LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp này, tác giả xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu
sắc nhất của mình tới TS.Võ Thị Bích Thủy phó trưởng phòng Hệ gen học vi sinh - Viện
Nghiên cứu hệ gen - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, người đã tận tình chỉ
bảo, hướng dẫn trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn.
Tác giả xin trân trọng cảm ơn quý thầy cô trong Ban giám hiệu Trường Đại học Khoa
học Thái Nguyên; Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ Sinh học - Trường Đại học Khoa học Thái
Nguyên; Quý thầy, cô trực tiếp giảng dạy, giúp đỡ trong suốt quá trình học tập, nghiên cứu
khoa học.
Tác giả xin chân thành cảm ơn PGS. TS Nghiêm Ngọc Minh, KS. Phạm Thùy Linh và
các anh chị em, cán bộ phòng Hệ gen học vi sinh - Viện Nghiên cứu hệ gen - Viện Hàn lâm
Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đã nhiệt tình hướng dẫn, giúp đỡ và đóng góp nhiều ý kiến
quý báu để tôi hoàn thành luận văn này.
Cuối cùng, xin được bày tỏ lòng yêu thương và biết ơn sâu sắc đến gia đình, đồng
nghiệp - những người đã tạo mọi điều kiện giúp đỡ, động viên tác giả trong quá trình học tập
và hoàn thành luận văn.

Thái Nguyên, tháng 4 năm 2017
Tác giả

Trần Thị Thanh Huệ

LỜI CAM ĐOAN


Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu do tôi trực tiếp thực hiện với sự giúp
đỡ của cán bộ, nhân viên phòng Hệ gen học vi sinh - Viện nghiên cứu hệ gen, Viện Hàn lâm
Khoa học và Công nghệ Việt Nam dưới sự hướng dẫn khoa học của TS. Võ Thị Bích Thủy.
Các tư liệu trích dẫn đều có nguồn gốc rõ ràng, các kết quả trong luận văn là trung thực và
chưa từng được ai công bố ở bất kỳ công trình nào khác.
Tác giả luận văn

Trần Thị Thanh Huệ


i

MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN
LỜI CAM ĐOAN
DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT .................................. iii DANH
MỤC BẢNG ........................................................................................ iv DANH MỤC HÌNH
..........................................................................................

v

MỞ

........................................................................................................... 1
1. Đặt vấn đề...................................................................................................... 1
2. Mục tiêu nghiên cứu...................................................................................... 2
3. Nội dung nghiên cứu ..................................................................................... 3
CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU............................................................ 4
1.1. Đặc điểm của xoắn khuẩn Leptospira ........................................................ 4
1.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới............................................................. 6
1.2.1. Tình hình bệnh Leptospirosis .................................................................. 6
1.2.2. Tình hình nghiên cứu vắc xin phòng bệnh Leptospirosis ..................... 10
1.3. Tình hình nghiên cứu trong nước............................................................. 12
1.3.1. Tình hình bệnh Leptospirosis ................................................................ 12
1.3.2. Tình hình nghiên cứu vắc xin phòng bệnh Leptospirosis ..................... 14
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................................ 15

2.1. Vật liệu nghiên cứu .................................................................................. 15
2.2. Hóa chất, thiết bị ...................................................................................... 16
2.2.1. Hóa chất ................................................................................................ 16
2.2.2. Thiết bị................................................................................................... 17
2.3. Địa điểm nghiên cứu ................................................................................ 17
2.4. Phương pháp nghiên cứu.......................................................................... 18
2.4.1. Phương pháp tách chiết DNA tổng số................................................... 18

