BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
***000***

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT VÀ PHÂN TÍCH SỰ BÀI THẢI CHLORAMPHENICOL
BẰNG KỸ THUẬT LC/MS/MS TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon)
ĐƯỢC NUÔI TRONG ĐIỀU KIỆN THÍ NGHIỆM

Ngành học

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện

: NGUYỄN MINH TRIẾT

Niên khóa

: 2005 – 2009

Tháng 08 năm 2009


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC
***000***

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT VÀ PHÂN TÍCH SỰ BÀI THẢI CHLORAMPHENICOL
BẰNG KỸ THUẬT LC/MS/MS TRÊN TÔM SÚ (Penaeus monodon)
ĐƯỢC NUÔI TRONG ĐIỀU KIỆN THÍ NGHIỆM

Hướng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

ThS. PHÙNG VÕ CẨM HỒNG

NGUYỄN MINH TRIẾT

KS. NGUYỄN THANH ĐIỀN

Tháng 08 năm 2009


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin chân thành cảm ơn:
-

Ban Giám Hiệu trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều kiện
cho tôi trong suốt thời gian học tập.

-

Các Thầy Cô trong Bộ môn Công nghệ Sinh học cùng các Thầy Cô khác đã luôn
tận tình hướng dẫn, giảng dạy và giúp đỡ tôi.


-

ThS. Phùng Võ Cẩm Hồng và kỹ sư Nguyễn Thanh Điền đã trực tiếp hướng dẫn và
giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài tốt nghiệp.

-

Các anh chị phụ trách phòng Hóa Lý thuộc Trung tâm Phân tích Thí nghiệm Hóa
Sinh trường Đại học Nông Lâm.

-

Các bạn Đỗ Minh Tấn, Bùi Văn Thông, Nguyễn Hữu Thái cùng toàn thể các bạn
trong lớp CNSH31 đã hỗ trợ, giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian làm đề
tài.

-

Các anh Linh, Lượm, Hiếu ở huyện Nhơn Trạch, tỉnh Đồng Nai đã tạo điều kiện
cho tôi thực hiện quy trình nuôi tôm.

Con thành kính ghi ơn ba mẹ cùng những người thân trong gia đình luôn tạo điều kiện và
động viên con trong suốt quá trình học tập tại trường.
Chân thành cảm ơn.

Tháng 08 năm 2009

Nguyễn Minh Triết


iii


TÓM TẮT
Trong những năm gần đây, việc sử dụng thuốc và các loại hóa chất trong nghề nuôi
tôm ngày càng gia tăng. Dẫn đến tình trạng tồn dư các thuốc và hóa chất trong tôm dùng
cho xuất khẩu và tiêu dùng. Hầu hết chúng đều có những ảnh hưởng đến sức khỏe của
người tiêu dùng. Trong số các loại kháng sinh, Chloramphenicol đã bị cấm sử dụng trong
nuôi trồng, chế biến và bảo quản tôm ở châu Âu, Mỹ cũng như ở Việt Nam. Tất cả các
sản phẩm tôm xuất khẩu phải không chứa kháng sinh Chloramphenicol. Nhiều nỗ lực đã
được thực hiện nhằm đảm bảo chất lượng cho các sản phẩm tôm xuất khẩu của Việt Nam.
Tuy nhiên, việc kiểm soát chỉ khắc khe với hàng xuất khẩu, còn với hàng tiêu thụ nội địa
thì việc kiểm tra chất lượng còn bỏ ngõ.
Để hiểu rõ thêm về sự bài thải của Chloramphenicol cũng như tìm ra phương pháp
phân tích CAP trong cơ thịt tôm đáp ứng được giới hạn phát hiện của phương pháp là 0,3
ppb hay thấp hơn, chúng tôi đã thực hiện các nghiên cứu của mình trên tôm (Penaeus
monodon). Sự bài thải của Chloramphenicol được khảo sát trên cơ thịt tôm sau khi cho ăn
kháng sinh và được thực hiện trong điều kiện thí nghiệm có kiểm soát. Tôm được nuôi
trong bốn ao và cho ăn thức ăn có chứa Chloramphenicol với nồng độ 2000 mg/kg, cho ăn
3 lần mỗi ngày trong 2 ngày. Mẫu được thu ở các thời điểm khác nhau (1, 5, 10, 20, 30,
60, 120 giờ) sau lần cuối cho ăn thức ăn có chứa kháng sinh. Việc phân tích được thực
hiện bằng sắc ký lỏng ghép khối phổ và LOQ của phương pháp là 0,03 ng/g. Nồng độ của
Chloramphenicol sau 60 giờ là không thể xác định (<0,3 ppb). Thời gian bài thải bán rã
của CAP được xác định là 13,5 giờ.

iv


SUMMARY
In recent years, there has been an increasingly use of drugs and chemicals in

shrimp farming. Consequence is the contamination of drugs and chemicals in shrimp’s
muscle. Most of them show to be toxic to humans. Among antibiotics, the use of
Chloramphenicol in food product has been banned in the European Union (EU), USA as
well as in Viet Nam. All aquatic prducts exported must not to be contaminated by the
antibiotic chloramphenicol. Efforts were then taken to guarantee the quality og Vietnam
exported shrimnp. However, to control chloramphenicol absence in local consumed
products still ramain an open issue.
To have better understand about elimination of CAP as well as finding a method
for determination of chloramphenicol residues in shrimps, our research were conducted in
shrimp (Penaeus monodon). Muscle residue

depletion of CAP following oral

administration was evluated in shrimp under experimental condition. Four groups of
shrimps were cultured in tanks and fed a commercial medicated diet containing 2000
mg/kg, three times daily for 2 days. Sampling was conducted at different intervals (1, 5,
10, 20, 30, 60, 120 h) after cossation of the medication. Drug analysis was carried out by
LC/MS/MS, and LOQ of method was 0,03 ng/g. The concentration of CAP after 60-h
post-dosing are undetedtable (< 0,3 ppb). So, it is not use in mucle residue depletion of
CAP analysis. The elimination half-life (t1/2) of CAP was 13,5 h.

