BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ĐÁNH GIÁ BIẾN LƯỢNG DI TRUYỀN QUẦN THỂ
CON LAI CÂY CAO SU CỦA TỔ HỢP LAI
PB260 X AC55 VÀ PB260 X RO62/26
BẰNG KỸ THUẬT RAPD – PCR

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Sinh viên thực hiện: HUỲNH THỊ MINH TÂM
Niên khóa: 2005 – 2009

Tháng 8/2009


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ĐÁNH GIÁ BIẾN LƯỢNG DI TRUYỀN QUẦN THỂ
CON LAI CÂY CAO SU CỦA TỔ HỢP LAI
PB260 X AC55 VÀ PB260 X RO62/26
BẰNG KỸ THUẬT RAPD – PCR

Hướng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

ThS. LÊ THỊ THÙY TRANG

HUỲNH THỊ MINH TÂM

ThS. NGUYỄN THỊ KIM LINH

Tháng 8/2009


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin chân thành cảm ơn: 
- Ban Giám Hiệu trường Đại Học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh, Ban Chủ Nhiệm
Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý Thầy Cô đã truyền đạt những kiến thức
quý báu cho tôi trong suốt thời gian học tại trường.
- Ban lãnh đạo Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam đã tạo điều kiện thuận lợi cho
tôi thực tập và hoàn thành tốt khóa luận tốt nghiệp.
- ThS. Lê Thị Thùy Trang, Phòng Công Nghệ Sinh Học, Bộ Môn Giống –
Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam đã trực tiếp và tận tình hướng dẫn về kiến thức
chuyên môn, động viên, giúp đỡ, tạo mọi đều kiện thuận lợi và đóng góp nhiều ý kiến
quý báu cho tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này.
- ThS. Nguyễn Thị Kim Linh, Bộ Môn Công Nghệ Sinh Học – Trường Đại Học
Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh đã có những ý kiến đóng góp quý báu giúp tôi hoàn thiện
khóa luận tốt nghiệp.
- ThS. Lê Mậu Túy, Trưởng Bộ Môn Giống – Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt
Nam; cùng các cô chú, anh chị là cán bộ công nhân viên Bộ Môn Giống – Viện
Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam đã nhiệt tình giúp đỡ và hướng dẫn tôi trong suốt

thời gian thực tập tại Viện.
- Tập thể lớp DH05SH, tất cả các bạn bè thân quen đã luôn là nguồn động viên tinh
thần cho tôi trong những năm học vừa qua.
Thành kính ghi công ơn ba mẹ cùng người thân trong gia đình luôn tạo điều kiện
và động viên con trong suốt quá trình học tập tại trường.
Sinh viên thực hiện
Huỳnh Thị Minh Tâm

iii


TÓM TẮT
Đề tài được tiến hành tại Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam (VNCCSVN) từ
tháng 3 đến tháng 7 năm 2009 nhằm đánh giá biến lượng di truyền quần thể con lai
của tổ hợp lai PB260 x AC55 (TH1) và PB260 x RO62/26 (TH2), là con lai giữa
nguồn di truyền thuần hóa Wickham và nguồn di truyền hoang dại Amazone, bằng kỹ
thuật RAPD làm cơ sở cho công tác tạo tuyển giống cây cao su tại Viện theo định
hướng đa dạng nguồn di truyền con lai cây cao su nhưng vẫn đảm bảo các tính trạng
kinh tế cao. Thành phần các hóa chất tham gia phản ứng PCR và điều kiện điện di sản
phẩm sau khi khuếch đại đã được tối ưu hóa. Các qui trình cải tiến này đã được dùng
để khuếch đại DNA ly trích từ 57 kiểu di truyền con lai của 2 tổ hợp cùng với các bố
mẹ của chúng sử dụng 8 primer đa hình.
Có tất cả 79 band DNA được tạo ra trên 8 primer, trong đó có 67 band đa hình
chiếm 84,82% trên tổng số band tạo thành, còn lại 12 band đồng hình chiếm 15,18%.
Số band đa hình/primer từ 2 đến 16 band (chiếm tỷ lệ từ 16,7% đến 100%) và trung
bình có 8,4 band đa hình/primer. Các sản phẩm khuếch đại có độ dài nằm trong
khoảng từ 180 – 2.300 bp. Tám primer này cũng cho phép phân biệt tất cả các cá thể
trong quần thể nghiên cứu.
Kết quả phân tích hệ số tương đồng di truyền (HSTĐDT) dựa trên chỉ số DICE của
57 con lai có giá trị từ 0,612 (giữa LH05/0891 và LH04/0160) đến 0,975 (giữa

LH05/0950 và LH05/0893), có nghĩa là khoảng cách di truyền (KCDT) giữa các con
lai trong cả hai tổ hợp biến thiên từ 0,025 đến 0,388 với trung bình là 0,163. Nguồn
biến thiên di truyền này là kết quả của một số kiểu biến dị mới, cụ thể là (1) một số
band xuất hiện ở bố mẹ nhưng không truyền lại cho con; (2) một số band không có ở
bố mẹ nhưng xuất hiện ở con lai; và (3) các band chỉ xuất hiện ở bố hoặc mẹ và con
lai. Dù là con lai của 2 tổ hợp cùng mẹ, quần thể con lai nghiên cứu có khoảng biến
thiên di truyền tương đối rộng và nguồn biến dị phong phú. Đây sẽ là nguồn vật liệu
quí giá cho công tác tuyển chọn giống theo hướng đa dạng nguồn di truyền nhưng vẫn
đảm bảo các tính trạng kinh tế. Kết quả phân tích tương đồng di truyền của con lai với
bố mẹ của chúng cho thấy con lai gần gũi với mẹ hơn với bố một cách có ý nghĩa, cụ thể
là trung bình hệ số tương đồng di truyền của con lai với mẹ là 0,848 và với bố là 0,708.

iv


Kết quả này nêu lên sự cần thiết mở rộng nguồn gen mẹ trong công tác tạo tuyển giống
cao su nhắm vào mục tiêu tối đa sự đa dạng di truyền ở thế hệ con lai.
Phân nhóm di truyền dựa trên dữ liệu RAPD thông qua 8 primer cho thấy sự phân
nhóm các kiểu di truyền trong quần thể nghiên cứu không phụ thuộc vào các tổ hợp
lai. So sánh các chỉ tiêu sinh trưởng, sản lượng, bệnh hại với sự phân nhóm di truyền
của quần thể nghiên cứu cho thấy các kiểu di truyền có sinh trưởng, sản lượng cao
hoặc mẫn cảm với bệnh phân bố một cách ngẫu nhiên trên cây phân nhóm di truyền.
Cũng không tìm thấy bất cứ các band đặc trưng nào liên kết với các tính trạng nông
học. Điều này có nghĩa là chưa có mối liên hệ nào giữa các chỉ tiêu nông học với 8
primer RAPD sử dụng trong nghiên cứu; và chưa thể sử dụng kỹ thuật RAPD với các
primer này để phân biệt các cá thể có thành tích nông học cao.
Kết quả đề tài cho thấy kỹ thuật RAPD đã phản ánh được biến lượng di truyền
trong quần thể con lai Wickham x Amazone. Kết quả đề tài tạo cơ sở dữ liệu cho
nghiên cứu di truyền quần thể con lai cao su WA, đóng góp tư liệu vào định hướng lựa
chọn bố mẹ lai trong chương trình lai tạo giống cao su.


