BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
KHẢO SÁT MẬT ĐỘ CỦA FAECAL COLIFORMS
Escherichia coli, Salmonella TRONG THỊT NGHÊU
TẠI CẦN GIỜ - TP. HỒ CHÍ MINH VÀ
BÌNH ĐẠI, BA TRI - TỈNH BẾN TRE

Ngành học
Sinh viên thực hiện
Niên khóa

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
: ĐỖ MINH TẤN
: 2005 – 2009

Tháng 08 năm 2009


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT MẬT ĐỘ CỦA FAECAL COLIFORMS
Escherichia coli, Salmonella TRONG THỊT NGHÊU
TẠI CẦN GIỜ - TP. HỒ CHÍ MINH VÀ
BÌNH ĐẠI, BA TRI - TỈNH BẾN TRE

Hướng dẫn khoa học
ThS. NGUYỄN TIẾN DŨNG
CN. HỒ THANH BÁ

Tháng 08/2009

Sinh viên thực hiện
ĐỖ MINH TẤN


LỜI CẢM ƠN
Để có điều kiện học tập và hoàn tất cuốn luận văn tốt nghiệp này tôi xin chân
thành gửi lời cảm ơn đến:
Con thành kính ghi ơn cha mẹ và gia đình đã không quãng gian khó nuôi dưỡng,
dạy dỗ và tạo điều kiện tốt nhất cho con nên người.
Ban Giám Hiệu trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, Ban chủ
nhiệm Bộ môn Công nghệ Sinh học, cùng tất cả Quý Thầy Cô đã truyền đạt kiến thức
cho tôi trong suốt quá trình học tập tại trường.
Thạc sĩ Nguyễn Tiến Dũng, Cử nhân Hồ Thanh Bá đã tận tình hướng dẫn và tạo
điều kiện tốt để tôi hoàn thành luận văn này.
Chú Quang – Phó Chủ nhiệm (PCN) HTX Rạng Đông – Bình Đại, anh Long –
bảo vệ bãi nghêu cùng Ban Chủ Nhiệm HTX Rạng Đông; Chú Tuấn – Chủ nhiệm
(CN), Chú Ngà – PCN, Chú Nhỏ - PCN,… cùng Ban Chủ Nhiệm và đội bảo vệ bãi
nghêu tại HTX An Thủy – Ba Tri; Chú 4 Thành – Bảo vệ bãi nghêu cùng ban quản lý
HTX Hội Cựu Chiến Binh Cần Thạnh – Cần Giờ; Chú Bân, Chú Sơn – quản lý bãi
nghêu Sân Vàm – Đồng Hòa – Cần Giờ… đã tạo mọi điều kiện tốt nhất cho công tác
lấy mẫu của tôi được thuận lợi.
Thầy Nguyễn Văn Lẫm – quản lý phòng phân tích vi sinh I5 – ĐH Nông Lâm
Tp. Hồ Chí Minh đã tận tình giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành đề

tài tại phòng I5.
Cùng tất cả các bạn lớp DH05SH nói chung và các thành viên của lớp làm đề
tài phòng I5 và Viện Công Nghệ Sinh Học và Môi Trường đã chia sẽ những vui buồn,
giúp đỡ tôi trong thời gian làm đề tài cũng như trong suốt 4 năm học tại trường.
Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn tất cả.
Tp.Hồ Chí Minh, tháng 8 năm 2009
Sinh viên
Đỗ Minh Tấn

iii


TÓM TẮT
Nhằm khẳng định mức độ an toàn vi sinh trong nghêu nuôi tại huyện Bình Đại
và Ba Tri - tỉnh Bến Tre và huyện Cần Giờ - Tp. Hồ Chí Minh, đề tài được thực hiện
từ tháng 03/2009 đến tháng 06/2009 được thực hiện tại phòng thí nghiệm vi sinh I5 và
Viện Công Nghệ Sinh Học và Môi Trường – Trường ĐH Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh.
Đề tài đã khảo sát 3 chỉ tiêu là Faecal Coliforms, Escherichia coli, Salmonella
trên tổng số 60 mẫu nghêu được lấy từ 3 vùng nuôi nghêu. Bằng phương pháp MPN
(Most Probable Number) ở 3 nồng độ với 5 lần lặp lại tham chiếu theo MFHPB 192002, Sổ tay phương pháp phân tích vi sinh vật của Canada, sử dụng cho quá trình
phân tích định tính Faecal Coliforms và E. coli; phân tích định tính Salmonella tham
chiếu theo NMKL 71- 5th ed. 1999.
Kết quả phân tích cho thấy: Về chỉ tiêu E. coli, 60/60 đạt được tiêu chuẩn an
toàn về an toàn vệ sinh thực phẩm đối với nhuyễn thể cho cả 3 vùng khảo sát (Theo
“28 TCN 193 : 2004 Vùng thu hoạch nhuyến thể hai mảnh vỏ - Điều kiện đảm bảo vệ
sinh an toàn thực phẩm”). Về chỉ số Faecal Coliforms, kết quả cho thấy có sự biến
động lớn giữa các lần lấy mẫu của cả 3 vùng khảo sát, có 4/60 mẫu có chỉ số
MPN/100g > 300. Tuy nhiên trung bình các chỉ số của các vùng trong các đợt lấy mẫu
vẫn ở mức thấp giá trị trung bình dao động từ < 52,4 – 183,45 MPN/100g. Đảm bảo ở
mức an toàn của vùng nuôi. Về chỉ tiêu Salmonella, tại Bình Đại và Ba Tri không phát

hiện Salmonella trong 40 mẫu phân tích. Tại Cần Giờ mẫu được lấy tại 2 địa điểm là
Cần Thạnh và Đồng Hòa. Tại Đồng Hòa không phát hiện Salmonella trên 10 mẫu phân
tích và tại Cần Thạnh phát hiện 2/10 mẫu dương tính với Salmonella. Kết quả này đã
cảnh báo thực trạng nuôi trồng khu vực này.

