. Hầu hết những thành công trong việc quản lý bệnh
8


đều xuất phát từ việc tuân thủ theo những nguyên tắc an toàn sinh học, hệ thống vệ
sinh tốt, chiến dịch sản xuất, quản lý môi trường và kiểm soát các bệnh khác.
Thực hành an toàn sinh học và hạn chế các trường hợp nhập đàn; kiểm soát côn
trùng, sâu bọ, gặm nhấm; tẩy trùng trước và sau khi vào trại. Sử dụng công cụ và thiết
bị sạch sẽ để ngăn chặn sự lây lan cũng như mức độ trầm trọng của quá trình xâm
nhiễm. Tập cho thú thích nghi với khí hậu nơi ở mới trước khi nhập đàn, đảm bảo hàm
lượng sữa non thú con được nhận, giảm kích thước đàn. Kiểm soát môi trường sống,
chuồng trại thông thoáng, không ẩm mốc cũng giúp làm giảm sự tác động của PCV2.
Kiểm soát các mầm bệnh khác cũng là một giải pháp để tránh các vấn đề tiềm ẩn có
liên quan đến PCV2 (Neumann và ctv, 2002). Hơn nữa, chiến dịch tiêm chủng vaccine
cũng được áp dụng để phòng bệnh trên nhiều đàn heo.

2.1.10.2. Điều trị bệnh do PCV2 gây ra
Đến nay vẫn chưa có biện pháp điều trị PMWS nào hoàn toàn triệt để. Các
chiến lược điều trị hiện nay thường tập trung vào những bệnh phụ nhiễm. Những
nghiên cứu về huyết thanh đã cho thấy hầu 100% ở những con heo sắp xuất chuồng
(80 – 100 kg) đều có PCV2 trên những trang trại bị nhiễm bệnh. Kinh nghiệm thực địa
cho thấy việc sử dụng huyết thanh của những con heo này có giá trị trong cả việc ngăn
chặn và điều trị bệnh. Heo con có thể được điều trị trong thời gian cai sữa từ 3 tuần trở
đi, hoặc ngay từ lúc bắt đầu phát bệnh (trích dẫn bởi Nguyễn Kim Ngân, 2006).
2.1.10.3. Vaccine phòng hội chứng PMWS trên heo
Vaccine luôn luôn đóng một vai trò quan trọng trong việc phòng ngừa các bệnh
do virus gây ra. Vaccine thường sử dụng là vaccine bất hoạt hoặc vaccine sống đã bị
biến đổi. Vaccine bất hoạt gây ra phản ứng miễn dịch giới hạn do đó thường không đủ
để bảo vệ cơ thể. Vaccine sống đã bị biến đổi khá khó để sản xuất, đồng thời có những
vấn đề liên quan đến sự an toàn khi sử dụng virus làm vaccine. Do đó, gần đây vaccine
tiểu đơn vị protein và vaccine DNA đang được chú trọng sử dụng (Ju và ctv, 2005).
Đã có nhiều nghiên cứu chứng minh được hiệu lực của vaccine tiểu đơn vị tái tổ
hợp trong tế bào côn trùng. Những nghiên cứu gần đây đều nhằm đến mục đích ngăn
ngừa và kiểm soát PCV2 bằng cách sử dụng protein capsid của PCV2 như là một loại
vaccine tiểu đơn vị. Vaccine tiểu đơn vị có thể được xem là loại vaccine an toàn nhất
nên được phát triển. Một phương pháp để sản xuất vaccine tiểu đơn vị đó là sử dụng
hệ thống biểu hiện baculovirus để biểu hiện protein ORF2 của PCV2. Protein này có
9


thể tự động sắp xếp tạo thành những phần giống như PCV2, chúng có cấu trúc được
xếp theo thứ tự và có tính lặp lại cao giúp tạo ra những phản ứng dịch thể và phản ứng
tế bào nhanh và mạnh (Fan và ctv, 2007).
Gần đây, vaccine DNA và vaccine tiểu đơn vị ORF1 và ORF2 của PCV2 đã
được nghiên cứu phát triển và chứng minh rằng có hiệu quả bảo hộ cho heo phòng sự
xâm nhiễm của PCV2. Một virus khảm được tạo ra bằng cách thay thế gene vỏ capsid