ĐẦU


ii

2.4.2. Định lượng và kiểm tra độ tinh sạch của DNA tổng số ........................ 19
2.4.3. Thiết kế các cặp mồi của các gen 16S rDNA, OmpL1, LipL32, LipL41, LipL21, LigA,
LigB.......................................................................................... 20
2.4.4. Kỹ thuật PCR......................................................................................... 20
2.4.5. Tinh sạch sản phẩm PCR của gen 16S rDNA....................................... 21
2.4.6. Giải trình tự gen 16S rDNA của 6 chủng xoắn khuẩn .......................... 22
2.4.7. Phân tích và xây dựng sơ đồ hình cây phân loại 6 chủng Leptospira.. 23
CHƯƠNG III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................ 24
3.1. Phân loại học phân tử 6 chủng Leptospira............................................... 24
3.1.1. Kiểm tra chất lượng DNA tổng số......................................................... 24
3.1.2. Trình tự các cặp mồi của các gen 16S rDNA, OmpL1, LipL32, LipL41, LipL21,
LigA, LigB.......................................................................................... 26
3.1.3. Nhân gen với các cặp mồi của gen 16S rDNA...................................... 27
3.1.4. Tinh sạch sản phẩm PCR gen 16S rDNA.............................................. 28
3.1.5. Giải trình tự gen 16S rDNA của 6 chủng xoắn khuẩn .......................... 29
3.1.6. Phân tích và xây dựng cây phát sinh chủng loại của 6 chủng xoắn
khuẩn ............................................................................................................... 30

3.2. Xác định sự có mặt của các gen LigA, LipL32, LigB, OmpL1, LipL21, LipL41
............................................................................................................. 34
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................................. 41
1. Kết luận ....................................................................................................... 41
2. Đề nghị ........................................................................................................ 41
TÀI LIỆU THAM KHẢO................................................................................. 1
PHỤ LỤC


5

DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT
bp

Base pair

dH2O

Nước khử ion

DNA

Deoxyribonucleic acid

dNTPs

deoxyribonucleotide triphosphates

EDTA


Ethylene Diamine Tetraacetace Axit

EMJH

Ellinghausen - McCullough-Johnson-Harris

EtBr

Ethidium Bromide

F-

Forward Primer : Mồi xuôi

R-

Reverse Primer: Mồi ngược

Kb

Kilobase

L.

Leptospira

MLST

Multilocus Sequence Typing


OMP

Protein ngoài màng (outer membrane protein)

PCR

Polymerase Chain Reaction

RNA

Ribonucleic acid

SDS

Sodium Dodecyl Sulfate

TAE

Tris-acetate-EDTA


DANH MỤC BẢNG
Bảng

Tên bảng

Trang

2.1


Danh mục các thiết bị đã sử dụng

17

2.2

Thành phần phản ứng nhân gen

21

3.1

3.2
3.3

Giá trị mật độ quang phổ hấp thụ ở bước sóng 260nm
và 280nm của 6 chủng Leptospira
Trình tự cặp mồi dùng để nhân các đoạn gen
Các loài Leptospira quốc tế tham khảo từ cơ sở dữ
liệu GenBank

25

27
30


DANH MỤC HÌNH
Hình


Tên hình

Trang

1

Leptospira interrogans

4

2

Chu kì nhiệt của phản ứng PCR nhân gen

21

3.1

Hình ảnh điện di DNA tổng số của 6 chủng Leptospira

24

3.2

Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen mã hóa rRNA 16S

28

3.3


Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen mã hóa rRNA 16S
tinh sạch

29

3.4

Hình ảnh cây phát sinh chủng loại của 6 chủng xoắn khuẩn

32

3.5.a

Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen LigA

35

3.5.b

Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen LipL32

35

3.5.c

Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen LigB

36

3.5.d


Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen OmpL1

36

3.5.e

Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen LipL21

37

3.5.f

Hình ảnh điện di sản phẩm PCR nhân gen LipL41

37


8

MỞ ĐẦU
1. Đặt vấn đề
Bệnh Leptospirosis (bệnh Xoắn khuẩn) là một trong những bệnh truyền nhiễm cấp
tính, lan truyền từ động vật sang người phổ biến trên thế giới, được Tổ chức Sức khỏe động
vật Thế giới (World Organisation for Animal Health- OIE) xếp vị trí thứ 2 trong nhóm
bệnh nguy hiểm và được bổ sung vào nhóm bệnh nghề nghiệp ở Việt Nam. Nguyên nhân
gây ra bởi một loại xoắn khuẩn Leptospira interrogans.
Leptospira interrogans là loài gây bệnh thường kí sinh ở người và động vật, bao gồm
hơn 200 typ, được chia thành 23 nhóm (trong đó Leptospira interrogans serovar
Icterohaemorrhagiae thường gặp nhất). Xoắn khuẩn này có khả năng gây bệnh trên động