v


MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN .............................................................................................................. iii
TÓM TẮT .....................................................................................................................iv
SUMMARY....................................................................................................................v
MỤC LỤC .....................................................................................................................vi

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ..........................................................................ix
DANH SÁCH CÁC BẢNG ...........................................................................................x
DANH SÁCH CÁC HÌNH............................................................................................xi
Chương 1 MỞ ĐẦU .......................................................................................................1
1.1. Đặt vấn đề................................................................................................................1
1.2. Yêu cầu của đề tài....................................................................................................2
1.3. Nội dung thực hiện ..................................................................................................2
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU .............................................................................3
2.1. Giới thiệu chung về tôm sú......................................................................................3
2.1.1. Phân loại học của tôm sú ......................................................................................3
2.1.2. Phân bố của tôm sú trên thế giới .........................................................................3
2.1.3. Tập tính ăn của tôm sú .........................................................................................4
2.1.4. Quá trình lột xác ở tôm ........................................................................................4
2.1.5. Các yếu tố vật lý, hóa học và sinh học của môi trường nước nuôi tôm ..............4
2.2. Giới thiệu chung về chloramphenicol (CAP) .........................................................6
2.2.1. Chloramphenicol .................................................................................................6
2.2.2. Hóa tính ................................................................................................................6
2.2.3. Hoạt phổ kháng sinh ............................................................................................6
2.2.4. Chloramphenicol trong hoạt động nuôi trồng thủy sản .......................................7
2.2.5. Chloramphenicol – Kháng sinh cấm ...................................................................7
2.2.6. Các nghiên cứu về thời gian bài thải của CAP trên tôm .....................................8
2.3. Giới thiệu chung về sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC/MS) ......................................9
2.3.1. Nguyên tắc và cấu tạo của hệ thống HPLC .........................................................9

vi


2.3.2. Đầu dò khối phổ (MS) .......................................................................................10
2.3.2.1. Ưu điểm của đầu dò khối phổ .........................................................................10
2.3.2.2. Nguyên tắc của đầu dò khối phổ ....................................................................10

2.3.3. Hệ thống LC/MS/MS dùng trong thí nghiệm ....................................................11
Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................................13
3.1. Thời gian và địa điểm tiến hành ...........................................................................13
3.1.1. Thời gian ............................................................................................................13
3.1.2. Địa điểm ............................................................................................................13
3.2. Vật liệu ..................................................................................................................13
3.2.1. Mẫu tôm .............................................................................................................13
3.2.2. Hóa chất .............................................................................................................15
3.2.3. Dụng cụ và thiết bị ............................................................................................15
3.3. Phương pháp phân tích LC/MS/MS .....................................................................16
3.3.1. Cách chuẩn bị mẫu phân tích .............................................................................16
3.3.2. Điều kiện phân tích ............................................................................................17
3.3.3. Pha các dung dịch chuẩn ...................................................................................17
3.3.4. Nguyên tắc định lượng CAP .............................................................................18
3.3.5. Công thức tính toán nồng độ CAP có trong mẫu ..............................................19
3.3.6. Hiệu suất thu hồi của quy trình chiết mẫu .........................................................19
3.3.7. LOD và LOQ của phương pháp ........................................................................20
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................................21
4.1. Kết quả ..................................................................................................................21
4.1.1. Trọng lượng của mẫu tôm sú sau quá trình nuôi thí nghiệm ............................21
4.1.2. Xây dựng đường chuẩn CAP..............................................................................22
4.1.3. Đánh giá hiệu quả thu hồi của quy trình chiết mẫu ...........................................23
4.1.4. LOQ của phương pháp .......................................................................................26
4.1.5. Xác định thời gian bài thải của CAP trên tôm sú ..............................................26
4.1.6. Khảo sát nhỏ về tình hình nhiễm CAP trên tôm ở khu vực huyện Thủ Đức ....28
4.2. Thảo luận ..............................................................................................................29

vii



Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................................31
5.1. Kết luận .................................................................................................................31
5.2. Đề nghị .................................................................................................................31
TÀI LIỆU THAM KHẢO ...........................................................................................32
PHỤC LỤC

viii


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
CAP

: Chloramphenicol

CLX

: Chợ Linh Xuân

CTD

: Chợ Thủ Đức

ĐC

: Đối Chứng

H

: Giờ


HPLC

: High Performance Liquid Chromatography

GC/MS

: Gas Chromatography/Mass Spectrometry

LC/MS/MS : Liquid Chromatography/Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry
LOD

: Limit of Detection

LOQ

: Limit of Quantitation

MRPL

: Minimum Require Performance Limit

MeOH

: Methanol

MS

: Mass Spectrometry

ppm


: part per million

ppb

: part per billion

Rt

: Retention time

TIC

: Total ion Chromatography

ix


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Trang
Bảng 2.1 Giá trị MRPL cho các phương pháp phân tích dùng cho phân tích CAP ..........8
Bảng 3.1 Tốc độ dòng của pha động trong quá trình sắc ký kháng sinh CAP ............. 17
Bảng 4.1 Trọng lượng tôm được thu ở các thời điểm khác nhau sau khi nuôi ............ 21
Bảng 4.2 Thời gian lưu và cường độ Ion m/z 151,9 của các nồng độ chuẩn ................ 22
Bảng 4.3 Cường độ của Ion m/z 151,9 của các mẫu đã thêm chuẩn ............................ 24
Bảng 4.4 Hiệu suất thu hồi của quy trình chiết tách CAP từ mẫu tôm .......................... 25
Bảng 4.5 Nồng độ trung bình của CAP trên tôm .......................................................... 27
Bảng 4.6 Kết quả phân tích CAP của 25 mẫu tôm ở địa bàn quận Thủ Đức ............... 29

