BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
PHÂN LẬP ĐỊNH DANH Chlorella vulgaris
NUÔI SINH KHỐI LY TRÍCH DẦU

Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Sinh viên thực hiện: NGUYỄN NGỌC LỢI
Niên khoá: 2005 – 2009

Tháng 09/2009


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP ĐỊNH DANH Chlorella vulgaris
NUÔI SINH KHỐI LY TRÍCH DẦU

Hướng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

TS. TRƯƠNG VĨNH

NGUYỄN NGỌC LỢI

Tháng 09/2009


LỜI CẢM ƠN
Xin chân thành cảm ơn:
Ban Giám Hiệu trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh đã tạo mọi
điều kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập tại trường.
Các thầy cô trong Bộ môn Công nghệ sinh học cùng các thầy cô trực tiếp
giảng dạy luôn tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt bốn năm qua.
TS. Trương Vĩnh đã dành nhiều thời gian và công sức để truyền đạt cho em
những kiến thức quí báu, lắng nghe và động viên em, tạo mọi điều kiện thuận lợi
cho em hoàn thành khóa luận này.
KS. Nguyễn Văn Lẫm phụ trách phòng thí nghiệm I5. Thầy đã nhiệt tình
giúp đỡ tôi vượt qua giai đoạn đầu của quá trình thực hiện đề tài và tạo mọi điều
kiện thuận lợi cho em trong suốt thời gian làm đề tài.
Các thầy cô phụ trách phòng thí nghiệm I4, bộ môn Công Nghệ Hóa Học
Trường Đại học Nông Lâm TP.HCM đã tận tình giúp đỡ tôi và tạo mọi điều kiện
trong suốt thời gian làm đề tài.
Các anh chị ở Viện Công Nghệ Sinh Học - Môi Trường, Trường Đại học
Nông Lâm TP.HCM đã tận tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian làm đề tài.
Toàn thể các bạn cùng làm đề tài ở phòng thí nghiệm I5, I4 và trung tâm
phân tích khu Cẩm Tú đã giúp đỡ và tạo niềm hứng khởi cho tôi khi làm đề tài.
Toàn thể lớp CNSH K31 đã giúp đỡ, chia sẽ và động viên tôi trong suốt
thời gian làm đề tài.
Thành kính ghi ơn bố mẹ đã nuôi nấng, dạy bảo điều hay lẽ phải cho con
cũng như đã động viên, hỗ trợ con về tinh thần, vật chất để con có thể hoàn thành
tốt khóa luận này. Ba mẹ là nguồn động viên là người tạo thêm sức mạnh để con

vượt qua mọi khó khăn trở ngại trong cuộc sống.
Tp. Hồ Chí Minh, ngày 22 tháng 07 năm 2009

Nguyễn Ngọc Lợi

iii


TÓM TẮT
Tảo đã được sử dụng trong nhiều ngành công nghiệp và các ứng dụng, và
nhiều ứng dụng mới được phát hiện như biodiesel từ tảo. Như một loạt các nghiên
cứu gần đây cho phép các công ty sử dụng để sản xuất cả nhiên liệu và sản phẩm
phi nhiên liệu từ từ các nguyên liệu từ cùng một loại tảo. Tảo là những nguyên liệu
duy nhất có khả năng thay thế hoàn toàn nhiên liệu cho ngành giao thông vận tải
trên toàn thế giới. Nhiên liệu từ tảo đại diện cho một thị trường mà giá trị hàng trăm
tỷ đô la..Từ nhu cầu phát triển nguồn nhiên liệu sinh học thay thế cho dầu diesel, tôi tiến
hành thực hiện đề tài: “ Phân lập, định danh Chlorella vulgaris nuôi sinh khối ly
trích dầu ”.
Đề tài được thực hiện qua 2 giai đoạn: Phân lập và định danh Chlorella
vulgaris từ giống tảo Chlorella sp. được cung cấp từ Khoa Thủy Sản, Trường Đại
Học Cần Thơ ; Nuôi cấy Chlorella vulgaris và ly trích dầu trong tảo.
Qua thực nghiệm, chúng tôi thu được một số kết quả sau:
Môi trường thích hợp nhất cho nuôi cấy để phân lập Chlorella vulgaris môi
trường BG-11 có bổ sung 10 ppm NAA. Định danh được 4 dòng Chlorella vulgaris
nuôi cấy trên môi trường BG-11 bao gồm: CV1, CV2, CV3 và CV4.
Nuôi cấy 4 dòng Chlorella vulgaris và Chlorella sp.(đối chứng) trên môi
trường đạm thấp trong chai thủy tinh 500 ml. Với kết quả thu được chúng tôi quyết
định chọn CV2 vì dòng này phát triển tốt hơn so với các dòng khác cùng nuôi cấy
và cả với mẫu đối chứng. Nuôi cấy 60 lít dòng CV2 trên môi trường nitơ cải tiến có
bổ sung 0,87 mM axít citric để thu sinh khối nhằm phân tích hàm lượng dầu tổng.

Kết quả hàm lượng dầu tổng thu được là 17,25 % khi ly trích sử dụng dung môi là
n-hexan.

iv


SUMMARY
Algae are already being used in a wide variety of industries and applications,
and many newer applications are being discovered such as biodiesel from algae .
Such a wide range of end-uses enable companies to produce both fuels and non-fuel
products from the same algae feedstock. Algae are the only feedstock that have the
potential to completely replace world's consumption of transportation fuels. Fuel
from algae represents a market that is worth hundreds of billions of dollars. The
thesis entiled: “Isolation and identification of Chlorella vulgaris for biomass culture
and lipid extraction from this algae ”
The topic consists of two stages: Isolation and identification of Chlorella
vulgaris from Chlorella sp. supplied by Faculty of Fisheries, Can Tho Universit ;
Chlorella vulgaris has been cultured and extracted lipids.
 Results:
BG-11 medium containing 10 mg/L NAA is suitable for development of
Chlorella vulgaris. Four types of Chlorella vulgaris were identified : CV1, CV2,
CV3 and CV4.
Four types of Chlorella vulgaris and Chlorella sp.(control) are cultured in
modified low nitrogen medium using 500 ml beaker. The CV2 was found to be the
best among others. A 60 L of type CV2 has been cultured in modified low nitrogen
medium with addition of 0.87 mM citric acid during culture. The total lipids of
17.25 % extracted from CV2 was obtained using n-hexan.