v


SUMMARY
Genetic variability of rubber hybrid progenies of the two crosses PB260 x AC55
and PB260 x RO62/26 was analyzed by RAPD technique to provide information
for breeding program targeting at the optimization of genetic diversity among
progenies through crossing between well-domesticated genetic resourse Wickham
(W) with highly genetic-diverse wild resourse Amazone (A). Concentrations of the
reagents involved in PCR reaction and agarose gel electrophoresis were optimized
to obtain the protocols that can produce clear, unambiguous, and repeatable
amplified banding pattern. These protocols were used to amplify DNA extracted
from 57 above-mentioned rubber genotypes together with their parent clones, using
eight arbitrarily selected primer.
A total of 79 DNA fragments, ranging from 180 to 2,300 bp, were amplified by
these 8 primers. There were 67 polymorphic bands representing 84.82%; and the
number of polymorphic DNA fragments per primer ranged from 2 to 16 with an
average of 8.4. This set of primers also allow to distinguigh every genotype from
this investigated population.
Genetic similarity coefficient among investigated population, based on Dice
similarity coefficient, ranged from 0.612 (LH05/0891 and LH04/0160) to 0.975
(LH05/0950 and LH05/0893), meaning that the genetic distance among 57
genotypes ranged from 0.025 to 0.388 with an everage of 0.163. The sourse of this
genetic variability was the result of some cases of variation involving (1) some
bands present in both parents but absent in the progenies; (2) some bands absent in
both parents but present in the progenies; and (3) some bands appeared in progenies
and either parent without presence in another parent. Although being the progenies
of the two crosses with the same maternal clone, this investigated progenies had a
relatively high range of genetic variability with a diverse genetic variation. This

will provide a good starting material for breeding and selection aiming at optimal
genetic diversity while maintaining good economic traits in the selected hybrids.
The results also revealed that the progenies were genetically closer to maternal
clone than to fatherly clones, as indicated by the average of genetic similarity

vi


coefficient to the maternal clone was 0.848 while that to the fatherly clones was
0.708. This indicates the necessity of enlargement of maternal genetic source for
widening genetic diversity in the progenies.
Dendrogram based on Dice’s genetic similarity by UPGMA method showed a
varying degree of seperation of genotypes among the investigated population
independent of crosses. The high yielding, good growth, and disease-susceptible
genotypes distributed randomly in the genetic cluster dendrogram; and no specific
band closely linked to agronomic traits was found indicated that RAPD technique
based on these eight primers could not be used to determine genotypes harboring
good agronomic characteristics.
RAPD markers showed potential for determining genetic variability among W x
A hybrid population. The identifiable RAPD phenotypes found for each individual
among investigated population revealed that RAPD marker could be used for
identification of WA clones. Results from this study provide the genetic-base
database for studying genetic variability of W x A hybrid progenies, contribute the
information to strategy of selecting suitable parents for breeding program orienting
to genetic diversity in the progenies.

vii


MỤC LỤC

Trang
LỜI CẢM ƠN................................................................................................................ iii
TÓM TẮT...................................................................................................................... iv
SUMMARY................................................................................................................... vi
MỤC LỤC ................................................................................................................... viii
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT .......................................................................... xi
DANH SÁCH CÁC BẢNG ........................................................................................ xiii
DANH SÁCH CÁC HÌNH.......................................................................................... xiv
Chương 1 MỞ ĐẦU ........................................................................................................1
1.1. Đặt vấn đề.................................................................................................................1
1.2. Yêu cầu của đề tài.....................................................................................................3
1.3. Nội dung thực hiện ...................................................................................................3
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU...............................................................................4
2.1. Giới thiệu tổng quát về cây cao su ...........................................................................4
2.2. Tiến trình cải tiến giống cao su ................................................................................5
2.2.1. Tiến trình cải tiến giống cao su trên thế giới.........................................................5
2.2.2. Tiến trình cải tiến giống cao su ở Việt Nam .........................................................7
2.3. Các chỉ thị phân tử phổ biến...................................................................................10
2.3.1. Marker phân tử truyền thống: Kỹ thuật RFLP ....................................................10
2.3.2. Marker dựa trên kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) ............................10
2.3.2.1. Nguyên tắc của phản ứng PCR.........................................................................10
2.3.2.2. Kỹ thuật Microsatellites (SSR – Simple Sequences Repeat) ...........................11
2.3.2.3. Kỹ thuật AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) ........................12
2.3.2.4. Kỹ thuật RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA) ..............................13
2.4. Ứng dụng marker DNA trong nghiên cứu cao su...................................................14
2.5. Ứng dụng kỹ thuật RAPD trong nghiên cứu biến lượng di truyền quần thể..........16
2.5.1. Ý nghĩa của nghiên cứu biến lượng di truyền quần thể.......................................16
2.5.2. Ứng dụng kỹ thuật RAPD trong nghiên cứu biến lượng di truyền quần thể.......18
Chương 3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................................................20


viii


3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ..........................................................................20
3.2. Vật liệu nghiên cứu.................................................................................................20
3.2.1. Đối tượng.............................................................................................................20
3.2.2. Hóa chất thí nghiệm.............................................................................................20
3.2.2.1. Hoá chất dùng trong ly trích DNA ...................................................................20
3.2.2.2. Hóa chất sử dụng trong phản ứng PCR ............................................................21
3.2.2.3. Hóa chất dùng trong điện di và đọc kết quả .....................................................21
3.2.3. Thiết bị, dụng cụ thí nghiệm................................................................................22
3.2.3.1. Các trang thiết bị cần thiết cho phân tích RAPD .............................................22
3.2.3.2. Thiết bị văn phòng............................................................................................22
3.2.3.3. Các phần mềm thống kê hỗ trợ.........................................................................22
3.3. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................................22
3.3.1. Phương pháp lấy mẫu và ly trích DNA ...............................................................22
3.3.2. Phương pháp kiểm tra hàm lượng và độ tinh sạch của DNA mẫu......................22
3.3.2.1. Định tính DNA bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1%......................22
3.3.2.2. Định lượng DNA mẫu bằng phương pháp đo mật độ quang ...........................23
3.3.3.Tối ưu hóa qui trình phản ứng PCR và điện di sản phẩm PCR............................23
3.3.3.1. Tối ưu hóa các thành phần phản ứng PCR với marker RAPD.........................23
3.3.3.2. Ảnh hưởng của nồng độ gel agarose và loại buffer đến quá trình điện di ......24
3.3.4. Phương pháp khuếch đại mẫu DNA các giống trong quần thể nghiên cứu ........24
3.3.5. Phương pháp điện di sản phẩm và thu thập số liệu sau khi khuếch đại DNA ....25
3.3.6. Phương pháp phân tích kết quả ...........................................................................25
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN......................................................................27
4.1. Ly trích, định tính và định lượng DNA từ các giống cao su nghiên cứu ...............27
4.2. Tối ưu hóa các thành phần phản ứng PCR với marker RAPD...............................28
4.2.1. Ảnh hưởng của nồng độ primer đến marker RAPD............................................28
4.2.2. Ảnh hưởng của nồng độ Taq DNA polymerase đến sản phẩm RAPD ...............28

