BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
******************

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
KHẢO SÁT HOẠT TÍNH LIPASE THU NHẬN TỪ
Aspergillus niger TRƯỚC VÀ SAU KHI CỐ ĐỊNH
TRÊN NATRIALGINATE VÀ CHITOSAN

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Sinh viên thực hiện: NGUYỄN THỊ HƯƠNG NHÀN
Niên khóa: 2005 – 2009

Tháng 08 năm 2009


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
******************

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
KHẢO SÁT HOẠT TÍNH LIPASE THU NHẬN TỪ
Aspergillus niger TRƯỚC VÀ SAU KHI CỐ ĐỊNH
TRÊN NATRIALGINATE VÀ CHITOSAN

Hướng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

TS. VŨ VĂN ĐỘ

NGUYỄN THỊ HƯƠNG NHÀN

CN. ĐỖ THỊ TUYẾN

Tháng 08 năm 2009


LỜI CẢM ƠN
Em xin bày tỏ lòng biết ơn đến Ban Giám Hiệu trường Đại Học Nông Lâm Tp
Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện cho em trong suốt thời gian học tập và bồi dưỡng
tại trường.
Em vô cùng biết ơn sự dìu dắt và hướng dẫn nhiệt tình của toàn thể quý Thầy
Cô trong bộ môn Công Nghệ Sinh Học cùng quý Thầy Cô trực tiếp giảng dạy em
trong suốt bốn năm qua, những người đã truyền thụ kiến thức quan trọng để em có thể
thực hiện tốt khoá luận này.
Em xin chân thành cảm ơn TS. Vũ Văn Độ và Cô Đỗ Thị Tuyến đã tạo điều
kiện cho em được thực tập tại viện Sinh Học Nhiệt Đới và đã tận tình hướng dẫn em
trong suốt thời gian thực tập tại đây.
Em cảm ơn các anh chị phụ trách phòng các hoạt chất có có hoạt tính sinh học
thuộc viện Sinh Học Nhiệt Đới Tp.HCM đã cung cấp nhiều kiến thức bổ ích.
Cảm ơn toàn thể các bạn sinh viên cùng thực tập tại phòng các hoạt tính sinh
học đã hết lòng giúp đỡ ủng hộ tôi trong thời gian làm đề tài.
Chân thành cảm ơn toàn thể lớp DH05SH đã giúp đỡ, hỗ trợ và động viên tôi
trong suốt thời gian học tập và thực tập ở trường.
Cuối cùng con xin gởi lòng biết ơn sâu sắc đến ba mẹ đã luôn ở bên con chăm
sóc và động viên con trong suốt quá trình học tập.

iii



TÓM TẮT
Lipase là một enzyme quan trọng được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực
công nghiệp: công nghiệp thực phẩm, công nghiệp dược, công nghiệp giặt tẩy, vân
vân, và được thu nhận từ nhiều nguồn khác nhau như thực vật, động vật, vi sinh vật.
Với ưu điểm là dễ nuôi cấy, sinh trưởng và phát triển nhanh cho nhiều enzyme trong
một thời gian ngắn Aspergillus niger được sử dụng phổ biến để nuôi cấy thu lipase
hiện nay.
Bên cạnh đó để tăng hiệu suất thu nhận enzyme lipase và khả năng sử dụng
được nhiều lần enzyme khá quan trọng này nhằm mang lại hiệu quả kinh tế cao nhất,
chúng tôi tiến nuôi cấy và thử các tác nhân tủa để thu được hàm lượng lipase cao nhất
từ quá trình nuôi cấy Aspergillus niger đồng thời cố định enzyme thu được này trên
hai cơ chất Chitosan và Natrialginate để tìm ra cơ chất tối ưu cho quá trình cố định.
Kết quả khảo sát thu được kết quả là với dung môi là muối (NH4)2SO4 thu được
lượng lipase cao nhất, và ở nồng độ muối là 60%; với dung môi tủa là aceton cho
lượng lipase ít hơn, và thu lượng lipase tối đa ở tỷ lệ tủa 1:5; với dung môi tủa là cồn
cho lượng lipase thấp nhất, và thu lượng lipase tối đa ở tỷ lệ tủa 1:3.
Sau đó thực hiện cố định lipase vừa thu nhận trên hai cơ chất Natrialginate và
Chitosan bằng phương pháp nhốt enzyme. Kết quả thu được hiệu suất cố định protein
và hiệu suất cố định hoạt tính lipase lần lượt là: 75% và 38,4% đối với cơ chất
Natrialginate; 69% và 50,39% đối với cơ chất Chitosan. Sau khi khảo sát tất cả các yếu
tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme cố định nhận thấy độ ổn định về hoạt tính của
enzyme cố định trên Chitosan là cao nhất (sau khi ủ 100 phút ở 40oC hoạt tính còn giữ
lại khoảng 28,57%) cao hơn nhiều so với CPE thu được ( chỉ còn 2,4% sau khi ủ CPE
100 phút ở 40oC). Enzyme cố định trên cơ chất Natrialginate tuy không bền nhiệt bằng
enzyme cố định trên cơ chất Chitosan nhưng lại có độ ổn định cao đối với pH cao
(hoạt tính còn khoảng 555,333 UI/g ở pH12), điều này có ý nghĩa lớn việc ứng dụng
lipase vào công nghiệp giặt tẩy.