iv


SUMMARY
In order to affirm the microorganism pollution level in Meretrix lyrata at Binh Dai,
Ba Tri - Ben Tre province and Can Gio - Ho Chi Minh City. The subject was studied from
March 2009 to June 2009 at I5 microorganism Department and Biotechnology and
Environment research institute – Nong Lam University, Ho Chi Minh City.
We progress testing 3 targets are Faecal Coliforms, Escherichia coli and
Salmonella in the 60 samples of 3 aquaculture areas of Bivalve mollusc. By MPN (Most
Probable Number) method at three concentrations, 5 times repeatedly (follows MFHPB
19-2002, Canada standard), we was qualitative Faecal Coliforms and E. coli. To quantify
Salmonella, we used the method which follows NMKL 71- 5th ed. 1999 standard.
The results of progress: In E. coli index, 60/60 of analysed samples fitted for
safety food standard (follows 28 TCN 193 : 2004 Harvesting area of Bivalve mollusc Conditions for food safety). In Faecal Coliforms, the results showed that there’s a
large fluctuation between the samples of all 3 studied areas. There’re 4/60 samples
which the results’re more than 300 MPN/100g. The average of results flutuate from <
52,4 to 183,45 MPN/100g. However, these aquaculture areas are safety. Salmonella is
not detected in all 40 tested samples at Binh Dai and Ba Tri. In Can Gio, we analysed
20 samples at two places: Can Thanh and Dong Hoa. At Dong Hoa, Salmonella is not
detected in all 10 tested samples and at Can Thanh, Salmonella is detected in 2/10
tested samples. This result warned about the real situation of this area.

v



MỤC LỤC
TRANG
LỜI CẢM ƠN .............................................................................................................. iii
TÓM TẮT .....................................................................................................................iv
SUMMARY................................................................................................................... v
MỤC LỤC ....................................................................................................................vi
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT .........................................................................ix
DANH SÁCH CÁC BẢNG ...........................................................................................x
DANH SÁCH CÁC HÌNH............................................................................................xi
Chương 1 MỞ ĐẦU......................................................................................................1
1.1. Đặt vấn đề................................................................................................................1
1.2. Mục đích và ý nghĩa ................................................................................................1
1.2.1. Mục đích ...............................................................................................................1
1.2.2.Ý nghĩa ..................................................................................................................2
1.3. Nội dung thực hiện ..................................................................................................2
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU...........................................................................3
2.1. Nghêu (Meretrix lyrata) .........................................................................................3
2.1.1. Đặc điểm sinh học ............................................................................................3
2.1.1.1. Phân bố ..............................................................................................................3
2.1.1.2. Sinh sản..............................................................................................................3
2.1.1.3. Tính ăn...............................................................................................................4
2.1.1.4. Sinh trưởng ........................................................................................................4
2.1.2. Thành phần khối lượng của nghêu .......................................................................5
2.2. Sơ lược về Salmonella, Escherichia coli và Faecal Coliforms ..............................5
2.2.1. Salmonella ............................................................................................................5
2.2.1.1. Lịch sử ...............................................................................................................6
2.2.1.2. Phân loại ............................................................................................................6
2.2.1.3. Đặc điểm sinh vật học .......................................................................................6
2.2.2. Escherichia coli (E. coli).....................................................................................7

2.2.2.1. Lịch sử ...............................................................................................................8

vi


2.2.2.2. Phân loại ............................................................................................................8
2.2.2.3. Đặc điểm sinh vật học .......................................................................................8
2.2.3. Faecal Coliforms .................................................................................................8
2.2.3.4. Vai trò chỉ thị vệ sinh an toàn thực phẩm của Coliforms và E. coli .................9
2.3. Các phương pháp phân tích Salmolnella, Faecal Coliforms và E. coli.................10
2.3.1. Phương pháp phân tích Faecal Coliforms và E. coli ..........................................10
2.3.1.1. Phương pháp truyền thống ..............................................................................10
2.3.1.2. Phương pháp PCR ...........................................................................................10
2.3.2. Phương pháp phân tích Salmonella ....................................................................11
2.3.2.1. Phương pháp nuôi cấy .....................................................................................11
2.3.2.2. Phương pháp miễn dịch ...................................................................................11
2.3.2.3. Phương pháp phân tử.......................................................................................11
2.4. Chế độ thủy triều tại miền Nam ...........................................................................12
Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................13
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu .........................................................................13
3.2. Vật liệu ..................................................................................................................13
3.2.1. Đối tượng............................................................................................................13
3.2.2. Nơi lấy mẫu và số lượng mẫu.............................................................................13
3.2.3. Dụng cụ, thiết bị và hóa chất ..............................................................................13
3.2.3.1. Dụng cụ............................................................................................................13
3.2.3.2. Thiết bị.............................................................................................................14
3.2.3.3. Môi trường.......................................................................................................14
3.3. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................................15
3.3.1. Phương pháp lấy mẫu ........................................................................................15
3.3.2. Phương pháp phân tích ......................................................................................15

3.3.2.1. Định tính Salmonella.......................................................................................15
3.3.2.2. Định lượng E. coli và Faecal Coliforms........................................................17
3.4. Xử lý số liệu phân tích...........................................................................................20
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN..................................................................21
4.1. Khảo sát đặc điểm của chủng đối chứng ...............................................................21
4.1.1. Đặc điểm của Salmonella ...................................................................................21
4.1.2. Đặc điểm của E. coli và Faecal Coliforms .........................................................22
vii