4.2.3. Ảnh hưởng của nồng độ gel agarose và loại buffer đến quá trình điện di ..........29
4.3. Khuếch đại DNA cao su bằng kỹ thuật RAPD sử dụng 8 primer ..........................30
4.4. Đánh giá sự đa hình của các primer trên quần thể giống nghiên cứu ....................31
4.5. Đánh giá biến lượng di truyền giữa các con lai trong quần thể nghiên cứu...........32
4.6. Đánh giá biến lượng di truyền của con lai so với bố mẹ của chúng ......................34
ix


4.7. Phân nhóm di truyền các con lai trong quần thể nghiên cứu .................................39
4.8. Mối quan hệ giữa marker và sự đa dạng di truyền với các tính trạng nông học ....41
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..........................................................................47
5.1. Kết luận...................................................................................................................47
5.2. Đề nghị ...................................................................................................................48
TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................49
PHỤ LỤC

x


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
A: Amazone (nguồn giống cao su sưu tập từ vùng nguyên quán Nam Mỹ sau đợt sưu
tập của Wickham năm 1876).
AFLP: Amplified Fragment Length Polymorphism.
Bp: basepair.
CIRAD: Centre de Coopération Internationale en Recherche Agronomique pour
le Développement, France (Trung tâm hợp tác quốc tế nghiên cứu phát triển
nông nghiệp, Pháp).
CTAB: Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide.
DHMT: Duyên hải miền Trung.
DNA: Deoxyribonucleic acid.

dNTP: Deoxyribonucleotide triphosphate.
DVT: Dòng vô tính.
ĐNB: Đông Nam Bộ.
EDTA: Ethylene Diamine Tetra acetic Acid.
HSTĐDT: Hệ số tương đồng di truyền.
IRRDB: International Rubber Research Development Board (Ủy Hội Nghiên Cứu và
Phát Triển Cao Su Quốc Tế).
KCDT: Khoảng cách di truyền.
LH: Ký hiệu các giống lai hoa của Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam.
MWL: Molecular Weight Ladder.
NTSYSpc: Numercial Taxonomy System package.
OD: Optical Density.
PCR: Polymerase Chain Reaction.
QTL: Quantitative Trait Loci.
RAPD: Random Amplified Polymorphic DNA.
RE: Restriction enzyme.
RFLP: Restriction Fragment Length Polymorphism.
RRII : Rubber Research Institute of India (Viện Nghiên cứu Cao su Ấn Độ).
SSCP: Single – Strand Conformation Polymorphism.

xi


SSR: Simple Sequence Repeat.
TAE: Tris – Acetate – EDTA.
TBE: Tris – Borate – EDTA.
TE: Tris – EDTA.
TN: Tây Nguyên.
TNLK05: Vườn tuyển non năm 2005 ở Lai Khê.
TNLK06: Vườn tuyển non năm 2006 ở Lai Khê.

TH1: Tổ hợp lai PB260 x AC55.
TH2: Tổ hợp lai PB260 x RO62/26.
VNCCSVN: Viện Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam.
W: Wickham (nguồn di truyền cao su do Wickham sưu tập từ Brazil đưa đầu tiên vào
Châu Á năm 1896, được thuần hóa qua tạo tuyển hơn 120 năm).
WA: Wickham – Amazone (nguồn giống cao su do lai tạo giữa 2 nguồn di truyền
Wickham và Amazone).

xii


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Trang
Bảng 3.1 Thành phần hóa chất trong QIAGEN DNeasy Plant Mini Kits ....................20
Bảng 3.2 Danh sách và trình tự 8 primer sử dụng trong nghiên cứu ............................21
Bảng 3.3 Chu trình nhiệt cho phản ứng RAPD trên DNA cao su ................................24
Bảng 3.4 Thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ gel và loại buffer thích hợp ...24
Bảng 4.1 Tỷ lệ và nồng độ các hóa chất tham gia phản ứng RAPD ............................30
Bảng 4.2 Chu trình nhiệt cho phản ứng RAPD ............................................................31
Bảng 4.3 Sản phẩm khuếch đại của 8 primer trên 60 DVT cao su nghiên cứu ............32
Bảng 4.4 Khái quát các thông số biến lượng di truyền trong quần thể nghiên cứu......33
Bảng 4.5 Các band DNA chỉ có ở con, ở mẹ và con lai hoặc ở bố và con lai ở TH1...37
Bảng 4.6 Các band DNA có ở bố mẹ nhưng không có ở con lai..................................38
Bảng 4.7 Các band DNA chỉ có ở con, ở mẹ và con lai hoặc ở bố và con lai ở TH2...38
Bảng 4.8 Chỉ tiêu nông học của con lai trong tổ hợp PB260 x AC55 ..........................42
Bảng 4.9 Chỉ tiêu nông học của con lai trong tổ hợp PB260 x RO62/26.....................44

xiii



DANH SÁCH CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1 Quá trình bắt cặp và khuếch đại sản phẩm trong phản ứng RAPD ...............13
Hình 4.1 Định tính DNA tổng số bằng phương pháp điện di trên gel agarose 1% ......28
Hình 4.2 Ảnh hưởng của nồng độ primer đến sản phẩm RAPD ..................................29
Hình 4.3 Ảnh hưởng của nồng độ Taq DNA polymerase đến sản phẩm RAPD. ........29
Hình 4.4 Ảnh hưởng của nồng độ gel agarose và loại buffer đến quá trình điện di ....30
Hình 4.5 Kết quả điện di sản phẩm RAPD khuếch đại bằng primer OPA04...............31
Hình 4.6 Phân nhóm di truyền của các con lai ............................................................40
Hình 4.7 Phân nhóm di truyền dựa trên kết quả RAPD đối với con lai trong TH1 .....43
Hình 4.8 Phân nhóm di truyền dựa trên kết quả RAPD đối với con lai trong TH2 .....45