iv


SUMMARY
Lipase is an important enzyme which is applied in many industrial fields such
as food, pharmacy, detergent, etc. Lipase was extracted from a lot of sources such as
animals, plants, or microorganisms. Aspergillus niger grows very fast and easily grows
well in a culture medium. So it is the best choice to extract lipase enzyme by growing
it in a culture medium process. Besides, it is important to increase output and reuse
this enzyme to get the highest efficiency. Depending on those demands, we test some
ways to precipitate enzyme and immobilize lipase enzyme on Natralginate and
Chitosan by entrapment in gel method. The result is:
The ways to precipitate:
- With (NH4)2SO4 solvent, we get the highest precipitation of 60% concentration
- With acetone solvent, we get the highest precipitation at the rate of 1:5
- With alcohol solvent, we get the highest precipitation at the rate of 1:3
Lipase was immobilized on Natralginate:
- Protein’s content: 75%
- Lipase’s activity: 38,4%
Lipase was immobilized on Chitosan:
- Protein’s content: 69%
- Lipase’s activity: 50,39%
Studied results of factors’ effect on immobilized lipase’s activity showed that:
thermal stable ability of lipase on Chitosan is the highest (at 40oC/100 minutes,
activity remained 28,57%). It is much higher compared to lipase (at 40oC/100 minutes,
compared to lipase activity remained 2,4%). Thermal stabile ability of lipase on
Natralginate is lower than thermal stable ability of lipase on Chitosan (at 40oC/100
minutes, activity remained 12,5%). However, it is stable in high pH (at pH12, lipase
activity is about 555,333 UI/g). So lipase on Natralginate is meaningful in industrial
detergent.


v


MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN................................................................................................................ iii
TÓM TẮT ......................................................................................................................iv
SUMMARY ....................................................................................................................v
MỤC LỤC ...................................................................................................................... vi
Chương 1 MỞ ĐẦU ........................................................................................................1
1.1. Đặt vấn đề.................................................................................................................1
1.2. Mục tiêu....................................................................................................................2
1.3. Mục đích...................................................................................................................2
1.4. Nội dung thực hiện ...................................................................................................2
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU...............................................................................3
2.1. Sơ lược về enzyme lipase .........................................................................................3
2.1.1. Định nghĩa .............................................................................................................3
2.1.2. Các nguồn thu nhận enzyme lipase .......................................................................5
2.1.2.1. Từ động vật.........................................................................................................5
2.1.2.2. Từ thực vật..........................................................................................................5
2.1.2.3. Từ vi sinh vật......................................................................................................5
2.1.3. Ứng dụng ...............................................................................................................6
2.1.3.1. Trong công nghiệp giặt tẩy.................................................................................6
2.1.3.2. Trong công nghiệp thực phẩm............................................................................6
2.1.3.3. Trong công nghiệp giấy......................................................................................7
2.1.3.4. Trong tổng hợp chất hữu cơ ...............................................................................7
2.1.3.5. Trong chuyển đổi sinh học trong môi trường nước............................................7
2.1.3.6. Trong chuyển đổi sinh học ở môi trường hữu cơ...............................................7
2.1.3.8. Trong phản ứng acyl hoá đặc hiệu vị trí.............................................................8

2.1.3.9. Trong công nghiệp hóa dầu ................................................................................8
2.1.3.10. Trong chế biến dầu và chất béo........................................................................8
2.2. Vi sinh vật tổng hợp lipase.......................................................................................9

vi


2.3. Sự cố định enzyme .................................................................................................10
2.3.1. Định nghĩa ...........................................................................................................10
2.3.2. Tính chất ưu nhược của enzyme cố định.........................................................11
2.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme hòa tan.........................................11
2.3.4.1. Phương pháp liên kết enzyme với vật liệu cố định (carrier binding) ........12
2.3.4.2. Phương pháp hấp thụ vật lý (physical adsorption)......................................13
2.3.4.3. Phương pháp nhốt (entrapment) ...................................................................14
2.3.4.4. Phương pháp khâu mạch (cross-linking) .....................................................15
2.3.5. Ứng dụng của Enzyme không hòa tan .............................................................15
2.3.5.1. Trong công nghiệp .........................................................................................15
2.3.5.2. Trong y học.....................................................................................................15
2.3.5.3. Trong nghiên cứu khoa học...........................................................................16
2.3.5.4. Trong bảo vệ môi trường...............................................................................16
2.3.6. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước .....................................................16
2.3.7. Vật lệu cố định, đại cương về Natrialginate và Chitosan....................................18
2.3.7.1. Những yêu cầu của một chất mang lý tưởng ................................................18
2.3.7.2. Phân loại ..........................................................................................................18
2.4. Đặc điểm của Natrialginate và Chitosan ................................................................19
2.4.1. Đặc điểm, tính chất của Chitin và Chitosan....................................................19
Chương 3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU................................................................23
3.1. Thời gian và địa điểm tiến hành .............................................................................23
3.2. Vật liệu ...................................................................................................................23
3.2.1. A. niger ................................................................................................................23

3.2.2. Natrialginate và Chitosan ....................................................................................23
3.2.3. Hóa chất...............................................................................................................23
3.2.4. Môi trường...........................................................................................................23
3.2.5. Thiết bị.................................................................................................................26
3.3. Phương pháp nghiên cứu........................................................................................26
3.3.1. Phương pháp giữ nấm mốc trên môi trường thạch nghiêng................................26
3.3.2. Phương pháp nuôi nấm trên môi trường lúa........................................................27
3.3.3. Phương pháp thu sinh khối nấm trên môi trường cảm ứng tạo enzyme lipase ...27
vii


3.3.4. Phương pháp tủa enzyme ....................................................................................27
3.3.4.1. Nguyên tắc........................................................................................................27
3.3.4.2. Phương pháp tủa enzyme bằng cồn..................................................................28
3.3.4.3. Phương pháp tủa enzyme bằng aceton .............................................................28
3.3.4.4. Phương pháp tủa enzyme bằng muối (NH4)2SO4 .............................................29
3.3.5.Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Bradford………………………...29

3.3.5.1. Nguyên tắc........................................................................................................29
3.3.5.2. Hoá chất............................................................................................................30
3.3.5.3. Thực hành.........................................................................................................30
3.3.5.4. Tính kết quả......................................................................................................32
3.3.6. Phương pháp xác định hoạt tính của lipase .........................................................32
3.3.6.2. Các bước tiến hành ...........................................................................................33
3.3.6.3. Tính kết quả......................................................................................................33
3.3.7. Xác định hàm lượng protein và hoạt tính lipase trong mẫu enzyme thu được ...34
3.3.8. Phương pháp xác định hoạt tính riêng của enzyme.............................................34
3.3.9. Phương pháp xác định hàm lượng protein trong 1g chất mang enzyme.............34
3.3.10. Phương pháp xác định hiệu suất cố định protein của enzyme cố định .............34
3.3.11. Phương pháp xác định hiệu suất cố định hoạt tính của enzyme cố định...........35