vật và có thể lây sang người. Bệnh do xoắn khuẩn gây ra còn gọi là bệnh vàng da, nó gây
ảnh hưởng đến các cơ quan và có thể gây sẩy thai ở thú nuôi. Bệnh xoắn khuẩn lây nhiễm
sang người qua niêm mạc, da, mắt hoặc các màng nhầy tiếp xúc trực tiếp hay gián tiếp với
nước tiểu hoặc mẫu mô động vật mắc bệnh. Bệnh phát triển ở khắp mọi nơi trên thế giới,
gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi và ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe của con
người. Do tính đa dạng về triệu chứng nên bệnh Leptospirosis khó chẩn đoán và tỷ lệ tử
vong cao. Việc điều trị bệnh này rất khó khăn nên đòi hỏi những biện pháp phòng ngừa
bệnh có hiệu quả cao.Vì vậy, việc sản xuất vắc xin phòng bệnh do xoắn khuẩn Leptospira
là một yêu cầu cấp thiết.
Trong quá trình nghiên cứu ứng dụng, các nhà khoa học đang tập trung vào các loại
vắc xin có khả năng phòng chống dịch bệnh mang tính dịch tễ vùng, an toàn, mức độ bảo
hộ cao và lâu dài, giá thành hạ, đảm bảo sức khỏe cộng đồng và động vật. Đặc biệt quan
tâm với loại vắc xin nhược độc được thiết kế dựa trên cơ sở trình tự gen và các yếu tố độc
lực của các tác nhân gây bệnh để tối ưu hóa mức độ an toàn của các loại vắc xin. Đây là
một bước đột


phá thực sự, ứng dụng công nghệ di truyền trong chế tạo vắc xin nói chung và vắc xin
Leptospirosis nói riêng.
Thực tế, nhiều protein ngoài màng của xoắn khuẩn Leptospira đã được tìm thấy và sử
dụng trong công nghệ chế tạo vắc xin tái tổ hợp. Quá trình tách chiết, tái tổ hợp và tinh
sạch các protein này đơn giản, hơn nữa protein tái tổ hợp có giá trị tương tự như kháng
nguyên trong xét nghiệm miễn dịch để phát hiện xoắn khuẩn Leptospira. Kết quả thực
nghiệm cho thấy vắc xin tái tổ hợp phòng bệnh xoắn khuẩn có miễn dịch cao hơn so với
các loại vắc xin thông thường. Do đó, những nghiên cứu về các gen quyết định kháng
nguyên tiềm năng, công thức tối ưu, tá dược, liều lượng và liệu trình để phát triển các loại
vắc xin phòng bệnh xoắn khuẩn đạt hiệu quả cao, an toàn cho người và động vật sử dụng là
rất cần thiết. Việc cải thiện chất lượng vắc xin tái tổ hợp DNA và vắc xin protein thực sự
quan trọng đối với các ứng dụng thực tế. Hơn nữa, việc nghiên cứu các protein màng sẽ
đóng góp vào cơ sở dữ liệu di truyền học, có ý nghĩa thiết thực đối với các nhà khoa học và

sản xuất liên quan đến vắc xin phòng bệnh do xoắn khuẩn Leptospira.
Xuất phát từ thực tiễn đó, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Xác định một số gen
mã hóa yếu tố quyết định kháng nguyên của xoắn khuẩn Leptospira interrogans gây
bệnh Leptospirosis tại Việt Nam” nhằm tạo cơ sở cho việc nghiên cứu, sản xuất vắc xin
tái tổ hợp phòng bệnh do xoắn khuẩn Leptospira interrogans tại Việt Nam.
2. Mục tiêu nghiên cứu
- Định danh được 6 chủng xoắn khuẩn Leptospira interrogans gây bệnh
Leptospirosis, đang sử dụng chế vắc xin vô hoạt ở Việt Nam.
- Xác định được một số gen quyết định kháng nguyên tiềm năng, có giá
trị ứng dụng trong chế vắc xin tái tổ hợp chống lại bệnh gây ra do xoắn khuẩn
Leptospira interrogans tại Việt Nam.