xiv


Chương 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Cây cao su, Hevea brasiliensis, thuộc chi Hevea, họ Euphorbiaceae, có nguồn gốc
từ vùng rừng thuộc lưu vực sông Amazone, Nam Mỹ. Vùng sinh thái tự nhiên của cây
cao su thuộc khí hậu nhiệt đới ẩm. Cây cao su là loài cây cung cấp nguyên liệu quan
trọng cho nhiều ngành công nghiệp, được xếp sau dầu hỏa, than đá và gang thép.
Bên cạnh các sản phẩm truyền thống từ mủ cao su, cây cao su còn có khả năng cung
cấp một khối lượng gỗ có giá trị kinh tế cao sau chu kỳ kinh doanh. Cây cao su được
đánh giá là cây công nghiệp có hiệu quả kinh tế cao, ổn định và có đóng góp đáng kể
vào công cuộc cải thiện kinh tế, xã hội và môi trường tại Việt Nam. Hiện nay cây cao
su còn được xem là thành phần trong cơ cấu cây trồng có thể đáp ứng chủ trương phủ
xanh đất trống, đồi trọc, tái tạo rừng và cải tạo môi sinh.
Sớm nhận thức được giống là yếu tố có tính quyết định trong hệ thống kỹ thuật
tác động đến năng suất và hiệu quả kinh tế của vườn cây, VNCCSVN đã tập trung

vào chương trình cải tiến giống cao su từ năm 1976, với mục tiêu ban đầu là cải
thiện năng suất mủ – gỗ (Trần Thị Thúy Hoa và ctv, 2005a). Tuy nhiên, sự giới hạn
nguồn gen ở các nước châu Á là yếu tố quan trọng nhất gây trở ngại cho công tác
chọn tạo giống cao su (Lại Văn Lâm và ctv, 2009b). Các nhà tạo giống cao su trên
thế giới đã nỗ lực tiến hành một đợt sưu tập các kiểu di truyền cao su ở vùng
nguyên quán thuộc lưu vực sông Amazone vào năm 1981 nhằm khắc phục bất cập
trên (Ong, 1982; trích từ Võ Thị Thu Hà, 1996). Nguồn di truyền cây cao su tại
Việt Nam cũng đã được bổ sung một số lượng lớn trong giai đoạn 1984 – 1996,
trong đó phần lớn là các kiểu di truyền hoang dại Amazone. Qua đánh giá lựa chọn
dựa vào các chỉ tiêu nông học, từ năm 1997, một số kiểu di truyền Amazone triển
vọng đã được đưa vào các chương trình lai tạo giống nhằm mở rộng nguồn gen
trong công tác chọn tạo giống cao su (Lại Văn Lâm và ctv, 2009b).
Qua đánh giá ban đầu cho thấy nguồn gen Amazone khi lai với nguồn gen Đông
Nam Á (Wickham) rất có giá trị trong việc cải thiện sinh trưởng (Trần Thị Thúy Hoa
và ctv, 2005a) và khả năng kháng bệnh của con lai (Lại Văn Lâm và ctv, 2008).
1


Các đánh giá ban đầu về đa dạng di truyền của nguồn gen Amazone sử dụng chỉ thị
isozyme (Lại Văn Lâm và cvt, 2005) và chỉ thị phân tử (Trần Thanh, 2007; Lại Văn
Lâm và ctv, 2009a) cho thấy biến lượng di truyền của nguồn gen này rất lớn, rất phong
phú và đa dạng. Đây được xem là nguồn di truyền cực kỳ hữu ích cho công tác tạo tuyển
giống cao su theo hướng mủ – gỗ, thích nghi rộng và chống chịu tốt phục vụ nhu cầu
phát triển cao su trong nước trong giai đoạn sắp tới. Hiện nay, VNCCSVN đã và đang
đẩy mạnh nguồn gen Amazone vào các chương trình lai tạo giống. Tuy nhiên, trong
công tác lai tạo giống này, phần lớn các tổ hợp bố mẹ được chọn chủ yếu dựa vào thành
tích nông học xuất sắc nhằm mong muốn tạo ra các con lai có sản lượng cao và sinh
trưởng tốt, chống chịu bệnh. Chính vì vậy, biến lượng di truyền của con lai như thế nào,
có hay không có các nguy cơ xói mòn gen do lai tạo định hướng năng suất là vấn đề
quan trọng đặt ra cho công tác tạo tuyển giống cao su. Trong khi đó, cây cao su lại là

cây công nghiệp dài ngày, có chu kỳ kinh tế và thời gian tạo tuyển giống dài, nếu đánh
giá phẩm chất con lai dựa vào các chỉ thị hình thái sẽ mất rất nhiều thời gian. Do vậy,
việc ứng dụng các chỉ thị phân tử trong công tác đánh giá biến lượng di truyền của con
lai là đặc biệt cần thiết, nó rút ngắn thời gian trong công tác tạo tuyển giống và đem lại
hiệu quả kinh tế cao. Kỹ thuật Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD) đã biểu
hiện nhiều hứa hẹn trong việc đánh giá biến lượng di truyền của các cá thể trong cùng
một loài cũng như quan hệ giữa các quần thể nghiên cứu (Gang và Weber, 1995).
Nghiên cứu của Varghese và ctv (1997) cũng cho thấy rằng kỹ thuật RAPD rất hữu ích
trong việc nhận diện giống và phân tích, đánh giá quan hệ di truyền của các dòng vô tính
(DVT) cao su trong quần thể. Dựa trên đòi hỏi thực tiễn và tính khả thi của kỹ thuật
RAPD, đề tài: “đánh giá biến lượng di truyền quần thể con lai cây cao su của tổ hợp lai
PB260 x AC55 và PB260 x RO62/26 bằng kỹ thuật RAPD – PCR” được thực hiện. Kết
quả của đề tài này sẽ cung cấp thông tin ở mức độ phân tử về biến lượng di truyền của
quần thể nghiên cứu và đóng góp một phần vào định hướng lựa chọn bố mẹ trong công
tác chọn tạo giống cao su ở Việt Nam.

2


1.2. Yêu cầu của đề tài
Đánh giá biến lượng di truyền của quần thể con lai thuộc hai tổ hợp lai
PB260 x AC55 và PB260 x RO62/26 bằng kỹ thuật RAPD, đây là các con lai giữa
nguồn di truyền thuần hóa Wickham và hoang dại Amazone. Qua đó đánh giá hiệu
quả về mặt cải tiến nguồn di truyền hạn hẹp Wickham thông qua chương trình lai
tạo giống với nguồn di truyền hoang dại Amazone, cung cấp tư liệu cho chương
trình tạo tuyển giống cao su.
Nghiên cứu này là một phần của đề tài nghiên cứu đang được thực hiện tại Viện
Nghiên Cứu Cao Su Việt Nam.
1.3. Nội dung thực hiện
- Ly trích DNA của các con lai đảm bảo được hàm lượng và độ tinh sạch cao, làm

vật liệu cho phản ứng RAPD.
- Tối ưu hóa qui trình phản ứng RAPD và điện di sản phẩm RAPD.
- Thực hiện phản ứng RAPD sử dụng 8 primer với các thành phần hóa chất và chu
trình nhiệt đã được tối ưu.
- Đánh giá biến lượng di truyền của các con lai của tổ hợp PB260 x AC55 và
PB260 x RO62/26 qua việc phân tích sản phẩm RAPD bằng các phần mềm thống kê
sinh học: NTSYSpc, Microsoft Excel.
- Đánh giá mối liên hệ giữa marker RAPD và các đặc tính nông học của các con
lai cao su.
- Tìm hiểu phương pháp đánh giá giống cao su theo các chỉ tiêu sinh trưởng, sản
lượng và kháng/nhiễm bệnh hại trong bước thí nghiệm tuyển non.