3.3.12. Phương pháp cố định lipase trên cơ chất Natrialginate và Chitosan:................35
3.3.12.1. Cố định lipase trên Natrialginate bằng phương pháp nhốt.............................35
3.3.12.2. Cố định lipase trên chitosan bằng phương pháp nhốt ....................................35
3.3.13. Xác định hàm lượng, hiệu suất cố định .............................................................36
3.3.14. Xác định hoạt tính và hoạt tính riêng của enzyme cố định ...............................36
3.3.15. Khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố đến hoạt tính của enzyme lipase thu nhận36
3.3.15.1. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ ...................................................................36
3.3.15.2. Khảo sát ảnh hưởng pH ..................................................................................36
3.3.15.3. Khảo sát độ bền nhiệt .....................................................................................36
3.3.16. Khảo sát ảnh hưởng của các yếu đến hoạt tính của enzyme cố định ................37
3.3.16.1. Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ ...................................................................37
3.3.16.2. Khảo sát ảnh hưởng pH ..................................................................................37
3.3.16.3. Khảo sát độ bền nhiệt .....................................................................................37
3.3.17. Khảo sát số lần tái sử dụng của lipase cố định..................................................37
viii


3.3.17.1. Khảo sát số lần tái sử dụng của lipase cố định trên Chitosan ........................37
3.3.17.2. Khảo sát số lần tái sử dụng của lipase cố định trên Natrialginate..................37
3.3.18. Phương pháp xử lý số liệu.................................................................................38
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN......................................................................38
4.1. Nghiên cứu quá trình tủa protein theo các tác nhân ...............................................39
4.1.1. Tủa protein trong dung môi cồn lạnh ..................................................................39
4.1.2. Tủa protein trong dung môi aceton .....................................................................39
4.1.3. Dịch chiết enzyme với tác nhân tủa là muối (NH4)2SO4 .....................................40
4.2. Hàm lượng, hoạt tính, hoạt tính riêng của CPE…………………………………..42
4.3. Kết quả cố định lipase vào chất mang Natrialginate và Chitosan ..........................42
4.4. Hàm lượng protein, hiệu suất cố định của enzyme lipase......................................43
4.5. Hoạt tính và hoạt tính riêng của lipase cố định ......................................................44
4.6. Hoạt tính lipase thu nhận theo nhiệt độ, pH và độ bền nhiệt. ................................44

4.6.1. Khảo sát hoạt tính của enzyme thu nhận theo nhiệt độ.......................................44
4.6.2. Khảo sát hoạt tính của enzyme thu nhận theo pH ..............................................45
4.6.3. Khảo sát hoạt tính của enzyme thu nhận theo thời gian ủ enzyme ....................46
4.7. Hoạt tính enzyme cố định trên Natrialginate theo nhiệt độ, pH và độ bền nhiệt ...47
4.7.1. Khảo sát hoạt tính của enzyme cố định trên Natrialginate theo nhiệt độ............47
4.7.2. Khảo sát hoạt tính của enzyme cố định trên Natrialginate theo pH....................48
4.7.3. Khảo sát hoạt tính enzyme cố định trên Natrialginate theo thời gian ủ .............49
4.8. Hoạt tính của lipase cố định trên Chitosan theo nhiệt độ, pH và độ bền nhiệt ......50
4.8.1. Khảo sát hoạt tính của enzyme cố định trên Chitosan và theo nhiệt độ..............50
4.8.2. Khảo sát hoạt tính của enzyme cố định trên Chitosan và theo pH......................51
4.8.3. Khảo sát hoạt tính của enzyme cố định trên Natrialginate theo thời gian ủ .......52
4.9. Khảo sát số lần tái sử dụng của enzyme cố định....................................................53
4.9.1. Khảo sát số lần tái sử dụng của enzyme cố định trên Natrialginate....................53
4.9.2. Khảo sát số lần tái sử dụng của enzyme cố định trên Chitosan ..........................54
4.10. So sánh hoạt tính của enzyme trong Natrialginate và enzyme trong Chitosan ....55
4.11. So sánh độ bền nhiệt của CPE ban đầu, enzyme cố định.....................................56

ix


Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..........................................................................58
5.1. Kết luận ..................................................................................................................58
5.2. Đề nghị ...................................................................................................................59
TÀI LIỆU THAM KHẢO…………………………………………………………….59
PHỤ LỤC

x


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

A. niger

Aspegillus niger

CBB

Coomassie brilliant blue

CPE

Chế phẩm enzyme

Ctv

Cộng tác viên

DCE

Dịch chiết enzyme

DD

Degree of Deacetylation

ELISA

Enzyme link immunosorbent assay

IU (UI)


