BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÁC GIỐNG NGÔ
BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ SSR (MICROSATELLITE)

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Sinh viên thực hiện: ĐỖ PHẠM AN NHIÊN
Niên khóa: 2005 - 2009

Tháng 08/2009


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHÂN TÍCH ĐA DẠNG DI TRUYỀN CÁC GIỐNG NGÔ
BẰNG CHỈ THỊ PHÂN TỬ SSR (MICROSATELLITE)

Hướng dẫn khoa học:

Sinh viên thực hiện:

ThS. TRƯƠNG QUỐC ÁNH

ĐỖ PHẠM AN NHIÊN

ThS. ĐÀO LÊ DIỆU

Tháng 08/2009


LỜI CẢM ƠN

Con xin chân thành tri ân ba mẹ và gia đình đã nuôi nấng và cho con ăn học thành tài.
Xin chân thành cảm ơn:
 Ban Giám hiệu trường đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, các thầy cô
khoa Công nghệ Sinh học đã hỗ trợ, truyền đạt kiến thức cho tôi trong thời
gian học tập, làm việc tại trường.
 Ban Giám đốc Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam đã tạo
điều kiện cho tôi được thực tập tại viện.
 Thầy Trương Quốc Ánh (Phòng Công nghệ sinh học – Viện Khoa học Kỹ
thuật Nông nghiệp miền Nam) và cô Đào Lê Diệu (Khoa Công nghệ Sinh
học – Đại học Nông Lâm TP. HCM) đã hướng dẫn em hoàn thành khóa
luận tốt nghiệp.
 Chị Nguyễn Thị Nha Trang, anh Lý Hậu Giang (Phòng Công nghệ Sinh
học – Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền Nam) đã giúp đỡ em
thực hiện đề tài này.
 Các bạn lớp Công nghệ Sinh học - niên khóa 2005 – 2009 đã luôn chia sẻ,
giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập tại trường.

TP. Hồ Chí Minh, tháng 08/2009

Đỗ Phạm An Nhiên


iii


TÓM TẮT

Ngô là cây lương thực quan trọng đứng thứ ba sau lúa và lúa mì, được trồng nhiều
nơi trên thế giới, thích hợp trên nhiều vùng với những điều kiện đất đai, thời tiết và khí
hậu khác nhau. Theo kế hoạch, năm 2010 nước ta sẽ nâng diện tích trồng ngô lên 1,2
triệu ha, năng suất 4,5 tấn/ha và sản lượng 5,4 triệu tấn. Để có thể tăng năng suất phục
vụ cho kinh tế, cần có sự đánh giá về mức đa dạng di truyền và khoảng cách di truyền
của các giống ngô, nhằm tránh việc giảm ưu thế lai ở các thế hệ sau. Để nghiên cứu đa
dạng di truyền, nhiều phương pháp khác nhau đã được tiến hành. Trong đó, chỉ thị
SSR là một công cụ đắc lực trong việc đánh giá mức độ đa dạng di truyền bởi sự chính
xác. Vì vậy, đề tài “Phân tích đa dạng di truyền các giống ngô bằng chỉ thị SSR
(Microsatellite)” đã được thực hiện tại Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp miền
Nam từ tháng 02/2009 đến tháng 07/2009.
Để cải thiện năng suất các giống ngô thì mức độ đa dạng di truyền đóng vai trò
quan trọng. Trong nghiên cứu này, 10 giống ngô được chọn lọc để ly trích DNA. Sau
đó, thực hiện phản ứng PCR với 10 cặp mồi SSR, điện di để có được số liệu đánh giá
đa dạng di truyền.
Mức độ đa dạng di truyền giữa các giống được xác định nằm trong khoảng từ 18%
đến 89%. Cặp mồi umc1354 và phi328175 khuếch đại nhiều allele nhất với 5 allele đã
được khuếch đại. Các giống MR-07-2 và V-10-1 có khoảng cách di truyền cao nhất
(89%) được đề nghị sử dụng trong các chương trình chọn giống sau này.

iv


SUMMARY


Maize is important food ranked third after rice and wheat which is grown in many
countries in the world, relevant in many areas with different soil conditions, weather
and climate varying. Under the plan, maize cultivation area will increase 1.2 million
hectares, yielded 4.5 tons/ha and yielded 5.4 million tons to 2010. To be able to
increase economic value, need to be assessment of the genetic diversity and genetic
distance of maize varieties, to avoid reducing heterosis in future advantages in the
following. Genetic diversity analysis has been conducted with many different methods.
The molecular marker SSR is power tool to effectively assess the level of genetic
diversity by the accuracy. Therefore, research: “Genetic diversity of maize varieties
using SSR (Microsatellite)” has been conducted, that is carried out at the laboratory of
Institute of Agricultural Science for Southern VietNam from February, 2009 to July, 2009.
For improvement of maize crop presence counseling genetic diversity is very
important. This study was conducted to determine genetic diversity among 10 maize
varieties using 10 simple sequence repeat (SSR) primer sets.
Average genetic distance of 10 maize genotypes ranged from 18 to 90%. SSR
primer sets umc1354 amplified the highest of 16 alleles. One genetically most diverse
comparison (MR-07-2 and V-10-1) was identified of 90% and recommendation have
been made to use this comparison of maize genotypes in further breeding programs.

v


MỤC LỤC

LỜI CẢM ƠN................................................................................................................ iii
TÓM TẮT...................................................................................................................... iv
SUMMARY.....................................................................................................................v
MỤC LỤC ..................................................................................................................... vi
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT .......................................................................... ix
DANH SÁCH CÁC BẢNG ............................................................................................x

DANH SÁCH CÁC HÌNH..............................................................................................x
Chương 1 MỞ ĐẦU ........................................................................................................1
1.1. Đặt vấn đề.................................................................................................................1
1.2. Yêu cầu .....................................................................................................................1
1.3. Nội dung thực hiện ...................................................................................................2
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU...............................................................................3
2.1. Tổng quan về cây ngô...............................................................................................3
2.1.1. Phân loại thực vật cây ngô.....................................................................................3
2.1.2. Tình hình sản xuất ngô trên thế giới......................................................................4
2.1.3. Tình hình sản xuất ngô tại Việt Nam ....................................................................5
2.1.4. Vai trò cây ngô trong nền kinh tế ..........................................................................6
2.1.4.1. Ngô làm lương thực cho người...........................................................................6
2.1.4.2. Ngô làm thức ăn gia súc .....................................................................................6
2.1.4.3. Ngô làm thực phẩm ............................................................................................7
2.1.4.4. Ngô cung cấp nguyên liệu cho công nghiệp.......................................................7
2.1.4.5. Ngô là nguồn hàng hóa xuất khẩu ......................................................................7
2.2. Giới thiệu về đa dạng sinh học .................................................................................7
vi