4.2. Kết quả phân tích tại Bình Đại ..............................................................................24
4.3. Kết quả phân tích tại Ba Tri ..................................................................................26
4.4. Kết quả phân tích tại Cần Giờ ...............................................................................27
4.5. So sánh mức độ nhiễm tại các vùng ......................................................................29
4.6. Thảo luận về kết quả phân tích tại Bình Đại .........................................................29
4.7. Thảo luận về kết quả phân tích tại Ba Tri .............................................................30
4.8. Thảo luận về kết quả phân tích tại Cần Giờ ..........................................................31
4.9. Thảo luận về so sánh các kết quả phân tích giữa các vùng ...................................33
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ......................................................................34
5.1. Kết luận..................................................................................................................34
5.2. Đề nghị ..................................................................................................................34
TÀI LIỆU THAM KHẢO..........................................................................................35
PHỤ LỤC

viii


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ATVSTP


: An toàn vệ sinh thực phẩm

BGBL

: Brilliant Green Bile Latose

BPW

: Buffered Pepton Water

E. coli

: Escherichia coli

EMB

: Eosin Methyl Blue

HTX

: Hợp tác xã

KIA

: Kligler Iron Agar

LDC

: Lysine Decarboxylase


LSB

: Lauryl Sulfate Broth

MR - VP

: Methyl Red - Vosges Poskauer

RV

: Rappaport Vassiliadis

SC

: Simmons Citrate

SPW

: Saline Pepton Water

TSA

: Trypton Soya Agar

TSI

: Triple sugar Iron Agar

VSV


: Vi sinh vật

XLD

: Xylose Lysine Deoxycholate

ix


DANH SÁCH CÁC BẢNG
TRANG
Bảng 3.1 Các thử nghiệm sinh hóa dùng cho Salmonella ...........................................16
Bảng 4.1 Kết quả phân tích mức độ nhiễm tại Bình Đại .............................................25
Bảng 4.2 Kết quả phân tích mức độ nhiễm tại Ba Tri .................................................26
Bảng 4.3 Kết quả phân tích mức độ nhiễm tại Cần Giờ ..............................................28
Bảng 4.4 Kết quả phân tích mức độ nhiễm tại các vùng .............................................29

x


DANH SÁCH CÁC HÌNH
TRANG
Hình 2.1 Con nghêu Bến Tre.....................................................................................3
Hình 2.2 Các xã viên thu hoạch nghêu tại HTX nghêu Rạng Đông (Bến Tre).............5
Hình 2.3 Hình dạng vi khuẩn Salmonella nhìn dưới kính hiển vi .................................5
Hình 2.4 E. coli dưới kính hiển vi .................................................................................7
Hình 3.1 Các bước phân tích chỉ tiêu Salmonella .......................................................17
Hình 3.2 Các bước phân tích chỉ tiêu Faecal Coliforms và E. coli .............................20
Hình 4.1 Khuẩn lạc đặc trưng của Salmonella đối chứng trên XLD...........................21
Hình 4.2 Các thử nghiệm sinh hóa của chủng Salmonella đối chứng .........................22

Hình 4.3 Khuẩn lạc E. coli đối chứng trên EMB (a) và thử nghiệm indol (+) (b). .....23
Hình 4.4 Thử nghiệm khẳng đinh E. coli ....................................................................24
Hình 4.5 Nơi lấy mẫu thuộc bãi nghêu HTX Rạng Đông – Bình Đại.........................30
Hình 4.6 Nơi lấy mẫu thuộc bãi nghêu HTX An Thủy – Ba Tri .................................31
Hình 4.7 Nơi lấy mẫu thuộc bãi nghêu Cần Giờ .........................................................33
Biểu đồ 4.1 Sự biến động của Faecal Coliforms, E. coli tại Bình Đại .......................25
Biểu đồ 4.2 Mức độ phân tán về kết quả phân tích giữa các mẫu tại Bình Đại...........26
Biểu đồ 4.3 Sự biến động của Faecal Coliforms, E. coli tại Ba Tri...........................27
Biểu đồ 4.4 Mức độ phân tán về kết quả phân tích giữa các mẫu lấy tại Ba Tri .........27
Biểu đồ 4.5 Sự biến động của Faecal Coliforms, E. coli tại Ba Tri............................28
Biểu đồ 4.6 Mức độ phân tán về kết quả phân tích giữa các mẫu lấy tại Ba Tri .........28
Biểu đồ 4.7 So sánh 2 chỉ tiêu Faecal Coliforms và E. coli giữa các vùng lấy mẫu ...29

xi


Chương 1
MỞ ĐẦU
1.1.

Đặt vấn đề
Salmonella, Escherichia coli và Faecal Coliforms là những chủng Vi sinh vật

chỉ thị mức độ vệ sinh an toàn thực phẩm nói chung và trong thực phẩm thủy sản nói
riêng. Trong khi đó ngành nghề nuôi trồng thủy hải sản ở nước ta càng ngày càng phát
triển, đã và đang trở thành thế mạnh trong việc xuất khẩu và mang lại doanh thu lớn.
Để đảm bảo cho công tác xuất khẩu thực phẩm thủy hải sản, đặc biệt là các sản
phẩm tươi sống sang các thị trường khó tính như Châu Âu và Mỹ, thì các sản phẩm
này phải đảm bảo các điều kiện về VSATTP, đặc biệt là các tiêu chuẩn về vi sinh.
Theo Báo Lao Động số 240 ngày 17/10/2008 – Hội đồng Bảo tồn biển quốc tế

vừa cấp giấy chứng nhận thương hiệu MSC (Marine Sterwarship Council) cho con
nghêu Bến Tre. Đây là chủng loại thủy sản đầu tiên của cả khu vực Đông Nam Á được
Hội đồng Bảo tồn biển quốc tế công nhận thương hiệu danh giá này. Với danh hiệu
MSC, nghêu Bến Tre sẽ vào được các thị trường khó tính nhất. Tỉnh Bến Tre hiện có
khoảng 15 ngàn hécta nuôi nghêu, tập trung ở 10 HTX thuộc 3 huyện Bình Đại, Thạnh
Phú và Ba Tri, với sản lượng hàng năm gần 20000 tấn.
Chính vì vậy, ngành nghề nuôi nghêu đang được sự quan tâm của Bộ Nông
nghiệp và Phát triển Nông thôn, cũng như các nghiên cứu về loại thủy sản này. Và việc
nghên cứu, khảo sát sự hiên diện của các chủng VSV nói trên mang một ý nghĩa hết
sức quan trọng.
1.2.