v



MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN ........................................................................................................... iii
TÓM TẮT ................................................................................................................. iv
SUMMARY ................................................................................................................v
MỤC LỤC................................................................................................................. vi
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT.................................................................... viii
DANH SÁCH CÁC BẢNG ..................................................................................... ix
DANH SÁCH CÁC HÌNH .........................................................................................x
Chương1 MỞ ĐẦU.....................................................................................................1
1.1. Đặt vấn đề ............................................................................................................1
1.2. Mục tiêu nghiên cứu.............................................................................................2
1.3. Nội dung nghiên cứu............................................................................................2
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..........................................................................3
2.1. Tổng quan về Chlorella sp...................................................................................3
2.1.1. Giới thiệu về Chlorella sp.................................................................................3
2.1.2. Đặc điểm sinh lý................................................................................................4
2.1.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy tảo Chlorella............................................4
2.1.3.1. Ảnh hưởng của ánh sáng................................................................................5
2.1.3.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ .................................................................................5
2.1.3.3. Ảnh hưởng của pH môi trường ......................................................................5
2.1.3.4. Ảnh hưởng của sự khuấy trộn môi trường .....................................................5
2.1.3.5. Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng nuôi cấy..........................................6
2.1.4. Các thành phần dinh dưỡng có trong tảo Chlorella..........................................8
2.2. Tổng quan về biodiesel ......................................................................................10
2.3. Tổng quan về axít citric......................................................................................11
2.4. Tổng quan về Chlorella vulgaris .......................................................................14
2.5. Những cách phân lập tảo thông dụng.................................................................16
2.6. Mối quan hệ giữa các chất hóa học trong trao đổi năng lượng ở sinh vật .........18

2.7. Những thành tựu nghiên cứu về Chlorella để phân tích hàm lượng dầu...........20
vi


Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.................................24
3.1. Địa điểm và thời gian tiến hành đề tài ...............................................................24
3.2. Vật liệu ...............................................................................................................24
3.2.1. Nguồn tảo giống..............................................................................................24
3.2.2. Thiết bị, dụng cụ thí nghiệm ...........................................................................24
3.2.3. Hoá chất thí nghiệm ........................................................................................24
3.3. Phương pháp nghiên cứu....................................................................................25
3.3.1. Phương pháp phân lập tảo Chlorella vulgaris ................................................25
3.3.2. Phương pháp bố trí thí nghiệm........................................................................26
3.3.2.1. Thí nghiệm 1: Nuôi sinh khối 4 dòng CV và đối chứng..............................26
3.3.2.2. Thí nghiệm 2: Chọn dòng CV2 nuôi tăng sinh khối ....................................28
3.3.2.3. Thí nghiệm 3: Ly trích lấy dầu trong dung môi n-hexan.............................29
3.3.3. Phương pháp theo dõi chỉ tiêu chất lượng môi trường ...................................30
3.3.4. Phương pháp xử lý số liệu...............................................................................30
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................31
4.1. Phân lập và định danh tảo ..................................................................................31
4.2. Nuôi sinh khối tảo ..............................................................................................37
4.2.1. Thí nghiệm 1: Nuôi sinh khối 4 dòng CV và đối chứng.................................37
4.2.2. Thí nghiệm 2 : Chọn dòng CV2 nuôi tăng sinh khối tảo. ...............................39
4.2.3. Thí nghiệm 3: Ly trích lấy dầu trong dung môi n-hexan................................41
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ......................................................................44
5.1. Kết luận ..............................................................................................................44
5.2. Đề nghị ...............................................................................................................44
Tài liệu tham khảo.....................................................................................................45
Phụ lục


vii


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ATP:

Adenosin Tri Phosphate

CAUP:

Culture Colllection of Algae of Charles University in Prague

CV:

Chlorella vulgaris

Ch sp/NK: Chlorella sp. nuôi trong môi trường nitơ thấp cải tiến không bổ sung
axít citric
CV2/NK:

Chlorella vulgaris dòng 2 nuôi trong môi trường nitơ thấp cải tiến
không bổ sung axít citric.

CV2/NC:

Chlorella vulgaris dòng 2 nuôi trong môi trường nitơ thấp cải tiến có
bổ sung axít citric.

NAA:


Naphtalen acetic axít

Tb:

Tế bào

TL

Trọng lượng

viii


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Trang
Bảng 2.1 Những thành phần có trong 100g trọng lượng khô của Chlorella sp. .......9
Bảng 2.2 Một số loài tảo nuôi sinh khối để ứng dụng sản xuất biodiesel ...............20
Bảng 4.1 Mối tương quan giữa mật độ tế bào và kết quả đo OD (A) 10ml .............32
Bảng 4.2 Mối tương quan giữa mật độ và kết quả đo OD (A) ở 0 giờ và 97 giờ.....33
Bảng 4.3 Mối tương quan giữa mật độ và kết quả đo OD (A) 14 ngày ...................34
Bảng 4.4 Tỷ lệ Chlorella vulgaris trong CV1, CV2, CV3, CV4 .............................36
Bảng 4.5 So sánh mật độ đỉnh, trọng lương khô thu được của 5 nghiệm thức ........38
Bảng 4.6 Gia tăng mật độ (triệu tb/ml) trong 96 giờ (F2) .......................................40
Bảng 4.7 Gia tăng mật độ (triệu tb/ml) trong 96 giờ (F3) ........................................40
Bảng 4.8 Gia tăng mật độ (triệu tb/ml) trong 96 giờ ( F4) .......................................40
Bảng 4.9 Gia tăng mật độ (triệu tb/ml) trong 96 giờ (F4’).......................................41
Bảng 4.10 Kết quả tính toán hàm lượng lipid (%) ở Chlorella. ..............................41