2.2.1. Đa dạng sinh học ...................................................................................................7
2.2.2. Đa dạng di truyền ..................................................................................................8
2.2.3. Ý nghĩa của việc nghiên cứu đa dạng di truyền ....................................................9
2.3. Các phương pháp sử dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền...............................9
2.3.1. Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) ........................................................9
2.3.2. Kỹ thuật điện di ...................................................................................................10
2.3.3. Phương pháp chỉ thị phân tử sử dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền................11
2.3.3.1. RFLP - restriction fragment length polymorphisms.........................................12
2.3.3.2. RAPD - random amplified polymorphic DNA ................................................13
2.3.3.3. AFLP - amplified fragment length polymorphisms .........................................14

2.3.4. Giới thiệu về kỹ thuật SSR (Simple Sequence Repeats).....................................15
2.3.4.1. Các bước thực hiện kỹ thuật SSR.....................................................................15
2.3.4.2. Các loại SSR.....................................................................................................15
2.3.4.3. Thuận lợi của kỹ thuật SSR..............................................................................16
2.4. Phần mềm NTSYSpc Version 2.11X .....................................................................16
2.5. Một số nghiên cứu phân tích đa dạng di truyền các giống cây trồng .........................16
2.5.1. Ngoài nước ...........................................................................................................16
2.5.2. Trong nước ..........................................................................................................17
Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU......................................18
3.1. Thời gian và địa điểm tiến hành nghiên cứu thí nghiệm........................................18
3.2. Vật liệu ...................................................................................................................18
3.2.1. Các giống ngô dùng trong thí nghiệm .................................................................18
3.2.2. Thiết bị thí nghiệm ..............................................................................................19
3.2.3. Hóa chất thí nghiệm.............................................................................................19
3.2.3.1. Dùng trong ly trích DNA..................................................................................19
vii


3.2.3.2. Các cặp mồi dùng trong thí nghiệm .................................................................20
3.2.3.3. Hóa chất dùng trong phản ứng PCR.................................................................21
3.3. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................................21
3.3.1. Đối tượng nghiên cứu..........................................................................................21
3.3.2. Các giai đoạn thực hiện nghiên cứu ....................................................................21
3.3.3. Ly trích DNA.......................................................................................................21
3.3.4. Định tính, định lượng sản phẩm DNA ................................................................22
3.3.5. Quy trình phản ứng Microsatellite ......................................................................22
3.3.6. Điện di sản phẩm PCR ........................................................................................23
3.4. Xử lý số liệu bằng NTSYSpc Version 2.11X.........................................................23
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN......................................................................25
4.1. Kết quả....................................................................................................................25

4.1.1. Sản phẩm DNA sau khi ly trích...........................................................................25
4.1.2. Sản phẩm sau phản ứng PCR ..............................................................................25
4.1.3. Đánh giá đa dạng di truyền..................................................................................27
4.1.4. Giá trị PIC............................................................................................................29
4.2. Thảo luận ................................................................................................................30
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..........................................................................31
5.1. Kết luận...................................................................................................................31
5.2. Đề nghị ...................................................................................................................31
TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................32
PHỤ LỤC

viii


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

A

:

Ampe.

bp

:

Base pair.

CIMMYT


:

International Maize and Wheat Improvement Center.

CTAB

:

Cetyltrimethylammonium bromide.

DNA

:

Deoxyribonucleic acid.

dNTP

:

Deoxynucleotide triphosphate.

EDTA

:

Ethylene diaminetetra acetic acid.

g


:

gram.

μg

:

Microgam.

μL

:

Microlitte.

mg

:

Miligram.

OD

:

Optical density.

PCR


:

Polymerase Chain Reaction.

RNA

:

Ribonucleic acid.

RNAse

:

Ribonuclease.

SDS

:

Sodium Dodecyl Sulfate.

Tm

:

Melting temperature (nhiệt độ nóng chảy).

U


:

Đơn vị hoạt tính của Taq.

UPGMA

:

Unweighted Pair Group of Arithmetic Means.

UV

:

Ultra Violet.

V

:

Volt.

ix


DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Đặc tính phân tách của các gel agarose và polyacrylamide ..........................11
Bảng 3.1 Danh sách 10 giống ngô sử dụng trong đề tài ...............................................18
Bảng 3.2 Danh sách 10 cặp mồi được sử dụng trong đề tài..........................................20

Bảng 3.3 Thành phần các hóa chất cho 1 phản ứng PCR .............................................23
Bảng 4.1 Khoảng cách di truyền dựa vào DNA 10 giống ngô sử dụng 10 cặp mồi SSR....28
Bảng 4.2 Giá trị PIC đối với mỗi cặp mồi ....................................................................29

DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 2.1 Cây ngô Zea mays (2n=20)..............................................................................3
Hình 2.2 Diện tích, năng suất và sản lượng ngô của thế giới giai đoạn 1961-2005.......5
Hình 2.3 Diện tích, năng suất và sản lượng ngô của Việt Nam giai đoạn 1961-2005...........6
Hình 3.1 Các giống ngô được dùng trong nghiên cứu. ........................................................19
Hình 4.1 Sản phẩm ly trích DNA. ................................................................................25
Hình 4.2 Hình ảnh phản ứng khuếch đại PCR 10 kiểu di truyền sử dụng mồi umc1354....27
Hình 4.3 Sơ đồ UPGMA thể hiện mối quan hệ và độ tương đồng giữa 10 giống ngô........28