Mục đích và ý nghĩa

1.2.1. Mục đích
Kiểm tra sự hiện diện của Salmonella, Escherichia coli và Faecal Coliforms
trong mẫu nhuyễn thể (nghêu) tại 3 khu vực nuôi trồng thủy sản tương đối lớn ở khu
vực phía Nam nước ta là: Cần Giờ (Tp. Hồ Chí Minh), Huyện Bình Đại, Huyện Ba Tri
(Tỉnh Bến Tre). Dựa vào kết quả đạt được, khẳng định lại mức độ an toàn vi sinh trong
các mẫu thủy sản sống nhằm mục đích xuất khẩu.

1


1.2.2. Ý nghĩa
Việc kiểm tra, phân lập Salmonella, E. coli và Faecal Coliforms trong mẫu
nhuyễn thể (nghêu) có một ý nghĩa hết sức quan trọng về mức độ an toàn trong thực
phẩm thủy sản cũng như mang ý nghĩa về kinh tế. Từ đó có một cách nhìn nhận tổng
quát về mức độ an toàn vi sinh trong công tác nuôi trồng thủy sản nói chung và nuôi
nghêu nói riêng.

1.3.

Nội dung thực hiện
Định tính Samonella trong mẫu nghêu bằng phương pháp phân lập, thử nghiệm

sinh hóa và định lượng E. coli và Faecal Coliforms trong mẫu nhuyễn thể bằng
phương pháp MPN (Most Probable Number).

2


Chương 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Nghêu (Sowerby, 1851)
Họ: Ngao (Veneridae)
Giống: Meretrix
Loài: Meretrix lyrata (nghêu Bến Tre)
Loài phụ: Meretrix meretrix (nghêu dầu)

Hình 2.1 Con nghêu Bến Tre.
2.1.1. Đặc điểm sinh học của nghêu (Admax, 2007)
2.1.1.1. Phân bố
Ở Việt Nam nghêu phân bố nhiều ở Gò Công Đông (Tiền Giang), Bình Đại, Ba
Tri, Thạnh Phú (Bến Tre), Cầu Ngang, Duyên Hải (Trà Vinh), Vĩnh Châu (Sóc Trăng),
Bạc Liêu, Vĩnh Lợi, Ngọc Hiển (Minh Hải), ven biển Cần Giờ (Tp. Hồ Chí Minh),
chưa thấy ở ven biển Bắc bộ, Trung bộ.
Nghêu sống vùi trong đáy cát bùn của vùng triều, chủ yếu ở giải triều giữa và
dưới triều, có thể gặp ở độ sâu 4 m. Trong tự nhiên chưa gặp loài này ở vùng đáy bùn,
đáy rắn chắc.
2.1.1.2. Sinh sản

Nghêu là loài phân tính đực cái riêng, chưa gặp hiện tượng lưỡng tính. Những con
có tuyến sinh dục thành thục nhìn thấy tuyến sinh dục căng lên như hai múi bưởi, màu
nâu nhạt. Mùa đẻ của chúng là quanh năm, tập trung vào tháng 6, chiếm đến 60% cá thể
chín muồi. Mùa đẻ phụ vào tháng 11 - 12. Số trứng trong noãn sào con cái khoảng
3168000 - 8650000, trung bình 5362000 trứng trong một cá thể. Con cái có tuyến sinh
dục thành thục ở kích thước chiều cao vỏ bé nhất 28 – 29 mm, con đực là 32 – 33 mm.

3


Nghêu đực và cái phun tinh trùng và trứng vào nước, trứng được thụ tinh phát
triển thành ấu trùng, ấu trùng của chúng sống trôi nổi trong nước một thời gian thì hình
thành vỏ rồi chìm xuồng đáy. Ấu thể nghêu lớn lên thành “nghêu cám” bé bằng nửa
hạt gạo, vỏ mỏng, dẹp, nặng 0,04 - 0,07 g/con (15000 - 25000 con/kg) vùi sâu khoảng
1 cm, nghêu cám theo triều lên kiếm ăn nên thường bị sóng cuộn và dòng triều đưa đi
tương đối xa, có khi lên bờ phơi khô mà chết. Khoảng hơn 1 tháng sau “nghêu cám”
lớn thành nghêu giống, nặng 0,16 - 0,20 g/con (5000 - 6000 con/kg), vỏ đã tương đối
cứng, có thể đem ương ở các bãi .
2.1.1.3. Tính ăn
Nghêu là loại động vật ăn lọc. Trong ống tiêu hoá của nghêu thấy: Mùn bã hữu
cơ 75 – 90 %, còn lại là sinh vật phù du chủ yếu là tảo Silic phù du Bacillariopyceae
(90 – 95 %), tảo giáp Dinophyceae (3,3 - 6,6 %), tảo lam, tảo lục, tảo kim mỗi loại từ
0,8 - 1,0 %. Tháng 2 - 5 nghêu ăn tích cực, lượng thức ăn trong ống tiêu hoá cao nhất.
Các tháng mùa mưa lũ và sau mùa lũ có độ muối nhạt, chúng phải ngậm vỏ, không ăn
một thời gian dài trong ngày, độ no thấp.
2.1.1.4. Sinh trưởng
Trong điều kiện tương đối thuận lợi, môi trường không xấu, từ trứng đến
“nghêu cám” qua 2 tháng, từ nghêu cám đến nghêu giống cỡ 800 - 1000 con/kg qua 6 8 tháng và từ nghêu giống đến nghêu thịt (cỡ 50 con/kg) qua 10 - 11 tháng nữa. Tổng
thời gian từ khi nghêu được sinh ra đến lúc thu hoạch là 18 - 20 tháng, có chiều cao vỏ
từ 4 – 71 mm.

