BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC



KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ KHẢ NĂNG
TẠO MÔ SẸO TỪ CÂY NGHỆ ĐEN
Curcuma zedoaria Berg. IN VITRO

Ngành học

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện

: LÊ THỊ MAI CHÂM

Niên khóa

: 2005 – 2009

Tháng 8/2009


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ KHẢ NĂNG
TẠO MÔ SẸO TỪ CÂY NGHỆ ĐEN
Curcuma zedoaria Berg. IN VITRO

Hướng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

TS. TRẦN THỊ LỆ MINH

LÊ THỊ MAI CHÂM

KS. TRỊNH THỊ PHI LY

Tháng 8/2009


LỜI CẢM ƠN
Con xin khắc ghi công ơn trời biển của cha mẹ đã suốt đời hi sinh, lo lắng cho con.
Em chân thành gửi lời cảm ơn đến:
-

Ban giám hiệu trường đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh.

-

Ban quản lý Khoa công nghệ sinh học.

-


Quý thầy cô toàn trường đã tận tình truyền đạt những kiến thức bổ ích cho em
trong suốt 4 năm em học tập tại trường.

Khóa luận này được hoàn thành với sự giúp đỡ của rất nhiều thầy cô, anh chị và các
bạn. Em xin trân trọng gửi lời cảm ơn đến:
-

Cô Trần Thị Lệ Minh đã tận tình hướng dẫn cho em hoàn thành khóa luận này.

-

Cô Trịnh Thị Phi Ly đã trực tiếp hướng dẫn em thực hiện, chỉnh sữa những sai
sót trong suốt quá trình làm đề tài này.

-

Thầy Lê Đình Đôn, Cô Tô Thị Nhã Trầm đã truyền đạt cho em những kinh
nghiệm quý báu.

-

Các anh chị thuộc Khoa Công nghệ Sinh học, phòng sắc ký của Viện Nghiên
cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường của trường Đại học Nông Lâm thành
phố Hồ Chí Minh đã giúp đỡ trong quá trình em thực hiện khóa luận.

-

Các bạn cùng nhóm nuôi cấy mô đã động viên, giúp đỡ tôi vượt qua những khó
khăn trong lúc thực hiện đề tài.


Cảm ơn lớp công nghệ sinh học 31 thân yêu, nhờ các bạn mà tôi có rất nhiều kỉ niệm
đẹp trong những năm đại học.
Sinh viên
Lê Thị Mai Châm


TÓM TẮT
Dịch chiết từ củ nghệ đen (tinh dầu, curcumin, các enzyme kháng oxy hóa) đã
được chứng minh có hiệu quả với nhiều bệnh trên người và động vật. Tuy nhiên, sản
lượng nghệ thu được từ việc trồng truyền thống trên đồng ruộng thường không ổn
định. Nuôi cấy in vitro sẽ giúp để cải thiện vấn đề này.
Đề tài : “Nghiên cứu thành phần hóa học và khả năng tạo mô sẹo từ cây nghệ
đen Curcuma zedoaria Berg in vitro” được thực hiện tại phòng thí nghiệm Khoa Công
nghệ sinh học và Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trường, trường Đại học
Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh từ tháng 3/2009 đến 7/2009.
Đối tượng nghiên cứu của đề tài là củ nghệ đen 1 năm tuổi được thu thập từ
Đồng Nai và Hà Tây. Chiết xuất tinh dầu nghệ đen bằng phương pháp chưng cất hơi
nước và ly trích curcumin bằng phương pháp Soxhlet. Phân tích thành phần tinh dầu
nghệ đen trên hệ thống gas chromatography – mass spectrometry. Sau đó, lựa chọn loại
nghệ đen ưu việt hơn để tiến hành nuôi cấy in vitro. Thử nghiệm tạo mô sẹo từ các
thành phần khác nhau của cây trên môi trường Murashige và Skoog có bổ sung chất
kích thích sinh trưởng benzyl adenine (nồng độ từ 1 – 4 mg/l), kinetin (nồng độ từ 1 – 4
mg/l), thidiazuron (nồng độ từ 1 – 4 mg/l), acid 2,4 dichrolophen - oxyacetique (nồng
độ từ 1 – 4 mg/l) hoặc acid naphtylacetique (nồng độ từ 1 – 4 mg/l), nồng độ đường là
20 g/l. Thử nghiệm ly trích và phân tích thành phần tinh dầu, curcumin trong mô sẹo
nghệ đen in vitro sau 4 tuần nuôi cấy.
Kết quả cho thấy hàm lượng tinh dầu, curcumin trong củ nghệ đen Đồng Nai
cao hơn củ nghệ đen Hà Tây, đồng thời tinh dầu nghệ đen Đồng Nai có chứa nhiều hợp
chất có hoạt tính sinh học quý hơn nghệ đen Hà Tây. Bộ phận tạo mô sẹo tốt nhất là
gốc lá (94,44 %), môi trường phù hợp là Murashige và Skoog có bổ sung 3 mg/l acid

naphtylacetique và 3 mg/l benzyl adenine. Hàm lượng tinh dầu, curcumin trong mô sẹo
nghệ đen in vitro sau 4 tuần nuôi cấy thấp hơn củ nghệ đen tự nhiên, đồng thời một số
chất trong tinh dầu củ nghệ đen tự nhiên lại không được tìm thấy trong mô sẹo nuôi
cấy in vitro.

iv


SUMMARY
The compounds from ground rhizomes of zedoary (essential oil, curcumin,
antioxidant enzymes,…) was proved to have important effect on human and animal
diseases. However, the yield of zedoary was obtained from traditional growing wasn’t
stable. Nowadays, we can improve this by in vitro culture.
The thesis: “ Study on chemical components and ability of forming callus from
Curcuma zedoaria Berg in vitro” was carried out at Biotechnology Department and
Research Institute for Biotechnology and Environmental technology, University of
Agriculture and Forestry, Ho Chi Minh city from March to July, 2009.
We was in the process of studying on one year ground rhizomes of zedoary from
Dong Nai and Ha Tay provinces. The essential oils of their fresh and dry rhizomes were
isolated by simutaneous steam-distillation and curcumin was extracted by Soxhlet
apparatus. The constituents of zedoary rhizome oils were analysed using gas
chromatography – mass spectrometry . The better zedoary was chosen for in vitro
culture. After having in vitro plants, we studyed on ability of forming callus from
different parts of in vitro zedoary plants on agar-solidified Murashige and Skoog
medium supplemented with benzyl adenine (1 – 4 mg/l), kinetin (1 – 4 mg/l),
thidiazuron (1 – 4 mg/l), 2,4 dichrolophen – oxyacetique acid (1 – 4 mg/l) or
naphtylacetique acid (1 – 4 mg/l), 20 g/l sucrose. We also extracted and analysed
constituents of essential oil, curcumin from in vitro zedoary callus after 4
weeks of culture.
The results showed that the yield of essential oil and curcumin from rhizomes in