3. Nội dung nghiên cứu
- Giải trình tự gen 16S rDNA và xây dựng sơ đồ phân loại hình cây của 6 chủng xoắn
khuẩn Leptospira gây bệnh Leptospirosis, đang sử dụng chế vắc xin vô hoạt ở Việt Nam.
- Xác định sự có mặt của một số gen mã hóa kháng nguyên trên 6 chủng xoắn khuẩn
Leptospira gây bệnh Leptospirosis, đang sử dụng chế vắc xin vô hoạt ở Việt Nam.


CHƯƠNG I
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Đặc điểm của xoắn khuẩn Leptospira
Đặc điểm sinh vật học: Xoắn khuẩn Leptospira có hình thể rất mảnh, đường kính
0,1- 0,2μm, dài 5- 25μm. Quan sát dưới kính hiển vi nền đen thấy vi khuẩn di động mạnh.
Thường nhuộm theo phương pháp nhuộm thấm bạc Fontana -Tribondeau mới phát hiện
được vi khuẩn, khi đó vi khuẩn nhìn thấy mảnh như sợi tóc, hai đầu cong như móc câu và 2
tiêm mao quanh bào chất để Leptospira có thể chui sâu vào mô vật chủ. Dưới kính hiển vi
điện tử phóng đại khoảng x 10.000 lần mới thấy các vòng xoắn nhỏ (15 - 30 vòng), sát
nhau như một sợi chỉ lóng lánh bạc, di động nhanh theo kiểu xoáy và bật thẳng như lò xo.

Xoắn khuẩn có khả năng xuyên qua da và niêm mạc, nhất là da bị xây xước. Bắt màu Gram
âm, ưa khí, mọc chậm ở các môi trường nuôi cấy, pH thích hợp
7,2-7,5; không thể phát triển trong điều kiện axít; nhiệt độ 28-300C (nhưng cũng
có thể nuôi cấy ở nhiệt độ tối đa là 390C và nhiệt độ tối thiểu là 13 - 150C)
( />
Hình 1. Xoắn khuẩn Leptospira interrogans
( />

Khi nuôi cấy trên môi trường thạch máu hoặc các môi trường thông thường, nếu
không bổ sung 5 - 10% huyết thanh thỏ, xoắn khuẩn không mọc được. Ngoài ra, giống như
các loài vi khuẩn khác, xoắn khuẩn cũng cần sắt để phát triển. Hiện nay có nhiều loại môi
trường bổ sung albumin huyết thanh bò (bovine serum albumin - BSA) dùng để nuôi cấy,
phân lập xoắn khuẩn, ví dụ môi trường thạch bán cố thể (0,1 - 0,2 thạch) có BSA + Tween
80 (môi trường EMJH - Ellinghausen McCullough - Johnson - Harris) hoặc môi trường có
BSA
+ hỗn hợp Tween 80 và Tween 40. Để hạn chế tạp nhiễm cho thêm vào môi trường các
chất như 5 - fluorouracil, fosfomycin hoặc hỗn hợp gồm rifamycin, polymycin, neomycin,
5 - fluorouracil, bacitracin và actidione; tuy nhiên các loại môi trường này có thể gây khó
khăn trong việc phân lập xoắn khuẩn nếu số lượng xoắn khuẩn ít hoặc một số chủng xoắn
khuẩn không mọc được trong môi trường có nhiều kháng sinh. Có thể quan sát rõ các
chủng xoắn khuẩn gây bệnh mọc sau khi nuôi cấy 5 - 7 ngày; trong khi đó các loài sống
hoại sinh có thể mọc trong vòng 2 - 3 ngày. Thời gian nuôi cấy tùy thuộc vào thời gian mọc
khác nhau của các serovar Leptospira, ví dụ L. interrogans serovar Pomona và L.
interrogans serovar Grippotyphosa cho kết quả sau 7 - 10 ngày nuôi cấy nhưng các chủng
khác như L. interrogans serovar Hardjo và L. interrogans serovar Bratislava có thể lâu hơn,
lâu nhất sau 26 tuần.
Xoắn khuẩn Leptospira có sức đề kháng yếu nhưng còn cao hơn so với các loại xoắn
khuẩn khác, bị diệt ở nhiệt độ 500C/10 phút. Ánh sáng và các thuốc khử trùng thông
thường như phenol, nước javen dễ diệt được Leptospira. Tuy vậy, xoắn khuẩn Leptospira
chịu được lạnh và sống được lâu ở nước tới 3 tuần; sống dai dẳng trong bùn lầy, nước