Nghêu càng lớn thì tỷ lệ thể tích càng to, tuy nhiên khối lượng thịt tăng chậm hơn
khối lượng vỏ. Cụ thể 100 kg nghêu cỡ chiều cao 35 – 37 mm, nặng 45 - 50 con/kg, ta
thu được 7,7 - 8,3 kg thịt; nhưng 100 kg nghêu to cỡ 49 – 50 mm, nặng 19 - 21 con/kg
thì chỉ thu được 6,7 - 7,3 kg thịt, vì vậy không nên để nghêu quá lớn mới thu hoạch.
2.1.2. Thành phần khối lượng của nghêu
Thành phần khối lượng của nghêu là tỷ lệ phần trăm về khối lượng của các phần
trong cơ thể so với khối lượng toàn bộ của nghêu. Thành phần khối lượng của nghêu
biến đổi theo giống loài, tuổi, giới tính, mức độ trưởng thành và khu vực sinh sống.
Mối tương quan giữa khối lượng với chiều dài nghêu cho thấy rõ quá trình phát
triển các cá thể của nghêu từ nhỏ đến lớn có tương quan nhau rất chặt chẽ và ở mức độ
nhất định có thể phán đoán về kết cấu, độ chắc của cơ thịt nghêu.
4


Theo nghiên cứu của Nguyễn Tiến Lực và ctv, 2005 cho thấy: Thành phần hóa
học cơ bản của nghêu là protein 12,6%, lipid 2,6%, khoáng tổng 3,7%, nước 81%. Kết
quả cũng cho thấy trong thịt nghêu rất phong phú các acid amin và có đủ các loại acid
amin không thay thế với hàm lượng và tỷ lệ cân đối gần như một protein lý tưởng. Đặc
biệt rất giàu Tryptophan, Histidin và Threonine so với thịt, cá. Thịt nghêu giàu và đầy
đủ các chất khoáng cần thiết theo yêu cầu thực phẩm cho người. Những nguyên tố có
nhiều trong thịt nghêu là Na, Fe, Zn, Cu. Các nguyên tố kim loại nặng ở mức thấp xa
so với giới hạn cho phép theo quy định tiêu chuẩn vệ sinh an toàn thực phẩm 1057
BYT/QĐ ban hành năm 1999.

Hình 2.2 Các xã viên thu hoạch nghêu tại HTX nghêu
Rạng Đông (Bến Tre).
2.2. Sơ lược về Salmonella, Escherichia coli và Faecal Coliforms
2.2.1. Salmonella

Hình 2.3 Hình dạng vi khuẩn

Salmonella nhìn dưới kính hiển vi.

5


2.2.1.1. Lịch sử
Salmonella là một trong những loại vi khuẩn quan trọng thuộc họ vi khuẩn đường
ruột Enterobacteriaceae. Năm 1885, Smith và Salmon D.E đã phân lập được vi khuẩn
Salmonella gây bệnh ở heo con đầu tiên đặt tên là Bacillus choleraesuis; năm 1892,
Loeffer đã phân lập nhóm vi khuẩn Bacillus typhimurium từ chuột, đây chính là
Salmonella typhimurium sau này. Năm 1990, Lignieres đã chính thức đặt tên vi khuẩn
này là Salmonella (Nguyễn Ngọc Hải, 2007).
2.2.1.2. Phân loại

Vi khuẩn Salmonella thuộc:
 Họ: Enterobacteriaceae
 Bộ: Salmonellaea
 Giống: Salmonella
 2 loài chính là: S. enterica và S. bongori
Salmonella enterica có 6 loài phụ: S. enterica I, S. SalamaeII, S. arizona IIIa,
S. diarizona IIIb, S. houtenae IV và S. indica VI; Salmonella bongori có một loài phụ.
Hiện nay có hơn 2300 type huyết thanh Salmonella khác nhau. Chúng gây bệnh cho
người hoặc động vật hoặc cả hai. Các bệnh do Salmonella gây ra ở người có thể chia
thành 2 nhóm: Thương hàn và không phải thương hàn (Nguyễn Ngọc Hải, 2007; Lê
Huy Chí và ctv, 2003; Nguyễn Thị Kim Thoại, 2007).
2.2.1.3. Đặc điểm sinh vật học
Salmonella hiện diện tự nhiên trong ruột, trong phân của các loài động vật như
heo, bò, gia cầm, rùa, rắn, các loài bò sát, v.v... Trong thực phẩm, Salmonella hiện
diện trong thịt gia súc và gia cầm, trứng, rau cải, xà lách, các sản phẩm bơ, sữa, cá và
các loại tôm, cua, sò, ốc... Salmonella là trực khuẩn gram âm. Hầu hết các Salmonella

đều có lông xung quanh thân (trừ Salmonella gallinarum và Salmonella pullorum), vì
vậy có khả năng di động, không sinh nha bào. Salmonella lên men glucose có sinh hơi
(trừ Salmonella typhi lên men glucose không sinh hơi) không lên men lactose, indol
âm tính, đỏ methyl dương tính, VP âm tính, Citrat thay đổi, urease âm tính, H2S dương
tính (trừ Salmonella paratyphi A: H2S âm tính)... (Nguyễn Tiến Dũng, 2007).
Đặc điểm gây bệnh: Số lượng Salmonella đủ để gây ngộ độc là khi chúng hiện
diện cả triệu tế bào trong một gam thực phẩm. Các triệu chứng do Salmonella gây ra
thường là tiêu chảy, ói mửa, buồn nôn. Thời gian ủ bệnh cho đến khi các triệu chứng
6


biểu hiện thường sau 12 - 36 giờ kể từ khi tiêu thụ thực phẩm bị nhiễm. Triệu chứng
thường kéo dài ít nhất từ 2 - 7 ngày. Nguồn nhiễm vi sinh vật vào các loại thực phẩm
thường có nguồn gốc từ đường ruột của người và các loài động vật, chúng có thể được
nhiễm gián tiếp hay trực tiếp. Ở nước ta, bệnh thương hàn chủ yếu do S. typhi, sau đó
đến S. paratyphi A, còn S. paratyphi B và S. paratyphi C thì ít gặp. Bệnh lây từ người
này sang người khác, qua thức ăn, nước uống bị nhiễm khuẩn. Sau khi khỏi bệnh về
mặt lâm sàng, khoảng 5% bệnh nhân trở thành người lành mang vi khuẩn kéo dài hàng
tháng hoặc hàng năm.
Cấu trúc kháng nguyên: Mỗi Salmonella có thể có một hoặc nhiều yếu tố kháng
nguyên. Hiện nay người ta biết có 67 yếu tố kháng nguyên O. Việc xác định các yếu tố
kháng nguyên O là hết sức quan trọng để định nhóm và định type. Kháng nguyên H:
Chỉ có ở những Salmonella có lông. Kháng nguyên H của Salmonella có thể tồn tại
dưới 2 pha: Pha 1 được ghi bằng chữ viết thường a, b, c, d... và pha 2 được ghi bằng
các chữ số Ả rập 1, 2,... Kháng nguyên Vi: Là kháng nguyên bề mặt bao bên ngoài
vách tế bào vi khuẩn, dưới dạng một màng mỏng không nhìn thấy được ở kính hiển vi
thường. Kháng nguyên Vi chỉ có ở 2 type huyết thanh Salmonella typhi và S.
paratyphi C. Người ta dựa vào sự khác nhau về cấu trúc kháng nguyên để xếp loại
Salmonella. (Nguyễn Xuân Hòa và Phạm Hồng Sơn, 2007).
2.2.2. Escherichia coli (E. coli)