ix



DANH SÁCH CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1 Những hóa thạch Chlorella ở tiền Kỷ Cambri ...........................................3
Hình 2.2 Những tế bào Chlorella sp. .........................................................................4
Hình 2.3 Chu trình Kreb’s ........................................................................................12
Hình 2.4 Tế bào Chlorella vulgaris .........................................................................13
Hình 2.5 Tổng hợp lipid từ nguyên liệu là acetyl-CoA trong ty thể .......................14
Hình 2.6 Sáu dòng tảo thuộc loài Chlorella vulgaris...............................................15
Hình 2.7 Sơ đồ sản xuất dùng cho nuôi tảo theo từng mẻ (Lee và Tamaru, 1993)..16
Hình 2.8 Thiết bị chuyên dùng để phân lập các loại tảo ..........................................16
Hình 2.9 Phương pháp tạo khuẩn lạc đơn trên đĩa Petri...........................................17
Hình 2.10 Phương pháp pha loãng mẫu ...................................................................18
Hình 2.11 Ảnh hưởng của các nồng độ Fe3+ thêm vào ngày thứ 7..........................21
Hình 2.12 Hàm lượng dầu được tích lũy trong tảo (%)............................................22
Hình 2.13 Sự gia tăng mật độ tế bào khi nuôi trong môi trường đạm thấp.............23
Hình 3.1 Hình dạng ngoài của buồng đếm hồng cầu ...............................................27
Hình 3.2 Kích thước các ô trong buồng đếm ...........................................................27
Hình 4.1 Ống tảo thu được qua quá trình lọc với mật độ 8 triệu tb/ml ....................31
Hình 4.2 Đường chuẩn độ của mẫu tảo trong ống nghiệm ......................................32
Hình 4.3 Phân lập tảo theo phương pháp pha loãng.................................................32
Hình 4.4 Đường chuẩn độ của mẫu tảo trong chai thủy tinh 100ml ở 0 giờ...........32
Hình 4.5 Bốn dòng CV phân lập được sau 14 ngày nuôi cấy chai 100 ml .............33
Hình 4.6 Trước khi phân lập và định danh Chlorella vulgaris ở 100X …………..34
Hình 4.7 Sau khi phân lập và định danh Chlorella vulgaris ở 100X .......................34
Hình 4.8 Các dòng Chlorella vulgaris phân lập được sau nuôi cấy.........................35
Hình 4.9 Bốn dòng CV phân lập được nuôi cấy trong chai thủy tinh 500 ml..........36
Hình 4.10 Thí nghiệm bố trí nuôi cấy tảo trong chai thủy tinh 500 ml....................36
Hình 4.11 Quá trình sinh trưởng của 5 nghiệm thức theo dõi trong 8 ngày ............37
Hình 4.12 Kết quả ly trích dầu bằng n-hexan...........................................................41


x


MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Thế giới đang gặp rất nhiều thảm họa từ thiên nhiên nguyên nhân chủ yếu do
tình trạng ấm dần lên của trái đất: hạn hán, lũ lụt. Theo nghiên cứu, nhiệt độ trái đất
cứ ấm lên 1oC thì sản lượng trên ruộng lúa giảm 10%. Thiên tai, bệnh tật cũng là
một trong những nguyên nhân hàng đầu dẫn tới tình trạng lương thực khan hiếm.
Gián tiếp ảnh hưởng đến nguồn cung cấp gạo là việc một số loại ngũ cốc đang được
sử dụng không phải để ăn, mà để làm nhiên liệu sinh học gây sức ép đối với nguồn
cung cấp lương thực trên toàn thế giới. Nhu cầu năng lượng ngày càng cao trong khi
nguồn năng lượng hóa thạch ngày càng cạn kiệt. Vì năng lượng sinh học là nguồn
tạo năng lượng nhanh và hiệu quả trong qui trình xử lí công nghiệp. Năng lượng
sinh học từ tinh bột chuyển hóa thành ethanol chạy máy là rất tốt tuy nhiên vấn đề
là sử dụng và sản xuất là vô cùng lớn. Tại Hoa Kỳ để thay thế 10% xăng thì phải sử
dụng 150 triệu tấn tinh bột bắp với số lượng tinh bột này đủ cung cấp lương thực
cho 650 triệu dân trong 1 năm. Việc dùng nhiên liệu sinh học thay thế một phần
xăng dầu do Mỹ và châu Âu xúc tiến đã khiến giá nông sản tăng đáng kể trong năm
ngoái. Riêng trong năm 2007, 1/4 lượng ngô sản xuất tại Mỹ được dùng làm nhiên
liệu. Được biết, lượng gạo dự trữ của toàn thế giới năm 2007 - 2008 thấp hơn năm
1983 - 1984 và chỉ bằng 50% năm 2000 - 2001.
Ý tưởng sản xuất biodisel từ vi tảo có từ lâu (Chisti Y, 1980). Việc sản xuất
biodiesel từ tảo không cạnh tranh với đất trồng cho thực phẩm và góp phần giảm
thiểu khí nhà kính làm sạch môi trường. Đặc biệt, tảo có sự phát triển nhanh, vòng
đời ngắn và có thể tồn tại ở bất cứ nơi nào có đủ ánh sáng, kể cả vùng hoang hoá,
nước mặn, nước thải, lại có khả năng làm sạch môi trường nước thải. Để nuôi tảo,
chỉ cần ánh sáng, CO2, nước và dinh dưỡng có thể là phân hoá học hoặc phân
chuồng. Tảo giống thường nuôi trong phòng thí nghiệm, về sau có thể chuyển qua

bể hoặc ao. So sánh với cây cọ dầu tuy là loại cây cho năng suất dầu cao, khoảng 5
tấn dầu/ha/năm nhưng loại cây này chiếm khá nhiều diện tích đất nông nghiệp. Nếu
tảo có chứa hàm lượng dầu khoảng 30% thì cho tới 45 tấn/ha/năm, cao gấp 9 lần so