x



DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ
Trang
Hình 2.1 Tôm sú trưởng thành (Penaeus monodon ) ................................................... 3
Hình 2.2 Cấu trúc của Chloramphenicol ...................................................................... 6
Hình 2.3 Sơ đồ minh họa hệ thống HPLC với 7 bộ phận chính ............................... 10
Hình 2.4 Tổng quan về hệ thống khối phổ ................................................................. 11
Hình 2.5 Hệ thống LC/MS/MS được dùng cho phân tích của đề tài.......................... 12
Hình 3.1 Ao dùng để nuôi tôm trong thí nghiệm ....................................................... 14
Hình 3.2 Ion m/z 151,9 và Ion m/z 256,9 .................................................................. 19
Hình 4.1 Phổ đồ Ion định lượng m/z 151,9 của nồng độ chuẩn 0,1 ppb .................. 22
Hình 4.2 Đường chuẩn CAP ..................................................................................... 23
Hình 4.3 Phổ đồ Ion định lượng m/z 151,9 của mẫu thêm chuẩn 0,1 ppb ................. 24
Hình 4.4 Đường chuẩn CAP của các mẫu tôm được thêm chuẩn CAP...................... 25
Hình 4.5 Tỷ lệ S/N của chuẩn 0,1 ppb ....................................................................... 26
Hình 4.6 Ln nồng độ CAP (ppb) theo thời gian ......................................................... 28
Sơ đồ 3.1 Quy trình nuôi tôm dùng làm mẫu thí nghiệm ........................................... 15

xi


Chương 1
MỞ ĐẦU
1.1 . Đặt vấn đề
Tôm là mặt hàng xuất khẩu đem lại giá trị kinh tế lớn cho nước ta trong những
năm qua cũng như đem lại lợi ích kinh tế rất lớn cho người nuôi tôm. Mật độ và diện tích
nuôi tôm ngày càng gia tăng, cùng với đó là tình trạng gia tăng sử dụng của các loại
thuốc và hóa chất trong việc nuôi trồng, chế biến và bảo quản sản phẩm. Việc sử dụng
thường xuyên và không tuân thủ nghiêm các quy định sẽ dẫn đến lạm dụng thuốc, gây ra

tồn dư các loại thuốc và hóa chất trên các sản phẩm tôm. Các nghiên cứu về tôm ở Việt
Nam hiện nay nhiều nhưng chủ yếu tập trung vào khía cạnh kỹ thuật nuôi, dinh dưỡng
và thức ăn, về sản xuất giống, về bệnh tôm nuôi trong ao. Các nghiên cứu về độ tồn
lưu, sự bài thải các kháng sinh thường sử dụng phổ biến trong tôm nuôi chưa được chú
trọng nghiên cứu nhiều. Trong khi đó, các nghiên cứu liên quan đến lĩnh vực này hiện rất
quan trọng và có ý nghĩa lớn nhằm cải thiện tính bền vững trong nuôi tôm theo định
hướng bảo vệ môi trường và sản xuất sản phẩm chất lượng cao và an toàn.
Chloramphenicol là một trong số các hóa chất và kháng sinh cấm sử dụng trong
nuôi trồng, chế biến và bảo quản các sản phẩm tôm (Theo Quyết định của châu Âu số
2001/699/EC ngày 19/09/2001 cũng như chỉ thị 07/2001/CT-BTS ngày 24/09/2001 của
Bộ thủy sản Việt Nam) do các tác hại mãn tính của nó đối với sức khỏe của con người.
Vì vậy, để có thể xuất khẩu sang các thị trường lớn như Mỹ, Châu Âu, Nhật và cho tiêu
dùng trong nước, các mặt hàng tôm phải đảm bảo không phát hiện CAP với giới hạn phát
hiện là 0,3 ng/g theo quy đinh của các thị trường này. Tuy nhiên cũng cần phải thấy rằng
ở Việt Nam quy định này chỉ khắt khe cho hàng xuất khẩu, còn với hàng tiêu thụ nội địa
thì việc kiểm tra quy trình nuôi, chế biến và bảo quản vẫn còn bỏ ngỏ. Trong khi đó,
các loại kháng sinh khác thuộc nhóm Phenicols như Thiamphenicol và Florphenicol
theo một số nghiên cứu cũng có tính độc hại không kém CAP c h ỉ bị hạn chế sử dụng
trong nuôi thủy sản (Theo quyết định 2002/657, 2377/90, 508/1999, 1181/2002 của
Cộng đồng Chung Châu Âu về việc cho phép dư lượng tối đa của kháng sinh
1


Thiamphenicol trong thực phẩm, kể cả các sản phẩm thủy sản là 50 ppb và Florfenicol
là 500 ppb). Do đó nghiên cứu sự bài thải của CAP sẽ làm tiền đề cho việc nghiên cứu
sự bài thải Thiamphenicol và Florphenicol nhằm giúp cho các nhà quản lý và người chăn
nuôi trong quản lý và sử dụng kháng sinh hợp lý để tránh ảnh hưởng đến sức khỏe của
người tiêu dùng.
1.2 . Yêu cầu của đề tài
Xây dựng được phương pháp tối ưu để có thể xác định hàm lượng của chất kháng

sinh CAP trong tôm sú nuôi. Phương pháp này phải đảm bảo độ chính xác và có độ nhạy
cao để có thể phát hiện được nồng độ chloramphenicol ở mức độ định lượng có thể đạt
tiêu chuẩn xuất khẩu của những thị trường có các tiêu chuẩn an toàn cao như Nhật, Mỹ,
Châu Âu (LOQ của phương pháp tương đương 0,3 ppb).
Xác định thời gian bài thải của chloramphenicol trong cơ thịt tôm.
1.3. Nội dung thực hiện
Xây dựng phương pháp phân tích kháng sinh chloramphenicol trong cơ thịt tôm
dựa trên hệ thống LC/MS/MS của Viện Công nghệ sinh học và Môi trường thuộc trường
đại học Nông Lâm.
Khảo xác và xác định thời gian bài thải của kháng sinh chloramphenicol ở nồng độ
200 ppm trên tôm được nuôi trong điều kiện thí nghiêm.
Khảo sát sơ bộ về tình hình nhiễm kháng sinh chloramphenicol trên tôm tiêu thụ ở
địa bàn quận Thủ Đức.