Hình 2.4 E. coli chụp dưới kính hiển vi.
Escherichia coli là những vi khuẩn ký sinh, bình thường có ở ruột, nhưng đồng
thời cũng là tác nhân gây bệnh khi chúng xâm nhập vào các cơ quan khác như đường
niệu, đường máu..., và có một số chủng E. coli có khả năng gây bệnh tiêu chảy như
ETEC, EPEC, EIEC... E. coli có mặt rất nhiều trong phân người và động vật.

7


2.2.2.1. Lịch sử
Tên đầy đủ là Escherichia coli được Buchner tìm ra năm 1885 và được
Escherich nghiên cứu đầy đủ năm 1886. E. coli bình thường sống trong ruột già. Trong
tiếng Latinh ruột già là colum. Vì tôn trọng nhà khoa học nên người ta lấy tên ông
ghép vào chữ ruột già theo ngữ pháp sở hữu cách tiếng Latin, nên loại vi khuẩn này
được gọi là Escherichia coli. Sau nhiều tên gọi khác nhau, năm 1991 vi khuẩn này
được định danh thống nhất toàn cầu là Escherichia coli.
2.2.2.2. Phân loại (Nguyễn Ngọc Hải, 2007)


Ngành: Proteobacteria



Lớp: Gamma Proteobacteria



Bộ: Enterobacteriales




Họ: Enterobacteriaceae



Chi: Escherichia

 Loài: E. coli
2.2.2.3. Đặc điểm sinh vật học
E. coli là trực khuẩn gram âm, di động do có lông quanh thân, một số chủng
E. coli có vỏ polysaccharide, không sinh nha bào, là vi khuẩn hiếu khí hoặc kỵ khí
không bắt buộc, phát triển dễ dàng trên các môi trường nuôi cấy thông thường, một số
có thể phát triển được ở môi trường tổng hợp đơn giản. Nhiệt độ thích hợp 370C, pH
thích hợp là 7 - 7,2.
E. coli lên men nhiều loại đường sinh axit và sinh hơi như: Glucose, lactose,
ramnose; indol dương tính, đỏ methyl dương tính, Vosges Proskauer (VP) âm tính, citrat
âm tính, urease âm tính, H2S âm tính.
E. coli có rất nhiều type huyết thanh mà công thức dựa vào sự xác định kháng
nguyên thân O, kháng nguyên vỏ K và kháng nguyên lông H. Đối với kháng nguyên
O: Có khoảng 150 yếu tố khác nhau về mặt huyết thanh; kháng nguyên K là kháng
nguyên bề mặt; được chia ra thành loại L, A hoặc B tùy theo sức đề kháng đối với nhiệt.
Có chừng 100 kháng nguyên K khác nhau. Kháng nguyên H: Đã xác định được khoảng
50 yếu tố H (Nguyễn Đức Lượng và Trần Minh Tâm, 2005; Trần Linh Thước, 2005).
2.2.3. Faecal Coliforms
Faecal Coliforms (Coliforms phân): Là Coliforms chịu nhiệt có phản ứng
indol dương tính khi được ủ khoảng 24 giờ ở 44,50C trong canh Trypton. Còn được

8



gọi là E. coli giả định (presumtive E. coli). Vi khuẩn Coliforms chịu nhiệt là những
Coliforms có khả năng lên men đường lactose ở 44 - 450C; nhóm này bao gồm
Escherichia và loài Kiebsiella, Enterobacter, Citrobacter.
Khác với E. coli, Coliforms chịu nhiệt có thể xuất xứ từ nguồn nước giàu chất
hữu cơ như nước thải công nghiệp từ xác thực vật thối rữa hoặc đất. Vì lý do đó thuật
ngữ Coliforms "phân" dù vẫn được sử dụng, nhưng không đúng và không nên tiếp tục
sử dụng nữa.
Coliforms chịu nhiệt không tái phát triển trong hệ thống phân phối nước ngoại
trừ khi nước chứa đủ chất dinh dưỡng, chất bẩn tiếp xúc với nước đã xử lý, nhiệt độ
của nước cao hơn 130C và nước không có Clo thừa (Nguyễn Tiến Dũng, 2007).
2.2.4. Vai trò chỉ thị vệ sinh an toàn thực phẩm của Coliforms và E. coli
Coliforms và Faecal Coliforms được xem là VSV chỉ thị, bởi vì số lượng của
chúng hiện diện trong mẫu chỉ thị khả năng có sự hiện diện của các VSV gây bệnh khác
trong thực phẩm. Các nhà nghiên cứu cho rằng số lượng Coliforms cao trong thực
phẩm thì khả năng hiện diện các VSV gây bệnh khác cũng rất lớn. Tuy vậy mối liên hệ
giữa số lượng VSV chỉ thị và VSV gây bệnh còn đang được tranh cải về khoa học.
Trong đại đa số các trường hợp, đậm độ của Coliforms chịu nhiệt có liên quan
trực tiếp đến đậm độ của E. coli. Vì vậy, việc sử dụng loại vi khuẩn này để đánh giá
chất lượng nước được xem là chấp nhận cho công việc hằng ngày. Khi lý giải về số
liệu, luôn luôn phải nhớ đến ý nghĩa giới hạn của chỉ tiêu này. Các phòng thí nghiệm
chuẩn quốc gia đang xây dựng các phương pháp tiêu chuẩn để thử nghiệm tính đặc
hiệu của Coliforms chịu nhiệt cho E. coli trong các điều kiện địa phương xem thử kết
quả ra sao. Vì Coliforms chịu nhiệt có thể định lượng được nên chúng có một vai trò
quan trọng thứ hai nữa là chỉ điểm về hiệu quả của các quá trình xử lý nước loại trừ vi
khuẩn. Vì vậy có thể sử dụng chúng để đánh giá mức độ cần thiết phải xử lý đối với
các loại nước có chất lượng khác nhau và đưa ra quyết định về các mục tiêu loại trừ vi
khuẩn phải thực hiện (Nguyễn Tiến Dũng, 2007; Nguyễn Văn Tuấn, 2008).