3


Chương 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu tổng quát về cây cao su
Cây cao su (Hevea brasiliensis) là một loài thuộc chi Hevea, họ Euphorbiaceae
(họ Thầu Dầu), được tìm thấy tại vùng châu thổ Amazone (Nam Mỹ). Năm 1876,
Henry Wickham đã đưa thành công hạt cao su từ Brazil sang các nước châu Á, sau đó
cây cao su được thuần hóa và trồng rộng rãi ở nhiều vùng nhiệt đới trên thế giới.
Cây cao su là loài đại mộc, sinh trưởng nhanh, trong tự nhiên có thể sống đến
100 năm và cao từ 30 – 50 m, chiếm diện tích từ 20 – 40 m2, vòng thân có thể đạt
3 – 5 m, thường là 1,5 m.
Lá cao su là lá kép 3 lá chét. Hoa nhỏ màu vàng, đơn tính đồng chu với tỷ lệ hoa đực
gấp 60 lần hoa cái, thụ phấn chéo hoặc tự thụ. Quả có 3 mảnh vỏ chứa 3 hạt, quả tự
khai. Hạt khá lớn với kích thước khoảng 2 cm, trong hạt có chứa nhiều dầu, dễ mất sức
nảy mầm. Khi trên 4 – 5 tuổi, cây cao su bắt đầu ra hoa sau thời kỳ thay lá. Trong tự
nhiên, cây cao su thụ phấn nhờ côn trùng là chủ yếu, tỷ lệ đậu trái rất thấp (dưới 3%).

Cây cao su là loài có rễ cọc rất phát triển, rễ hút tập trung chủ yếu ở tầng đất mặt,
rễ bàng phát triển rất rộng.
Nhiệt độ thích hợp nhất cho cây phát triển trong khoảng 250C – 280C. Lượng mưa
tối thiểu cần cho cây sinh trưởng và phát triển bình thường là 1.500 mm/năm.
Độ cao cũng có ảnh hưởng rất lớn đến sự sinh trưởng và phát triển của cây cao su.
Thông thường, cây cao su sẽ phát triển tốt ở độ cao dưới 200 m. Cây cao su ưa đất hơi
chua (pH đất thích hợp từ 4,5 – 5,5), tầng đất dày, không úng và địa hình ít dốc.
Cây phát triển bình thường ở nơi có tối thiểu 1.600 giờ nắng/năm, phát triển tốt ở điều
kiện gió nhẹ (vận tốc gió khoảng 3 m/s).
Chu kỳ sinh trưởng và phát triển của cây cao su được chia làm 2 giai đoạn chính:
- Thời kỳ chưa trưởng thành (giai đoạn kiến thiết cơ bản): bắt đầu từ khi trồng đến
khi khai thác mủ. Trong giai đoạn này cây sinh trưởng rất nhanh.
- Thời kỳ trưởng thành (giai đoạn kinh doanh): là giai đoạn khai thác mủ, giai đoạn
này thường kéo dài khoảng 20 – 30 năm. Giai đoạn này cây sinh trưởng chậm lại.

4


Về phương diện bệnh hại, cây cao su bị trên 550 loài vi sinh vật tấn công, trong đó
24 loài có ảnh hưởng nghiêm trọng về mặt kinh tế (Phan Thành Dũng, 2004).
Sản phẩm chủ yếu từ cây cao su là mủ cao su với các đặc tính hơn hẳn cao su tổng
hợp về độ giãn, độ đàn hồi cao, chống đứt, chống nhiệt tốt, ít phát nhiệt khi cọ xát,
dễ sơ luyện. Mủ cao su là nguyên liệu cần thiết trong công nghệ chế biến các sản phẩm
không thể thiếu được trong đời sống hằng ngày của con người như: vỏ, ruột xe, các gối
đệm chống sốc, các sản phẩm cao su xốp, dụng cụ gia đình, y tế, thể thao, ...
Ngoài ra, từ vườn cây cao su ta còn có thể thu được các sản phẩm khác như gỗ cao
su (100 – 200 m3/ha), dầu hạt cao su (700 – 1.000 kg dầu hạt/ha) và mật ong.
Bên cạnh các giá trị kinh tế, cây cao su còn có tác dụng bảo vệ môi trường sinh
thái, cải thiện các vấn đề kinh tế xã hội, góp phần bảo vệ an ninh quốc phòng
(Nguyễn Thị Huệ, 2007).

2.2. Tiến trình cải tiến giống cao su
2.2.1. Tiến trình cải tiến giống cao su trên thế giới
Hầu hết các giống cao su được trồng ở châu Á và châu Phi hiện nay đều xuất phát
từ nguồn hạt do Wickham thu thập ở Brazil đưa về trồng ở Singapore. Trong thời kỳ
đầu, cao su được trồng bằng hạt thực sinh không chọn lọc nên sản lượng rất thấp dưới
500 kg/ha (Võ Thị Thu Hà, 1996). Năm 1910, Cramer khuyến cáo chọn lọc cây đầu
dòng có năng suất cao để cung cấp hạt cho các vườn trồng mới nhằm tăng năng suất
vườn cây. Kết quả là vườn trồng từ nguồn hạt giống có chọn lọc đã tăng năng suất
đáng kể. Kể từ khi phương pháp nhân giống vô tính bằng kỹ thuật ghép mầm ngủ trên
gốc thực sinh được áp dụng thành công trên cây cao su bởi Van Helten năm 1917,
phương pháp này đã mở ra một hướng đi mới trong tạo tuyển giống cao su là tạo các
DVT. Các cây đầu dòng sẽ được nhân vô tính và qua các giai đoạn tuyển chọn,
các DVT xuất sắc sẽ được khuyến cáo cho sản xuất đại trà. Từ đó, diện tích cây cao su
ghép được phát triển nhanh chóng và thay thế dần các phương pháp trồng bằng hạt.
Công tác chọn tạo giống cao su ở hầu hết các nước đều nhắm đến mục tiêu nâng
cao sản lượng, đồng thời cải tiến những đặc tính nông học khác như sinh trưởng,
kháng bệnh, kháng gió. Những phương pháp cải tiến giống thường được các nước
trồng cao su sử dụng bao gồm chọn lọc cây đầu dòng, lai hoa nhân tạo, lai hoa tự do
trong điều kiện cách ly, đột biến và đa bội hóa nhiễm sắc thể. Trước đây, một số
phương pháp khác cũng đã được khảo nghiệm như lai liên loài, lai tự do kết hợp tạo
5