2


Chương 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 . Giới thiệu chung về tôm sú
2.1.1. Phân loại học của tôm sú
Ngành:

Arthropoda

Lớp:

Crustacea

Bộ:


Decapoda

Họ chung:

Penaeidea

Họ:

Penaeus Fabricius

Giống:

Penaeus

Loài:

Penaeus monodon

Hình 2.1 Tôm sú trưởng thành (Penaeus monodon).
(www.nio.org/prawns/gif/toxonomy/tax23.htm ).
2.1.2. Phân bố của tôm sú trên thế giới
Phạm vi phân bố của tôm sú khá rộng, từ ấn Độ Dương qua hướng Nhật Bản, Đài
Loan, phía Đông Tahiti, phía Nam châu Úc và phía Tây châu Phi (Racek - 1955, Holthuis
và Rosa - 1965, Motoh - 1981, 1985). Nhìn chung, tôm sú phân bố từ kinh độ 30E đến
155E từ vĩ độ 35N tới 35S xung quanh các nước vùng xích đạo, đặc biệt là Indonesia,

3



Malaixia, Philippines và Việt Nam. Tôm bột (PL.), tôm giống (Juvenile) và tôm gần
trưởng thành có tập tính sống gần bờ biển và rừng ngập mặn ven bờ. Khi tôm trưởng
thánh di chuyển xa bờ vì chúng thích sống vùng nước sâu hơn (Nguyễn Văn Hải, 2005).
2.1.3. Tập tính ăn của tôm sú
Tôm sú là loài ăn tạp, thích ăn động vật sống và di chuyển chậm hơn là xác thối
rữa hay mảnh vụn hữu cơ, đặc biệt là ưa ăn giáp xác, thực vật dưới nước, giun nhiều tơ,
loài 2 mảnh, côn trùng. Tôm sống ngoài tự nhiên ăn 85 % là giáp xác, cua nhỏ, động vật
nhuyễn thể hai mảnh vỏ, còn lại là 15 % là cá, giun nhiều tơ, thủy sinh vật, mảnh vụn hữu
cơ, cát bùn. Tôm sú nuôi trong ao, hoạt động bắt mồi nhiều vào sáng sớm và chiều tối.
Tôm bắt mồi bằng càng, sau đó đẩy thức ăn vào miệng để gặm, thời gian tiêu hóa trung
bình từ 4-5 giờ (Nguyễn Văn Hải, 2005).
2.1.4. Quá trình lột xác ở tôm
Trong quá trình tăng trưởng, khi trọng lượng và kích thước tăng lên mức độ nhất
định, tôm phải lột bỏ lớp vỏ cũ để lớn lên. Sự lột xác thường xảy ra vào ban đêm. Sự lột
xác đi đôi với việc tăng thể trọng, cũng có trường hợp lột xác nhưng không tăng thể
trọng. Khi quan sát tôm nuôi trong bể, hiện tượng lột xác xảy ra như sau: Lớp biểu bì
giữa khớp đầu ngực và phần bụng nứt ra, các phần phụ của đầu ngực rút ra trước, theo
sau là phần bụng và các phần phụ phía sau, rút ra khỏi lớp vỏ cứng, với động tác uốn
cong mình toàn cơ thể. Lớp vỏ mới mềm sẽ cứng lại sau 1-2 giờ với tôm nhỏ, 1-2 ngày
đối với tôm lớn. Tôm sau khi mới lột xác, vỏ còn mềm nên rất nhạy cảm với môi trường
sống thay đổi đột ngột. Trong quá trình nuôi tôm, thông qua hiện tượng này, có thể điều
chỉnh môi trường nuôi kịp thời (Nguyễn Văn Hải, 2005).
2.1.5. Các yếu tố vật lý, hóa học và sinh học của môi trường nuôi tôm
Nhiệt độ của nước: Tôm cũng như tất cả các động vật sống dưới nước thuộc loại
máu lạnh (cold -blooded, poikilothermic) Nhiệt độ ảnh hưởng tới nhiều phương diện
trong đời sống của tôm: hô hấp, tiêu thụ thức ăn, đồng hoá thức ăn, miễn nhiễm đối với
bệnh tật, sự tăng trưởng... Nhiệt độ thích hợp cho tôm loại Penaeus tại các ao hồ vùng
nhiệt đới khoảng 28 - 300 C. Tôm sú có thể chịu được nhiệt độ 280 C tôm lớn tương đối
chậm, trên 300 C tôm lớn nhanh hơn nhưng rất dễ mắc bệnh.