1


với cọ dầu. Và trên thế giới có nhiều loại tảo có hàm lượng dầu tới 70% và cho 120
tấn/ha/năm. Tuy nhiên, nếu hàm lượng dầu trong tảo đạt khoảng 57% thì giá thành
sản xuất dầu biodiesel sẽ bằng giá dầu diesel 11.500 VND/lít.
Chlorella là một ngành tảo vi mô xanh lục tế bào đơn cực nhỏ (2 - 10 µm)
tồn tại trên Trái đất khoảng 2,5 tỉ năm. Ngành vi tảo này có những 2 đặc tính khác
thường trong nó: thành tế bào duy nhất và khả năng sinh sản khác thường tới mức
ngạc nhiên.
Từ nhu cầu thực tế phát triển nguồn năng lượng thay thế đồng thời đảm bảo
an ninh lương thực. Chúng tôi thực hiện nghiên cứu đề tài: "Phân lập, định danh
Chlorella vulgaris nuôi sinh khối ly trích dầu ".
1.2. Mục tiêu nghiên cứu
Tiến hành phân lập dòng tảo Chlorella vulgaris và các yếu tố giúp cho tảo
tổng hợp được nhiều dầu. Từ đó làm cơ sở để tối ưu hóa quá trình nhân sinh khối
tảo Chlorella vulgaris ở quy mô lớn để sản xuất biodiesel. Chọn được dòng
Chlorella vulgaris nuôi cấy ở điều kiện nuôi cấy chọn lọc được bố trí trong nghiên
cứu của đề tài để có hàm lượng dầu cao là  15% trọng lượng khô.
1.3. Nội dung nghiên cứu
Phân lập và tách đơn bào tử dòng tảo Chlorella vulgaris trong môi trường
BG-11.
Nuôi cấy các dòng tảo Chlorella vulgaris trong môi trường nitơ thấp cải tiến
và định lượng dầu tổng bằng soxhlet.
Bước đầu tiến hành nuôi cấy dòng tảo Chlorella vulgaris có bổ xung thêm
acid citric vào trong môi trường nitơ thấp cải tiến để cải thiện khả năng tổng hợp và

tích lũy lipid của tảo lên 15% trọng lượng khô.
Nuôi cấy tảo ở thể tích 5 - 6 lít để đánh giá khả năng phát triển của tảo và cải
thiện điều kiện nuôi cấy nhằm có mật độ tảo cao.

2


Chương 2:
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Tổng quan về Chlorella sp.
2.1.1. Giới thiệu về Chlorella sp.
Chlorella thuộc ngành tảo lục (Chlorophyta). Chlorella là một ngành tảo vi
mô xanh lục tế bào đơn cực nhỏ (từ 2 đến 10 µm) tồn tại trên trái đất khoảng 2,5 tỉ
năm. Ngành tảo vi mô này có những 2 đặc tính khác thường trong nó: thành tế bào
duy nhất và khả năng sinh sản khác thường tới mức ngạc nhiên của nó.

Hình 2.1 Những hóa thạch Chlorella ở tiền Kỷ Cambri
( />Đầu những năm 1900, người ta biết rằng cơ thể Chlorella bao gồm 60%
protein và sinh sản rất nhanh, các nhà khoa học ở các quốc gia khác nhau, đặc biệt
là ở Đức bắt đầu nghiên cứu ý tưởng làm thực phẩm từ Chlorella.
Mặc dù việc nghiên cứu bị gián đoạn bởi chiến tranh thế giới thứ II ở châu Âu,
niềm đam mê trong việc nghiên cứu Chlorella vẫn được tiếp tục. Năm 1948, một
nhà nghiên cứu tại viện nghiên cứu Stanford đã thành công trong việc phát triển

3


Chlorella. Tuy nhiên, việc nghiên cứu bị dừng lại vì vấn đề tài chính. Vào năm
1950, viện Carnegie đảm nhận việc nghiên cứu và họ kết luận rằng Chlorella có thể

phát triển cho việc thương mại và sẽ là một giải pháp để cải thiện nạn đói trên thế
giới. Lợi ích ban đầu của Chlorella là làm nguồn thực phẩm.

Hình 2.2 Những tế bào Chlorella sp.
( />2.1.2. Đặc điểm sinh lý
Chlorella là hình thức tế bào đầu tiên của sự sống có nhân thật. Phát triển
trong điều kiện có nhiều ánh sáng và chất dinh dưỡng, Chlorella tái sản xuất bằng
cách phân chia tế bào với tốc độ 4 tế bào trong mỗi 17 - 24 giờ. Tảo thường chứa
chất diệp lục và tảo lục là cơ thể sống màu xanh đơn giản nhất.
Giống như chất diệp lục khác được chứa trong thực vật, tảo biến đổi những
những chất vô cơ thành những chất hữu cơ bằng cách sử dụng năng lượng ánh
sáng và quang hợp. Chúng tạo nên mắt xích đầu tiên trong chuỗi thức ăn của trái
đất. Thành tế bào làm nhiệm vụ nhốt và bảo vệ tế bào bên trong, làm cho
Chlorella có thể chống chịu được những thay đổi môi trường, cũng như sự tấn
công của các vi sinh vật khác.
2.1.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy tảo Chlorella
2.1.3. 1 Ảnh hưởng của ánh sáng
Đối với Chlorella, ánh sáng có ý nghĩa rất lớn. Cường độ ánh sáng càng cao,
khả năng phát triển của tảo càng mạnh. Shigetoh miyachi (1983) cho rằng cường độ
ánh sáng thích hợp cho sự phát triển của tảo Chlorella nằm trong khoảng 500 –

4


10000 lux (Trích dẫn bởi Nguyễn Đức Lượng, 2006). Robert (1971) cho rằng có thể
là ánh sáng tự nhiên hoặc ánh sáng của đèn huỳnh quang, chu kỳ chiếu sáng tối
thiểu là 18 giờ/ngày, tối đa là 24 giờ/ngày tùy vào thể tích. Tuy nhiên không phải tất
cả các phiêu sinh vật đều chịu được ánh sáng liên tục nhưng phần lớn các giống tảo
làm thức ăn đều chịu được ánh sáng liên tục (Trích dẫn bởi Đậu Thị Như Quỳnh,
2001). Điều này hạn chế một phần phiêu diêu sinh vật hiện diện trong quá trình nuôi