Unit International, đơn vị quốc tế

HRP

Horseradish Peroxidase

HTR

Hoạt tính riêng

OD

Optical density

PHEMA

Polyhydroxy ethyl metrhcryla

PEG

Polyetylenglycol

PGA

Potato glucose agar

TPP

Tripolyphosphate


UV

Ultraviolet

xi


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Trang

Bảng 3.1 Thành phần môi trường PGA .......................................................................24
Bảng 3.2 Thành phần môi trường Czapek ...................................................................24
Bảng 3.3 Thành phần dinh dưỡng của cám gạo...........................................................25
Bảng 3.4 Tỷ lệ cồn tủa enzyme....................................................................................28
Bảng 3.5 Tỷ lệ aceton tủa enzyme ...............................................................................28
Bảng 3.6 Tỷ lệ muối (NH4)2SO4 tủa enzyme...............................................................29
Bảng 3.7 Số liệu để dựng đường chuẩn albumin .........................................................30
Bảng 3.8 Bố trí thí nghiệm dựng đường chuẩn albumin..............................................30
Bảng 4.1 Hoạt tính và hàm lượng enzyme lipase theo tỷ lệ cồn tủa enzyme .............38
Bảng 4.2 Hoạt tính và hàm lượng enzyme lipase theo tỷ lệ aceton tủa enzyme .........39
Bảng 4.3 Hoạt tính và hàm lượng enzyme lipase theo tỷ lệ muối (NH4)2SO4.............39
Bảng 4.4 Hoạt tính cao nhất của lipase khi tủa với các dung dịch đệm ......................40
Bảng 4.5 Hàm lượng protein, hoạt tính lipase của CPE lipase ban đầu thu được .......40
Bảng 4.6 Hiệu suất cố định và hàm lượng protein có trong 1g chất mang..................42
Bảng 4.7 Hoạt tính riêng của lipase cố định ................................................................43
Bảng 4.8 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính CPE thu nhận ........44
Bảng 4.9 Kết quả ảnh hưởng của pH lên hoạt tính enzyme lipase thu nhận ...............45
Bảng 4.10 Kết quả khảo sát hoạt tính của lipase theo thời gian ủ enzyme ở 40oC......46
Bảng 4.11 Kết quả hoạt tính lipase cố định trên Natrialginate theo nhiệt độ .............47
Bảng 4.12 Kết quả hoạt tính của lipase cố định trên Natrialginate theo pH................48

Bảng4.13 Khảo sát hoạt tính của lipase trong Natrialginate theo thời gian ủ .............49
Bảng 4.14 Kết quả hoạt tính của lipase cố định trên Chitosan theo nhiệt độ ..............50
Bảng 4.15 Kết quả khảo sát hoạt tính của lipase cố định trên Chitosan theo pH ........51
Bảng 4.16 Kết quả hoạt tính của lipase cố định trên Chitosan theo thời gian ủ ..........51
Bảng 4.17 Hoạt tính của lipase cố định trên Natrialginate qua các lần tái sử dụng ....52
Bảng 4.18 Kết quả hoạt tính của lipase trong Chitosan qua các lần tái sử dụng .........53
Bảng 4.19 Kết quả so sánh số lần tái sử dụng của enzyme lipase cố định .................54
Bảng 4.20 Kết quả so sánh độ bền nhiệt của enzyme lipase........................................55

xii


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1 Cấu trúc không gian của lipase .......................................................................3
Hình 2.2 Sản phẩm quá trình thủy phân xúc tác bởi lipase. ..........................................4
Hình 2.3 Aspergillus niger............................................................................................9
Hình 2.4 Cấu trúc phân tử Chitin....................................................................... 19
Hình 2.5 Cấu trúc phân tử Chitosan................................................................... 20
Hình 2.6 Cấu trúc đoạn phân tử Natrialginate và gốc acid cấu tạo nên chúng............21
Hình 4.2 Enzyme lipase được nhốt trong gel Chitosan………………………………41
Hình 4.1 Enzyme lipase được nhốt trong gel Natrialginate………………………….41

xiii


Chương 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Enzyme là chất xúc tác sinh học được tạo thành trong tế bào sinh vật, nó đóng

vai trò quan trọng và không thể thiếu được trong trao đổi chất. Enzyme còn được ứng
dụng trong nhiều lĩnh vực khác nhau của công nghiệp và đời sống. Enzyme lipase
được đánh giá là một trong những enzyme quan trọng trong ngành công nghệ enzyme.
Mỗi năm chỉ có hơn 3% enzyme lipase được sử dụng nhưng nó có ý nghĩa rất lớn.
Bằng chứng là enzyme này đã được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau
như trong công nghiệp sữa, công nghiệp sản xuất chất tẩy rửa, công nghiệp giấy, công
nghiệp hoá dầu và công nghiệp thực phẩm.
Ở Việt Nam, ngành công nghiệp thực phẩm, công nghiệp giặt tẩy, công nghiệp
hoá dầu cần nhiều enzyme đặc biệt là lipase nhưng chế phẩm lipase đang sử dụng hầu
như là phải nhập khẩu hoàn toàn. Do đó, việc nghiên cứu và triển khai sản xuất
enzyme lipase trong nước đang được quan tâm. Vi sinh vật có chu kỳ sinh trưởng và
phát triển ngắn, tốc độ sinh sản nhanh, môi trường nuôi cấy đơn giản và dễ dàng kiểm
soát là một nguồn thu nhận enzyme lipase quan trọng. Aspergillus niger là một trong
những vi sinh vật cho hàm lượng enzyme cao. Tuy nhiên vi sinh vật cho hàm lượng
enzyme cao là chưa đủ cần phải có phương pháp thích hợp để thu nhận được enzyme
cao nhất.
Bên cạnh đó việc nâng cao hiệu suất sử dụng enzyme lipase cũng đang được
nghiên cứu. Phương pháp cố định enzyme là một trong những hướng nghiên cứu nhằm
nâng cao hiệu suất sử dụng enzyme. Bằng cách cố định enzyme trong chất mang
không tan trong nước enzyme có thể được tách ra khỏi cơ chất một cách dễ dàng sau
phản ứng. Thêm vào đó enzyme cố định được tái sử dụng nhiều lần khắc phục tình
trạng khan hiếm enzyme như hiện nay. Một vấn đề được đặt ra nữa là: làm thế nào tìm
được cơ chất thích hợp cho sự cố định lipase để nâng cao hiệu suất cố định enzyme và
tăng số lần tái sử dụng của enzyme cố định.