x


Chương 1
MỞ ĐẦU

1.1. Đặt vấn đề
Ngô là cây lương thực quan trọng đứng thứ ba sau lúa và lúa mì, được trồng
nhiều nơi trên thế giới, thích hợp trên nhiều vùng với những điều kiện đất đai, thời tiết
và khí hậu khác nhau. Ở Việt Nam, năng suất ngô tăng nhanh và liên tục trong suốt
hơn 20 năm qua. Năm 1980, năng suất ngô nước ta chỉ bằng 34% so với trung bình
của thế giới (1,1/3,2 tấn/ha); năm 1990 bằng 42% (1,55/3,7 tấn/ha); năm 2000 bằng
60% (2,5/4,2 tấn/ha); năm 2005 bằng 73% (3,6/4,9 tấn/ha) và năm 2007 đã đạt 81,0%
(3,96/4,9 tấn/ha). Sản lượng ngô Việt Nam vượt ngưỡng 1 triệu tấn vào năm 1994,
năm 2000 vượt ngưỡng 2 triệu tấn, và năm 2007 chúng ta đạt diện tích, năng suất và
sản lượng cao nhất từ trước đến nay: diện tích là 1.072.800 ha, năng suất 3,96 tấn/ha,
sản lượng vượt ngưỡng 4 triệu tấn, đạt được 4.250.900 tấn. Theo kế hoạch, năm 2010

nước ta sẽ nâng diện tích trồng ngô lên 1,2 triệu ha, năng suất 4,5 tấn/ha và sản lượng
5,4 triệu tấn.
Mức độ đa dạng di truyền là một chỉ tiêu quan trọng trong quá trình chọn tạo
giống vì khi các cặp cha mẹ có độ đồng nhất di truyền cao sẽ làm mất tính ưu thế lai,
có thể ảnh hưởng đến năng suất và hiệu quả kinh tế của các giống cây trồng.
Để nghiên cứu đa dạng di truyền, nhiều phương pháp khác nhau đã được ứng
dụng: phương pháp sử dụng các chỉ thị hình thái, chỉ thị isozyme hay chỉ thị DNA
(RFLP, RAPD, AFLP, SSR). Tùy vào đối tượng, điều kiện và mục đích nghiên cứu để
có phương pháp phù hợp nhất. SSR là một công cụ đắc lực trong việc đánh giá mức độ
đa dạng di truyền. Vì vậy, đề tài đã được tiến hành.
1.2. Yêu cầu
Đánh giá mức độ đa dạng di truyền giữa 10 giống ngô được chọn để thực hiện
nghiên cứu. Sử dụng 10 cặp mồi SSR để thực hiện phản ứng khuếch đại, xây dựng
phân nhóm di truyền và tính toán khoảng cách đa dạng di truyền nhằm chọn lựa các

1


cặp bố mẹ có khả năng cho ưu thế lai cao nhất, đáp ứng nhu cầu gia tăng năng suất cây
trồng, cải thiện kinh tế.
Nghiên cứu trong luận văn là một phần của đề tài “Chọn tạo giống ngô lai chịu
hạn, ngắn ngày bằng kết hợp phương pháp công nghệ sinh học (công nghệ đơn bội,
chỉ thị phân tử...) với phương pháp truyền thống” thuộc Bộ Khoa học và Công nghệ.
1.3. Nội dung thực hiện
Ly trích DNA ngô đảm bảo hàm lượng và độ tinh sạch tốt, đạt yêu cầu sử dụng
trong các phản ứng khuếch đại bằng các cặp mồi SSR.
Thực hiện phản ứng PCR với 10 cặp mồi SSR.
Đánh giá mức độ đa dạng di truyền giữa 10 giống ngô nghiên cứu từ các số liệu
thu thập được qua các kết quả thực hiện phản ứng khuếch đại bằng phầm mềm Excel,
NTSYSpc và một số công thức tính toán mức độ đa dạng di truyền.


2


Chương 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1. Tổng quan về cây ngô
2.1.1. Phân loại thực vật cây ngô
Ngô có tên khoa học là Zea mays do nhà thực vật học Thụy Điển Linnaeus đặt
theo hệ thống tên kép Hy Lạp – Latinh: Zea – từ Hy Lạp để chỉ cây ngũ cốc và mays là
từ “Mahiz” tên gọi cây ngô của người bản địa da đỏ. Cũng có thể mays là từ “Maya” –
tên một bộ tộc da đỏ ở vùng Trung Mỹ - xuất xứ của ngô. Zea thuộc chi Maydeae, họ
hòa thảo (Gramineae).

Hình 2.1 Cây ngô Zea mays (2n=20).
Tại Hoa Kỳ có một kho trung tâm các đột biến ở ngô, The Maize Genetics
Cooperation — Stock Center, do Cục Nghiên cứu Nông nghiệp của Bộ Nông nghiệp
Hoa Kỳ (USDA) thành lập và nằm tại Khoa các khoa học cây trồng của Đại học
Illinois tại Urbana-Champaign. Tổng cộng bộ sưu tập có gần 80.000 mẫu. Bộ sưu tập
này bao gồm vài trăm gen đã đặt tên, cộng với các tổ hợp gen bổ sung và các biến thể
có thể di truyền khác. Ở đây có khoảng 1.000 sai lệch nhiễm sắc thể (chẳng hạn các
hoán vị hay nghịch đảo) và các nguồn với số nhiễm sắc thể bất thường (như các dạng
tứ bội). Dữ liệu di truyền miêu tả các nguồn đột biến ở ngô cũng như vô số các dữ liệu
khác về di truyền học của ngô có thể truy cập tại MaizeGDB (Maize Genetics and
Genomics Database: Cơ sở dữ liệu di truyền học và bộ gen ngô).
3


Năm 2005, Quỹ Khoa học Quốc gia Hoa Kỳ (NSF), Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ và

Bộ Năng lượng Hoa Kỳ (DOE) đã xác định trình tự chuỗi bộ gen của ngô. Dữ liệu về
chuỗi DNA trong kết quả đã được đưa ngay vào Ngân hàng gen, kho chứa công cộng
của các dữ liệu chuỗi gen. Việc thiết lập trình tự chuỗi cho bộ gen ngô là khá khó khăn
do kích thước lớn và các sắp xếp phức tạp. Bộ gen ngô có 50.000-60.000 gen nằm rải
rác trong 2,5 tỷ bazơ - các phân tử tạo ra ADN - mỗi gen lại có 10 nhiễm sắc thể.
Từ loài Zea mays, dựa vào cấu trúc nội nhũ của hạt được phân thành các loài phụ.
Những loài phụ chính bao gồm:
Zea mays

subsp.indurata

sturt - ngô đá.

Zea mays

subsp.indentata

sturt - ngô răng ngựa.