4


Độ mặn: Các loài giáp xác có khả năng thích nghi của chính bản thân theo sự thay
đổi độ mặn của môi trường nước. Bản thân tôm sú có thể thích ứng với điều kiện môi
trường nước thay đổi từ từ, Postlarvae có thể sống được cả trong môi trường nước ngọt.
Tôm sú có thể chịu được sự biến thiên của độ mặn từ 3-45 0/00, nhưng độ mặn lý tưởng
cho tôm sú là 18-20 0/00 .
Oxy: Đây là yếu tố quan trọng nhất cần đặc biệt chú trọng trong kỹ nghệ nuôi tôm.
Lượng dưỡng khí thấp trong ao dễ gây cho tôm chết nhiều hơn cả. So với lượng oxygen
trong không khí là 200.000 ppm, (1 ppm = 1 phần triệu) thì số oxygen hoà tan trong nước
rất ít, nhưng ta chỉ cần 5 ppm oxygen trong nước là đủ cho tôm hô hấp một cách an toàn.
Trong ao hồ, hiện tượng quang tổng hợp của các phiêu sinh vật là yếu tố chính tạo nên
oxygen hoà tan trong nước. Vì hiện tượng này chỉ xảy ra trong ban ngày, dưới ánh nắng
mặt trời nên về ban đêm và ngay cả về ban ngày nhưng thời tiết u ám kéo dài thì ao hồ
không đủ oxygen cho tôm.
Độ cứng của nước: Độ cứng của nước liên quan tới tổng số nguyên tử kim loại hoá
trị 2 (divalent metal ions) mà chính yếu là calcium và magnesium trong môi trường.
Nước trong ao hồ có độ cứng 20 - 150 ppm thì thích hợp cho việc nuôi tôm cá.
Độ pH: Ao hồ nuôi tôm mà có độ pH trong khoảng 7,2 - 8,8 thì được coi là thích
hợp. pH của mặt nước thiên nhiên chịu ảnh hưởng rất nhiều của chất CO2, chất này được
sử dụng bởi các phiêu sinh vật trong hiện tượng quang tổng hợp. Độ pH của ao hồ thường
tăng về ban ngày và giảm về ban đêm, vì vậy cần đo độ pH mỗi ngày ít nhất 2 lần để có
được chu kỳ trọn vẹn.
Độ đục của nước: Độ đục của nước được xác định bởi đĩa Secchi, một cách đơn
giản ta kết luận là độ đục của nước ao thích hợp nếu đĩa Secchi được đọc ở trong khoảng
25 – 40 cm. Điều này có nghĩa là nếu độ đọc trên đĩa Secchi mà ngắn hơn 25cm thì nước
ao quá đục, ngược lại nếu độ đọc này ở mức xa hơn 40 cm thì nước ao lại quá trong, đồng
nghĩa với nước quá nghèo chất dinh dưỡng.
Ngoài ra còn có rất nhiều yếu tố khác ảnh hưởng đến quá trình sinh trưởng và phát

triển của tôm như độ đục của nước, độ kiềm, hydro sulfide (H2S), các hợp chất của N2
(Amonia, Nitrite, Nitrate, vi sinh vật và tảo) (Nguyễn Văn Hải, 2005).

5


2.2. Giới thiệu về kháng sinh Chloramphenicol (CAP)
2.2.1. Chloramphenicol
Chloramphenicol (sau đây được gọi tắt là CAP) lần đầu tiên được phân lập từ vi nấm
Streptomyces venezuelae vào năm 1947 do công của Ehrlich và các cộng sự. Năm 1949,
các nhà khoa học đã tìm ra cơ cấu hóa học và đã tổng hợp nhân tạo được với phương pháp
bào chế công nghiệp (Võ Văn Ninh, 2001).
2.2.2. Hóa tính
CAP dù là sinh tổng hợp hay tổng hợp nhân tạo là loại bột kết tinh mịn màu trắng,
đôi khi hơi xám hoặc hơi vàng, vị đắng, hơi tan trong nước, tan trong hầu hết dung môi
hữu cơ. Dạng bột khô bền trong không khí và cũng cần đựng trong lọ nút kín tránh ánh
sáng. Dạng bột khô và dung dịch rất chịu nhiệt, kể cả khi đun sôi trong 5 giờ. Dạng dung
dịch rất bền trong khoảng pH từ 2 - 9 nhưng nếu dung dịch quá kiềm sẽ gây phân hủy
kháng sinh mau chóng (Võ Văn Ninh, 2001).

Hình 2.2 Cấu trúc của Chloramphenicol.
(www.biocompare.com/articles/technicolarticles).
2.2.3. Hoạt phổ kháng sinh
CAP có tác dụng kìm khuẩn hay diệt khuẩn trong một số bệnh truyền nhiễm. Thuốc
có tác dụng ức chế vi khuẩn với nồng độ thấp. Hoạt phổ kháng sinh của CAP rất rộng, có
tác dụng trên nhiều loại vi khuẩn gram (+), gram (-), ricketsia (Bùi Thị Tho và Nghiêm
Thị Anh Đào, 2005).

6



2.2.4. CAP trong nuôi trồng thủy hải sản.
Trước đây CAP được sử dụng trong nuôi trồng thủy sản với nhiều mục đích khác
nhau như dùng để sát trùng ao nuôi tôm trước mỗi vụ nuôi, dùng với lượng nhỏ trộn vào
trong thức ăn cho tôm với mục đích kích thích khả năng sinh trưởng của tôm nuôi hay
trong chế biến tôm với mục đích bảo quản tôm được tươi lâu. Ngoài ra, CAP còn được sử
dụng để điều trị một số bệnh trên tôm do nấm gây ra như vi tảo Lagenidium callinestes,
sirolpidiumsp., Saprolegnia parasita, maliphthoros sp., hoặc do vi khuẩn Fusarium
solani.. (Bùi Thị Tho và Nghiêm Thị Anh Đào, 2005).
2.2.5. Chloramphenicol - kháng sinh cấm
Mặc dù đã biết được các đặc tính ưu việt của thuốc: phổ kháng sinh rộng, mạnh, có
nhiều loại mầm bệnh mẫm cảm với nó, thuốc có tác dụng rất lớn khi điều trị các bệnh
nhiễm trùng cấp tính nguy hiểm đến tính mạng. Nhưng sau 50 – 60 năm dùng CAP người
ta cũng phát hiện được những tác hại của thuốc: gây suy tủy, tỷ lệ quái thai cao, gây dị
ứng. Theo các tác giả Nguyễn Thị Tho và Nghiêm Thị Anh Đào (2005) sở dĩ thuốc có tác
động nguy hại như trên là do cơ chế tác động của thuốc, ngoài việc gắn vào tiểu đơn vị
ribosom 50s (chỉ có ở vi sinh vật), thuốc còn gắn vào cả tiểu đơn phần ribosom 70s (có
trong nguyên sinh chất của tế bào vật chủ: trâu, bò, lợn, gia cầm và người).
CAP cũng gây suy tủy ở gia súc non, mất khả năng sinh tinh trùng, ức chế sự phát
triển của tế bào trứng. Gia súc đang có mang sẽ gây ra quái thai.Với động vật cho thịt,
trứng sửa, CAP sẽ để lại tồn dư. Khi người ăn các sản phẩm này sẽ gây ra các hiện tượng
tương tự như suy tủy, còi cọc, chậm lớn, nhất là khả năng gây ra quái thai. Do người là
khâu cuối cùng sử dụng các sản phẩm có tồn dư này, ngày nào cũng phải sử dụng nên sự
tích lũy CAP ở người cần phải được giám sát.
Do những tác hại lâu dài của CAP đối với sức khỏe của con người, kể từ năm
1994, CAP đã được liệt vào danh sách cấm sử dụng Phụ lục IV Quy định của Hội đồng
Châu Âu – Council Regulation (EEC) số 2377/90 và vì vậy bị cấm sử dụng ở Châu Âu
trong động vật và sản phẩm thịt động vật làm thức ăn cho người. Phụ lục II của Ủy Ban
Châu Âu (commission Decision) số 2003/181/EC đã quy định giá trị MRPL cho các
phương pháp phân tích sử dụng chloramphenicol trình bày ở bảng 2.2