của PCV1 bằng gene vỏ capsid của PCV2 và kết quả tạo ra virus PCV1 – 2 nhược độc
trong cơ thể heo. Virus này sẽ kích thích hệ thống miễn dịch tạo kháng thể đặc hiệu
kháng lại protein vỏ capsid và tạo tính miễn dịch giúp cơ thể chống lại PCV2 hoang
dại (Ju và ctv, 2005). Ngoài ra, các tác giả này cũng nghiên cứu sự tái tổ hợp giữa
PCV2 và virus gây bệnh giả dại – PRV tạo ra một loại virus mới là PRV – PCV2 để
biểu hiện protein dung hợp ORF1 – ORF2 của PCV2 bằng cách sử dụng virus giả dại
bị đột biến làm vector. Virus tái tổ hợp này sẽ kích thích đáp ứng miễn dịch của cơ thể
để chống lại PRV và PCV2.
Một số loại vaccine thương mại phòng hội chứng PMWS trên thị trường hiện nay
 Vaccine Circumvent™ PCV
Ngày 16/10/2007 Intervet Inc. thông báo Circumvent™ PCV (Porcine
Circovirus Vaccine, loại 2) cung cấp một giải pháp mới trong việc kiểm soát và quản
lý các bệnh có liên quan đến Porcine Circovirus. Với hàng chục triệu liều được sử
dụng cho tới ngày nay đã cho thấy vaccine này có tác động làm giảm một tỷ lệ lớn heo
chết do bệnh so với heo không được tiêm vaccine. Circumvent PCV có thể được sử
dụng cho heo từ ba tuần tuổi. Để đạt phản ứng miễn dịch tối ưu, heo nên được tiêm hai
liều 2cc (ml) dưới cơ vào lúc 3 và 6 tuần tuổi.
Circumvent PCV là vaccine PCV2 nhận được giấy phép của Bộ Nông Nghiệp
Mỹ (USDA) vào tháng 10/ 2005. Vaccine được cung cấp cho các bác sĩ thú y bắt đầu
từ tháng 4/ 2006 tuy nhiên vẫn còn giới hạn và đến năm 2007 số lượng vaccine trở nên
dồi dào để đáp ứng được cho nhu cầu thị trường.

10


Hình 2.2 Vaccine Circumvent™ PCV
(www.circumventpcv.com).
Vaccine Circumvent có khả năng làm giảm sự hoành hành của bệnh và còn
cho phép heo duy trì sự phát triển bình thường, thêm vào đó còn giảm được tỷ lệ heo
chết. Các nghiên cứu có liên quan tới chương trình tiêm chủng Circumvent PCV vào 3

và 6 tuần tuổi chỉ ra rằng sự tăng trưởng được cải thiện giữa lô được tiêm vaccine và lô
đối chứng. Circumvent PCV có chứa tá dược Microsol Diluvac Forte® (MDF) là một
tá dược hiệu quả cao và an toàn trong hàng triệu liều vaccine (Intervet Inc., 2007).
 Vaccine Circovac®
Circovac là loại vaccine nhũ dầu bất hoạt phòng Porcine Circovirus type 2. Mỗi
liều 2ml hoàn nguyên có chứa: PCV2 bất hoạt; 2,1log10 đơn vị ELISA, tá dược:
Thiomersal 0,2mg, 2 ml nhũ dầu.
Khi tiêm vaccine cho heo, hệ thống miễn dịch của heo sẽ nhận ra virus bất hoạt
là một tác nhân ngoại lai và sản xuất kháng thể để tiêu diệt chúng. Những kháng thể
này được truyền từ heo mẹ sang heo con thông qua sữa non nhờ đó giúp heo con
chống lại sự xâm nhiễm của PCV2 sau khi được sinh ra.