Zea mays

subsp.ceratina

kulesh - ngô nếp.

Zea mays

subsp.saccharata

sturt - ngô đường.


Zea mays

subsp.everta

sturt - ngô nổ.

Zea mays

subsp.amylacea

sturt - ngô bột.

Zea mays

subsp.tunecata

sturt - ngô bọc.

Sau đó dựa vào màu hạt và màu lõi để phân thành các thứ (varieta).
2.1.2. Tình hình sản xuất ngô trên thế giới
Ngô là cây lương thực quan trọng đứng thứ ba sau lúa và lúa mì, được trồng nhiều
nơi trên thế giới, thích hợp trên nhiều vùng với những điều kiện đất đai, thời tiết và khí
hậu khác nhau. Ngành sản xuất ngô của thế giới tăng liên tục, nhất là trong hơn 40
năm gần đây. Nhờ ứng dụng ưu thế lai trong nghiên cứu và trồng ngô, cùng với những
thành tựu mới trong chọn tạo giống ngô lai nhờ kết hợp phương pháp truyền thống với
công nghệ sinh học mà năng suất ngô của thế giới tăng liên tục. Năng suất chỉ chưa
đến 2 tấn/ha từ năm 1961, năm 2004 đã đạt 4,99 tấn/ha và đến năm 2007 diện tích ngô
đã vượt qua lúa nước với 157 triệu ha, năng suất trung bình 4,9 tấn/ha và sản lượng đạt
kỷ lục 766,2 triệu tấn (USDA 2007). Nhờ ứng dụng rộng rãi về ưu thế lai trong nghiên

cứu và trồng ngô, đồng thời không ngừng cải thiện các biện pháp kỹ thuật canh tác.
Đặc biệt, từ 10 năm nay, cùng với những thành tựu mới trong chọn tạo giống ngô lai
nhờ kết hợp phương pháp truyền thống với công nghệ sinh học.
4


Với 52% diện tích trồng bằng giống được tạo ra bằng công nghệ sinh học, năng
suất ngô nước Mỹ năm 2005 đạt hơn 10 tấn/ha trên diện tích 30 triệu hecta. Năm 2007,
diện tích trồng ngô chuyển gen trên thế giới đã đạt 35,2 triệu ha, riêng ở Mỹ đã lên đến
27,4 triệu ha, chiếm 73% trong tổng số hơn 37,5 triệu ha ngô của nước này

800

5

700

4,5
4

600

3,5

500

3

400


2,5

300

2

200
100
0

N ă n g s u ấ t (tấ n /h a )

S ả n lư ợ n g (triệ u tấ n )

(GMO.COMPASS).

1,5

Sản lượng (1000 tấn)

1

Diện tích (1000 ha)

0,5

Năng suất (tấn/ha)

0
1961


1965

1970

1975

1980

1985

1990

1995

2000

2005

Năm

Hình 2.2 Diện tích, năng suất và sản lượng ngô của thế giới giai đoạn 1961-2005.
2.1.3. Tình hình sản xuất ngô tại Việt Nam
Từ giữa những năm 1980, nhờ hợp tác với Trung tâm Cải tạo Ngô và Lúa mỳ
Quốc tế (CIMMYT), nhiều giống ngô cải tiến đã được đưa vào trồng ở nước ta, góp
phần tăng năng suất lên gần 1,5 tấn/ha vào đầu những năm 1990. Năm 2007 giống ngô
lai đã chiếm khoảng 95% trong số hơn 1 triệu hecta.
Ở Việt Nam, năng suất ngô tăng nhanh và liên tục trong suốt hơn 20 năm qua.
Năm 1980, năng suất ngô nước ta chỉ bằng 34% so với trung bình của thế giới (1,1/3,2
tấn/ha); năm 1990 bằng 42% (1,55/3,7 tấn/ha); năm 2000 bằng 60% (2,5/4,2 tấn/ha);

năm 2005 bằng 73% (3,6/4,9 tấn/ha) và năm 2007 đã đạt 81,0% (3,96/4,9 tấn/ha). Sản
lượng ngô Việt Nam vượt ngưỡng 1 triệu tấn vào năm 1994, năm 2000 vượt ngưỡng 2
triệu tấn, và năm 2007 chúng ta đạt diện tích, năng suất và sản lượng cao nhất từ trước
đến nay: diện tích là 1.072.800 ha, năng suất 3,96 tấn/ha, sản lượng vượt ngưỡng 4
5


triệu tấn, đạt được 4.250.900 tấn. Theo kế hoạch, năm 2010 nước ta sẽ nâng diện tích

4.000

4,00

3.500

3,50

3.000

3,00

2.500

2,50

2.000

2,00

1.500


1,50

1.000

1,00

500

0,50

0

0,00

N ăng suất (tấn/ha)

Sản lư ợ ng (1000 tấn)

trồng ngô lên 1,2 triệu ha, năng suất 4,5 tấn/ha và sản lượng 5,4 triệu tấn.

Diện tích (1000 ha)
Sản lượng (1000 tấn)
Năng suất (tấn/ha)

1961 1965 1970 1975 1980 1985 1990 1995 2000 2005

Năm

Hình 2.3 Diện tích, năng suất và sản lượng ngô của Việt Nam giai đoạn 1961-2005.

2.1.4. Vai trò cây ngô trong nền kinh tế
2.1.4.1. Ngô làm lương thực cho người
Ngô là cây lương thực nuôi sống gần 1/3 số dân trên toàn thế giới, tất cả các nước
trồng ngô nói chung đều ăn ngô ở mức độ khác nhau. Toàn thế giới sử dụng 21% sản
lượng ngô làm lương thực cho người. Các nước ở Trung Mỹ, Nam Á và châu Phi sử
dụng ngô làm lương thực chính. Các nước Đông Nam Phi sử dụng 85% sản lượng ngô
làm lương thực cho người, Tây Trung Phi 80%, Bắc Phi 42%, Tây Á 75%, Đông Nam
Á và Thái Bình Dương 39%, Đông Á 30%, Trung Mỹ và vùng Caribe 61%, Nam Mỹ
12%, Đông Âu và Liên Xô cũ 4%, các nước thị trường chung phát triển 14%. Nếu như
ở châu Âu khẩu phần cơ bản là: bánh mì, khoai tây, sữa; châu Á: cơm, cá, rau xanh thì
ở châu Mỹ Latinh là bánh ngô, đậu đỗ và ớt. Vì vậy trên phạm vi thế giới mà nói, ngô
sẽ vẫn còn là cây lương thực rất quan trọng, vì ngô rất phong phú các chất dinh dưỡng
hơn lúa mì và gạo.
2.1.4.2. Ngô làm thức ăn gia súc
Phải nói ngô là cây thức ăn gia súc quan trọng nhất hiện nay. Hầu như 70% chất
tinh trong thức ăn tổng hợp là từ ngô, điều đó phổ biến trên toàn thế giới. Ngoài việc
6