Dong Nai province were higher than the others. In addition, constituents of essential
oil from it contained more biological activity compounds than the others. The ability of
forming callus from leaf-base explants of in vitro plants was the best (94,44 %), the
suitable medium was agar-solidified MS medium supplemented with 3 mg/l
naphtylacetique acid and 3 mg/l benzyl adenine. After 4 weeks of culture, the yield of
essential oil, curcumin from in vitro zedoary callus was lower and some compounds
didn’t appear in essential oil instead of in ground rhizomes of zedoary

v


MỤC LỤC
Trang
Lời cảm ơn..................................................................................................................iii
Tóm tắt........................................................................................................................iv
Summary......................................................................................................................v
Mục lục .......................................................................................................................vi
Danh sách các chữ viết tắt .........................................................................................ix
Danh sách các bảng .....................................................................................................x
Danh sách các hình .....................................................................................................xi
Chương 1 MỞ ĐẦU ....................................................................................................1
1.1. Đặt vấn đề.............................................................................................................1
1.2. Yêu cầu của đề tài.................................................................................................1
1.3. Nội dung thực hiện ...............................................................................................1
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU...........................................................................3
2.1. Tổng quan về cây nghệ đen ..................................................................................3
2.1.1. Vị trí phân loại nghệ đen Curcuma zedoaria Berg ...........................................3
2.1.2. Đặc điểm hình thái cây nghệ đen ......................................................................3
2.1.3. Đặc tính sinh học cây nghệ đen.........................................................................4
2.1.4. Đặc điểm sinh thái, phân bố cây nghệ đen ........................................................5

2.1.5. Thành phần hóa học củ nghệ đen ......................................................................5
2.1.5.1. Tinh dầu..........................................................................................................5
2.1.5.2. Curcumin ........................................................................................................6
2.1.5.3. Các enzyme kháng oxy hóa............................................................................8
2.1.6. Công dụng của củ nghệ đen...............................................................................9
2.2. Phương pháp nhân giống nghệ đen in vitro..........................................................9
2.2.1. Điều kiện nuôi cấy nghệ đen in vitro.................................................................9
2.2.2. Môi trường nuôi cấy nghệ đen in vitro............................................................11
2.2.3. Nuôi cấy nghệ đen in vitro ..............................................................................12
2.3. Ly trích và xác định các hợp chất thứ cấp..........................................................12
2.3.1. Ly trích tinh dầu ..............................................................................................12

vi


2.3.2. Ly trích curcumin ............................................................................................14
2.3.3. Xác định thành phần các hợp chất thứ cấp......................................................15
2.3.3.1. Xác định thành phần tinh dầu.......................................................................15
2.3.3.2. Xác định thành phần curcumin.....................................................................15
Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU..................................17
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ......................................................................17
3.2. Vật liệu ...............................................................................................................17
3.3. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................................18
3.3.1. Phương pháp ly trích và phân tích thành phần các hợp chất thứ cấp trong củ 18
3.3.1.1. Phương pháp ly trích và xác định hàm lượng tinh dầu.................................18
3.3.1.2. Phương pháp xác định thành phần tinh dầu .................................................19
3.3.1.3. Phương pháp ly trích và xác định hàm lượng curcumin ..............................20
3.3.2. Phương pháp nuôi cấy mô cây nghệ đen.........................................................21
3.3.2.1. Phương pháp khử trùng mẫu cấy..................................................................21
3.3.2.2. Phương pháp nhân chồi nghệ đen in vitro....................................................23

3.3.2.3. Phương pháp tạo mô sẹo nghệ đen in vitro ..................................................24
3.3.3. Phương pháp ly trích và phân tích thành các hợp chất thứ cấp trong mô sẹo.25
3.3.4. Phương pháp xử lý số liệu ...............................................................................26
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN..................................................................27
4.1. Kết quả ly trích và phân tích thành phần các chất trong củ nghệ đen................27
4.1.1. Kết quả ly trích và xác định hàm lượng tinh dầu ............................................27
4.1.2. Kết quả ly trích và xác định hàm lượng curcumin ..........................................27
4.1.3. Thành phần hóa học tinh dầu củ nghệ đen ......................................................28
4.2. Kết quả nuôi cấy mô cây nghệ đen.....................................................................32
4.2.1. Kết quả khử trùng mẫu cấy .............................................................................32
4.2.2. Kết quả nhân chồi nghệ đen in vitro................................................................33
4.2.3. Kết quả tạo mô sẹo nghệ đen in vitro ..............................................................36
4.3. Kết quả ly trích và phân tích thành phần các hợp chất thứ cấp trong mô sẹo....38
4.3.1. Kết quả ly trích và xác định hàm lượng tinh dầu ............................................38
4.3.2. Kết quả ly trích và xác định hàm lượng curcumin ..........................................39
4.3.3. Thành phần hóa học tinh dầu mô sẹo nghệ đen in vitro..................................39

vii


Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ......................................................................41
5.1. Kết luận...............................................................................................................41
5.2. Đề nghị ...............................................................................................................42
TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................43
PHỤ LỤC

viii


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

2,4 D

: Acid 2,4 dichrolophen - oxyacetique

AIB

: Acid indolybutyrique

ANA

: Acid naphtylacetique

ANOVA : Analysis of Variance
BA

: Benzyl adenine

BDNF

: Brain Derived Neurotrophic Factor

CBP

: CREB-Binding Protein

CREB

: cAMP Responsed Element Bingding

DNA


: Deoxyribonucleic acid

GA3

: Gibberellic Acid

GC-MS : Gas Chromatography - Mass Spectrometry
HIV

: Human Immuno-deficiency Virus

HPLC

: High Performane Liquid Chromatography

HSV-1 : Herpes Simples Virus 1
HSV-2 : Herpes Simples Virus 2
IPA

: Isopentenyladenine

L

: Liter

LSD

: Least Square Deconvolution


M

: Meter

Mg

: Miligram

MMSE : Mini Mental Stale Examination
MS

: Murashige và Skoog

mTOR I : Mammalian Target Of Rapamycin I
NF-κB

: Nuclear Factor - kappa B

NT

: Nghiệm thức

PE

: Petroleum Ether

SOD

: Superoxide Dismutases


TDZ

: Thidiazuron

UV

: Ultra Violet
ix


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Trang
Bảng 3.1 Mô tả nghiệm thức khảo sát sự ảnh hưởng của nồng độ javel, HgCl2 .............. 23
Bảng 4.1 Hàm lượng tinh dầu có trong củ nghệ đen Đồng Nai, Hà Tây........................... 27
Bảng 4.2 Hàm lượng curcumin có trong củ nghệ đen thu nhận từ Đồng Nai, .................. 28
Bảng 4.3 Thành phần hóa học tinh dầu nghệ đen Đồng Nai (tươi và khô) ....................... 29
Bảng 4.4 thành phần hóa học tinh dầu nghệ đen Hà Tây (tươi và khô) ............................ 30
Bảng 4.5 Kết quả khử trùng mẫu mầm nghệ đen sau 4 tuần nuôi cấy............................... 32
Bảng 4.6 Kết quả ảnh hưởng của nồng độ BAP kết hợp với IBA lên hiệu quả ................ 33
Bảng 4.7 Kết quả ảnh hưởng của nồng độ NAA kết hợp với BA hoặc TDZ .................... 36
Bảng 4.8 Thành phần hóa học của tinh dầu mô sẹo nghệ đen in vitro .............................. 39