11


Hình 2.3 Vaccine Circovac® (www.viphavet.com).
Hiệu quả của các liều thử nghiệm đã chỉ ra rằng việc tiêm chủng vaccine cho
heo mẹ bằng Circovac có thể làm giảm những tổn thương có liên quan đến Circovirus
trong các mô bạch huyết của heo con. Tỷ lệ heo chết do PCV2 ở các trại được thử
nghiệm giảm từ 3,6% đến 10% (European Medicines Agency).
2.2. Tổng quan về sinh lý máu heo
2.2.1. Hồng cầu
Chức năng hồng cầu: Vận chuyển O2, CO2 và tham gia điều hòa pH máu.
Đường kính hồng cầu từ 4 – 8 µm (0,004 – 0,008 mm) và đặc trưng cho từng loài.
Hồng cầu hình cầu, dẹp và phẳng. Hồng cầu ở loài có vú không nhân, lõm ở giữa, ở
gia cầm có hình bầu dục, lồi hai mặt. Các yếu tố ảnh hưởng đến số lượng hồng cầu
trong máu: phái tính, tuổi, vận động, dinh dưỡng, mang thai, tiết sữa, cao độ và hoạt
động vật lý.
Chức năng hô hấp của hồng cầu do hemoglobin (Hb) đảm nhận. Hb chiếm xấp
xỉ 95% hàm lượng protein hồng cầu và chiếm khoảng 35% khối lượng hồng cầu. Phân

tử Hb kết hợp và phóng thích oxy dễ dàng làm hồng cầu có màu đỏ. Hb có chức năng
chuyên chở O2 từ máu đến mô, tham gia quá trình hô hấp và chức năng đệm (điều hòa
pH máu). Khi hồng cầu bị hủy, bilirubin được hình thành, vận chuyển đến gan để tổng
hợp sắc tố mật, còn globin và sắt được tái hấp thu để tạo hồng cầu mới. Trường hợp
bệnh lý, hàm lượng Hb tăng trong những bệnh gây mất nước, tiêu chảy, nôn mửa, các
bệnh làm tăng quá trình thẩm thấu, bệnh xoắn ruột, trúng độc cấp tính. Hb giảm trong
12


các bệnh thiếu máu, việc giảm Hb có thể do hàm lượng chất này trong hồng cầu giảm,
hoặc do số lượng hồng cầu giảm (Trần Thị Dân và Dương Nguyên Khang, 2006).
2.2.2. Bạch cầu
Tất cả các bạch cầu đều lớn hơn hồng cầu, chúng có nhân, bào quan và hạt. Số
lượng bạch cầu giảm khi bị bệnh do siêu vi, tăng khi cơ thể bị nhiễm trùng và nhiễm
trùng kéo dài. Có năm loại bạch cầu chia làm hai nhóm: bạch cầu hạt và bạch cầu
không hạt. Bạch cầu có hạt có ba loại: trung tính, ưa acid và ưa base; bạch cầu không
hạt có hai loại: đơn nhân lớn và lâm ba cầu.
Bạch cầu trung tính có kích thước 10 – 15 µm, chiếm hơn 50% trong tổng số
bạch cầu, hầu hết dự trữ trong xương. Giai đoạn còn non, nhân hình móng ngựa, gậy;
khi già nhân chia 2 – 5 thùy nên gọi là bạch cầu đa nhân. Bạch cầu trung tính tăng
nhiều trong bệnh truyền nhiễm, phản ứng viêm có mủ, ngộ độc, tiêm protein lạ vào cơ
thể; bạch cầu này có thể thực bào vi khuẩn và vật nhỏ nên được gọi là tiểu thực bào.
Bạch cầu ưa acid có kích thước 14 – 20 µm. Nhân hình móng ngựa, bầu dục, ba
lá. Tế bào chất có hạt bắt màu eosin. Bạch cầu ưa acid tăng trong trường hợp nhiễm ký
sinh trùng, dị ứng, bệnh trên da. Bạch cầu ưa acid có ít khả năng thực bào và tiêu hóa
vi khuẩn.
Bạch cầu ưa base có kích thước 10 – 18 µm, có rất ít trong máu. Bạch cầu ưa
base chứa hạt phân tiết histamine và heparine, dạng polysaccharide và sulphate. Bạch
cầu ưa base có vai trò đáp ứng dị ứng.
Bạch cầu đơn nhân có kích thước 14 – 22 µm, còn gọi là đại thực bào. Có vai