1


Để đáp ứng được hai yêu cầu thiết thực và bức thiết này ở nước ta hiện nay
chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài “Thu nhận enzyme lipase từ Aspergillus niger,

khảo sát hoạt tính lipase trước và sau cố định trên hai cơ chất Natrialginate và
Chitosan”. Với đề tài này, chúng tôi hi vọng sẽ góp một phần nhỏ trong nghiên cứu
sinh hóa và phát triển phương pháp tối ưu thu nhận lipase từ Aspergillus niger đồng
thời góp phần nhỏ trong việc tìm được cơ chất thích hợp cố định enzyme lipase mang
lại hiệu quả kinh tế cao.
1.2. Mục tiêu
Thực hiện việc thu nhận enzyme lipase từ A. niger trong phòng thí nghiệm. Sử
dụng enzyme thu được để cố định trên hai cơ chất Natrialginate và Chitosan.
1.3. Mục đích
Làm cơ sở nghiên cứu cho việc tìm ra phương pháp thu nhận được hàm lượng
lipase cao nhất. Đồng thời tìm ra cơ chất tối ưu cho việc cố định enzyme lipase để
mang lại hiệu quả kinh tế cao nhất trong công nghiệp.
1.4. Nội dung thực hiện
- Thu nhận enzyme lipase từ A. niger trong phòng thí nghiệm.
- Khảo sát các tác nhân tủa dịch chiết enzyme như: cồn, aceton, muối.
- Dùng enzyme vừa thu nhận cố định trên hai cơ chất Natrialginate và Chitosan.
- Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme thu nhận và enzyme cố
định trên hai cơ chất Natrialginate và Chitosan
- Khảo sát số lần tái sử dụng của enzyme cố định.
- Xác định hiệu suất cố định trên hai cơ chất Natrialginate và Chitosan.

2


Chương 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Sơ lược về enzyme lipase
2.1.1. Định nghĩa
Lipase (triglyceride acyl hydrolase) thuộc nhóm enzyme thuỷ phân (Hydrolase),
là enzyme có khả năng xúc tác sự thuỷ giải các nối ester của triacylglyceride thành

glycerol và acid béo tự do. Mã số của enzyme lipase là EC 3.1.1.3
a. Cấu trúc không gian
Phiến β màu xanh được bao quanh bởi các xoắn α màu vàng. Nhóm serine hoạt
động là các thanh màu đỏ và vùng nắp xoắn của enzyme cũng có màu đỏ.
Cấu trúc chung của enzyme lipase gồm một phiến β ở giữa với nhóm serine hoạt động
đặt trong một vòng (loop) gọi là cùi chỏ xúc tác (catalytic elbow). Trên serine là một
khe kị nước (hydrophobic cleft) được hình thành sau sự hoạt hóa. Khe ưa nước là một
túi dài (elongated pocket) tùy theo cơ chất gắn khít vào.

Hình 2.1 Cấu trúc không gian của lipase.
()
b. Cơ chất
Mỡ động vật và dầu thực vật là những nguồn cơ chất chính của enzyme lipase.
Để phân tích hoạt tính của lipase người ta thường dùng cơ chất là triglyceride được
tinh sạch hoặc tổng hợp. Chẳng hạn như triolein tributyrin. Các dạng triglyceride dễ

3


dàng phân cắt bởi enzyme lipase hơn khi nó được nhũ hóa kĩ và tạo thể nhũ tương với
nước hoặc bơ.
c. Cơ chế tác dụng
Quá trình xúc tác của lipase là quá trình xảy ra chậm so với quá trình xúc tác
của các enzyme khác như protease hay amylase. Sản phẩm của quá trình thủy phân
nhờ sự xúc tác bởi lipase là monoglyceride và acid béo.

Hình 2.2 Sản phẩm quá trình thủy phân xúc tác bởi lipase.
()
Theo Brokerhoff (1973), khi enzyme lipase này tác động lên “một siêu cơ
chất”, ví dụ như bề mặt của giọt dầu thì nó được định hướng đúng cho phản ứng. Vùng

kị nước của enzyme liên kết với những cơ chất kị nước. Còn những vùng hoạt động
của enzyme thì có thể nằm gần với vùng kị nước này hoặc những vùng ưa nước cần
thiết cho sự thủy giải acyl enzyme trung gian.
Sự phân tích muối của lipid dẫn xuất từ glycerol-1-oleate-2,3-dipalmitate và từ
1,2-dipalmitate-3-oleate đã cho thấy 2 vị trí ngoài là 1 và 3 được phân cắt với tốc độ
như nhau. Do đó, enzyme lipase từ động vật là enzyme lipase đặc hiệu vị trí 1, 3. Nếu
các glyceride hiện diện dưới dạng nhũ hóa thì acid béo mạch ngắn sẽ được thủy giải
nhanh hơn acid béo mạch dài.

4


2.1.2. Các nguồn thu nhận enzyme lipase
2.1.2.1. Từ động vật
Ngay từ năm 1923, Willstatter và Klemmen đã thu nhận enzyme từ tụy tạng heo
nhưng đến 1996 Vergen mới tinh sạch hoàn toàn enzyme lipase này.
Enzyme lipase từ tụy tạng là enzyme lipase tốt nhất từ nguồn động vật. Enzyme này
hiện diện trong tụy tạng và dịch tụy tạng. Enzyme thu được khối lượng phân tử là
45000 - 50000 Dalton. Khoảng pH tối ưu cho enzyme này là 7,0 - 9,3. Enzyme lipase
này hoạt động mạnh hơn khi có sự hiện diện của muối canxi. Các acid mật và muối
mật cũng có tác dụng làm tăng hoạt tính của enzyme lipase từ tụy tạng do vậy mà nó
có khả năng nhũ hoá cơ chất. Nhờ đó tăng cơ hội tương tác giữa enzyme và cơ chất.
2.1.2.2. Từ thực vật
Enzyme lipase từ nguồn thực vật có nhiều trong các hạt dầu bao gồm: hạt đậu
nành, đậu phộng, nhô, thầu dầu và hạt của các cây như cây mù tạt, cây cải dầu, cây
bông, cây anh túc. Enzyme lipase từ hạt này có thể xúc tác thuỷ giải dầu thực vật và cả
mỡ động vật. Nhưng enzyme lipase này thuỷ giải các chất có thành phần đơn giản như
ester của các acid béo với gốc methyl mạnh hơn là đối với các cơ chất là mỡ động vật
hay dầu thực vật.
Hầu hết các công trình nghiên cứu về những đặc tính của enzyme lipase từ thực

vật đều khảo sát enzyme lipase từ hạt thầu dầu. Nồng độ ion H+ thích hợp cho hoạt
động của enzyme lipase này là khoảng pH5.
2.1.2.3. Từ vi sinh vật
Enzyme lipase có thể tạo ra từ nhiều chủng vi khuẩn, nấm men và nấm mốc.
Khoảng 15 năm về trước thì enzyme này đã được dùng làm chế phẩm trong nghiên
cứu khoa học. Về sau các nhà sản xuất Nhật Bản mới bắt đầu thu enzyme lipase từ
giống Rhizopus và Aspegillus để ứng dụng trong công nghiệp dược phẩm thay thế cho
nguồn enzyme lipase từ tụy tạng. Do áp dụng những kỹ thuật công nghệ mới nên chế
phẩm enzyme lipase từ nhiều chủng vi sinh vật khác nhau không ngừng tăng lên. Với
các đặc điểm thuận lợi như: tốc độ sinh sản nhanh, enzyme thu nhận có hoạt tính cao,
hơn nữa điều kiện của quá trình nuôi cấy lại không phụ thuộc vào ngoại cảnh vi sinh
vật là nguồn thích hợp cho việc sản xuất enzyme theo quy trình công nghiệp.