tuyển tái hồi nhưng mức độ áp dụng các phương pháp này không cao (Trần Thị Thúy
Hoa, 1998). Kỹ thuật nuôi cấy in-vitro cũng đã được áp dụng trong việc nhân giống
vô tính cây cao su nhưng vẫn còn ở mức độ thăm dò và phần lớn cây nuôi cấy mô
đang trong thời gian đánh giá ở các mức độ thí nghiệm khác nhau (Huỳnh Bảo Lam,
2004). Bên cạnh đó, phương pháp chuyển nạp gen cũng đang được nghiên cứu và
ứng dụng bước đầu trên cây cao su tại một số Viện Nghiên cứu Cao su trên thế giới
như Ấn Độ, Trung Quốc, Mã Lai (Huỳnh Bảo Lam, 2004). Tuy nhiên, cho đến nay

phương pháp lai hoa nhân tạo vẫn là phương pháp có hiệu quả nhất và được hầu hết
các nước trên thế giới áp dụng. Phương pháp này hướng đến mục tiêu tạo ra con lai
có sự kết hợp các tính trạng tốt từ bố mẹ. Các tổ hợp lai được ưu tiên gồm (1) lai
giữa các nguồn Wickham xuất sắc, (2) lai giữa nguồn Wickham và Amazone để tạo
ưu thế lai từ hai nguồn di truyền xa nhau, (3) lai lui WA với nguồn gen chọn lọc
Wickham hoặc Amazone (Trần Thị Thúy Hoa, 1998). Sau đó, các con lai sẽ được
nhân thành DVT và trải qua các bước tuyển chọn để gạn lọc ra những DVT xuất sắc.
Hiện nay, các DVT cao su được trồng ở dạng stum, bầu ghép hay bầu có 2 – 5 tầng
lá. Sự tiến bộ của công tác chọn tạo giống cũng có sự đóng góp đáng kể từ một số
ứng dụng tiến bộ của các ngành khác như: nghiên cứu giải phẫu học; nghiên cứu bộ
nhiễm sắc thể ở các loài cao su; nghiên cứu sinh lý dòng mủ; ghép tán để tăng tính
kháng bệnh lá, bệnh cành và kháng gió; và đặc biệt nghiên cứu các đặc điểm di
truyền ở cây cao su qua thống kê sinh học đã có những đóng góp nền tảng cho việc
định hướng chương trình cải tiến giống cao su.
Tuy nhiên, công tác giống cao su trên thế giới vẫn còn tồn tại một số vấn đề.
Nguồn vật liệu giống ban đầu do Wickham sưu tập rất giới hạn về mặt di truyền vì
chỉ xuất phát từ một vùng nhỏ so với diện tích phân bố tự nhiên của cây cao su, do
đó không đại diện đầy đủ cho nguồn gen của cây cao su. Nguồn di truyền hạn hẹp
này còn bị xói mòn nghiêm trọng vì mục tiêu cải tiến giống chỉ nhằm vào sản lượng
mủ. Bên cạnh đó, sự cận thân giữa các DVT vẫn còn tồn tại, khó tránh khỏi giao phối
cận huyết ở những chu kỳ kế tiếp; do vậy, tốc độ cải tiến giống suy giảm nghiêm
trọng chỉ sau 2 – 3 chu kỳ lai tạo như đã được lưu ý ở Mã Lai (Priyadarshan, 2007).
Những đợt sưu tập nguồn di truyền mới từ vùng nguyên quán Amazone trong giai
đoạn 1950 – 1980 mang tính tự phát từ các viện nghiên cứu cao su rất rời rạc và hiệu
quả sử dụng không cao (Trần Thị Thúy Hoa, 1998). Sau đợt sưu tập số lượng lớn các
6


kiểu di truyền cao su của Ủy Hội Nghiên Cứu và Phát Triển Cao Su Quốc Tế
(IRRDB) năm 1981, nguồn di truyền cây cao su đã được mở rộng đáng kể (Lại Văn

Lâm và cvt, 2005). Tuy nguồn di truyền Amazone đa dạng về số kiểu di truyền
nhưng những đánh giá ban đầu cho thấy rằng không thể sử dụng trực tiếp nguồn di
truyền này vào sản xuất. Chính vì vậy, việc gia tăng biến lượng di truyền con lai
thông qua công tác lai tạo giữa nguồn gen Wickham với nguồn gen hoang dại
Amazone đang được tăng cường. Các nghiên cứu về di truyền phân tử hỗ trợ trong
công tác lai tạo giống đã và đang được các Viện Nghiên cứu Cao su thế giới tiến
hành nhằm chọn lọc ra các tổ hợp lai tốt, có giá trị cao về mặt di truyền.
2.2.2. Tiến trình cải tiến giống cao su ở Việt Nam
Sự đa dạng nguồn di truyền ban đầu là nền tảng cho sự tiến bộ lâu dài trong công
tác tạo tuyển giống các loài cây trồng vật nuôi. Quỹ gen cao su ở Việt Nam vào giai
đoạn trước 1976 rất hạn hẹp. Từ sau 1976, VNCCSVN đã tập trung đầu tư cho công
tác cải tiến giống với quan điểm giống là yếu tố nền có tính quyết định trong hệ thống
kỹ thuật đồng bộ đối với cây cao su. Công việc đầu tiên là xây dựng quỹ gen cây cao
su theo các bước: sưu tập nguồn giống trong nước; nhập nội nguồn giống từ Sri Lanka,
Malaysia; nhận giống từ các nguồn viện trợ. Các nguồn giống này là một nguồn vật
liệu giống ban đầu tiến bộ về giá trị nông học và phong phú về di truyền cho chương
trình cải tiến giống cao su ở Việt Nam (Trần Thị Thúy Hoa, 1998). Các nguồn giống
này thuộc 3 nguồn di truyền cơ bản: nguồn di truyền Wickham, nguồn di truyền
Amazone sưu tập trong giai đoạn 1950 – 1980 và nguồn di truyền Wickham x
Amazone đã qua tuyển chọn ở các nước Nam Mỹ, Châu Phi, và vài nước Đông Nam Á
như Sri Lanka. Trong giai đoạn 1986 – 1994, quỹ gen cây cao su ở Việt Nam đã được
bổ sung đáng kể thông qua chương trình trao đổi giống song phương và đa phương và
từ Ủy Hội Nghiên Cứu và Phát Triển Cao Su thế giới với gần 3.000 kiểu di truyền
Amazone từ bộ sưu tập IRRDB’81. Quỹ gen cây cao su ở Việt Nam cũng đã được liên
tục đánh giá ở các thí nghiệm đồng ruộng nhằm lựa chọn các kiểu di truyền xuất sắc
về các đặc tính nông học phục vụ sản xuất và công tác cải tiến giống. Gần đây, các kỹ
thuật sinh học hiện đại cũng đã được ứng dụng để đánh giá sự đa dạng di truyền quỹ
gen cây cao su ở Việt Nam (Lại Văn Lâm và ctv, 2005; Lại Văn Lâm và ctv, 2009a;
Trần Thanh, 2007). Các nghiên cứu này cho thấy rằng quỹ gen cây cao su ở Việt Nam,
đặc biệt là bộ sưu tập IRRDB’81, rất đa dạng và phong phú về mặt di truyền; và rằng