7


Bảng 2.2 Giá trị MRPL cho các phương pháp phân tích dùng
cho phân tích CAP (theo qui định số 2003/181/EC)
Hóa chất
Sản phẩm
MRPL (µg/kg)
Chloramphenicol

Thịt

0,3

Chloramphenicol

Trứng

0,3

Chloramphenicol

Sữa

0,3

Chloramphenicol

Nước thải


0,3

Chloramphenicol

Sản phẩm thủy sản

0,3

Chloramphenicol

Mật ong

0,3

Ở Việt Nam, theo các Chỉ thị số 07/2002/CT- TTg ngày 25/02/2002 của Thủ tướng
Chính phủ V/v tăng cường quản lý việc sử dụng thuốc kháng sinh, hoá chất trong sản
xuất kinh doanh thực phẩm có nguồn gốc động vật và Quyết định số 01/2002/QÐ- BTS
ngày 22/01/2002 của Bộ trưởng Bộ Thuỷ sản V/v cấm sử dụng một số hoá chất, kháng
sinh trong sản xuất, kinh doanh thuỷ sản; một số hoá chất và kháng sinh đã bị cấm sử
dụng (theo Danh mục kèm theo Quyết định số 01/2002/QÐ- BTS ngày 22/01/2002).
2.2.6. Các nghiên cứu về thời gian bài thải của CAP trên tôm
Các nghiên cứu về thời gian đào thải của CAP trên tôm đã được thực hiên bởi
Wang Weifen (2003) trên tôm Penaeus chinensis. Tôm được Weng Weifen nuôi trong các
bể và cho ăn thức ăn có chứa CAP với nồng độ 2000 mg/kg, mỗi ngày cho ăn hai lần
trong liên tục 3 ngày. Weng Weifen và ctv phân tích CAP trong cơ thịt tôm bằng kỹ thuật
sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) và có LOQ của phương pháp là 0,02 μg/g (tương
đương 20 ppb). LOQ của phương pháp này vượt ngưỡng giới hạn của châu Âu, Mỹ là 0,3
ppb nên không thể đáp ứng được các nhu cầu phân tích hiện nay. Trong nghiên cứu của
mình, Weng Weifen kết luận thời gian bài thải bán rã của CAP là 10,04 giời và sau 48

giờ, CAP sẽ bài thải hoàn toàn khỏi cơ thịt tôm.
Nghiên cứu về sự bài thải của CAP trên tôm còn được thực hiện bởi Steven
M.Plakas (1992). Trong nghiên cứu của mình, Steven đã cho tôm ngâm trong kháng sinh
CAP ở nồng độ 25 ppm trong 4 giờ liên tục. Sau đó, tôm được chuyển sang nuôi trong
môi trường nước biển và theo dõi sự bài thải của CAP. Phương pháp phân tích được sử

8


dụng ở đây là GC và ông đưa ra kết quả là sau 24 giờ, nồng độ CAP trong tôm chỉ còn ở
mức 5 ppb. Nồng độ này cũng cao hơn giới hạn định lượng của châu Âu và Mỹ (0,3 ppb).
2.3 . Giới thiệu chung về sắc ký lỏng ghép khối phổ (LC/MS)
2.3.1. Nguyên tắc và cấu tạo của hệ thống HPLC
Nguyên tắc của hệ thống sắc ký lỏng cao áp (HPLC – High Performance Liquid
Chromatography) dựa trên sự phân bố của chất tan giữa hai chất lỏng không trộn lẫn vào
nhau khi cho một chất lỏng di chuyển (pha động) qua chất lỏng đứng im (pha tĩnh). Pha
tĩnh bị hấp thụ trên bề mặt chất rắn (chất mang). Thường pha tĩnh là dung môi phân cực,
pha động là nước hoặc dung môi hữu cơ. Đôi khi pha tĩnh thường là những chất lỏng ít
phân cực khi đó pha động phải là dung môi phân cực hơn. Hệ thống HPLC gồm có 7 bộ
phận chính như sau:
-

Bình chứa dung môi: nơi chứa pha động của quá trình sắc ký

-

Bơm cao áp: để bơm pha động vào cột tách với áp suốt lớn, thực hiện quá

trình sắc ký, rửa giải chất tan ra khỏi cột sắc ký. Bơm này phải trơ với hóa chất, điều
chỉnh được khoảng áp suốt rộng (0-400bar) tạo áp suốt ổn định của pha động qua cột tách.