cấy tảo và làm tăng khả năng đề kháng cho tảo.
2.1.3.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ
Mỗi loài tảo thích hợp với nhiệt độ tối ưu và biên độ nhiệt khác nhau tùy
theo loài (Trịnh Trường Giang, 1997). Nhiệt độ đóng vai trò quan trọng trong phát
triển và sinh sản của tảo. Chính vì vậy, việc chọn các chủng loại tảo có khả năng
chịu nhiệt thì ý nghĩa lớn đến năng suất tảo. Mặt khác, nhiệt độ thấp cũng ảnh
hưởng xấu đến sinh trưởng của tảo. Tảo Chlorella phát triển tốt ở khoảng nhiệt độ
25 – 35oC. Tuy nhiên, khoảng nhiệt độ tối ưu cho tảo Chlorella phát triển còn phụ
thuộc rất nhiều ở cường độ chiếu sáng, khoảng thời gian chiếu sáng và thành phần
dinh dưỡng có trong môi trường nuôi cấy (Nguyễn Đức Lượng, 2006).
2.1.3.3. Ảnh hưởng của pH môi trường
Một thông số quan trọng của môi trường là pH vì pH xác định độ hòa tan của
CO2 và muối khoáng ảnh hưởng đến quá trình trao đổi chất ở tảo. Thông số này lại
phụ thuộc vào thành phần khả năng đệm của môi trường, nhiệt độ có vai trò trong
hoạt hóa khả năng trao đổi chất của tế bào tảo. Tảo Chlorella phát triển tốt ở pH
axít yếu đến pH trung tính (pH = 5,5 – 7). Tuy nhiên loại này cũng có khoảng thích
nghi ở vùng pH = 3 – 8,5 (Nguyễn Đức Lượng, 2006).
2.1.3. 4. Ảnh hưởng của sự khuấy trộn môi trường
Khuấy trộn môi trường trong nuôi cấy tảo là điều kiện bắt buộc. Mục đích
của khuấy đảo: Tăng khả năng tiếp xúc của tế bào tảo với chất dinh dưỡng, làm tăng
quá trình trao đổi chất, tăng khả năng thoát chất khí trong quá trình hô hấp của tảo,
hạn chế vi sinh vật yếm khí có trong môi trường, đảm bảo chu kỳ sáng tối cho tảo
trong quá trình quang hợp (Nguyễn Đức Lượng, 2006).

5


Như vậy, kỹ thuật khuấy sục là vấn đề rất cần được quan tâm nhằm mục tiêu
tăng năng suất tảo mà không làm ảnh hưởng tới trạng thái tế bào. Về mặt kinh tế,
chọn giải pháp khuấy sục sao cho chi phí thấp nhất là yêu cầu đầu tiên (Đặng Đình

Kim và Đặng Hoàng Phước Hiền, 1999).
Trong quá trình nuôi tảo, người ta lắp những thiết bị khuấy hoặc sục khí có
công suất nhỏ mà ít sử dụng loại công suất lớn (Nguyễn Đức Lượng, 2006). Vì
không phải tất cả các loài tảo đều có thể chịu đựng được với chế độ sục khuấy mạnh
(Đặng Đình Kim và Đặng Hoàng Phước Hiền, 1999)
2.1.3.5. Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng nuôi cấy
Các dưỡng chất : trong môi trường nước Chlorella cần đủ nguồn dinh dưỡng
carbon, nitơ, các chất khoáng đa lượng và vi lượng. Ngoài ra chúng còn cảm ứng với
một số chất như là chất ức chế hoặc chất kích thích sinh trưởng.
Khảo cứu môi trường tự nhiên của Chlorella sinh sống, đến pha chế các môi
trường nhân tạo, hoặc nửa nhân tạo bằng bổ sung các chất vào nguồn tài nguyên
thiên nhiên : nước biển, nước suối khoáng, nước khoáng ngầm, giếng khoan,…
Dinh dưỡng carbon : Tảo Chlorella đồng hoá carbon chủ yếu ở dạng vô cơ,
tốt nhất là carbonat (CO32-), thông qua quá trình quang hợp. Shigetoh miyachi
(1983) cho rằng carbon dạng khí CO2 cũng có thể được sử dụng nhưng phải đảm
bảo cho môi trường ở vùng pH axít thích hợp. Nguồn carbon để nuôi Chlorella ở
khoảng 2 - 8 g NaHCO3/lít (Trích dẫn bởi Nguyễn Đức Lượng, 2006).
Dinh dưỡng nitơ : Theo Lê Đình Lăng (1999) tảo Chlorella và nhiều vi sinh
vật cố định nitơ, đồng hoá nitơ theo phản ứng khử nhờ enzyme nitrogenase xúc tác
khi có ATP. Kết quả nitơ được tổng hợp thành protein của chúng. Khả năng cố định
đạm của Chlorella rất cao, cho hàm lượng nitơ  10% trọng lượng khô, hay thường
trên 50% protein. Nhưng Chlorella không có khả năng sử dụng nitơ dạng khí N2 mà
sử dụng dưới dạng nitrat (NO3-). Ngoài ra có thể dùng nguồn nitơ khác : nitơ amon :
(NH4)2SO4 (Amonisulphat - AS), (NH4)2HPO4 (Diamoniphotphat - DAP) là các loại
phân bón hay dùng trong nông nghiệp, hoặc urê (NH2)2CO. Vậy nguồn thức ăn cho
Chlorella có thể chuyển đổi theo cách :
Urê (NH2CONH2)

Amoniac (NH3)


6

Amonium (NH4+)

Nitrat (NO3-).