trò loại bỏ các mô bào chết. Bạch cầu đơn nhân nằm trong mạch máu chỉ vài giờ sau
đó cư trú ở mô bào.
Lâm ba cầu (bạch cầu lympho) lớn có kích thước 10 – 18 µm, lâm ba cầu nhỏ
có kích thước khoảng 6 – 10 µm, có khả năng vận động amip giới hạn; được tạo thành
từ nốt bạch huyết, lách và tuyến ức. Lâm ba cầu có thể sống nhiều năm. Lâm ba cầu
bảo vệ cơ thể bằng cách kích thích hệ thống miễn dịch tạo kháng thể tiêu diệt vi sinh
vật và chống tế bào ung thư (Trần Thị Dân và Dương Nguyên Khang, 2006).
2.2.3. Tiểu cầu
Tiểu cầu hình bầu dục, hình thoi, kích thước 2 – 4µm. Khi mạch máu bị vỡ tiểu
cầu gắn vào vết thương, giải phóng các chất phân giải ngoại bào trong túi bào quan
qua hệ thống kênh. Tiểu cầu không nhân nên không có khả năng phân chia tế bào. Số
13


tiểu cầu nhiều hơn bạch cầu 20 – 40 lần, số lượng trong máu khoảng 150.000 600.000 tiểu cầu/mm3. Số tiểu cầu giảm trong bệnh truyền nhiễm cấp tính, choáng và
dị ứng. Đời sống trung bình của tiểu cầu là 10 ngày, bị tiêu diệt bởi đại thực bào ở gan
và lách (Trần Thị Dân và Dương Nguyên Khang, 2006).
2.2.4. Tỉ dung (Hematocrit)
Tế bào máu dễ dàng tách khỏi huyết tương bằng cách quay ly tâm. Hồng cầu
lắng xuống đáy, bạch cầu và tiểu cầu hiện diện lớp mỏng bên trên hồng cầu. Phần trăm
thể tích giữa hồng cầu với máu được gọi là tỉ dung (hematocrit). Hồng cầu lắng xuống
đáy vì có tỷ trọng lớn hơn huyết tương. So với nước, tỉ trọng hồng cầu 1,09; bạch cầu
1,07 và huyết tương 1,03. Tỉ dung trung bình của heo là 40% (Dương Nguyên Khang,
2006). Và biến thiên trong khoảng 30 – 50%. Tỉ dung trong máu gia súc thay đổi trong
cả điều kiện sinh lý bình thường, kích thước hồng cầu, dinh dưỡng, cao độ, vận động.
2.2.5. Công thức bạch cầu
Mỗi loại bạch cầu có tỉ lệ phần trăm và chức năng khác nhau tùy theo phản ứng
miễn dịch của cơ thể trong đề kháng bệnh. Công thức bạch cầu thay đổi theo tuổi, sinh
lý và bệnh lý. Sự thay đổi đặc trưng và tỷ lệ các loại bạch cầu thường đi đôi với những
xáo trộn chức năng của các cơ quan tạo máu và còn biểu hiện tình trạng bệnh lý của cơ

thể (Trần Thị Dân và Dương Nguyên Khang, 2006).
Bảng 2.1 Công thức bạch cầu máu heo
Loại bạch
cầu
Tỷ lệ (%)

Bạch cầu
trung tính
45 – 55

Bạch cầu
ưa acid
2–3

Bạch cầu
ưa base
0,0 – 0,8

Lâm ba
cầu
40 – 50

Bạch cầu
đơn nhân
2-6

(Dương Nguyên Khang, 2006)