x


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1 Cây và hoa nghệ đen..................................................................................... 4
Hình 2.2 Củ nghệ đen cắt ngang.................................................................................. 4
Hình 3.1 Củ nghệ đen cắt ngang thu nhận từ Đồng Nai và Hà tây ............................. 17

Hình 4.1 Sự phát triển của cây nghệ đen in vitro sau 4 tuần nuôi cấy ........................ 32
Hình 4.2 Sự phát triển của chồi nghệ đen in vitro sau 4 tuần nuôi cấy ....................... 35
Hình 4.3 Mô sẹo nghệ đen in vitro sau 4 tuần nuôi cây .............................................. 37
Hình 4.4 Sự biến đổi của mẫu lá nghệ đen in vitro trong môi trường sau 4 tuần........ 38
Sơ đồ 3.1 Quy trình ly trích và xác định hàm lượng tinh dầu bằng phương pháp....... 19
Sơ đồ 3.2 Quy trình ly trích và xác định hàm lượng curcumin bằng phương pháp..... 21
Sơ đồ 3.3 Quy trình chuẩn bị nguyên liệu nuôi cấy mô cây nghệ đen ........................ 22

xi


Chương 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Các hợp chất thứ cấp từ thực vật rất đa dạng và phong phú, được ứng dụng
nhiều trong công nghệ dược phẩm để chữa nhiều bệnh trên người (ung thư, cao huyết
áp, tiểu đường). Hiện nay, chúng đang dần thay thế cho các hợp chất được tổng hợp
nhân tạo bằng hoá học.
Dịch chiết từ củ nghệ đen đã được chứng minh có khả năng chữa được các
bệnh xanh xao, thiếu máu, tăng cường bài tiết mật, tăng trương lực ống tiêu hóa, kém
ăn, nấm mãn tính đường ruột, viêm loét dạ dày (Trần Thị Việt Hoa, 2007). Do đó,
phải trồng một lượng lớn cây thuốc. Nhưng việc trồng truyền thống trên đồng ruộng
mất rất nhiều thời gian, chi phí lớn mà năng suất lại không cao, sản lượng khai thác
không ổn định do hậu quả của một số yếu tố như: điều kiện tự nhiên không thuân lợi,
chi phí lao động ngày càng cao, diện tích đất nông nghiệp ngày càng hạn hẹp, sâu
bệnh phá hoại. Phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật sẽ giúp để giải quyết
những vấn đề này. Do đó, đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học và khả năng tạo mô
sẹo từ cây nghệ đen Curcuma Zedoaria Berg in vitro” được tiến hành.
1.2. Yêu cầu của đề tài
- Xác định hàm lượng tinh dầu, curcumin trong củ nghệ đen thu nhận từ Đồng Nai và Hà

Tây.
- Xác định thành phần tinh dầu trong củ nghệ đen thu nhận từ Đồng Nai và Hà Tây.
- Tìm được môi trường thích hợp cho việc nhân chồi nghệ đen in vitro.
- Tạo được mô sẹo vàng, giòn thích hợp cho việc nuôi cấy huyền phù tế bào.
- Xác định hàm lượng, thành phần tinh dầu, curcumin trong mô sẹo nghệ đen in vitro.
1.3. Nội dung thực hiện
Nội dung 1: Xác định hàm lượng và phân tích thành phần tinh dầu, curcumin.
- Ly trích tinh dầu, curcumin trong củ và mô sẹo nghệ đen in vitro.
- Phân tích thành phần tinh dầu trong củ và mô sẹo nghệ đen in vitro.


Nội dung 2: Nuôi cấy mô cây nghệ đen
- Vô mẫu tạo cây nghệ đen in vitro sạch bệnh để chủ động trong các thí nghiệm sau.
- Nhân chồi: Gia tăng số lượng cây nghệ đen in vitro.
- Tạo mô sẹo: Chuẩn bị cho việc nuôi cấy huyền phù tế bào nghệ đen in vitro.

2


Chương 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Tổng quan về cây nghệ đen
2.1.1. Vị trí phân loại nghệ đen Curcuma zedoaria Berg.
Giới

:Plantae (Thực vật)

Ngành

:Tracheophyta (Hạt kín)


Lớp

:Liliopsida (Một lá mầm)

Phân lớp

:Commelinidae

Bộ

:Zingiberales (Gừng)

Họ

:Zingiberaceae (Gừng)

Giống

:Curcuma (Nghệ)

Loài

:Curcuma zedoaria Berg

Tên tiếng anh : Zedoary, zedoary turmeric.
Tên thông thường: nga truật, nghệ tím, nghệ đen.
2.1.2. Đặc điểm hình thái cây nghệ đen
Nghệ đen là loại cây thảo dược sống hàng năm, cao từ 1 - 1,5 m (hình 2.1).
Thân rễ nghệ đen hình nón có vân ngang và khía dọc với nhiều nhánh phụ thon

như hình quả trứng, tỏa ra xung quanh như hình chân vịt.
Lá nghệ đen có bẹ to ôm vào chân cây ở phía dưới, có đóm tía đỏ ở gần giữa
mặt trên, lá dài 30 - 60 cm, rộng 7 - 8 cm. Cuống lá ngắn hoặc không có.
Hoa nghệ có nhiều màu (hình 2.1), đài có thùy hình mác tù, dài 15 mm, thùy
giữa nhọn; cánh môi hẹp ở phía dưới và rộng ở phía trên, mọc ngang, dài từ 15 - 20
cm, thường mọc trước khi ra lá, cụm hoa tập trung thành bông hình trụ, mọc lên từ
thân rễ. Đài hình ống có lông, 3 răng không đều; tràng có ống dài gấp 3 lần đài, thùy
hình mũi mác; bao phấn kéo dài thành cựa chẽ ngang; trung đới dạng bản tròn, ngắn,
chỉ dính với các nhị lép; cánh môi thắt lại ở gốc, lõm ở đầu, màu vàng, dính nhau ở
dưới; bầu có lông, nhụy lép, hình giùi. Lá bắc phía dưới hình trứng hay hình mác tù
màu xanh lục nhạt, đầu lá màu đỏ, không mang hoa.