9



2.3. Các phương pháp phân tích Salmolnella, Faecal Coliforms và E. coli trong
nhuyễn thể và thực phẩm
2.3.1. Phương pháp phân tích Faecal Coliforms và E. coli
2.3.1.1. Phương pháp truyền thống
Phương pháp đếm khuẩn lạc trên đĩa là phương pháp được sử dụng rộng rãi để
định lượng VSV, đặc biệt là vi khuẩn, cho phép xác định số lượng tế bào VSV còn
sống hiện diện trong mẫu. Phương pháp này có đặc điểm là cho phép định lượng chọn
lọc VSV tùy thuộc vào môi trường và điều kiện nuôi cấy; có thể thực hiện bằng kỹ
thuật hộp trãi hay hộp đổ với các thiết bị hỗ trợ đọc kết quả. Trong trường hợp này,
cần tiến hành pha loãng mẫu thành nhiều nồng độ pha loãng bậc 10 liên tiếp sao cho
có độ pha loãng với mật độ tế bào thích hợp để xuất hiện các khuẩn lạc đơn riêng lẽ
trên bề mặt thạch với số lượng đủ lớn để hạn chế sai số khi đếm và tính toán.
Phương pháp MPN (Most Probable Number): Là phương pháp ước đoán giá trị có
xác suất cao nhất theo nguyên tắc thống kê. Giá trị MPN là giá trị có xác xuất cao nhất.
Phương pháp này dựa trên nguyên tắc mẫu được pha loãng thành một dãy thập phân (hai
nồng độ kế tiếp nhau khác nhau 10 lần), 3 hoặc 5 mẫu có độ pha loãng thập phân liên tiếp
được ủ trong ống nghiệm chứa môi trường thích hợp có ống bẫy khí Durham. Mỗi nồng
độ pha loãng được ủ từ 3 đến 5 ống lặp lại. Theo dõi sự sinh hơi và đổi màu để định
lượng sự hiện diện trong từng ống nghiệm; đây là các ống dương tính. Ghi nhận số ống
nghiệm có phản ứng dương tính ở mỗi nồng độ pha loãng và dựa vào bảng MPN để suy
ra số lượng VSV tương ứng hiện diện trong 1 g (hoặc 1 ml) mẫu ban đầu.
Có 2 hệ thống MPN: Chia theo thể tích mẫu cấy ta có 2 phương pháp là
MPN/100ml(g) và MPN/ml(g); chia theo số lượng ống trong hệ thống ta có hệ thống 3
ống 3 nồng độ và hệ thống 5 ống 3 nồng độ.
Phương pháp phát quang ATP: Là phương pháp định lượng VSV thông qua số
lượng ATP của VSV trong mẫu, ATP chủ yếu hiện diện ở tế bào VSV sống, số lượng
ATP phụ thuộc vào điều kiện dinh dưỡng, trạng thái tế bào. (Nguyễn Đức Hùng và ctv,
2003; Nguyễn Tiến Dũng, 2007).

2.3.1.2. Phương pháp PCR
Có thể sử dụng các kỹ thuật sinh học phân tử như PCR để chẩn đoán và phát
hiện nhanh Faecal Coliforms và E. coli, nhưng chủ yếu áp dụng cho các chủng nguy

10


hiểm như E. coli O157:H7. Phát hiện E. coli O157:H7 bằng kỹ thuật Multiplex PCR
với đoạn gene stx1 và stx2 (Nguyễn Ngọc Hải, 2007).
2.3.2. Phương pháp phân tích Salmolnella
2.3.2.1. Phương pháp nuôi cấy
Phương pháp này dựa trên nguyên tắc nuôi phân lập trên môi trường nuôi cấy
chọn lọc sau đó dùng các phản ứng sinh hóa để khẳng định các khuẩn lạc nghi ngờ là
Salmolnella. Môi trường tăng sinh chọn lọc cho Salmolnella là canh RV sau đó được
phân lập trên môi trường XLD và PGPL.
Khuẩn lạc nghi ngờ được khẳng định bằng các phản ứng trên môi trường KIA/TSI,
manitol, LDC, urea và khẳng định bằng kháng huyết thanh (Nguyễn Tiến Dũng, 2007).
2.3.2.2. Phương pháp miễn dịch
Dựa trên nguyên tắc liên kết đặc hiệu giữa kháng nguyên - kháng thể, với các
kháng nguyên của Salmonella: Kháng nguyên H, kháng nguyên O, kháng nguyên Vi:
Huyết thanh học: Với nguyên tắc là kháng thể kháng Salmonella trong huyết
thanh của cơ thể sinh vật  Kháng nguyên Salmonella .
ELISA (Bộ kit Hyoptest (Bommeli)).
Miễn dịch huỳnh quang: Theo nguyên tắc là kháng thể kháng Salmonella trong
huyết thanh của cơ thể sinh vật được nhuộm huỳnh quang  Kháng nguyên
Salmonella (Nguyễn Tiến Dũng, 2007).
2.3.2.3. Phương pháp phân tử
Phương pháp PCR dựa trên cấu trúc phân tử của Salmonella với DNA đích
(gen inv) tạo nên band 520 bp trên gel điện di, cặp mồi invA1 và invA2 (invA1: 5’TTGTTACGGCTATTTTGACCA–3’; invA2: 5’-CTGACTGCTACCTTGGCTGATG
-3’); kỹ thuật Real Time PCR (iQ- CheckTM Salmonella): Phát hiện Salmonella trong