2.3. Tổng quan về ELISA
2.3.1. Nguyên lý kỹ thuật ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)

Phương pháp ELISA có rất nhiều dạng mà đặc điểm chung đều dựa trên cơ sở
sự bắt cặp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể, trong đó kháng thể được gắn với
một enzyme. Khi cho thêm cơ chất thích hợp vào phản ứng enzyme sẽ thủy phân cơ
chất thành một chất có màu. Sự xuất hiện màu chứng tỏ đã xảy ra phản ứng đặc hiệu
với kháng nguyên và thông qua cường độ màu mà biết được nồng độ kháng nguyên
hay kháng thể cần phát hiện (John, 2002).
Kỹ thuật ELISA được thực hiện trên đĩa 96 giếng. Dưới mỗi giếng có phủ
protein có thể bắt với kháng thể cần kiểm tra. Mẫu máu được tách lấy huyết thanh có
14


kháng thể (còn gọi là kháng thể sơ cấp). Huyết thanh được ủ trong giếng, và mỗi giếng
có chứa một huyết thanh khác nhau. Trong 96 mẫu kiểm tra còn có một mẫu huyết
thanh đối chứng dương và một mẫu huyết thanh đối chứng âm.
Sau một khoảng thời gian, huyết thanh và các kháng thể không bám sẽ bị rửa
trôi. Để phát hiện kháng thể bám, một kháng thể thứ hai có gắn enzyme như
peroxidase hoặc alkaline phosphatase được thêm vào mỗi giếng. Những enzyme này
có thể chuyển hóa cơ chất không màu thành sản phẩm có màu. Sau giai đoạn ủ, dung
dịch kháng thể thứ hai này được rửa đi và những kháng thể không bắt cặp cũng bị rửa
trôi. Bước cuối cùng là thêm vào cơ chất của enzyme để tạo ra sản phẩm phát màu
trong các giếng.
Khi phản ứng enzyme được hoàn tất, toàn bộ đĩa ELISA được đem đi đo mật độ
quang cho từng giếng nhờ máy đọc đĩa. Lượng sản phẩm phát màu phản ánh lượng
kháng thể sơ cấp gắn với protein ở đáy mỗi giếng ().
Có 3 phương pháp chính làm nền tảng cho tất cả các kỹ thuật ELISA: ELISA
trực tiếp, LISA gián tiếp và ELISA Sandwich. Tất cả 3 hệ thống trên có thể được sử
dụng làm cơ sở cho các xét nghiệm ELISA cạnh tranh và ELISA ức chế.
2.3.2. ELISA trực tiếp – Direct ELISA
ELISA trực tiếp có thể được xem là dạng ELISA đơn giản nhất. Kỹ thuật
ELISA trực tiếp sử dụng phương pháp đánh dấu kháng thể trực tiếp. Các đĩa được phủ

mẫu có chứa kháng nguyên đích, và sự gắn kết với các kháng thể có đánh dấu được
định lượng bằng phương pháp so màu, phát quang hóa học, hoặc chấm điểm huỳnh
quang. Khi cho kháng thể thứ hai vào, kỹ thuật ELISA trực tiếp sẽ trở nên khá nhanh
và tránh được nhiều vấn đề tiềm ẩn như phản ứng chéo của kháng thể thứ hai với các
thành phần có trong mẫu kháng nguyên. Tuy vậy, phương pháp ELISA trực tiếp đòi
hỏi phải đánh dấu kháng thể sử dụng, gây mất nhiều thời gian và chi phí đắt
().
Theo John (2002) kháng nguyên được pha loãng trong buffer, thường là buffer
carbonate/bicarbonate có pH cao (9,6) hoặc trong phosphate-buffered saline (PBS)
trung tính. Sau giai đoạn ủ là giai đoạn rửa để loại bỏ kháng nguyên không bám dính.
Kháng thể đặc hiệu với kháng nguyên và được đánh dấu enzyme được thêm vào và kết
hợp đặc hiệu tại những vị trí kháng nguyên trên bề mặt rắn.

15