3


Hình 2.1 Cây (a) (www.pacificbulbsociety,org/.../index.php/Curcuma)
và hoa (b) () nghệ đen.
Thân rễ mang nhiều củ, nạc dày, có màu vàng nhạt ở trong và những vòng màu
xanh tím ở ngoài (đối với củ già thì có màu tím, xám). Ngoài những củ hình trụ, thân rễ
còn mang những củ hình trái xoan hoặc hình trứng, màu trắng, có cuống dài và mảnh.

Hình 2.2 Củ nghệ đen cắt ngang.
2.1.3. Đặc tính sinh học cây nghệ đen
Nghệ đen có hệ thống thân rễ phân nhánh và phát triển, phần thân trên mặt đất
thường lụi vào mùa khô, cây thường mọc thành khóm, đôi khi thành quần thể thuần loại
trên đất ẩm, gần bờ suối trong thung lũng hay trong nương rẫy. Độ cao từ 100 m đến
1600 m. Cây ưa sáng, có thể hơi chịu bóng. Vào giữa mùa xuân, từ thân rễ mọc lên
4



nhiều thân khí sinh. Song trong một khóm thường chỉ có một thân chính sinh ra từ thân
rễ. Phần thân rễ này thường gọi là củ cái, chỉ tồn tại được hai năm sau tự thối rữa để lại
các phần thân rễ non hơn phát triển thành củ cái mới. Hoa tự thụ phấn hoặc nhờ côn
trùng. Chưa quan sát được quả và cây non mọc từ hạt. Cây sinh sản vô tính bằng cách
nảy chồi con từ chồi bên thân rễ hay từ đỉnh sinh trưởng.
2.1.4. Đặc điểm sinh thái, phân bố cây nghệ đen
Phân bố: Cây nghệ đen được tìm thấy ở miền Đông Himalayas và được trồng
nhiều khắp Ấn Độ, Sri Lanka, Trung Quốc, Nhật Bản, Thái Lan. Ở Việt Nam, nghệ đen
được trồng nhiều ở Đồng Nai, Gia Lai, Lâm Đồng, Đắc lắc, Đắc Nông, Kontum, Phú
Yên, Quảng Trị.
Đặc điểm sinh thái: Cây nghệ đen mọc hoang ở khắp rừng núi Việt Nam, phát
triển rất tốt ở những nơi ven suối nước và những rẫy, nương đất khô, xốp có độ ẩm của
vùng trung du, miền núi.
2.1.5. Thành phần hóa học củ nghệ đen
Dịch chiết từ củ nghệ đen có thành phần chính là tinh dầu, curcumin, các
enzyme kháng oxy hóa.
2.1.5.1. Tinh dầu
Tinh dầu là một chất lỏng cô đặc, sánh chứa những hợp chất thơm dễ bay hơi
được ly trích từ cây (lá, thân, hoa, vỏ, rễ, hoặc những thành phần khác của cây). Chúng
cũng được biết đến như là dầu bay hơi hoặc là dầu ete, hoặc đơn giản là dầu của những
thành phần khác nhau từ cây ly trích được. Mỗi loại tinh dầu nhất định đều mang mùi
thơm đặc trưng của cây. Tinh dầu không có tính chất hóa học đặc trưng chung, chúng
có những mùi thơm riêng biệt. Hầu hết các loại tinh dầu đều trong, ngoại trừ vài loại
tinh dầu như dầu cây hoắc hương, dầu cam, dầu nghệ thì có màu khác (vàng, hổ phách,
xanh, tím). Tinh dầu được sử dụng trong sản xuất nước hoa, mỹ phẩm, xà phòng tắm,
làm phụ gia thức ăn và nước uống. Ngoài ra, tinh dầu còn có giá trị dược tính, ví dụ:
Tinh dầu nghệ đen có thể chữa được bệnh đau dạ dày; tinh dầu bạc hà có thể trị được
chứng say tàu xe, đau bụng.
Các loại tinh dầu ly trích được từ các giống nghệ khác nhau thì có màu và mùi
khác nhau. Tỷ lệ tinh dầu chứa trong cây không cao, thường dao động từ 0,1 % đến 2

%. Thành phần các chất trong tinh dầu nghệ đen (Curcuma zedoaria Berg):
camphene, 1,8-cineole, camphor, β-elemene, γ-elemene, isoborneol, α-humulene,
5


germacrene D, β-selinene, γ-selinene, germacrene B, curzerene, germacrone
(Nguyễn Bá Sơn, 2004).
Hoạt tính sinh học của tinh dầu: Kháng sinh, kháng vi sinh vật, diệt côn trùng,
kháng oxy hóa, dược phẩm. Mỗi một chất trong tinh dầu sẽ có những hoạt tính đặc
trưng. Ví dụ, germacrone là một hợp chất có tính kháng khuẩn, kháng viêm và có
khả năng ngăn chặn sự phát triển của tế bào ung thư; camphor và curzerene có
hoạt tính kháng khuẩn.
2.1.5.2. Curcumin
Những sắc tố hiện diện trong củ nghệ khoảng từ 3 – 5 %. Sản phẩm chủ yếu của
những sắc tố trên là 1,7-bis-(4-hydroxy-3-methoxy-phenyl)-hepta-1,6-diene-3,5-dione
(được biết với tên là curcumin), desmethoxy và bisdesmethoxy bắt nguồn từ nó với
nhiều tỷ lệ khác nhau.
Curcumin là hợp chất chính thuộc curcuminoid, là hợp chất chính có trong họ
nghệ. Có 4 loại curcuminoid là curcumin, dihydrocurcumin, tetrahydrodesmethoxycur-cumin, và tetrahydrobisdesmethoxycurcumin. Curcuminoid là một hợp chất thứ cấp
có màu vàng. Curcumin có thể tồn tại ở hai dạng chuyển đổi là keto và enol. Dạng enol
thì ổn định hơn ở pha rắn và pha lỏng.
Những curcuminoid có thể hỗ biến từ dạng keto sang dạng enol và ngược lại, có
những đặc tính kháng oxy hóa. Curcumin là một sắc tố hòa tan được dầu, trên thực tế
không hòa tan được trong nước ở pH trung tính hay acid, hòa tan được trong dung dịch
kiềm. Nó ổn định ở nhiệt độ cao và trong dung dịch acid, nhưng không ổn định trong
những hợp chất kiềm và sự có mặt của ánh sáng.
Trạng thái tự nhiên của curcumin là bột kết tinh màu vàng cam. Curcumin có
thể được sử dụng như là một màu thực phẩm. Là một chất phụ gia thực phẩm, nó được
kí hiệu là E100. Nó có mặt trong bột và nước sốt cà ri (Ivan, 2004).
Curcumin được sử dụng rộng rãi để nhuộm màu nhiều thực phẩm. Bộ luật về tiêu

chuẩn phụ gia thực phẩm (The Draft Codex General Standard for Food Additives) cung cấp
một danh sách bao quát cho nhiều loại thực phẩm có thể sử dụng curcumin. Đó là mỡ, dầu
và nhũ dầu, kem ăn, những sản phẩm rau và quả, mức kẹo, sản phẩm ngũ cốc, bánh mì, thịt
và những sản phẩm từ thịt, cá và những sản phẩm từ cá, trứng và những sản phẩm từ trứng,
gia vị, súp, mắm và những sản phẩm protein, nhiều thực phẩm có giá trị dinh dưỡng riêng