-

Gradient: là thiết bị dùng để chỉnh chính xác tỷ lệ của các dòng dung môi

trước khi được đẩy vào cột.
-

Van bơm mẫu: để bơm mẫu phân tích vào cột tách theo những lượng mẫu

nhất định không đổi trong một quá trình sắc ký. Đó là van 6 chiều có chứa vòng mẫu có
thể tích là 20 µl, 50 µl hay 100 µl.
-

Cột tách: là nơi chứa pha tĩnh, nơi diễn ra quá trình sắc ký. Hiệu quả tách

sắc ký phụ thuộc chủ yếu vào cột do đó tùy thuộc vào mức độ sắc ký, chất phân tích để
lựa chọn cột cho phù hợp.
-

Detector (Đầu dò): có nhiều loại đầu dò, dựa theo tính chất của chất phân

tích mà lựa chọn các đầu dò phù hợp để đạt được độ nhạy cao khi phát hiện các chất cũng
như đo định lượng. Một số loại đầu dò phổ biến là dầu dò hấp thụ quang phân tử vùng
phổ, đầu dò phổ nguyên tử AES hay AAS, đầu dò phổ huỳnh quang, đầu dò khối phổ.
-

Bộ phận ghi nhận và xử lý kết quả: phổ biến nhất là các máy tự ghi để ghi

tín hiệu đo dưới dạng các peak của các chất, máy tính và máy in


9


Bơm

Bình chứa
dung môi

Van

Cột

Đầu dò

Ghi nhận
và xử lý

Gradient
Sơ đồ 2.1 Hệ thống HPLC với 7 bộ phận chính.

2.3.2. Đầu dò khối phổ (MS)
2.3.2.1. Ưu điểm của đầu dò khối phổ
Đầu dò khối phổ có thể cho phép ta phân tích các hợp chất tương đối phân cực đến
phân cực nhiều, khó bay hơi (thường thì các hợp chất này GC/MS rất khó thực hiện hay
không thực hiện được). Phân tích kiểm nghiệp phức tạp mà HPLC thông thường không
thực hiện được. Ngoài ra khối phổ còn được dùng trong các phân tích về chất lượng nông
thủy sản, thức ăn gia súc, thuốc trị bệnh. Các loại phân tích này ngày càng nghiêng nhiều
về phần kiểm nghiệm, với các yêu cầu về giới hạn phân tích rất thấp mà các loại phân tích
khác không thực hiện được. Chính vì các ưu điểm trên mà đầu dò khối phổ ngày càng
được ứng dụng rộng rãi trong ngành phân tích, nhất là đối với việc kiểm nghiệm thuốc và

dư lượng các chất cấm có trong các sản phẩm dùng cho người do các lo ngại về các vấn
đề sức khỏe (Chu Phạm Ngọc Sơn, 2008).
2.3.2.2. Nguyên tắc của đầu dò khối phổ
Nhiệm vụ của đầu dò khố phổ là nhận danh và định lượng các hóa chất có trong nền
mẫu. Khi ghép với sắc ký lỏng thì hóa chất được xác định bằng một mũi trên sắc đồ ở thời
gian lưu xác định Rt đặc trưng cho hóa chất. Rt này chính là thời gian từ lúc hóa chất bắt
đầu vào cột và ra khỏi cột để vào đầu dò (detector) khối phổ. Mũi này biểu diễn tổng
cường độ các ion sinh ra từ hóa chất thông qua một kỹ thuật ion xác định. Tổng các mũi
này trên sắc đồ hợp thành sắc đồ toàn ion Total ion Chromatography hay TIC. Mũi này
cũng có thể biểu diễn cường độ của loại ion sinh ra từ phân mảnh của phân tử hóa chất
hoặc từ sự phân mảnh của một loại ion. Khối phổ tương ứng của hóa chất biểu diễn cường

10


độ các ion sinh ra từ một ion nhất định của hóa chất. Như vậy việc nhận danh một chất
thông qua vừa thời gian lưu, vừa khối phổ sẽ chắc chắn hơn là chỉ dựa riêng vào thời gian
lưu của chất đó (Chu Phạm Ngọc Sơn, 2008).

Ion

Bộ tách khối

Nguồn
ion hoá

Bộ phát hiện
Ion
Detector


Mass Analyzer
Sort Ions by Mass (m/z)

Ion hoá các mẫu phân tích

Xử lý dữ
100
75

Mẫu

•
•
•

Rắn
Lỏng
Dễ bay hõi

50
25
0
1330

1340

1350

Mass


Hình 2.4 Tổng quan về hệ thống khối phổ.
(Phùng Võ Cẩm Hồng, 2008)
2.3.3. Hệ thống LC/MS/MS dùng trong thí nghiệm
Hệ thống sắc ký lỏng cao áp Ultimate 3000 của hãng Dionex (Mỹ/Eu). Đây là hệ
thống sắc ký chuyên dụng cho phép triển khai các ứng dụng phân tích dư lượng (small
molecule) và các nghiên cứu về proteomics. Hệ thống này bao gồm các bộ phận sau :
Bộ đưa mẫu tự động (autosample): Bộ đưa mẫu tự động được thiết kế linh hoạt cho
phép lấy mẫu từ các ống đựng mẫu khác nhau. Thiết kế này cũng đảm bảo độ chính xác
và độ lặp lại cao.
Bơm dung môi tự động: Hệ thống thiết kế với công nghệ dòng thông minh “Smart
Flow technology” không tạo xung trong quá trình bơm mẫu, do vậy không cần bộ giảm
xung. Do vậy hệ thống đạt độ tập trung tốc độ dòng (RSD) cao hơn so với các hệ thống
khác: 0,01 – 0,1 RSD. Chế độ rửa bơm tự động (Smrt startup and shutdown), cho phép tự
động rửa bơm và cân bằng hệ thống về điều kiện ban đầu để tối ưu cho các lần chạy ứng
dụng sau đó.