cung cấp chất tinh, cây ngô còn là thức ăn xanh và ủ chua lý tưởng cho đại gia súc, đặc
biệt là bò sữa. Ở Liên Xô cũ hàng năm trồng khoảng 20 triệu ha ngô, trong đó chỉ có 3
triệu ha lấy hạt, còn lại dùng làm thức ăn ủ chua.
2.1.4.3. Ngô làm thực phẩm
Những năm gần đây, cây ngô còn là cây thực phẩm, người ta dùng bắp ngô bao tử
làm rau cao cấp. Nghề này phát triển rất mạnh mang lại hiệu quả cao ở Thái Lan, Đài
Loan. Sở dĩ ngô rau được ưa dùng vì nó sạch và có hàm lượng dinh dưỡng cao Các thể
loại ngô nếp, ngô đường (ngô ngọt) được dùng làm ăn tươi (luộc, nướng) hoặc đóng
hộp làm thực phẩm xuất khẩu.
2.1.4.4. Ngô cung cấp nguyên liệu cho công nghiệp
Ngoài việc ngô là nguyên liệu chính cho các nhà máy thức ăn gia súc tổng hợp,

ngô còn là nguyên liệu cho các nhà máy sản xuất rượu cồn, tinh bột, dầu, glucoza,
bánh kẹo… Người ta đã sản xuất ra khoảng 670 mặt hàng khác nhau của các ngành
công nghiệp lương thực, thực phẩm, công nghiệp dược và công nghiệp nhẹ.
2.1.4.5. Ngô là nguồn hàng hóa xuất khẩu
Trên thế giới, hàng năm lượng ngô xuất nhập khẩu là khoảng 70 triệu tấn. Đó là
một nguồn lợi lớn của các nước xuất khẩu. Các nước xuất khẩu chính là Mỹ, Pháp,
Argentina, Trung Quốc, Thái Lan. Các nước nhập chính là Nhật Bản, Hàn Quốc, Liên
Xô cũ, châu Phi, Mexico…
2.2. Giới thiệu về đa dạng sinh học
2.2.1. Đa dạng sinh học
Đa dạng sinh học (Biodiversity) là sự giàu có, phong phú và đa dạng về nguyên
liệu di truyền, về loài và các hệ sinh thái (Lê Trọng Cúc; 2002).
Định nghĩa do Quỹ bảo tồn thiên nhiên thế giới (1989) đề xuất như sau: “Đa dạng
sinh học là sự phồn thịnh của sự sống trên trái đất, là hàng triệu loài thực vật, động vật
và vi sinh vật, là những gene chứa đựng trong các loài và là những hệ sinh thái vô
cùng phức tạp cùng tồn tại trong môi trường”.
Do vậy đa dạng sinh học được xem xét theo 3 mức độ:

7


- Đa dạng sinh học ở cấp độ loài bao gồm toàn bộ các sinh vật sống trên trái đất,
từ vi khuẩn đến các loài thực vật, động vật và các loài nấm.
- Đa dạng sinh học ở mức độ gen là sự khác biệt gen giữa các loài, giữa các quần
thể sống cách ly về địa lý cũng như các cá thể cùng chung sống trong một quần thể.
- Đa dạng sinh học còn bao gồm sự khác biệt giữa các quần xã mà trong đó
các loài sinh sống và các hệ sinh thái, nơi mà các loài cũng như các quần xã sinh
vật tồn tại và cả sự khác biệt của mối tương quan giữa chúng với nhau (Phạm
Bình Quyền, 2002).
Ngoài ra đa dạng sinh học còn liên quan đến việc phân bố địa lý. Đây là sự phân

biệt có tầm rộng và là chiến lược nghiên cứu của nhiều nước trên thế giới.
2.2.2. Đa dạng di truyền
Sự đa dạng về di truyền là phân mức cơ bản nhất trong đa dạng sinh học, tạo nên
sự khác biệt của các cá thể trong quần thể và nghiên cứu về đa dạng di truyền cũng là
các nghiên cứu cơ bản và chính xác nhất sự khác biệt về loài.
Sự đa dạng về mặt di truyền trong loài thường bị ảnh hưởng bởi những tập tính
sinh sản của các cá thể trong quần thể. Một quần thể là một nhóm cá thể giao phối
được với nhau tạo ra con lai hữu thụ; trong loài bao gồm một hay nhiều quần thể.
Các cá thể trong một quần thể thường có bộ gene khác nhau. Sự đa dạng về bộ
gene này là do các cá thể có các gene khác nhau, dù chỉ là rất ít; gene là đơn vị di
truyền cùng với nhiễm sắc thể đặc trưng cho những protein riêng biệt.
Những hình thái khác nhau của gene được thể hiện bằng những alleles và những
khác biệt do sự đột biến. Những alleles khác nhau của một gene có thể ảnh hưởng đến
sự phát triển và đặc điểm sinh lý của mỗi cá thể theo cách khác nhau.
Những sự khác biệt về gene trong di truyền học được tăng dần khi con cái nhận
đầy đủ tổ hợp gene và nhiễm sắc thể của bố mẹ thông qua sự tái tổ hợp của các gene
trong quá trình sinh sản. Các gene trao đổi trong quá trình giảm phân và một tổ hợp
mới được thiết lập khi nhiễm sắc thể của cả bố và mẹ kết hợp thành một tổ hợp thống
nhất mới cho con cái.