đọng với pH bazơ (pH=7,7), tốt nhất là nước cống, rãnh, ruộng đồng, khe suối.
( />

Về phân loại thì xoắn khuẩn Leptospira thuộc giới Monera, ngành Spirochaetes, họ
Leptospiraceae, giống Leptospira. Người ta phân ra thành các loài gây bệnh, loài không
gây bệnh và loài trung gian. Dựa vào cấu trúc kháng nguyên mà phân loại thì Leptospira
được chia ra làm 23 nhóm, bao gồm 230 typ huyết thanh; mỗi typ huyết thanh có các
kháng nguyên đặc hiệu. Một typ huyết thanh có thể gây nhiều bệnh cảnh khác nhau.
Ngược lại, một bệnh cảnh lâm sàng có thể do bất kỳ typ nào trong nhóm gây bệnh tạo nên.
Các typ huyết thanh có nhiều yếu tố kháng nguyên trùng chéo, gây khó khăn cho chẩn
đoán. Có ít nhất 5 typ huyết thanh có tầm quan trọng tại Mỹ và Canada, tất cả đều gây
bệnh ở chó (với các thuật ngữ Icterohaemorrhagiae, Canicola, Pomona, Grippotyphosa và
Bratislava). Ở Việt Nam thường gặp 12 typ huyết thanh sau: L. interrogans serovar
Australis, L. interrogans serovar Canicola, L. interrogans serovar Autumnalis, L.
interrogans

serovar Grippotyphosa, L. interrogans serovar Bataviae, L. interrogans

serovar Hebdomalis, L. interrogans serovar Icterohaemorrhagiae, L. interrogans serovar
Ponoma, L. interrogans serovar Mitis, L. interrogans serovar Saxkoebing 6, L. interrogans
serovar Poi, L. interrogans serovar Sejroe.Trong đó, 6 typ gây bệnh đang sử dụng làm vắc
xin vô hoạt ở Việt Nam là: L. interrogans serovar Pomona, L. interrogans serovar
Canicola, L. interrogans serovar Mitis, L. interrogans serovar Icterohaemorrhagiae, L.
interrogans serovar Bataviae và L. interrogans serovar Grippotyphosa.
( qn/vn/portal/InfoDetail.jsp?
area=58&cat=1066&ID=2240 )
1.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
1.2.1. Tình hình bệnh Leptospirosis
Bệnh do xoắn khuẩn Leptospira interrogans gây ra, được phát hiện đầu
tiên vào năm 1850 trên chó tại Stuttgart (Đức). Khi đó, bệnh được gọi là bệnh