7


có khả năng cải tiến nguồn di truyền hạn hẹp Wickham thông qua lai tạo với nguồn di
truyền Amazone. Nguồn quỹ gen đa dạng và phong phú này sẽ là nguồn vật liệu rất có
giá trị và đảm bảo cho công tác cải tiến giống cao su lâu dài ở Việt Nam.
Trước đây công tác tạo tuyển giống cao su ở Việt Nam được thực hiện theo
phương thức tạo giống chủ yếu dựa vào kinh nghiệm, chọn giống tốt dựa vào biểu
hiện kiểu hình trong vùng sinh thái hạn hẹp. Từ năm 1979, Viện khởi động chương
trình lai tạo giống theo mục tiêu nâng cao năng suất mủ và sản lượng gỗ, mở rộng địa
bàn ra ngoài vùng truyền thống Đông Nam Bộ (ĐNB) nhằm phát triển cây cao su
hiệu quả ở Tây Nguyên (TN), duyên hải miền Trung (DHMT) và một phần miền Bắc
(Trần Thị Thúy Hoa và ctv, 2005b). Vào năm 1984, cây cao su được phát triển mạnh
ở TN và từ năm 1990, Nhà nước chủ trương đưa lại cây cao su ra miền Trung và
miền Bắc (Mai Văn Sơn, 2001). Từ những định hướng ban đầu như vậy, VNCCSVN
đã vạch ra chương trình tạo tuyển giống với mục tiêu là tạo ra các bộ giống có đặc
tính: (1) cao sản về mủ và gỗ cho vùng truyền thống ĐNB; (2) thích nghi với điều
kiện vùng cao, nhiệt độ thấp, gió mạnh, khô hạn, đất nghèo dinh dưỡng ở ngoài vùng
truyền thống. Các quá trình cải tiến giống cao su ở Việt Nam sau đó vừa kế thừa
được những thành tựu của các nước vừa vận dụng sáng kiến cải tiến kỹ thuật trong
nước (Trần Thị Thúy Hoa, 2005a). Vận dụng những kinh nghiệm nghiên cứu từ Viện
Nghiên Cứu Cao Su Malaysia, Viện Nghiên Cứu Cao Su Châu Phi và kết hợp những
cải tiến kỹ thuật trong nước, hiện nay phương pháp tạo tuyển giống cao su của Việt
Nam là lai hoa hữu tính từ cha mẹ có chọn lọc. Phương pháp tuyển giống trải qua
bốn giai đoạn bao gồm tuyển non, sơ tuyển, chung tuyển và sản xuất thử. Cho đến
nay công tác cải tiến giống cao su tại Việt Nam đã đạt được nhiều thành tựu đáng kể
bao gồm nâng cao năng suất, tạo giống đa mục tiêu và thích ứng với nhiều vùng sinh
thái, rút ngắn qui trình tạo tuyển giống. Theo báo cáo của VNCCSVN (2008) thì cho
đến thời điểm này, tỷ lệ giống cao su nội địa gia tăng đáng kể về số lượng và qui mô
diện tích được trồng. Hướng lai tạo giống hiện nay của Viện là thực hiện các kiểu tổ

hợp lai giữa nguồn di truyền Wickham đã được thuần hóa ở châu Á và nguồn gen
hoang dại Nam Mỹ (Amazone), nhằm kế thừa các thành tựu cải tiến năng suất ở cây
cao su và khai thác tiềm năng di truyền phong phú của các nguồn gen mới, đặc biệt
khả năng sinh trưởng khỏe, ít bệnh và tính thích nghi cao. Nguồn di truyền
IRRDB’81 được đặc biệt đánh giá cao về triển vọng cải tiến biến lượng di truyền
8


quần thể và các tính trạng kinh tế và đã được đưa vào làm bố mẹ trong công tác tạo
giống từ năm 1997. Theo đánh giá kết quả lai tạo giống mới giai đoạn 1998 – 2002
thì nhóm W x A có số tổ hợp lai phong phú nhất với 62 tổ hợp trong tổng số 116 tổ
hợp lai (Lê Hoàng Ngọc Anh, 2005). Các đánh giá ban đầu dựa trên kiểu hình về
hiệu quả của các nguồn di truyền trong công tác tạo tuyển giống ở Việt Nam cho
thấy nguồn di truyền Amazone có nhiều triển vọng cho mục tiêu nâng cao sinh
trưởng (Trần Thị Thúy Hoa và ctv, 2005a; Lê Hoàng Ngọc Anh, 2005) và tính kháng
bệnh (Lại Văn Lâm và ctv, 2005; Lê Hoàng Ngọc Anh, 2005) của con lai. Hiện nay,
một số kỹ thuật sinh học phân tử cũng được nghiên cứu nhằm hỗ trợ công tác nghiên
cứu chọn tạo giống cao su, sử dụng hiệu quả nguồn di truyền sẵn có. Nghiên cứu của
Lại Văn Lâm và ctv (2005) sử dụng chỉ thị isozyme để đánh giá biến lượng di truyền
của các nhóm cao su cho thấy nhóm Wickham x Amazone có biến lượng di truyền
lớn hơn nhóm Wickham, tạo ra 41 alen so với 26 alen của nhóm Wickham. Sử dụng
chỉ thị RAPD để đánh giá biến lượng di truyền của các con lai thuộc các tổ hợp lai
Wickham x Amazone tại Viện đã cho thấy rằng biến lượng di truyền của con lai là
rất rộng và lớn hơn bố mẹ của chúng (Phạm Ngọc Chinh, 2007; Trần Thanh, 2007).
Tuy nhiên các nghiên cứu này mới chỉ dựa trên số lượng marker quá ít (2 marker
RAPD) và trên quần thể nhỏ (con lai từ vài tổ hợp lai) và cũng chưa tìm thấy sự
tương quan giữa marker và sự phân nhóm sinh trưởng và sản lượng của con lai.
Nhưng các nghiên cứu ban đầu này đã khẳng định hiệu quả của việc mở rộng biến
lượng di truyền thông qua định hướng lai tạo giữa 2 nguồn di truyền Wickham và
Amazone của Viện. Bên cạnh đó, Viện cũng tiến hành đánh giá kiểu hình trên các

giống cao su trồng ở TN, DHMT và miền Bắc để phục vụ cho định hướng mở rộng
vùng sinh thái cho cây cao su. Kết quả ban đầu cho thấy, ở TN, thời gian kiến thiết
cơ bản có thể kéo dài hơn vùng ĐNB nhưng năng suất của một số giống mới có thể
tương đương với vùng ĐNB; ở miền Trung, một số giống mới có triển vọng hơn
giống cũ về sinh trưởng và sản lượng. Các kết quả trên là cơ sở để Tổng công ty cao
su Việt Nam và Nhà nước đẩy mạnh các dự án phát triển cao su trên các vùng TN,
duyên hải miền Trung và Bắc Trung Bộ (Mai Văn Sơn, 2001). Một số đánh giá gần
đây về tiềm năng sản lượng của một số giống cao su tại vùng ít thuận lợi cho thấy
những giống đầu bảng là những giống lai tạo trong nước (Trần Thị Thúy Hoa và ctv,
2005b), điều đó cũng cho thấy định hướng lai tạo giống thích nghi với vùng ít thuận
9