Phốt pho vô cơ dưới dạng muối natri, kaliphotphat hoà tan  90 – 180 mg/lít.
Phốt pho tham gia hợp chất cao năng ATP, axít nucleotit, hợp chất của màng tế
bào. Nếu môi trường nuôi cấy thiếu phốt pho, Chlorella biến đổi màu rất nhanh, các
quá trình trao đổi chất giảm mạnh (Nguyễn Đức Lượng, 2006).
Kali K+ và Na+ : dưới dạng muối cloride hoặc vài dạng kết hợp với nguồn
nitơ, phốt pho. Tảo Chlorella rất ưa muối, trong môi trường ưu trương nhất chứa
kali tới 5 g/lít và natri tới 25 g/lít. Trong thực nghiệm một số ý kiến cho rằng tỷ lệ
K+/Na+ nên nhỏ hơn 5, lớn hơn tảo sẽ chậm phát triển, hoặc xấu hơn nữa gây rối
loạn tế bào, phá vỡ cất trúc tế bào tảo (Lê Đình Lăng, 1999).
Magie (Mg+2) : đóng vai trò tương tự như phốt pho, trong tổng hợp các hạt
polyphotphate. Magie rất quan trọng đối với tảo vì nó là nhân của clorophin ảnh
hưởng trực tiếp đến quá trình quang hợp của tảo (Lê Đình Lăng, 1999).
Sắt: là những dưỡng chất thiết yếu, ảnh hưởng trực tiếp tới sinh trưởng và
hàm lượng của protein. Sắt thường dùng ở dạng muối FeSO4 (0,01 g/lít). Có thể
dùng sắt dạng phức EDTA (Etylen Diamin Tetra Acetic Axít), phức này hoà tan bền
hơn trong kiềm so với dạng vô cơ. Nồng độ Fe3+ trong môi trường rất rộng từ 0,56 –
56 mg/lít môi trường. Nồng độ Fe3+ trong môi trường để thu được lượng dầu cao
khoảng 56,6% trọng lượng khô đối với Chlorella vulgaris là trong khoảng 1 - 1,32
mg/lít (Zhi-Yaun Liu và ctv, 2007).
Các khoáng vi lượng khác : Bo (B3+), kẽm (Zn2+), Mangan (Mn2+), đồng
(Cu2+), Coban (Co2+) ...là các vi lượng được dùng, nhưng ảnh hưởng không rõ đến
sinh khối protein, nhưng lại có ảnh hưởng tới một số thành phần khác như vitamin:
thiamin – B1, riboflavin – B2, pyridoxine – B6, cyanocobalamin – B12, biotin,

pyridoxine… (Thinh và ctv, 1999).
Chlorella có thể bị tác động bởi các kích thích tố (hormon), giúp tảo tăng
trưởng nhanh hơn như indol axetic axít (AIA), gibberelic axít (GA3), naphtalen
acetic axít (NAA). Một số công trình nghiên cứu chứng tỏ Chlorella có sản sinh các
hormon tăng trưởng hoạt tính kiểu AIA, GA3 và NAA. Các hormon nội sinh này
kích thích nâng cao sinh khối và tăng tốc sinh sản của tảo (Lê Đình Lăng, 1999).
2.1.4. Các thành phần dinh dưỡng có trong tảo Chlorella
Chlorella chứa hơn 19 loại amino axít, bao gồm tất cả những loại thiết yếu.
Thành phần chính: protein, carbohydrate, lipid và rất giàu vitamin B12. Nó cung
7


cấp gấp 50 lần chất diệp lục trong cỏ linh lăng, 2 lần protein so với đậu nành và
nhiều B12 so với gan bò, Vitamin A gấp 5,8 lần cà rốt, B1 gấp 1,3 lần men vô
cơ, B2 gấp 35 lần sữa, sắt gấp 13 lần gan lợn và 45 lần nho, chất xơ gấp 1,5 lần
khoai lang, canxi gấp 1,6 lần sữa.
Giá trị dinh dưỡng của tảo có thể thay đổi rất lớn ở các pha phát triển và dưới
các điều kiện nuôi khác nhau (Enright và ctv, 1986; Brown và ctv, 1997). Kết quả
nghiên cứu của Thinh và ctv (1999) chỉ ra rằng tảo phát triển đến cuối pha logarit
thường chứa 30 - 40% protein, 10 - 20% lipid và 5 - 15% carbohydrate. Khi tảo
được nuôi qua pha cân bằng thì hàm lượng này bị thay đổi rất lớn, ví dụ như: khi
nitrat giảm thì hàm lượng carbohydrate có thể tăng gấp 2 lần hàm lượng protein.
Mối liên quan giữa giá trị dinh dưỡng của tảo với hàm lượng lipid tổng,
carbohydrat, và protein không được thể hiện rõ. Tuy nhiên, lipid rất quan trọng
trong việc dự trữ năng lượng cho ấu trùng khi sống trong điều kiện thiếu thức ăn,
tảo có hàm lượng carbonhydrat cao cho sự phát triển tốt nhất của hàu giống và ấu
trùng điệp (Whyte và ctv 1989).
Các axít béo không no (PUFA) có trong tảo, ví dụ như: docosahexaenoic axít
(DHA), eicosapentaenoic axít (EPA), arachidonic axít (AA) rất cần thiết đối với
động vật nuôi thủy sản (Brown và ctv, 1997). Hầu hết các loài tảo đều chứa loại axít

béo không no EPA ở mức độ từ trung bình tới cao (7 – 34 %).
Vi tảo được coi là có giá trị dinh dưỡng tốt cho các đối tượng nuôi nếu hàm
lượng PUFA (DHA, EPA) dao động từ 1 – 20 mg/ml tế bào (Thinh và ctv, 1999).
Ngoài ra, các khoáng chất và sắc tố trong tảo cũng đóng góp một vai trò quan trọng
trong việc xây dựng nên giá trị dinh dưỡng của một loài tảo (Fabregas và Herrero,
1986). Thành phần chủ yếu của sắc tố là chlorophyll và các loại carotenoid chiếm
0,5 - 5 % trọng lượng khô. Ngoài ra còn có phycoerythin và phycocyanin nhưng chỉ
chiếm một lượng nhỏ khoảng 1% khối lượng khô. ß-carotene (tiền vitamin A) được
xem là rất quan trọng trong chuỗi thức ăn của giáp xác.
Nghiên cứu của Ronnestad, Helland và Lie (1998) đã phát hiện ra rằng sắc tố
lutein và astaxanthin (có nhiều trong tảo xanh) có khả năng chuyển đổi thành
vitamin A trong chuỗi mắt xích thức ăn của động vật nuôi thủy sản. Vi tảo là nguồn
cung cấp vitamin quan trọng cho các đối tượng nuôi thuỷ sản. Theo Brown (2002),
hàm lượng acid ascorbic (vitamin C) trong vi tảo 51 mg/g trọng lượng khô ở tảo
8


Chorella sp.. Còn lại các vitamin khác (B1, B2, B6, B12, biotin, pyridoxine…) là
cao hơn so với các giống tảo khác.
Bảng 2.1 Những thành phần có trong 100 g trọng lượng khô của Chlorella sp.