8


Tổng các gene và allele trong một quẩn thể là vốn gene của quần thể và những tổ
hợp của các allele mà mỗi cá thể có được gọi là kiểu di truyền (genotype). Kiểu hình
(phenotype) của mỗi cá thể được biểu hiện bởi các tính chất về hình thái, sinh lý, hoá
sinh và được đặc trưng bởi các kiểu di truyền trong từng môi trường nhất định.
Số lượng khác biệt nhau về gene trong một quần thể được xác định bởi số gene
trong vốn gene đó, thường mỗi gene có nhiều hơn một allele (các gene đa hình) và số
các allele cho mỗi một gene đa hình. Sự tồn tại của các gene đa hình cho phép các cá

thể trong quần thể có thể có kiểu gene dị hợp tử, có nghĩa là cá thể nhận được những
alleles khác nhau từ các gene của mỗi bố mẹ. Sự khác biệt về gene cho phép các loài
thích ứng được với sự thay đổi của môi trường.
2.2.3. Ý nghĩa của việc nghiên cứu đa dạng di truyền
Đa dạng sinh học rất cần thiết cho sự tồn tại của các loài, các quần xã tự nhiên và
nó cũng quan trọng đối với con người.
Sự đa dạng di truyền là cần thiết cho tất cả sinh vật để duy trì nòi giống, kháng
với các loại dịch bệnh và thích nghi với những thay đổi của môi trường.
Sự đa dạng di truyền của cây trồng và vật nuôi có giá trị đặc biệt trong chọn tạo
giống cây trồng, vật nuôi mới phục vụ lợi ích của con người.
2.3. Các phương pháp sử dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền
2.3.1. Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)
Phương pháp PCR (phản ứng chuỗi polymerase) do Karl Mullis và cộng sự phát
minh 1985. Nhờ enzyme DNA polymerase xúc tác, trên các mạch khuôn DNA tổng
hợp nên các mạch đơn mới. Các mạch đơn mới được tổng hợp lại được sử dụng làm
khuôn cho quá trình tổng hợp mạch mới theo chu kỳ tiếp theo. Sự tổng hợp mạch đơn
DNA mới cần có sự tham gia của DNA mồi tạo các nhóm 3’OH tự do. Các nucleotide
được gắn ở vị trí nhóm OH kéo dài thành mạch đơn mới.
Phản ứng PCR được thực hiện với các thành phần: khuôn DNA, enzyme DNA
polymerase, mồi, các loại nucleotide, MgCl2, dung dịch đệm. Phản ứng PCR được
thực hiện qua các bước thay đổi nhiệt độ bằng máy luân nhiệt (thermocycler).

9


Ưu điểm: thời gian thực hiện nhanh, chỉ cần 3 giờ là có thể khuếch đại được một
trình tự đáng quan tâm, thực hiện đơn giản và ít tốn kém, yêu cầu về độ tinh sạch của
mẫu không cao.
Nhược điểm: cần phải có DNA mồi đặc trưng cho DNA cần khuếch đại. Để có
đoạn mồi này ít nhất phải biết trước trình tự nucleotide cần khuếch đại. Kích thước

DNA cần khuếch đại không vượt quá 3 kb. Khả năng ngoại nhiễm lớn (do thao tác
nhiều lần). Sai sót còn do sử dụng Enzyme Taq DNA polymerase khoảng 104 (sai sót
cho một lần sao chép) (Trần Thị Xô, Nguyễn Thị Lan, 2005).
2.3.2. Kỹ thuật điện di
Điện di là kỹ thuật được sử dụng trong thí nghiệm để phân tích các đại phân tử
tích điện. Trong phòng thí nghiệm sinh học phân tử người ta thường sử dụng phương
pháp điện di để tách ly, phát hiện phân tử DNA nguyên vẹn, DNA bị cắt hạn chế và
DNA của sản phẩm PCR.
Hệ thống điện di bao gồm nguồn điện, buồng điện di, khuôn đổ gel và hệ thống
soi chụp ảnh. Các bước được tiến hành như sau:
- Cân agarose cho vào dung dịch đệm TBE (Tris-borate-EDTA) hoặc TAE (Trisacetate-EDTA) ở nhiệt độ phòng, khuấy đều và để yên 1 phút, cho vào lò viba (làm
nóng chảy gel và không tạo bọt).
- Làm nguội gel xuống 50 – 55oC, đổ gel vào khuôn gel và lắp lược.
- Khi gel nguội, tháo lược, đặt khuôn gel vào buồng điện di và đổ đệm chạy vào
khay gel sao cho đệm cao hơn mặt gel khoảng 2 – 5 mm.
- Nạp DNA mẫu và DNA chuẩn vào các giếng, đậy nắp và cắm điện cực.
- Chọn hiệu điện thế, cường độ dòng điện và thời gian chạy điện di.
- Chụp hình ảnh gel dưới ánh sáng UV để xem kết quả.
Lưu ý: tùy thuộc vào kích thước của DNA mẫu mà người ta chọn loại gel
(agarose, polyacrylamid), nồng độ gel, loại đệm (TBE hoặc TAE). Đệm TAE cho độ
phân giải cao các phân đoạn lớn hơn 4 kb, trong khi đệm TBE có phân giải cao từ 0,1
đến 3 kb. Ngoài ra, độ phân giải các phân đoạn DNA còn phụ thuộc vào phương pháp
điện di, tối ưu điện thế, tối ưu lượng DNA nạp và đệm nạp.
10


Bảng 2.1 Đặc tính phân tách của các gel
agarose

và


polyacrylamide

(Schleif

và

Wensink, 1981)
Loại gel

Phạm vi phân tách (bp)