lợi để mở rộng địa bàn phát triển cây cao su là có triển vọng. Triển vọng chọn tạo
cao su có khả năng thích nghi với khí hậu vùng Tây Bắc cũng đã được khẳng định
trong Định hướng phát triển cao su Việt Nam đến năm 2015 và 2020 của Bộ Nông
Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn (2008).
2.3. Các chỉ thị phân tử phổ biến
2.3.1. Marker phân tử truyền thống: Kỹ thuật RFLP (Restriction Fragment
Length Polymorphism)
RFLP được định nghĩa là tính đa hình chiều dài các phân đoạn cắt giới hạn,
biểu hiện sự khác nhau về kích thước các phân đoạn được tạo ra khi cắt DNA bằng các
enzyme cắt giới hạn (restriction enzyme – RE). Khi sử dụng một enzyme cụ thể để cắt
hệ DNA của một sinh vật nào đó sẽ tạo nên một khối các đoạn DNA với chiều dài nhất
định cho sinh vật đó. Tính chuyên biệt của kỹ thuật này được biểu hiện ở mức chỉ cần
sự thay thế của một base duy nhất tại một vị trí cũng đủ để ngăn cản quá trình cắt
DNA của enzyme sử dụng. Chỉ cần đột biến điểm (1 base) tại vị trí cắt của enzyme
giới hạn hoặc sự chèn vào hay mất đi một đoạn DNA giữa hai vị trí cắt của enzyme
giới hạn cũng đủ để tạo ra sự đa hình của các cá thể trong cùng loài. Trong thực
nghiệm, kỹ thuật RFLP được thực hiện bằng cách sử dụng một hoặc vài enzyme cắt

giới hạn để cắt toàn bộ hệ gen của từng cá thể trong quần thể nghiên cứu; sản phẩm
sau khi cắt được tách ra dựa vào kích thước của chúng bằng cách điện di trên gel
agarose; gel sẽ được thấm hút vào màng lai bằng kỹ thuật Southern – blot và lai với
những probe phát huỳnh quang chuyên biệt. Sự khác biệt về di truyền của các cá thể
trong quần thể nghiên cứu được phân biệt dựa vào số lượng và kích thước của những
đoạn DNA hiển thị sau khi lai. Ưu điểm lớn nhất của kỹ thuật RFLP là tính đồng trội
và tính ổn định của kết quả khi lặp lại nhiều lần. Tuy nhiên, kỹ thuật này đòi hỏi số
lượng lớn DNA với độ tinh sạch cao, kỹ năng cao của người thực hiện, nhiều thiết bị
dùng trong lai phân tử và tiêu tốn nhiều thời gian thực hiện.
2.3.2. Marker dựa trên kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)
2.3.2.1. Nguyên tắc của phản ứng PCR
Phản ứng PCR dựa trên sự xúc tác của enzyme DNA polymerase để khuếch đại
một đoạn DNA nhờ hai đoạn oligonucleotid (primer) tương hợp với hai đầu 3’ ở cả hai
mạch của DNA mục tiêu (target sequence). Để primer gắn được vào DNA mục tiêu,
trước tiên hai mạch của chuỗi xoắn kép phải được tách ra nhờ nhiệt độ cao, sau đó
10


nhiệt độ giảm xuống cho primer liên kết vào các mạch DNA mục tiêu theo nguyên tắc
bổ sung, cuối cùng phản ứng polymer hoá được thực hiện nhờ enzyme DNA
polymerase nối dài mạch bổ sung. Sau mỗi phản ứng (một chu kỳ) như trên số lượng
bản sao của đoạn DNA mục tiêu tăng lên gấp đôi. Do các sản phẩm mới được tổng
hợp lại được dùng làm khuôn cho primer ở phản ứng tiếp theo nên số bản sao của
DNA lại được tăng theo hàm số mũ của cơ số 2. Vì vậy sau vài chục chu kỳ từ một
phân tử DNA có thể được nhân lên hàng triệu bản sao trong vài giờ. Trong phản ứng
PCR, đoạn DNA làm khuôn và đoạn mồi quyết định tính đặc hiệu của các bản sao
được tạo ra. Một qui trình PCR chuẩn được tiến hành theo các bước như sau:
- Bước 1: Giai đoạn biến tính (Denaturation) thường là 940C – 960C trong vòng 30
giây – 1 phút. Giai đoạn này DNA từ mạch kép được tách thành mạch đơn. Chỉ ở
mạch đơn DNA mới có chức năng làm khuôn cho phản ứng trùng ngưng.

- Bước 2: Giai đoạn bắt cặp (Anealing), nhiệt độ được hạ thấp để cho các primer
gắn vào khuôn. Thông thường nhiệt độ dao động khoảng 300C – 720C tùy thuộc vào
primer, đa số là 550C. Giai đoạn này kéo dài từ 30 giây – 1 phút.
- Bước 3: Giai đoạn tổng hợp hay nối dài (Extension), lúc này nhiệt độ tăng lên đến
720C để tối ưu cho enzyme DNA polymerase. Giai đoạn này kéo dài từ 1 phút đến
nhiều phút tuỳ vào độ dài DNA cần khuếch đại.
Chu kỳ gồm 3 bước này sẽ được lặp lại nhiều lần khoảng 25 – 40 (tuỳ vào ứng dụng
chuyên biệt) để tạo ra hàng triệu bản sao của đoạn DNA mục tiêu. Cuối cùng, phản ứng
được kết thúc bằng một giai đoạn nối dài cuối cùng (final extention) ở 720C trong 5 phút,
sau đó cho dừng hẳn và có thể tồn trữ sản phẩm PCR ở nhiệt độ phòng hoặc ở 40C.
Toàn bộ phản ứng PCR được thực hiện trong vài giờ bằng máy luân nhiệt
(thermocycler) nên rất tiện lợi và không tốn nhiều công sức. Đã có nhiều loại kỹ thuật
marker phân tử được xây dựng dựa trên nền tảng kỹ thuật PCR. Ở đây, chỉ một vài kỹ
thuật thông dụng được giới thiệu.
2.3.2.2. Kỹ thuật Microsatellites (SSR – Simple Sequences Repeat)
Microsatellite hay Simple Sequences Repeat (SSR) là những đoạn DNA ổn định và
chuyên biệt có trình tự đơn giản gồm khoảng 2 – 6 nucleotide (DNA sequence motif)
được lặp lại nhiều lần. Chính sự khác nhau ở số lần lặp lại của các DNA sequence
motif này đã tạo nên những biến thiên di truyền trong quần thể. Nhiều kỹ thuật phân tử
khác nhau đã được xây dựng bằng cách thiết kế những primer chuyên biệt cho từng
11