()
2.2. Tổng quan về biodiesel
Biodiesel là tên gọi cho một loạt các ester dựa vào nhiên liệu từ axít béo
thường được định nghĩa như monoalkyl ester dầu từ rau quả, chẳng hạn như dầu
đậu nành, cải dầu hoặc cây gai dầu, hoặc đôi khi từ mỡ động vật thông qua một quá
trình chuyển hóa đơn giản. Đây là nguồn nhiên liệu tái tạo và có hiệu quả như xăng,
dầu diesel trong động cơ diesel.
Loại nhiên liệu này có nhiều ưu điểm nổi bật so với các loại nhiên liệu truyền
thống (dầu khí, than đá...).

Tính chất thân thiện với môi trường: chúng sinh ra ít hàm lượng khí gây
hiệu ứng nhà kính (một hiệu ứng vật lý khiến Trái Đất nóng lên) và ít gây ô nhiễm
môi trường hơn các loại nhiên liệu truyền thống.
Nguồn nhiên liệu tái sinh: các nhiên liệu này lấy từ hoạt động sản xuất nông
nghiệp và có thể tái sinh. Chúng giúp giảm sự lệ thuộc vào nguồn tài nguyên nhiên
liệu không tái sinh truyền thống.

9


Để sản xuất diesel sinh học người ta pha khoảng 10% mêtanol vào dầu thực
vật và dùng nhiều chất xúc tác khác nhau (đặc biệt là KOH, NaOH). Ở áp suất
thông thường và nhiệt độ vào khoảng 60°C liên kết este của glyxêrin trong dầu thực
vật bị phá hủy và các axít béo sẽ được este hóa với methanol. Chất glyxêrin hình
thành phải được tách ra khỏi dầu diesel sinh học. Siêu âm làm tăng tốc độ phản ứng
hóa học và hiệu suất của quá trình chuyển hóa dầu thực vật và mỡ động vật thành
biodiesel. Siêu âm có thể đạt được sản lượng biodiesel hơn 99%. Siêu âm làm giảm
thời gian tiến hành và thời gian phân tách.
Điều này cho phép chuyển quy trình sản xuất từng bước theo mẻ phản ứng
sang quá trình “dòng chảy liên tục”, và nó làm giảm đầu tư và chi phí thực hiện. Sản
xuất biodiesel từ dầu thực vật hay mỡ động vật, bao hàm cả việc chuyển hóa axít
béo, dựa vào chất xúc tác phản ứng với methanol hay ethanol để có được este
methyl hay este ethyl. Thông qua việc chuyển đổi este này dầu diesel sinh học có độ
nhớt ít hơn dầu thực vật rất nhiều và có thể được dùng làm nhiên liệu thay thế cho
dầu diesel mà không cần phải cải biến động cơ để phù hợp.
( />2.3. Tổng quan về axít citric
Axít citric là một axít hữu cơ thuộc loại yếu và nó thường được tìm thấy
trong các loại trái cây thuộc họ cam quít. Nó là chất bảo quản thực phẩm tự nhiên
và thường được thêm vào thức ăn và đồ uống để làm vị chua. Ở lĩnh vực hóa sinh
thì axít citric đóng một vai trò trung gian vô cùng quan trọng trong chu trình axít

citric của quá trình trao đổi chất xảy ra trong tất cả các vật thể sống.
Ngoài ra axít citric còn đóng vai trò như là một chất tẩy rửa, an toàn đối với
môi trường và đồng thời là tác nhân chống oxy hóa. Axít citric có mặt trong nhiều
loại trái cây và rau quả nhưng trong trái chanh thì hàm lượng của nó được tìm thấy
nhiều nhất, theo ước tính axít citric chiếm khoảng 8% khối lượng khô của trái.
Với vai trò là một chất phụ gia thực phẩm, axít citric được dùng làm gia vị,
chất bảo quản thực phẩm và đồ uống, đặc biệt là nước giải khát, nó mang mã số
E330. Muối citrat của nhiều kim loại được dùng để vận chuyển các khoáng chất
trong các thành phần của chất ăn kiêng vào cơ thể. Tính chất đệm của các phức
citrat được dùng để hiệu chỉnh độ pH của chất tẩy rửa và dược phẩm.

10


Axít citric được dùng trong công nghệ sinh học và công nghiệp dược phẩm
để làm sạch ống dẫn thay vì phải dùng axít nitric. Axít citric cũng được cho vào
thành phần của kem để giữ các giọt chất béo tách biệt. Ngoài ra nó cũng được thêm
vào nước ép chanh tươi.( Thái Phú Khánh Hòa. Axít Citric. 2006.
http//:www.hoahocvietnam.com/Home/Moi-tuan-mot-hoa-chat/Axit-Citric.html)
Chu trình Kreb’s ( chu trình axít citric) là quá trình nhằm oxi hóa acetyl-CoA
thành CO2, H2O, và giải phóng triệt để năng lượng. Là con đường cuối cùng chung
cho sự oxi hóa glucid, lipid, protein bởi vì glucose, axít béo, amino axít thoái biến
ra acetyl-CoA. Glucose được biến đổi theo tiến trình đường phân EM (EmbdenMayehoff), sản phẩm không dừng lại ở pyruvate mà bị carboxylase tạo acetyl-CoA
để đi vào chu trình Kreb’s. Axít béo qua quá trình  oxi hóa trong ti thể sẽ được
phân cắt thành các đơn vị 2C là acetyl-CoA. Amino axít qua quá trình khử nhóm
amin sẽ tạo thành các keto axít và sẽ được đưa vào chu trình Kreb’s (Nguyễn Phước
Nhuận và ctv, 2003).
Các enzyme của chu trình Kreb’s định vị trong phần khuôn ty lạp thể và các
đương lượng khử giải phóng được chuyển vào chuỗi hô hấp nhờ các hạt đính ở
phần màng trong ty thể. Năng lượng giải phóng qua môt vòng chu trình Kreb’s có