5


Các loài vi nấm phân lập từ các mẫu đất ở Ai Cập được xác định là có khả năng
tạo enzyme lipase cao bao gồm: Asperills niger, A. terreus, A. oryzae, A. fumigatus,
Penicilium chysogenum, P. funiculosum, Fusarium solani, Fusarium moniliforme,
Fusarium vasinfectum và Alternaria alternata. Trong số đó, loài có khả năng tạo
enzyme lipase mạnh nhất là A. niger tiếp theo sau là A. terrus, A. fumigatus, Fusarium
moniliforme. Loài tạo enzyme lipase thấp nhất là P. chysogenum.
Mohawed và ctv, (1985) đã phân lập được 24 loài thuộc giống Aspegillus từ
môi trường đất ở Ai Cập. Trong đó loài có khả năng tạo lipase mạnh nhất là A. niger.
Điều này chứng tỏ hoạt động của enzyme lipase không chỉ khác nhau ở những giống
khác nhau mà còn khác nhau ngay cả ở những loài khác nhau của cùng một giống.
2.1.3. Ứng dụng
2.1.3.1. Trong công nghiệp giặt tẩy
Những ứng dụng của enzyme lipase mang lại giá trị thương mại chủ yếu là
trong lĩnh vực chất tẩy rửa. Có đến 32% tổng số enzyme lipase bán ra dùng trong công

nghiệp giặt tẩy. Ước tính khoảng 1000 tấn enzyme lipase dùng để sản xuất 13 tỉ tấn
bột giặt mỗi năm (Jaeger và Reetz, 1998). Do có khả năng phân huỷ chất béo nên
enzyme lipase được ứng dụng như là nhân tố chính trong công nghiệp giặt tẩy và chất
tẩy rửa trong gia đình.
2.1.3.2. Trong công nghiệp thực phẩm
Dầu và mỡ là thành phần quan trọng trong thức ăn. Giá trị dinh dưỡng và giá trị
cảm quan cùng với những tính chất vật lý của triglyceride được quyết định bởi nhiều
yếu tố như: vị trí gắn vào khung glycerol của chuỗi axit béo, chiều dài của chuỗi acid
béo và độ không bão hoà của nó. Enzyme lipase có thể làm thay đổi những đặc tính
của chất béo bằng cách thay đổi vị trí của chuỗi acid béo cũ bằng chuỗi acid béo mới.
Với cách này những loại lipid rẻ tiền và không mong muốn có thể được chuyển đổi
thành lipid có giá trị cao hơn (Colman và Macrae, 1980).
Ngoài ra enzyme lipase còn dùng để làm tăng hương vị cho phomat chín, bánh
mì và thức uống. Một khía cạnh khác, enzyme này cũng được dùng để loại bỏ chất béo
từ các sản phẩm thịt và cá.

6


2.1.3.3. Trong công nghiệp giấy
Chất bã (pitch) hay thành phần kị nước của gỗ (chủ yếu là trigyceride và chất
sáp) đã gây ra nhiều khó khăn trong quá trình sản xuất giấy (Jaeger và Reetz, 1998).
Công ty sản xuất giấy công nghiệp Nippon tại Nhật Bản đã phát triển một phương
pháp kiểm soát “pitch” bằng cách dùng các enzyme lipase từ nấm candidi rugosa để
thuỷ giải đến 90% triglyceride trong gỗ. Từ đó enzyme lipase thường được dùng để
loại bỏ các “pitch” từ bột giấy trong quá trình sản xuất giấy.
2.1.3.4. Trong tổng hợp chất hữu cơ
Đây là một ứng dụng có ý nghĩa rất lớn trong ngành hoá học nói chung và tổng
hợp chất hữu cơ nói riêng. Enzyme lipase được dùng để xúc tác nhiều loại phản ứng
chuyển đổi hoá học, đặc hiệu vùng và đặc hiệu không gian (www.sciencedirect.com).

2.1.3.5. Trong chuyển đổi sinh học trong môi trường nước
Enzyme lipase chuyển hoá acyl thu từ loài Candida parapsilosis có thể dùng xúc tác
sự tổng hợp sinh học các acid béo trong môi trường 2 pha nước và chất béo. Những cơ
chất trong phản ứng này là những chất acyl (acid béo hoặc ester giữa acid béo với gốc
metyl) và hydroxylamine. Sự chuyển hoá từ chất cho là ester cho đến hydroxylamine
(aminolysis) được xúc tác chọn lọc hơn khi so sánh với cơ chất là acid béo tự do.
Chính đặc điểm này làm cho enzyme lipase từ loài C. parapsilosis xúc tác chọn lọc có
định

hướng

quá

trình

chuyển

đổi

sinh

học

trong

môi

trường

nước


().
2.1.3.6. Trong chuyển đổi sinh học ở môi trường hữu cơ
Enzyme lipase hoạt động trong môi trường hữu cơ không có thành phần nước
tự do đã thể hiện một số đặc tính đáng chú ý. Với những đặc tính này người ta đã thiết
lập nên một hệ thống enzyme không cần dùng nước cho sự tổng hợp và biến đổi sinh
học (Klibanoz, 1997).
2.1.3.7. Trong sự tổng hợp ester
Enzyme lipase đã mang lại những thành công trong việc xúc tác để tổng hợp
nên những ester mới. Những ester được tạo bởi chuỗi acid béo ngắn được dùng làm
tăng hương vị trong công nghiệp thực phẩm. Những ester giữa chuỗi acid béo dài với
gốc metyl hoặc gốc etyl thì được dùng để làm giàu nhiên liệu diesel (Vulfson, 1994).