6


biệt tùy mục đích, đồ uống, thức ăn hỗn hợp. Mức độ sử dụng của curcumin trong khoảng
từ 5 đến 500 mg/kg phụ thuộc vào từng loại thực phẩm (Ivan, 2004).
Curcumin cũng có tác dụng trên nhiều bệnh ở người. Nghệ đã được sử dụng
trong quá khứ là một thành phần của thuốc Ayurvedic Ấn Độ từ năm 1900 trước Công
nguyên để điều trị nhiều loại bệnh. Các nghiên cứu sau nửa thế kỉ thứ 20 đã khẳng định
rằng curcumin chịu trách nhiệm cho hầu hết các hoạt động sinh học của củ nghệ
(Aggarwal và ctv, 2007). Những nghiên cứu trong phòng thí nghiệm và trong cơ thể
động vật đã đưa ra một loạt hiệu quả trị bệnh hoặc phòng bệnh liên quan tới curcumin.
Lúc đó, những hiệu quả này chưa được xác nhận trên con người. Tuy nhiên, năm 2008,
nhiều thử nghiệm lâm sàng trên con người đã được tiến hành, nghiên cứu hiệu quả
của curcumin trên nhiều bệnh bao gồm bệnh ung thư máu, ung thư tụy, hội chứng
rối loạn sự hình thành tế bào tủy xương, ung thư ruột kết, bệnh vảy nến, bệnh
Alzheimer (Hatcher và ctv, 2008).
Những nghiên cứu trong phòng thí nghiệm và trên thú đã kết luận rằng
curcumin có đặc tính kháng u bướu, kháng oxy hóa (Aggarwal và ctv, 2006 ; Choi và
ctv, 2006), chống viêm khớp, chống bệnh thoái hóa dạng tinh bột (biểu hiện của bệnh
là có một loại glycoprotein giống như tinh bột hiện diện trong các cơ quan nội tạng),
chống bệnh thiếu máu cục bộ, và chống viêm. Đặc tính kháng viêm có thể do ức chế sự
sinh tổng hợp eicosanoid (Srivastava và ctv, 1995) . Ngoài ra, nó có thể điều trị được
bệnh sốt rét, ngăn ngừa bướu cổ, và có thể gây trở ngại cho quá trình nhân rộng của
virus HIV. Trong bệnh HIV, nó sẽ liên kết với protein gắn p300/CREB (CBP) và ức

chế sự hoạt động của protein này. Nó cũng có hiệu quả trong việc bảo vệ và trị bệnh
gan (Marotta và ctv, 2003). Một nghiên cứu tại trường đại học tiểu bang Michigan
(Kutluay và ctv, 2008) đã chỉ ra rằng ở nồng độ thấp curcumin có thể gây rối loạn quá
trình nhân đôi HSV-1. Tương tự, nhóm nghiên cứu cũng cho rằng curcumin ức chế sự
sao chép DNA virus. Kết quả này không phụ thuộc vào hiệu quả hoạt động enzyme
histone acetyltransferase của p300/CBP. Một nghiên cứu trước đó đã thực hiện tại
trường đại học Cincinnati (Bourne và ctv, 1999) kết luận rằng curcumin kết hợp một
cách đáng kể với việc bảo vệ khỏi sự lây nhiễm HSV-2 trong âm đạo thú.
Curcumin hoạt động như một gốc tự do và chống oxy hóa, ngăn chặn quá trình
oxy hóa lipid và oxy hóa gây hư hại DNA. Curcuminoid cảm ứng cho sự hoạt động
enzyme glutathone S-transferase và là những chất ức chế mạnh mẽ cytochrome P450.
7


Những hiệu quả chống ung thư của curcumin bắt nguồn từ khả năng làm cho
các tế bào ung thư tự hủy mà không gây độc cho các tế bào khỏe mạnh. Curcumin có
thể gây trở ngại tới hoạt động của nhân tố sao chép NF-κB, nhân tố này liên kết với
một số bệnh viêm như bệnh ung thư (Aggarwal, 2004). Thực vậy, cho thêm 0,2 %
curcumin vào chế độ ăn uống cân bằng của chuột hoặc thỏ trước đây đã làm giảm chất
sinh ung thư, curcumin làm giảm chất sinh ung thư ruột kết. Một nghiên cứu (Beevers
và ctv, 2009) đề nghị rằng curcumin có thể ức chế phức mTOR I qua một cơ chế mới.
TheoYang và ctv (2005), curcumin có thể ức chế sự tích tụ của beta-amyloid hủy
diệt trong bộ não của chuột bị bệnh Alzheimer. Cũng có bằng chứng (Chiam và ctv,
2006) cho rằng curcumin cải thiện chức năng tinh thần. Một cuộc phẫu thuật trên 1010
người Châu Á đã ăn cà ri vàng ở giữa độ tuổi 60 đến 93 kết luận rằng những người đã
ăn nước sốt mỗi 6 tháng có kết quả MMSE cao hơn những người không ăn.
Nhiều nghiên cứu đã chứng tỏ rằng curcumin, trong số các yếu tố khác như sự
va chạm mạnh, ánh sáng, và sử dụng thuốc chống đau, có hiệu quả rõ ràng trên sự hình
thành thần kinh cá ngựa và sự tập trung của nhân tố thần kinh có nguồn gốc từ não
(BDNF), giảm trong cả khi liên kết với stress, suy nhược, và sự lo âu (Xu và ctv, 2007;