vàng da truyền nhiễm. Năm 1886, Adolf Weil ở Heidelberg (Đức) đã mô tả dấu hiệu lâm
sàng của bệnh này là sốt phát ban, sưng mật, đặc biệt bệnh xuất hiện đột ngột kèm theo
lách to, vàng da và viêm thận. Đến đầu thế kỷ 20, những thuật ngữ được sử dụng để mô tả
bệnh Leptospirosis bao gồm sốt xuất huyết Java, sốt bảy ngày, sốt mùa thu, bệnh Akiyama
và sốt đầm lầy [9].
Năm 1915, Inada và cộng sự đã xác định Leptospira interrogans serovar
Icterohaemorrhagiae là tác nhân gây bệnh Weil ở Nhật Bản [32] và cũng được Hiibener và
Reiter xác nhận tại Đức [31]. Inada và cộng sự (1918) đã phát hiện serovar L. interrogans
serovar Hebdomadis gây sốt 7 ngày ở Nhật Bản [33]. Những nghiên cứu tiếp theo đã tìm
thấy hàng loạt các serovars khác nhau của Leptospira như L. interrogans serovar
Pyrogenes (1923), L. interrogans serovar Bataviae (1926), L. interrogans serovar
Grippotyphosa (1928) [12]. Đến nay, người ta đã phát hiện ra hơn 230 serovars khác nhau
của Leptospira interrogans ở khắp nơi trên thế giới [60].
Bệnh Leptospirosis lây nhiễm sang người qua niêm mạc, da, mắt hoặc các màng nhầy
tiếp xúc trực tiếp hay gián tiếp với nước tiểu hoặc mẫu mô động vật mắc bệnh. Các triệu
chứng thường gặp của bệnh Leptospirosis là cơ bắp chân đau, sốt cao đột ngột, rét run, sốt
liên tục hoặc kèm theo mạch nhanh, huyết áp dao động, mệt nhiều, đau đầu, nhức mắt,
buồn nôn và nôn, trường hợp nặng có biểu hiện li bì, vật vã, mê sảng. Sau khi qua da và
niêm mạc, xoắn khuẩn Leptospira vào máu, gây nhiễm khuẩn huyết, giai đoạn khởi phát
này kéo dài khoảng 5-7 ngày. Sau đó, xoắn khuẩn khu trú và gây bệnh ở gan, thận, màng
não, tim, phổi, thượng thận. Bệnh nhân có triệu chứng vàng da do độc tố xoắn khuẩn hủy
diệt hồng cầu và gây viêm tổ chức trung diệp ở gan. Gan to ra, xung huyết, xuất huyết vi
thể, các bè gan đảo lộn, có thể có ổ hoại tử và xuất huyết rải rác (có thể nhầm lẫn áp xe
gan). Xoắn khuẩn cũng gây tổn thương ống thận, dẫn đến thiểu niệu và vô niệu, tăng urê và
creatinin máu - nguyên nhân chính làm bệnh nhân tử vong. Thận bệnh nhân to ra, đôi khi
có xuất huyết, các tế bào



phình lên và hoại tử, gây bít tắc, khe thận bị phù và xâm nhiễm tế bào đơn nhân (dễ bị chẩn
đoán nhầm với viêm gan virus, sốt xuất huyết dengue hoặc nhiễm khuẩn huyết).
Leptospira trong giai đoạn hoại huyết có thể đến cơ quan sinh dục gây rối loạn sinh sản.Về
mức độ nguy hiểm của nhiễm xoắn khuẩn Leptospira, tuy ít ảnh hưởng trực tiếp đến tính
mạng của người bệnh, song gây ra các tổn thương ở nhiều cơ quan, trong đó đáng chú ý
đến triệu chứng hoại tử cơ, hoại tử ống thận cấp có thể gây suy thận cấp, tổn thương các
mô, gan, viêm và xuất huyết khu trú ở tim, phổi; gây tổn thương (không nguy hiểm lắm) ở
não và màng não. Đặc biệt trên cơ địa phụ nữ mang thai thì khi nhiễm xoắn khuẩn
Leptospira có thể gây ra sẩy thai [4].
Theo các chuyên gia nghiên cứu về Leptospira thì bệnh này có ở mọi nơi trên thế
giới, nhiều nhất ở Châu Phi, Nam Mỹ, Châu Á, gây thiệt hại đáng kể cho ngành chăn nuôi
và ảnh đến sức khỏe con người ở nhiều quốc gia, đặc biệt là các nước vùng nhiệt đới [8],
[9], [62].
Một số gia súc nhiễm Leptospira nhưng không thể hiện triệu chứng lâm sàng và đây
là nguồn truyền lây mầm bệnh. Một số loài gặm nhấm như chuột là loài vật trung gian
mang trùng nguy hiểm nhất [40]. Mặc dù, các loài chuột là vật chủ chính quan trọng nhưng
cũng có nhiều loại động vật có vú khác bao gồm chó, hươu, nai, thỏ, nhím, bò, cừu, gấu
trúc, thú có túi, chồn và một số động vật có vú ở biển có thể mang và truyền bệnh như là
vật chủ phụ. Ở châu Phi, mèo Banded Mongooses đã được xác định là ổ chứa mang mầm
bệnh, ngoài ra còn có một số vật chủ hoang dã khác ở châu Phi cũng có khả năng mang
mầm bệnh. Chó có thể liếm nước tiểu của động vật bị nhiễm bệnh thải ra cỏ hoặc đất hoặc
uống nước bị nhiễm bệnh. Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng loài “chó nhà” nhiễm
Leptospirosis do thói quen liếm nước tiểu của chuột bị nhiễm bệnh đi vào nhà. Tuy không
lây lan mạnh và làm chết nhiều chó như dịch Carre, Parvo, nhưng nếu mắc nhiễm sẽ bị
viêm gan, báng bụng, vàng da,