7


2.1.3.8. Trong phản ứng acyl hóa đặc hiệu vị trí
Enzyme lipase có khả năng acyl hoá nhiều loại steroid, đường và những dẫn
xuất từ đường với sự đặc hiệu vùng cao. Đường được acyl hóa 1 nhóm sinh ra trong
môi trường pyridine khan từ các muối trietylcarboxylate và nhiều loại đường đơn
khác. Ngược lại, Chen và ctv.(1995) đã sử dụng enzyme lipase từ Asperillus niger để
xúc tác phản ứng khử acyl có chọn lọc vị trí từ đường metyl-D-glucopyraside đã được
acyl hóa từ trước. Tương tự, sự khử gốc acetyl có tính đặc hiệu vị trí từ những dẫn
xuất của đường monosaccharide đã được acyl hoá trước đó trong môi trường 1,1,1trichloroethane bằng cách sử dụng enzyme lipase có bổ sung polyetylenglycol (PEG).
2.1.3.9. Trong công nghiệp hóa dầu
Việc ứng dụng enzyme lipase trong công nghiệp hóa dầu đã tiết kiệm năng
lượng và giảm nhiệt độ xuống thấp nhất trong quá trình rượu hóa, acid hóa, thuỷ giải
và tạo glycerol (Vulfson, 1994).
Mặc dù enzyme lipase được tạo ra theo tự nhiên là dùng để thuỷ giải nối ester
của triglyceride, nhưng bên cạnh đó nó còn xúc tác những phản ứng tổng hợp ester

trong môi trường có lượng nước thấp. Sự thuỷ giải và ester hóa có thể xảy ra đồng thời
trong một quá trình được gọi là ester hóa nội (interesterification).
Dựa trên cơ chất mà enzyme thực hiện phản ứng, enzyme lipase có thể xúc tác
phản ứng acid hóa (một acyl được sinh ra do phản ứng giữa một acylglycerol và acid
carboxylic), hay phản ứng rượu hóa (một acyl được sinh ra do phản ứng giữa một
acylglycerol và một rượu) và phản ứng chuyển ester hoá (2 gốc acyl được tạo ra do
phản ứng trao đổi giữa acylglycerol).
2.1.3.10. Trong chế biến dầu và chất béo
Các quá trình thuỷ phân chất béo và dầu bằng chế phẩm enzyme lipase được
phát triển rộng rãi trên thế giới, đặc biệt là ở Nhật Bản. Hiện nay, có khoảng 34 công
nghệ được ứng dụng trên toàn thế giới. Các loại enzyme lipase chủ yếu được sản xuất
từ Candida cylindracea. Trên thế giới có khoảng 10 triệu tấn dầu, chất béo đang được
xử lý bằng phương pháp enzyme. Người ta thường tạo điều kiện tối ưu bằng tỷ lệ dầu
(chất béo) và chất đệm là 70 : 30, duy trì pH5 - pH6 và nhiệt độ thuỷ phân là 300C với
enzyme từ nấm Candida cylindracea.

8


2.2. Vi sinh vật tổng hợp lipase

Hình 2.3 Aspergillus niger.
2.2.1. Khái quát về A. niger
Aspergillus niger cấu tạo dạng sợi, sinh bào tử và không có diệp lục, sử dụng
nguồn hữu cơ có sẵn để sinh sống. Aspergillus niger có trong đất, xác bã thực vật và
hoa quả vùng nhiệt đới.
Van Tieghem là người đầu tiên phát hiện và phân lập chủng nấm mốc
Aspergillus niger từ quả, hạt, đặc biệt là hạt đậu phộng, bồ đào, dừa.
2.2.2. Đặc điểm sinh học
Aspergillus niger sinh trưởng được ở nhiệt độ tối thiểu là 6 - 8oC, tối đa là 45 470C, tối ưu là 28 - 350C, sinh trưởng trong môi trường có độ ẩm tối thiểu là 23%. Độ

ẩm môi trường thích hợp để lên men bán rắn là 60 - 65%, chỉ sinh trưởng và phát triển
trong sự có mặt của O2 và pH tối ưu từ 4 - 6,5.
Trên môi trường thạch Czapeck, Aspergillus niger mọc thưa, đường kính khuẩn
lạc khoảng 40mm.
2.2.3. Đặc điểm sinh hóa
a. Khả năng lên men đường
Aspergillus niger có khả năng đồng hóa tốt các lọai đường đơn và đường đôi
như glucose, maltose, saccharose.

9


b. Khả năng tổng hợp enzyme
Aspergillus niger có khả năng tổng hợp các lọai enzyme sau: Amylase,
Cellulose, Pectinase, Lipase.
c. Khả năng lên men rượu
Theo Menezes, một số loài Aspergillus niger có khả năng lên men rượu trong
điều kiện kị khí. Người ta cũng đã tiến hành nghiên cứu sử dụng bã khoai mỳ để sản
xuất rượu etylic dựa vào khả năng lên men rượu của Aspergillus niger.
2.2.4. Tác hại
Aspergillus niger được xếp vào loại an toàn thực phẩm không chứa độc tố
aflatoxin. Tuy nhiên Aspergillus niger cũng làm hư hại trái cây tươi sau thu họach
như: táo, lê, chanh, nho, vân vân, gây nhiễm phomat. Aspergillus niger cũng sống bám
trên đồ gỗ, đồ da.
Bệnh nấm ở cây do phần lớn Aspergillus niger gây ra như thối rữa chồi cây hoa
bông vải, thối rữa thân cây.
Aspergillus niger cũng thường gây bệnh cho chim, chim con nhiễm bệnh
thường dễ chết, còn chim lớn thường không chết nhưng cũng sống yếu hơn những con
chim không bệnh.
2.3. Sự cố định enzyme