ba phân tử NADPH+H+ và một phân tử FADH2 được thành lập do sự thoái biến của
một phân tử aceyl-CoA, có tất cả mười hai phân tử ATP được tạo ra qua một vòng
chu trình Kreb’s.
Axít citric đóng có vai trò trong sự tổng hợp lipid bên trong ty thể của tế bào.
Lipid được tạo thành trước hết là tổng hợp axít béo. Tổng hợp axít béo no bắt đầu từ
acetyl-CoA và diễn ra carboxyl hóa bằng ATP để chuyển hóa thành malonyl-CoA.
Malonyl-CoA tiếp tục phản ứng với acetyl-CoA để tạo thành axít béo có mạch
carbon dài thêm 2C. Quá trình này cần có NADPH tham gia và thải ra CO2.
Carboxyl hóa acetyl- CoA là bước tốc độ xác định của tổng hợp axít béo. Thay đổi
bước này dẫn đến làm thay đổi tốc độ tổng hợp axít béo. Axít citric và isocitric có
tác dụng hoạt hóa acetyl-CoA-carboxylase (Nguyễn Quốc Khang, 2002).
Nghiên cứu ghép gen cho nhiều dầu cũng cho kết quả khả quan. Enzyme
Acetyl-CoA carboxylase (ACC) chi phối số lượng lipids tích trữ trong cơ thể vi-tảo,
và gen chi phối ACC đã được đánh dấu và ghép vào bộ máy di truyền của tảo. Chìa
11


khóa cho công nghệ sản xuất dầu từ tảo nhằm tăng nhanh sản lượng biodiesel và hạ
thấp giá thành sản phẩm đủ sức cạnh tranh với nhiên liệu dầu mỏ là nâng cao hàm
lượng chất béo từ 15 - 30% trong điều kiện tự nhiên lên 75 - 85% trọng lượng khô
của tảo thông qua hoạt động của enzyme chuyển hóa acetyl - CoA carboxylase.

Hình 2.3 Chu trình Kreb’s
( />
12


Khi tổng hợp axit béo ngoài ty thể đòi hỏi ATP và khung carbon. Khung
carbon có thể do acetyl-CoA hay citrat cung cấp. Do tính chất bán thấm của màng
mà liên kết thioester của acetyl-CoA không thể thấm trực tiếp qua màng mà phải

chuyển hóa thành acetylcarnitin giàu năng lượng. Phản ứng này được sự xúc tác của
enzyme chuyển nhóm acetylcarnitin là acetylcarnitintranferase và có thể không tiêu
hao năng lượng. Trong tế bào chất acetyl-CoA không thể lọt qua màng ty thể để vào
bên trong ty thể vì thế trong tế bào tự có cơ chế trao đổi qua lại giữa vài hệ thống
vận chuyển với nhau. Tính chất màng ty thể không cho acetyl-CoA thấm qua,
nhưng lại cho acetyl-carnitin thấm qua. Cho nên phải có biến đổi qua lại giữa hai
dạng acetyl này với nhau nhờ acetycarnitintransferase. Nhờ cơ chế biến đổi này mà
các axít béo chuỗi dài cũng có thể đi vào được ty thể. Carnitin có vai trò quan trọng
đối với sự xuất hiện của axít béo trong ty thể (Nguyễn Quốc Khang, 2002).
Acetyl-CoA là nguyên liệu chính cho chu trình Kreb’s tạo ra năng lượng cho
sự sống, phát triển, và phân chia của tế bào. (Nguyễn Phước Nhuận và ctv, 2003).
Các nhân tố làm giảm hoạt động của citratsynthetase xúc tác cho acetyl-CoAcarboxylase : các axít béo có mạch carbon dài được tổng hợp nhiều, thiếu axít citric.
Điều này gây ứ đọng acetyl-CoA. Tế bào sử dụng acetyl-CoA ứ đọng để tổng hợp
acetoacetic và tác động đến axít béo để phân giải tạo ATP cho tế bào sử dụng, ức
chế tổng hợp axít citric trong ty thể dẫn đến thiếu axít citric và ức chế luôn quá trình
chuyển hóa acetyl-carnitin thành acetyl-CoA (Nguyễn Quốc Khang, 2002).

Hình 2.4: Tổng hợp lipid từ nguyên liệu là acetyl-CoA trong ty thể
( />13


2.4. Tổng quan về Chlorella vulgaris
Giới:

Flora

Ngành:

Chlorophyta


Lớp:

Trebouxiophyceae

Bộ:

Chlorellales

Họ:

Chlorellaceae

Giống:

Chlorella

Loài:

Chlorella vulgaris

Chlorella vulgaris Beijerinck (1890), tế bào hình cầu, thể màu hình chén
chiếm gần 2/3 thể tích tế bào, chứa một hạt tạo tinh bột lớn dễ nhìn thấy, có một
nhân màu sáng. Kích thước 2-10µm (Dương Đức Tiến và Võ Hành, 1997).
Chúng hiện diện khắp nơi trên bề mặt trái đất như: sông suối, ao hồ, và ở
biển. Chlorella vulgaris là dòng tảo có khả năng thích nghi cao trong tự nhiên và có
sức chống chịu điều kiện bất lợi tốt. Phạm Hữu Giục (1991) cho rằng nếu trong môi
trường nuôi cấy hoàn toàn không có nguồn nitơ, tế bào không chết mà tồn tại ở
trạng thái tiềm sinh. Chlorella sẽ nhanh chóng phục hồi lại trạng thái sinh lý bình
thường khi bổ sung nitơ vào môi trường (Trích dẫn bởi Nguyễn Đức Lượng, 2006).


Hình 2.5 Tế bào Chlorella vulgaris
( />
14


Chlorella vulgaris var. vulgaris

Chlorella vulgaris f. globosa

Chlorella vulgaris var. vulgari f. minuscula

Chlorella vulgaris var f. viridis

Chlorella vulgaris f. suboblonga

Chlorella vulgaris var. vulgaris f. vulgaris

Hình 2.6 Sáu dòng tảo thuộc loài Chlorella vulgaris
(http//:www.botany.natur.cuni.cz/algo/CAUP/H1955Chlorella vulgaris.html).

15