các mẫu thực phẩm và môi trường. Với Probe phát huỳnh quang (fluorescent probes) =
một trình tự oligonocleotide phát sáng rất chuyên biệt = tín hiệu phân tử (molecular
beacon); Probe dạng tự do  tín hiệu huỳnh quang từ F sẽ bị Q hấp thu  không phát
sáng. Và kỹ thuật Multiplex PCR: Với các primer là Primer Rfbj: Gene rfbj (kháng
nguyên O.4), Primer Flic:Gene flic-1 (kháng nguyên H1-I), Primer Flib: Gene flib
(kháng nguyên H2-1,2) (Nguyễn Ngọc Hải, 2007).

11


2.4. Chế độ thủy triều tại miền Nam
Chế độ bán nhật triều ở miền Nam: Bán nhật triều là trong một chu kỳ triều có 2
lần triều lên và 2 lần triều xuống, những vùng chịu ảnh hưởng của loại triều này thường
nằm ở vĩ tuyến gần xích đạo. Nguyên nhân là do sự thay đổi lực hấp dẫn từ Mặt Trăng
(phần chủ yếu) và từ các thiên thể khác như Mặt Trời (phần nhỏ) tại một điểm bất kỳ
trên bề mặt Trái Đất. Tại vùng biển phía Nam nước ta chế độ lên xuống của thủy triều
rõ rệt hơn vùng biển phía Bắc.
Nguồn nước: Nước biển Đông một năm có hai đợt triều cường vào tháng 7, 8
âm lịch và tháng 11, 12 âm lịch, do ảnh hưởng của thủy triều nên nồng độ muối có sự
dao động, độ mặn trung bình 25 ‰. Do ảnh hưởng của nước sông đổ về, độ mặn dao
động 15 – 18 ‰. Độ pH 7,5 – 8,64; hàm lượng NH4+ > 2 mg/l, PO33-: 0,08 – 0,71 mg/l.
Nước lên với nồng độ muối cao 25 – 30 ‰, chỉ tồn tại 2 - 3 giờ/ngày, lúc này
nghêu tranh thủ kiếm ăn, sau đó lại nhanh chóng khép vỏ và vùi xuống sâu.
Nhiệt độ: Nhiệt độ trung bình của không khí 25,2 - 28,40C, cao nhất 28,40C
(tháng 4) thấp nhất 25,20C (tháng 1). Mùa nóng nhiệt độ tối đa 350C, có khi lên 37,80C
(tháng 6, 7) (Nguyễn Xuân Nam, 2004).

12



Chương 3
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu
Thời gian: Tiến hành việc lấy mẫu và thực hiện thí nghiệm từ tháng 02 đến
tháng 06 năm 2009.
Đề tài được thực hiện tại phòng phân tích vi sinh I5 và Viện Công nghệ Sinh
học và Môi trường - Trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh.
3.2. Vật liệu
3.2.1. Đối tượng
Salmonella spp trong nhuyễn thể 2 mảnh (nghêu).
Escherichia coli và Faecal Coliforms trong nhuyễn thể 2 mảnh (nghêu).
3.2.2. Nơi lấy mẫu và số lượng mẫu
Nơi lấy mẫu: Mẫu được lấy tại 3 vùng đó là: HTX Thủy sản Hội Cựu chiến
Binh Cần Thạnh và bãi nghêu Sân Vàm xã Đồng Hòa thuộc huyện Cần Giờ Tp. Hồ
Chí Minh; HTX Thủy sản Rạng Đông thuộc huyện Bình Đại tỉnh Bến Tre; HTX Thủy
sản An Thủy thuộc huyện Ba Tri tỉnh Bến Tre.
Số lượng mẫu cho cả 3 vùng khảo sát là 60 mẫu.
3.2.3. Dụng cụ, thiết bị và hóa chất
3.2.3.1. Dụng cụ
- Ống nghiệm θ 12 + giá ống nghiệm
- Đĩa petri Thuỷ tinh hoặc nhựa
- Transfer pipet 50 µl - 200 µl, 1000 µl - 5000 µl + Đầu típ
- Ống kim tiêm loại 5 ml, 10ml
- Que cấy vòng + Que cấy nhọn
- Bao PE sạch
- Dao cứng có mũi nhọn, kéo

13



3.2.3.2. Thiết bị
- Bể điều nhiệt/ Tủ ấm 44,5 ± 0,20C/ 44,5 ± 0,50C.
- Bể điều nhiệt/ Tủ ấm 370 C ± 0,50C.
- Nồi hấp thanh trùng.
- Cân kỹ thuật (độ chính xác 0,01g), pH kế.
- Tủ cấy Vi sinh.
3.2.3.3. Môi trường
Môi trường và thuốc thử cho kiểm nghiệm Salmonella:
- Canh Peptone đệm (BPW)
- Canh Rappaport - Vassiliadis soy peptone
- Thạch Xylose lysine desoxycholate (XLD)
- Thạch Brilliant Green Phenol Red Lactose Sucrose (BPLS)
- TSI (Triple sugar Iron Agar)/ KIA (Kligler ion agar)
- TSA (Trypton Soya Agar)
- Canh Urea phenol red
- Canh Lysine decarboxylase
- Canh Mannitol Phenol red
Môi trường và thuốc thử cho kiểm nghiệm E. coli và Faecal Coliorms:
- Canh thang Lauryl Sulfate Broth (LSB) nồng độ kép
- Canh thang Lauryl Sulfate Broth (LSB) nồng độ thường
- Canh EC
- Dung dịch pha loãng SPW (dung dịch đệm pH khoảng 7,2)
- Canh Tryptone
- Thuốc thử Kovac’s
- Canh MR-VP
- Thuốc thử Methyl red.
- Thuốc thử Alpha napthol.
- Dung dịch KOH 40%
- Thạch Simmons citrate


14