rối loạn toàn thân và tử vong. Nguy cơ lây bệnh Leptospirosis cho người rất cao qua tiếp
xúc với nước tiểu từ những con vật bị bệnh [61].
Tỷ lệ mắc bệnh Leptospirosis hàng năm là khác nhau từ 0,02/100.000 dân ở các quốc

gia vùng khí hậu ôn đới và 100/100.000 dân ở vùng khí hậu nhiệt đới. Theo Tổ chức Y tế
Thế giới (WHO) ước tính hàng năm trên thế giới có từ
7 đến 10 triệu người nhiễm xoắn khuẩn vàng da. Do tính đa dạng của các triệu chứng, bệnh
do xoắn khuẩn Leptospira khó chẩn đoán nên tỉ lệ tử vong tại một số vùng có thể lên đến
20%-25% [44]. Ở các nước đang phát triển, những người mắc bệnh chủ yếu là nông dân và
người nghèo ở các thành phố. Ở các nước phát triển, những người thường phải làm việc
ngoài trời ở những nơi ấm và ẩm thấp thường có nguy cơ nhiễm bệnh [7]. Người mắc bệnh
ngẫu nhiên chứ không phải là nguồn bệnh. Tuy nhiên một số tác giả cho rằng, có sự lây
truyền từ người sang người do thải xoắn khuẩn qua đường nước tiểu của người bệnh hoặc
lây qua đường tiêu hóa: qua thức ăn, nước uống không đun sôi, nấu chín, bị ô nhiễm. Cá
biệt, bệnh có thể lây qua đường hô hấp do hít phải các giọt nước nhiễm khuẩn ở dạng khí
dung.
Xoắn khuẩn Leptospira rất khó tiêu diệt vì nó đa dạng về nguồn nhiễm, như động vật
ở ao hồ, động vật hoang dã và đặc biệt là động vật nuôi trong gia đình, đồng thời xoắn
khuẩn Leptospira có thể tồn tại rất lâu trong môi trường tự nhiên. Hơn nữa, bệnh này càng
khó kiểm soát ở những nước nông nghiệp phát triển (do có đàn gia súc đông) và tình trạng
vệ sinh môi trường kém (tạo điều kiện mầm bệnh phát triển) [65]. Bệnh xoắn khuẩn có thể
lây sang người qua tiếp xúc với thú bệnh khi da, niêm mạc bị trầy xướt hay da nguyên lành
nhưng bị ngâm nước lâu làm giãn nở các lỗ chân lông, xoắn khuẩn có thể chui qua da và
gây bệnh. Sự truyền lây còn xảy ra do sự vấy nhiễm của động vật nhiễm bệnh với các
nguồn nước, thực phẩm hay ngay cả chỗ nằm ô nhiễm, chó tiếp xúc với môi trường bị vấy
nhiễm này cũng lây bệnh. Nước tù đọng hay chảy chậm là môi trường sống thích hợp cho
xoắn khuẩn Leptospira tồn tại lâu.