0,3 % agarose

50.000 đến 1.000

0,7 % agarose

20.000 đến 300

1,4 % agarose

6.000 đến 300

4 % acrylamide

1.000 đến 100

10 % acrylamide


500 đến 25

20 % acrylamide

50 đến 1

Thuốc nhuộm ethidium bromide là một thuốc nhuộm huỳnh quang mà có thể nhận
biết cả hai loại DNA sợi đơn và sợi kép. DNA nhuộm ethidium bromide được nhận
biết bằng tia cực tím. Tại bước sóng 254 nm, ánh sáng UV được hấp thụ bởi DNA và
chuyển sang thuốc nhuộm. Tại bước sóng 302 nm và 366 nm, ánh sáng UV được hấp
thụ bởi chính thuốc nhuộm. Trong cả hai trường hợp, năng lượng được phát xạ ứng với
tia tại bước sóng 590 nm trong vùng vàng đỏ của quang phổ thấy được. Ethidium
bromide là chất gây đột biến mạnh, cần phải mang găng tay khi thao tác với dung dịch
thuốc nhuộm này và các gel nhuộm. Để tạo độ phân giải cao rõ nét, các vạch và nền
nhạt nên nhuộm gel với ethidium bromide ngay sau khi điện di (Trần Thị Xô, Nguyễn
Thị Lan, 2005).
2.3.3. Phương pháp chỉ thị phân tử sử dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền
Về căn bản, bất cứ chuỗi mã DNA nào được dùng để phân biệt giữa hai cá thể, hai
dòng hoặc giống khác nhau, đều có thể được xem như là một chỉ thị phân tử. Các chỉ
thị phân tử có thể chia thành 2 nhóm sau (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 2004):
Chỉ thị dựa trên cơ sở chuỗi phản ứng polymerase (PCR - Polymerase Chain
Reaction) (PCR-based): RAPD, AFLP, SSR, SSCP, STS.
Đòi hỏi: DNA mục tiêu, Taq polymerase, các đoạn mồi (7 – 30 Nu), dNTP + Mg++.
11


Đặc điểm: không đòi hỏi chất lượng DNA cao, nhanh chóng, rẻ tiền, dễ bị hư
hỏng, dễ bị nhiễm, điều kiện hoạt động phải thuận lợi, dễ kiểm soát.
Chỉ thị trên cơ sở đánh dấu thăm dò và lai DNA (DNA / DNA hydridizationbased): RFLP, minisatellite.
2.3.3.1. RFLP - restriction fragment length polymorphisms

RFLP được định nghĩa là tính đa hình chiều dài các phân đoạn cắt giới hạn, biểu
hiện sự khác nhau về kích thước các phân đoạn được tạo ra khi cắt DNA bằng các
enzyme cắt giới hạn khi có sự thay đổi trình tự trên DNA bộ nhân hoặc trong các bào
quan khác.
RFLP là kỹ thuật được sử dụng phổ biến nhất hiện nay. Nguyên tắc của kỹ thuật
này dựa trên độ đặc hiệu của các enzyme cắt hạn chế (RE) đối với vị trí nhận biết của
chúng trên DNA bộ gen. DNA bộ gen sẽ được cắt bằng các enzyme cắt giới hạn, chạy
điện di qua gel agarose, thấm qua màng lai và lai với một mẫu dò DNA (được đánh
dấu phóng xạ) liên kết với một locus đặc biệt. Sự khác biệt vị trí cắt giữa hai cá thể sẽ
tạo ra những phân đoạn cắt khác nhau.
RFLP có ưu điểm là chỉ thị đồng trội cho phép phân biệt được cá thể đồng hợp và
dị hợp. Do kích thước DNA khảo sát trong RFLP lớn vì vậy số lượng chỉ thị tạo ra
nhiều đủ đáp ứng nhu cầu nghiên cứu. Tuy nhiên do qui trình thực hiện phức tạp, nguy
hiểm đối với sức khoẻ người nghiên cứu (sử dụng phóng xạ đánh dấu), DNA yêu cầu
có chất lượng cao đã làm hạn chế việc sử dụng kỹ thuật này.
Cùng với sự phát triển kỹ thuật PCR, kỹ thuật RFLP trở nên đơn giản hơn. Một
cặp mồi oligonucleotide có thể dùng khuếch đại một vùng DNA cần khảo sát, sau đó
đoạn DNA được khuếch đại được cắt bằng các RE, điện di và phân tích trên gel
nhuộm ethidium bromide hoặc bạc. PCR-RFLP bỏ qua bước lai nên giá thành rẻ hơn
và ít nguy hiểm hơn phương pháp RFLP.
RFLP được ứng dụng trong nghiên cứu đa dạng và hệ thống phát sinh loài. RFLP
được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu lập bản đồ gene (Neale và Williams 1991).
RFLP cũng được sử dụng để kiểm tra mối quan hệ giữa các giống cây trồng (Miller và
Tanksley, 1990; Lanner và cộng sự, 1997), nghiên cứu đa dạng di truyền (Debreuil và

12


cộng sự, 1996), sự lai giống và chuyển nạp gene (Brubaker và Wendel, 1994; Clausen
và Spooner, 1998; Desplanque và cộng sự, 1999).

RFLP là phương pháp được sử dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền giữa các
giống Pennisetum glaucum (Gepts và Clegg, 1989) và những loài của Lycopersicon
(Miller và Tanksley, 1990). RFLP cũng được sử dụng để nghiên cứu sự khác biệt giữa
hơn 50 loại cây trồng; bao gồm: lúa mạch, bắp, đậu lupin và cây thông (Solitis và cộng
sự, 1992).
2.3.3.2. RAPD - random amplified polymorphic DNA
RAPD được định nghĩa là sự đa hình các đoạn DNA được khuếch đại ngẫu
nhiên. PCR - RAPD thực hiện dựa trên cơ sở sự bắt cặp ngẫu nhiên của các mồi
đơn ngắn (10 nucleotide) với mạch khuôn. Các đoạn mồi oligonucleotide nếu bắt
cặp ngẫu nhiên với cả hai mạch đối diện của mạch khuôn DNA trong khoảng cách
có thể khuếch đại được (dưới 3000bp) sẽ cho ra những đoạn DNA có kích thước
khác nhau sau khi khuếch đại.
Sự có mặt của các sản phẩm DNA khác nhau chứng tỏ đã có một sự tương đồng
hoàn toàn hay một phần giữa DNA bộ gen và mồi. Các mồi dùng trong RAPD thường
ngắn vì vậy dễ dàng tìm được các đoạn tương đồng trên mạch đơn DNA bộ gen. Do đó
tính đa dạng thu được nhờ RAPD là đáng tin cậy, vì khi có sự thay đổi một baze nào
đó thì nó sẽ ngăn cản việc tiếp hợp giữa mồi và DNA mạch khuôn. Sự mất đoạn nhiễm
sắc thể hoặc sự thêm bớt điểm gắn mồi cũng như sự xen vào của một gen nào đó sẽ
làm thay đổi kích thước đoạn DNA được khuếch đại.
Nguyên tắc phản ứng RAPD cũng như nguyên tắc phản ứng PCR thông thường.
Tuy nhiên, vì sử dụng mồi ngẫu nhiên nên nhiệt độ bắt cặp của mồi thấp để tạo điều
kiện bắt cặp không nghiêm ngặt. Nhiệt độ bắt cặp của phản ứng là 30oC-36oC. Chính
vì yếu tố đặc hiệu thấp nên kết quả RAPD thường có độ lặp lại không cao và khó tối
ưu phản ứng. Đây chính là trở ngại lớn nhất của RAPD vì kết quả phụ thuộc rất nhiều
yếu tố như thành phần phản ứng PCR (đặc biệt là thành phần Mg2+ và chất lượng DNA
bản mẫu), các thiết bị cũng như thao tác thí nghiệm. Ngoài ra RAPD là một marker
trội do đó những gen điều khiển tính trạng lặn sẽ khó tìm thấy sự đa hình trong điện di.