2.3.1. Định nghĩa
Enzyme cố định (hay còn gọi là enzyme không hòa tan) là những enzyme
chuyển động trong không gian bị giới hạn. Sự giới hạn của enzyme đạt được bằng
cách đưa nó vào một pha cách ly, tách rời khỏi pha dung dịch tự do mà ở đó nó vẫn có
khả năng tiếp xúc được với phân tử cơ chất. Pha chứa enzyme cố định thường không
tan trong nước nhưng cũng có thể là các polymer ưa nước cao phân tử.
Theo Michael Trevan, thuật ngữ cố định (immobilization enzyme, insoluble
enzyme) được hiểu là đưa những phân tử enzyme vào những pha riêng rẽ. Pha này
được tách riêng với dung dịch tự do. Pha enzyme thường không tan trong nước và
được gắn với những polimer ưa nước có trọng lượng phân tử lớn.
Theo Kalus Mosbach, các chất xúc tác sinh học cố định là enzyme, tế bào, cơ
thể sống hoặc tổ hợp giữa chúng trong một trạng thái cho phép sử dụng lại và liên tục.

10


2.3.2. Tính chất ưu nhược của enzyme cố định
Enzyme cố định ngày càng được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực là
nhờ vào những đặc điểm nổi bật sau:
- Có thể tái sử dụng lặp đi lặp lại nhiều lần một lượng enzyme xác định
trong một thời gian dài, do đó làm giảm giá thành sản phẩm, hiệu quả kinh tế cao,
tiết kiệm enzyme, đặc biệt quan trọng đối với những enzyme đắt tiền. Thuận lợi
trong các quá trình tự động hóa và liên tục.
- Tăng độ tinh sạch của sản phẩm vì enzyme được cố định ở những pha
riêng rẽ, dễ dàng tách ra khỏi sản phẩm. Do đó tránh được ảnh hưởng không tốt
đến sản phẩm. Điều này có ý nghĩa đặc biệt quan trọng khi sử dụng enzyme cố
định trong sản xuất dược phẩm, trong công nghiệp sản xuất hóa chất tinh khiết và
trong phân tích.
- Có thể dừng phản ứng ở bất cứ giai đoạn nào khi cần thiết, chỉ cần tách
enzyme cố định ra khỏi cơ chất.

- Kéo dài thời gian bảo quản và bền vững với chất kiềm hãm cũng như các
tác nhân gây biến tính so với enzyme hòa tan.
- Hoạt tính ổn định hơn so với enzyme tự do khi có những thay đổi của môi
trường như: pH, nhiệt độ,...nhờ vào các liên kết của enzyme với chất mang như
liên kết cộng hóa trị, liên kết hydro, liên kết ion và các liên kết khác.
Bên cạnh đó enzyme cố định cũng có những nhược điểm nhất định:
- Hạn chế khả năng tiếp xúc giữa cơ chất với enzyme cho nên hoạt tính
riêng của enzyme thường thấp hơn so với enzyme tự do.
- Một lượng enzyme đáng kể bị mất hoạt tính khi cố định bằng phương
pháp cộng hóa trị là do chất hoạt hóa và do phản ứng gắn kết không đặc hiệu của
các liên kết trên vật liệu cố định vào trung tâm hoạt động của enzyme.
2.3.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính enzyme hòa tan
Khi gắn lên chất mang, enzyme bị giới hạn trong một phạm vi môi trường xác
định, cấu tạo không gian của phân tử có thể bị thay đổi, do đó làm biến đổi một số tính
chất của enzyme ban đầu (enzyme hòa tan). Một số yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính
enzyme không hòa tan là
- Bản chất và tính chất hóa học của chất mang.

11


- Các tính chất lý học của chất mang như tính hòa tan, tính bền cơ học, độ
trương, điện tích, tính háo nước và kị nước,…đều có ảnh hưởng nhất định đến lượng
enzyme được liên kết, tính bền và hoạt tính sinh học của các dẫn xuất enzyme cố định.
Bản chất hóa học của các chất mang cũng có ảnh hưởng đáng kể đến khả năng tạo
thành dẫn xuất enzyme, và tới khả năng hấp thụ không đặc trưng các chất từ môi
trường phản ứng.
- Dẫn xuất enzyme không hòa tan thường có tính bền nhiệt cao so với enzyme
tan do kết quả của sự định vị enzyme tạo nên. Chất mang cũng có tác dụng hạn chế sự
biến tính của enzyme trong các dung môi có khả năng làm đứt mối liên kết hydrogen

và liên kết kỵ nước.
- Sự khuếch tán của cơ chất, sản phẩm và các phân tử khác.
- Tốc độ khuếch tán của cơ chất, sản phẩm và các chất phụ khác.
2.3.4. Các phương pháp cố định enzyme
Để thu được chế phẩm enzyme cố định có hoạt tính cao và ổn định thì việc
lựa chọn vật liệu cố định cũng như phương pháp cố định là hết sức quan trọng.
Dựa vào liên kết giữa chất mang và enzyme, người ta chia làm hai phương
pháp cố định: phương pháp vật lý (liên kết vật lý) và phương pháp hóa học (liên
kết đồng hóa trị). Theo Scouten và Gerhartz có bốn phương pháp cố định enzyme
- Phương pháp liên kết enzyme với vật liệu cố định (carrier binding).
- Phương pháp hấp thụ vật lý (physical adsorption).
- Phương pháp nhốt (entrapment).
- Phương pháp khâu mạch (cross – linking).
2.3.4.1. Phương pháp liên kết enzyme với vật liệu cố định (carrier binding)
Nguyên tắc của phương pháp này là enzyme được nối với chất mang thông
qua cầu nối. Cầu nối phải có kích thước không lớn và có hai đầu, một đầu gắn
chất mang còn đầu kia gắn với enzyme, đảm bảo liên kết vững chắc của enzyme
với chất mang.
Quá trình kết hợp với enzyme xảy ra một giai đoạn nếu chất mang có chứa
các nhóm có khả năng tham gia trực tiếp với nhóm amin của protein enzyme.
Trường hợp ngược lại là quá trình xảy ra với hai giai đoạn

12