Wu và ctv, 2006; Bala và ctv, 2006).
2.1.5.3. Các enzyme kháng oxy hóa
Những enzyme kháng oxy hoá tạo thành hàng rào phòng tuyến đầu tiên chống
lại các gốc tự do trong cơ thể sinh vật. Nguyên tắc của chúng phụ thuộc vào tình trạng
oxy hoá của tế bào. Tuy nhiên, các nhân tố khác cũng gián tiếp làm gia tăng hoạt động
chống oxy hoá của enzyme và biểu hiện gen. Các enzyme kháng oxy hóa được tìm
thấy trong dịch chiết củ nghệ là superoxide dismutases (SOD), peroxidase, catalase.
SOD là chìa khóa chống lại sự oxy hóa, với chức năng là enzyme hàng đầu
trong việc loại trừ các gốc superoxide (O2-) độc hại cho tế bào bởi việc xúc tác phản
ứng phân tách nó từ oxygen (O2) và hydrogen peroxide (H2O2) (Jianne, 2006). SOD
bao gồm 3 loại chính, phụ thuộc vào đồng nhân tố kim loại: loại Cu/Zn-SOD (gắn kết
cả đồng và kẽm), loại Fe-SOD và Mn-SOD (gắn kết với hoặc sắt hoặc mangan), và
cuối cùng là loại Ni gắn kết với niken. Loại Cu/Zn-SOD thường được sử dụng bởi
sinh vật có nhân thật. Loại Fe-SOD và Mn-SOD được sử dụng bởi sinh vật chưa có
nhân điển hình và nguyên sinh vật. Loại Ni-SOD được sử dụng bởi sinh vật chưa có
nhân điển hình. Trong thực vật bậc cao, SOD được định vị trong những ngăn tế bào
8


khác nhau. Mn-SOD hiện diện trong thể hạt sợi và trong thể peroxi. Fe-SOD đã được
tìm thấy nhiều trong lục lạp nhưng cũng được phát hiện ra trong thể peroxi, Cu/ZnSOD cũng được xác định vị trí trong phần bào tan, lục lạp, thể peroxide và hạt trong.
Peroxidase là một nhóm enzyme rộng, xúc tác dạng phản ứng điển hình sau:
ROOR' + electron cho (2 e-) + 2H+ → ROH + R'OH
Catalase là một nhóm enzyme chung được tìm thấy trong hầu hết sinh vật sống.
Chức năng của chúng là xúc tác cho sự phân hủy hydrogen peroxide (H2O2) thành
nước và oxy. Catalase có hệ số tuần hoàn cao nhất trong tất cả enzyme, một phân tử
catalase có thể biến đổi hàng ngàn phân tử H2O2 thành nước và oxy.
2.1.6. Công dụng của củ nghệ đen
Theo Y học cổ truyền, nghệ đen (nga truật) có vị cay, đắng, tính ôn; có tác dụng
hành khí, phá huyết, thông kinh, tiêu tích, hóa thực. Nghệ đen thường được dùng làm

thuốc chữa đau bụng, ăn không tiêu, đầy hơi, bế kinh, tích huyết, hành kinh không
thông, nhiều máu cục (huyết khối) (Lê Lương Đống, 2005).
Những nghiên cứu gần đây còn cho thấy dịch chiết từ củ nghệ đen có tính kháng
oxy hóa cao, kháng viêm, có khả năng ngăn chặn sự hình thành và phát triển của khối u,
có tiềm năng trong nghiên cứu điều trị ung thư (ung thư máu, ung thư tụy, ung thư ruột
kết), phòng ngừa và điều trị được nhiều loại bệnh, đó là hội chứng rối loạn sự hình thành
tế bào tủy xương, bệnh vảy nến, bệnh Alzheimer. Ngày nay, cũng có nhiều nghiên cứu đã
và đang tiến hành về tác dụng của curcumin (có trong dịch chiết củ nghệ) trên một số
bệnh nan y. Trong tương lai có lẽ nghệ đen còn có nhiều tác dụng hơn nữa.
2.2. Nhân giống nghệ đen in vitro
2.2.1. Điều kiện nuôi cấy nghệ đen in vitro
Điều kiện vô trùng
Vô trùng là điều kiện đầu tiên quyết định sự thành công trong nuôi cấy in vitro.
Khâu vô trùng phải xuyên suốt toàn bộ quá trình nuôi cấy. Trong đó, vô trùng mẫu cấy,
vô trùng dụng cụ, vô trùng môi trường rất cần thiết.
Vô trùng mẫu cấy: Mẫu thực vật (lá, thân, củ, hoa) lấy từ môi trường ngoài nên
có rất nhiều vi sinh vật bám vào. Việc rửa bằng nước thôi là chưa đủ, mẫu cần phải
được rửa kĩ hơn bằng các hóa chất. Sử dụng các hóa chất hủy diệt vi sinh vật: NaOCl
(nước Javel), Ca(OCl)2, mercurbuttol, HgCl2 (thường sử dụng với nồng độ từ 1 ‰ – 2
), kháng sinh (ampicillin, tetracyclin) và thuốc diệt nấm, ethanol 70 – 80o. Tùy thuộc
9


từng loại mẫu của từng loại cây mà ta sử dụng các hóa chất nào với nồng độ và thời gian
là bao nhiêu. Nhưng trước khi đưa vào phòng cấy để khử trùng thì mẫu phải được rửa xà
phòng và để dưới vòi nước đang chảy.
Vô trùng dụng cụ: Dụng cụ (pen, dao, kéo, đĩa cấy) trước khi cấy phải được vô
trùng cẩn thận. Trước hết là phải rửa thật sạch rồi sau đó được hấp khử trùng ở
autoclave (dụng cụ phải được gói cẩn thận bằng hai lớp giấy trước khi đem hấp), trong
giai đoạn hơi ở 121oC và 25 phút, đặt vào tủ sấy ở 80oC sau khi hấp xong. Tháo bỏ lớp

giấy, đưa dụng cụ vào tủ cấy (có thể bật tia UV để tăng sự vô trùng cho dụng cụ).
Trước khi sử dụng để cấy, dụng cụ phải được khử trùng kĩ trên ngọn lửa đèn cồn 96o.
Vô trùng môi trường: Môi trường nuôi cấy phải được khử trùng cẩn thận trước
khi đặt mẫu vào. Nếu môi trường không được vô trùng thì vi sinh vật sẽ phát triển rất
nhanh trên bề mặt, khi đó việc vô trùng mẫu cấy trở nên vô ích. Sau khi cho đầy đủ
thành phần vào, môi trường cấy được khử trùng trong autoclave ở 121oC và 15 – 20
phút. Lưu ý là có một số chất kích thích sinh trưởng và kháng sinh không chịu được
nhiệt độ cao ở autoclave nên sẽ được thêm vào môi trường cấy sau khi hấp xong.
Ngoài ra, cơ thể con người cũng mang rất nhiều vi sinh vật, nên trước khi vào
phòng cấy phải rửa tay thật sạch bằng xà phòng. Sau khi vào phòng cấy, phải đeo khẩu
trang và bao tay. Tất cả các vật dụng trước khi đưa vào tủ cấy phải được khử trùng với
ethanol 70 – 80o. Các thao tác trong tủ cấy càng nhanh càng đỡ bị nhiễm.
Điều kiện ánh sáng
Đối với các mô nuôi cấy, quang tổng hợp không phải là một hoạt động cần thiết,
vì năng lượng được cung cấp đầy đủ trong môi trường nuôi cấy. Nhưng ánh sáng thì
cần thiết để điều hòa vài quá trình về sự biến đổi hình dạng cây.
Cường độ ánh sáng: Việc sử dụng cường độ ánh sáng quá mạnh hoặc quá yếu sẽ
gây ra sự thất bại trong nuôi cấy mô tế bào thực vật. Bình thường, trong các phòng
nuôi cấy, cường độ ánh sáng thay đổi từ 5 – 25 w/m2 (100 - 5000 lux).
Thời gian chiếu sáng: Cho tới bây giờ, dường như không có dữ liệu liên quan đến
thời gian chiếu sáng trong việc tạo hình của cây. Phần lớn, thường chiếu sáng từ
16 – 18 giờ/ngày.