13



RAPD được sử dụng trong nhiều mục đích, nghiên cứu mức độ đồng nhất di
truyền. RAPD cũng được sử dụng trong nghiên cứu bản đồ gene (Williams và
cộng sự, 1990; Hadrys và cộng sự, 1992).
Chalmers và cộng sự (1992) đã sử dụng kỹ thuật RAPD trong nghiên cứu đa
dạng di truyền giữa hai loài đậu: Gliricidia sepium và G. Maculata. Mosseler và
cộng sự (1992) cũng áp dụng marker RAPD để đánh giá mức độ đa dạng giữa
các giống thông đỏ.
2.3.3.3. AFLP - amplified fragment length polymorphisms
AFLP – đa hình chiều dài các đoạn DNA được khuếch đại chọn lọc, do Vos và
cộng sự phát minh, 1975. Nguyên tắc của phương pháp AFLP giống như RFLP, điểm
khác biệt cơ bản là AFLP không cần phải tiến hành lai phân tử (lai Southern blot), do
vậy thực hiện nhanh hơn.
AFLP được định nghĩa là sự đa hình các đoạn cắt khuếch đại, là kỹ thuật kết hợp
giữa RFLP và PCR. AFLP sử dụng enzyme cắt giới hạn cắt DNA bộ gen, sử dụng
những phân đoạn DNA làm khuôn cho phản ứng khuếch đại PCR. AFLP có thể dùng
để phân biệt các cá thể rất gần nhau, thậm chí ngay cả những dòng đẳng gen. Sự khác
nhau trong chiều dài các đoạn khuếch đại có thể do những thay đổi của các base trong
vùng trình tự mồi, hoặc thêm, mất đoạn ở giữa hai vị trí cắt.
Thông thường, RE sử dụng trong AFLP là một cặp enzyme, một enzyme cắt
thường xuyên (tạo ra những trình tự nhỏ) và một enzyme cắt không thường xuyên
(nhằm hạn chế số lượng các đoạn cắt). Cặp enzyme thường được dùng nhất là EcoRI MseI. Sau khi cắt bằng cặp enzyme này, một trình tự nối mạch đôi (adaptor) sẽ được
gắn vào hai đầu đoạn DNA cắt bằng enzyme ligase. Đoạn adaptor gồm 2 phần: phần
trình tự lõi và phần trình tự đặc hiệu cho vị trí cắt enzyme. Mồi của phản ứng PCR
được thiết kế dựa trên trình tự adaptor và chứa một trình tự chọn lọc khoảng vài
nucleotide. Chỉ những phân đoạn DNA nào chứa cả trình tự adaptor và trình tự
nucleotide chọn lọc mới được khuếch đại, chính trình tự chọn lọc sẽ làm giảm sự xuất
hiện sản phẩm PCR và làm đơn giản quá trình phân tích.
AFLP nhanh, đơn giản không phức tạp như RFLP nhưng vẫn khảo sát được toàn
bộ gen. Kỹ thuật này đòi hỏi ít lượng DNA ban đầu, không cần biết trước trình tự đích

14


và độ lặp lại phản ứng cao, các mồi sử dụng không cần đặc hiệu loài (các mồi thương
mại có thể dùng cho hầu hết các loài). Tuy nhiên AFLP là một marker trội, điều này
làm hạn chế phân biệt cá thể đồng hợp và dị hợp.
AFLP được ứng dụng trong nghiên cứu tính đồng nhất di truyền, nguồn gốc tổ
tiên, nhận dạng các dòng giống cây trồng. AFLP là một công nghệ có giá trị trong việc
nghiên cứu bản đồ gene (Vos và cộng sự, 1995).
2.3.4. Giới thiệu về kỹ thuật SSR (Simple Sequence Repeats)
SSR – là kỹ thuật khuếch đại các đoạn lặp lại đơn giản, còn gọi là phương pháp
vi vệ tinh hay tiểu vệ tinh (Microsatellite). Bộ gene eukaryote có nhiều đoạn DNA
lặp lại, các đoạn lặp DNA có kích thước dài ngắn khác nhau tùy theo từng loài,
từng giống. Các đoạn DNA lặp lại thường nằm gần tâm động hoặc đầu mút của các
nhiễm sắc thể, có thể có vai trò giữ tính ổn định của bộ nhiễm sắc thể, trong các
quá trình phân bào.
Sử dụng các mồi đơn giản để khuếch đại các đoạn DNA lặp lại. Dựa vào kết quả
thu được về độ dài các đoạn lặp DNA khác nhau, số lượng các đoạn lặp DNA khác
nhau giữa các giống động vật, thực vật và vi sinh vật có thể xác định được mức độ đa
dạng di truyền của các mẫu so sánh.
2.3.4.1. Các bước thực hiện kỹ thuật SSR
Tách chiết và tinh sạch DNA của các mẫu nghiên cứu.
Thực hiện phản ứng nhân gen qua PCR với các mồi đặc trưng cho các đoạn lặp
đơn giản.
Điện di kết quả trên gel agarose và tính toán số liệu, xác định mức độ giống và
khác nhau giữa các đoạn lặp DNA.
Xử lý số liệu bằng Map Marker Program, SYSTAT hay NTSYSpc…, lập bản đồ
di truyền và dựng cây phát sinh chủng loại (Khuất Hữu Thanh, 2006).
2.3.4.2. Các loại SSR
Căn cứ vào cấu tạo của đơn vị lặp lại (2-6 lần), có các loại SSR như sau:

Dinucleotide SSR (GT)6, Trinucleotide SSR (CTG)4, Tetranucleotide SSR (ACTC)4.

15