11


Bộ đuổi khí chân không: Đây là bộ đuổi khí chuyên dụng với khay đựng chai dung
môi được thiết kế linh hoạt sự dụng với các chai đựng dung môi khác nhau. Có thể sử
dụng 6 chai dung môi dung tích 1 lít hoặc 3 chai dung môi, dung tích 2 lít. Ngoài ra hệ
thống còn cho phép chúng ta lựa chọn chế độ đuổi khí: 2 kênh, 4 kênh hoặc 6 kênh túy
theo từng ứng dụng phân tích.
Bộ ổn đinh nhiệt chuyện đổi tự động: Hệ thống điều khiển và ổn định nhiệt cho cột cho
phép ổn định nhiệt cho cột, chuyển đổi cột và chia dòng (Flow spliting) để chạy các ứng
dụng Nano, Micro, Capillary đồng bộ trên toàn hệ thống từ đưa mẫu tự động tới bơm
dung môi. Thiết kế chuyên dụng cho phép lắp ghép nhiều cột phân tích đồng thời trên hệ
thống với giá trị chuyển đổi 2 x 10 cổng.
Hệ thống khối phổ phân tách: sử dụng hệ thống khối phổ liên hoàn ba tứ cực là hệ

máy 4000 Qtrap LC/MS/MS của hãng Appliedbiosystems MDS SCIEX (Mỹ/Canada). Hệ
thống 4000 Qtrap là hệ thống khối phổ liên hoàn với độ nhạy cao phục vụ cho công việc
kiểm tra, định lượng dư lượng các hợp chấp, các nhóm chuyển hóa của hợp chất trong
môi trường, trong thực phẩm.

Hình 2.5 Hệ thống LC/MS/MS được dùng cho phân tích của đề tài.
(Viện Công nghệ sinh học và Môi trường thuộc trường đại học Nông Lâm)

12


Chương 3
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Thời gian, địa điểm và phương pháp tiến hành
3.1.1. Thời gian
Đề tài được thực hiện từ tháng 2 đến tháng 7 năm 2009
3.1.2. Địa điểm
Đề tài được thực hiện tại Viện Công Nghệ Sinh Học và Môi Trường - trường Đại
Học Nông Lâm và tại huyện Nhơn Trạch, tỉnh Đồng Nai.
3.2 Vật liệu
3.2.1. Mẫu tôm
Để tạo được nguồn mẫu tôm phù hợp với nghiên cứu, chúng tôi đã tiến hành thiết
kế bốn ao nuôi tôm. Việc thiết kế ao nuôi sẽ giúp chúng tôi có thể kiểm soát được môi
trường nước trong ao nuôi, nhằm tránh các yếu tố bất lợi có thể ảnh hưởng đến kết quả
của thí nghiệm. Ao nuôi tôm được thiết kế theo quy trình như sau:
-

Tiến hành đào bốn ao, mỗi ao có kích thước 2 m x 1 m x 0,7 m.

-


Phủ một lớp vải bạc dưới đáy mỗi ao.

-

Phủ một lớp cát dày 2 cm dưới đáy mỗi ao.

-

Xử lý đáy ao bằng 1 kg vôi bột (rãi đều khắp đáy ao)

-

Sau đó cho nước vào mỗi ao, mực nước cho vào có độ sâu là 0,6 m (tương

đương 1,2 m3 nước). Chúng tôi cho lắng ao trong một tuần.
-

Quanh 4 ao có rào một lớp lưới mùng nhằm ngăn sự thấm nước ra môi

trường và ngăn sự xâm nhập của các loài sinh vật khác vào môi trường ao thí nghiệm.
Sau khi đã thiết kế xong ao nuôi, chúng tôi sẽ thực hiện quá trình nuôi tôm. Loại
tôm được nuôi là tôm sú (Penaeus monodon), đây là loài tôm có giá trị trên thị trường
hiện nay. Chúng tôi lấy mẫu tôm đang nuôi được 50 ngày, đây là giai đoạn sinh trưởng,
phát triển và trao đổi chất mạnh nhất của tôm nên thích hợp cho việc nuôi thí nghiệm.
Tôm được nuôi như sau:

13



-

Tôm được nuôi trong bốn ao đã thiết kế, mỗi ao cho vào 50 tôm. Tôm

được cho ăn 3 lần trong ngày vào lúc 6 giờ, 11 giờ 30 và 18 giờ.
-

Việc chuyển tôm từ môi trường ao nuôi tự nhiên sang ao nuôi thí nghiệm

có thể xảy ra hiện tượng sốc tôm do thay đổi môi trường đột ngột. Do đó trong 3 ngày
đầu, cả bốn ao đều được cho ăn thức ăn công nghiệp của cơ sở Hải Long nhằm giúp tôm
thích nghi với điều kiện của môi trường nuôi thí nghiệm.
-

Sau khi tôm đã thích nghi với môi trường thí nghiệm chúng tôi thực hiện

việc ngưng cho tôm ăn thức ăn công nghiệp trong một ngày. Mục đính của việc làm này
nhằm đào thải phần thức ăn còn lại trong tôm mà có thể ảnh hưởng đến kết quả của quá
trính thí nghiệm.
-

Tiếp theo đó là hai ngày cho tôm ăn thức ăn có chứa kháng sinh CAP với

nồng độ 2000 ppm ở hai ao. Hai ao còn lại dùng làm ao đối chứng, ở hai ao này vẫn cho
tôm ăn thức ăn không có chứa kháng sinh CAP.
-

Sau lần cuối cho tôm ăn thức ăn có chứa kháng sinh CAP thì bắt đầu tiến

hành thu mẫu. Thời gian thu mẫu là 1 giờ, 5 giờ, 10 giờ, 20 giờ, 30 giờ, 60 giờ, 120 giờ

sau lần cho ăn cuối ở hai ao có cho ăn thức ăn có chứa CAP. Ở mỗi thời điểm thu mẫu,
chúng tôi tiến hành thu 5 tôm ngẫu nhiên ở ao đối chứng và ao có cho ăn thức ăn kháng
sinh với nồng độ 2000 ppm. Mẫu sau khi thu sẽ được bảo quản ở - 200C đến khi tiến hành
phân tích.

Hình 3.1 Ao dùng để nuôi tôm trong thí nghiệm.
(xã Phước An, huyện Nhơn trạch, tỉnh Đồng Nai)

14