10


Điều kiện nhiệt độ
Nhiệt độ của phòng tăng trưởng thực vật trong nuôi cấy mô được điều chỉnh sao
cho phù hợp với từng loại cây nuôi cấy (cây ôn đới, nhiệt đới). Nhiệt độ thường được
điều chỉnh ổn định từ 22 – 25oC. Đối với cây ôn đới thì nhiệt độ phù hợp là

20oC ± 1oC, và cây nhiệt đới là 25oC ± 1oC.
2.2.2. Môi trường nuôi cấy nghệ đen in vitro
Môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật là một dung dịch có chứa các muối
khoáng, vitamin, đường và các chất kích thích sinh trưởng.
Các muối khoáng được chia làm hai loại là đa lượng và vi lượng. Các đa lượng
gồm N, P, K, S, Mg, Ca và các vi lượng gồm B, Mn, Zn, Ca, Ni, Co, Mo, Al, I, Fe.
Việc sử dụng nhiều vitamin khác nhau trong môi trường sẽ làm thuận lợi
cho sự phát triển của mô nuôi cấy. Các vitamin này thuộc nhóm B là B1, B6,
biotin, myoinositol.
Bởi vì mô hoặc tế bào thực vật bị hạn chế quang hợp trong quá trình nuôi cấy
nên phải bổ sung đường vào môi trường. Thông thường, người ta sử dụng saccharose
với nồng độ từ 5 – 40 g/l.
Tùy vào mục đích nuôi cấy mà người ta có hoặc không bổ sung chất kích thích
sinh trưởng vào môi trường và với nồng độ là bao nhiêu. Các nhóm chất kích thích
sinh trưởng được sử dụng là auxin, cytokinin, gibberellin.
Auxin: Hai tính chất quan trọng của auxin được sử dụng trong nuôi cấy mô thực
vật là sự phân chia tế bào và hiệu quả ra rễ. Các loại auxin được sử dụng là AIB,
ANA, 2,4 D. 2,4 D và ANA thích hợp cho việc tạo mô sẹo. ANA, AIB thích hợp cho
việc tạo rễ. Tuy nhiên, trong quá trình nhân chồi ta cũng có thể thêm auxin vào môi
trường để làm tăng thêm hiệu quả nuôi cấy.
Cytokinin: Cytokinin duy trì sự sống của mô, kích thích sự phân chia tế bào và
định hướng tế bào trong con đường phân hóa. Các cytokinin được sử dụng là zeatine,
IPA (bao gồm kinetin, BAP).
Gibberelline: Chỉ có GA3 được sử dụng. GA3 rất dễ bị phân hủy ở autoclave nên
chỉ được thêm vào sau khi môi trường được hấp khử trùng xong. Tác dụng của GA3 là
kéo dài đốt thân, tác động tới sự ra hoa ở thực vật.
Môi trường MS thích hợp với hầu hết các loại cây nuôi cấy. Thành phần môi
trường MS ở phụ lục 1.
11



2.2.3. Nuôi cấy nghệ đen in vitro
Tạo cây nghệ đen in vitro
Sau khi khử trùng, mẫu sẽ được nuôi cấy trên môi trường MS rắn chứa đầy đủ
chất dinh dưỡng khoáng vô cơ, hữu cơ, đường, vitamin. Từ một đỉnh sinh trưởng, sau
một khoảng thời gian nuôi cấy sẽ phát triển thành một hay nhiều chồi. Sau đó, chồi tiếp
tục vương thân, ra rễ và lá để trở thành một cây hoàn chỉnh.
Nuôi cấy mô sẹo nghệ đen in vitro
Mô sẹo là một khối tế bào phát triển vô tổ chức, hình thành do sự phản phân hóa
của các tế bào đã phân hóa. Mô sẹo được hình thành khi mẫu nhỏ của cây (thân, lá)
được đặt trong môi trường MS rắn có bổ sung chất kích thích sinh trưởng (auxin,
cytokinin, gibberellin). Mô sẹo có rất nhiều ứng dụng, đối với mô sẹo nghệ đen thì ứng
dụng quan trọng là để nuôi cấy huyền phù tế bào.
Nhân chồi nghệ đen in vitro
Có thể nhân nhanh số lượng cây nghệ trong một thời gian ngắn bằng phương
pháp nuôi cấy in vitro. Từ một mẫu cây in vitro có sẵn, cắt bớt lá rồi chia thành các
đoạn nhỏ có chứa chồi (đối với cây hai lá mầm) hoặc cắt bỏ hết lá và hủy đỉnh sinh
trưởng (đối với cây một lá mầm), đặt vào môi trường nhân chồi. Môi trường nhân chồi
là môi trường MS cơ bản có bổ sung thêm cytokinin hoặc cytokinin kết hợp với auxin
với nồng độ tùy thuộc vào từng loại cây nuôi cấy (Dương Công Kiên, 2002).
2.3. Trích ly và xác định các hợp chất thứ cấp
2.3.1. Ly trích tinh dầu
Tinh dầu thường được ly trích bằng phương pháp chưng cất. Những cách thức
ly trích khác là vắt, Soxhlet, phân tách bằng dung môi.
Phương pháp chưng cất
Ngày nay, hầu hết các loại tinh dầu được ly trích bằng phương pháp chưng cất.
Nguồn vật liệu thực vật thô, bao gồm hoa, lá, gỗ, vỏ, rễ, hạt, vỏ quả, củ được đặt trong
nồi chưng cất, phía trên nước. Khi được làm nóng, hơi nước bay lên nguyên liệu cần
chưng cất, kéo theo những hợp chất dễ hóa hơi. Hơi (nước, tinh dầu) đi ngang qua ống,
nơi đó chúng ngưng tụ lại thành từng giọt nhờ vào hệ thống nước lạnh chảy liên tục

bên ngoài ống, những giọt nước (có lẫn tinh dầu) này rơi xuống ống nhận. Tinh dầu
nhẹ hơn nên sẽ nổi lên mặt nước, đẩy nước chảy lại vào bình chưng cất.

12


Phương pháp cơ học
Hầu hết tinh dầu vỏ họ citrus đều được thu nhận bằng bằng máy vắt, hoặc máy
ép lạnh. Do vỏ họ citrus chứa tinh dầu rất nhiều, mặt khác việc trồng và thu hoạch
nguyên liệu thô cần chi phí rất thấp nên tinh dầu họ citrus rẻ hơn nhiều so với những
loại tinh dầu khác. Hoa, lá, củ của các loại cây chứa rất ít tinh dầu nên không được ly
trích bằng phương pháp vắt, bóp. Tinh dầu có trong các loại nguyên liệu này được thu
nhận bằng các phương pháp hiện đại hơn.
Phương pháp dung môi
Hầu hết các loại hoa chứa rất ít tinh dầu dễ bay hơi nên không thể thu được bằng
cách ép, mặt khác những hợp chất hóa học của chúng thì quá nhạy và quá dễ biến tính bởi
nhiệt độ cao nếu sử dụng nồi chưng cất. Thay vào đó, sử dụng dung môi như hexane
hoặc supercritical carbon dioxide để ly trích tinh dầu. Phần chiết từ hexane hoặc dung
môi kị nước khác là một dung dịch cô đặc, nó là hỗn hợp của tinh dầu không hòa tan,
chất sáp, chất nhựa, và tinh dầu hòa tan của thực vật. Các loại dung môi, thường là ethyl
alcohol chỉ phân hủy những hợp chất thơm có trọng lượng phân tử thấp, thường sử dụng
để ly trích tinh dầu thơm từ hoa. Alcohol được loại bỏ bởi lần chiết thứ hai, để lại tinh
dầu nguyên chất.
Supercritical carbon dioxide được sử dụng như là dung môi trong ly trích tinh
dầu và các chất khác. Phương pháp này có rất nhiều lợi ích, đó là tránh những chất kết
tủa hóa học trong sản phẩm và làm mất lớp màng khi sử dụng nồi chưng cất. Nó không
tách được tinh dầu nguyên chất một cách trực tiếp. Supercritical carbon dioxide sẽ tách
cả sáp và tinh dầu có trong hoa. Quy trình sau đó sử dụng carbon dioxide lỏng, thực
hiện trong máy chiết tương tự bởi việc giảm nhiệt độ ly trích, sẽ phân tách được sáp ra
khỏi tinh dầu. Quá trình làm giảm nhiệt độ này ngăn chặn việc biến tính và phân hủy

những hợp chất trên. Khi quá trình ly trích hoàn thành, áp suất được giảm xuống làm
cho carbon dioxide trở lại dạng khí (Lê Ngọc Thạch, 2003).
Phương pháp Soxhlet
Phương pháp này sử dụng hệ thống Soxlet, hệ thống này bao gồm bình Soxhlet
(hình 2.4), ống ngưng tụ hơi dung môi, bình cầu đựng dung môi và chất cần ly trích,
bếp để làm sôi dung môi. Nguyên liệu cần ly trích thường được sấy khô. Cho nguyên
liệu khô vào khoang chứa nguyên liệu rồi đổ dung môi vào sao cho ngập được nguyên
liệu, ngâm khoảng 30 phút trước khi cung cấp nhiệt độ. Dung môi sẽ sôi, bay hơi rồi
13


ngưng tụ lại nhờ vào hệ thống làm lạnh phía trên. Hơi dung môi nóng ngưng tụ lại
thành dạng nước rồi chảy ngược lại vào khoang chứa nguyên liệu. Ở đây, dung môi sẽ
hòa tan chất cần ly trích sau đó chảy ngược lại vào bình cầu (theo nguyên tắc bình
thông nhau). Hệ thống được lặp lại nhưng chỉ có dung môi bay hơi, chất cần ly trích
vẫn ở trong bình cầu. Sau khi hết thời gian ly trích (tùy thuộc vào nguyên liệu và chất
cần ly trích mà thời gian sẽ dài hay ngắn), ta đem bình cầu có chứa dung môi và chất
cần ly trích cô cạn ở nhiệt độ mà dung môi bay hơi, thu được chất cần ly trích.
2.3.2. Ly trích curcumin
Phương pháp dung môi
Curcumin được ly trích từ nguyên liệu củ nghệ khô. Quá trình ly trích đòi hỏi
nguyên liệu thô dạng bột, dung môi phải được chọn lọc kĩ để có thể hòa tan hết
curcumin. Hỗn hợp gồm dung môi và nguyên liệu được ngâm liên tục trong nhiều giờ
(6 giờ trở lên) trên hệ thống lắc. Có khoảng 90 % curcumin trong dịch chiết nếu sử
dụng phương pháp này, 10 % còn lại là tinh dầu và nhựa tự nhiên (Ivan, 2004).
Các dung môi có thể hòa tan được curcumin là: acetone, carbon dioxide, ethyl
acetate, dichloromethane, n-butanol, methanol, ethanol, và hexane.
Isopropanol: Trong quy trình sản xuất curcumin, isopropanol được sử dụng để ly trích
curcumin tinh khiết.
Ethyl acetate: Do hạn chế trong việc sử dụng những dung môi chlor như

dichloroethane, người ta sử dụng ethyl acetate.
Acetone: Được sử dụng như là một dung môi trong quá trình sản xuất curcumin.
Carbon dioxide: Không được sử dụng hiện tại trong sản suất công nghiệp. Tuy nhiên,
nó có khả năng thay thế cho những dung môi chứa chlor.
Methanol: Thỉnh thoảng được sử dụng như là chất thêm vào cho việc tinh sạch curcumin.
Ethanol: Được sử dụng một cách tiết kiệm bởi vì curcumin tan hoàn toàn trong ethanol.
Hexane: Cũng được sử dụng để ly trích curcumin. Tùy thuộc vào từng phòng thí
nghiệm mà người ta sử dụng các hóa chất khác nhau.
Phương pháp Soxhlet
Nguyên liệu được sấy khô và xay thành dạng bột rồi cho vào hệ thống Soxhlet.
Nguyên tắc hoạt động cũng tương tự như với hệ thống Soxhlet ly trích tinh dầu. Thời
gian cần cho một lần ly trích curcumin khoảng 18 giờ đến 72 giờ, thời gian dài hay
ngắn còn tùy thuộc vào loại dung môi đem ly trích.
14