Có thể chẩn đoán bệnh bằng cách tìm kháng thể chống lại vi khuẩn hoặc tìm DNA
của vi khuẩn trong máu hay nước tiểu bệnh nhân, động vật mang mầm bệnh [35]. Chẩn
đoán huyết thanh học là phương pháp phổ biến được sử dụng để chẩn đoán bệnh do xoắn
khuẩn gây ra. Các phương pháp chẩn đoán khác như sử dụng kính hiển vi tụ quang nền
đen, phản ứng miễn dịch huỳnh quang, PCR, phương pháp nuôi cấy, chẩn đoán biến đổi vi

thể cũng được sử dụng. Tuy nhiên, kỹ thuật PCR dùng để phát hiện chuỗi DNA của
Leptospira chỉ thực hiện ở các trung tâm lớn. Có nhiều cặp mồi (primer) khác nhau đã
được thiết lập, trong đó một số đặc hiệu ở mức giống Leptospira nhưng một số loại đặc
hiệu ở mức serovar.
1.2.2. Tình hình nghiên cứu vắc xin phòng bệnh Leptospirosis
Các nỗ lực phòng bệnh bao gồm trang bị bảo vệ để không tiếp xúc với động vật có
nguy cơ nhiễm bệnh, vệ sinh sạch sẽ sau khi tiếp xúc và tiêu diệt các loài gặm nhấm ở
những khu dân cư [52]. Việc sử dụng kháng sinh để ngừa bệnh không đem lại hiệu quả rõ
ràng [7]. Một số vắc xin dùng cho động vật để phòng vài loại xoắn khuẩn vàng da có thể
làm giảm nguy cơ lây lan sang người. Từ lâu, các nhà khoa học đã mong muốn tìm được
một loại vắc xin hiệu quả để ngăn ngừa bệnh do xoắn khuẩn Leptospira thông qua tiêm
chủng cho người và động vật có nguy cơ lây nhiễm cao. Qua nhiều thập kỷ nghiên cứu với
chi phí hàng triệu đô la, các nhà khoa học đã tìm được một số loại vắc xin phòng bệnh
Leptospirosis. Tuy nhiên cho đến nay, các loại vắc xin để phòng bệnh này vẫn còn hạn chế
và chưa đạt hiệu quả cao trong ứng dụng lâm sàng [64].
Một số loại vắc xin phòng bệnh Leptospirosis như: vắc xin sống [41], [15], vắc xin
lipopolysaccharide (LPS) [22], [54], vắc xin lipoprotein [16] [37], [58], vắc xin protein
màng ngoài (OMPs), [25], [46] và vắc xin các yếu tố độc lực tiềm năng [55], [68]. Hiện
nay, ở một số nước như Nhật Bản, Cuba và Trung Quốc đã có vắc xin phòng chống bệnh
Leptospirosis cho người tuy nhiên chưa


được cấp phép sử dụng rộng rãi do cần phải tiếp tục nghiên cứu về độ an toàn của vắc xin
này. Vắc xin áp dụng ở động vật chỉ có một vài chủng.
Vắc xin protein tái tổ hợp là loại vắc xin có tiềm năng lớn trong phòng bệnh do xoắn
khuẩn Leptospira. Vắc xin protein tái tổ hợp được xây dựng với phương pháp công nghệ
sinh học hiện đại [49], [58], [59] nhưng trong đó vắc xin OMPs tái tổ hợp, vắc xin
lipoprotein và vắc xin các yếu tố độc lực tái tổ hợp được quan tâm hơn cả. Những đặc
trưng bảo vệ của vắc xin tái tổ hợp đã được kiểm nghiệm, bao gồm: OmpL1, LipL41 [18],
[29], hemolysis-associated protein 1 (Hap1) [14], và protein miễn dịch (Lig) [48]. Năm

1993, lần đầu tiên OmpL1 được báo cáo [27]. Sáu năm sau đó, nghiên cứu trên chuột mô
hình đã chứng minh tác dụng gây miễn dịch của 2 loại vắc xin OmpL1 và LipL41 [29]. Vào
năm 2002, LigA được mô tả như một globulin miễn dịch giống protein [48], sau đó các
phản ứng miễn dịch của protein LigA, LigB cũng được xác nhận [37], [49], [59]. Hơn nữa,
gen Lig đã được chứng minh là hữu ích trong việc phát hiện bệnh xoắn khuẩn [47]. Một số
protein ngoài màng khác như LAg42, Loa22 [36], Lk73.5 [10] cũng được công nhận là
nguyên liệu trong việc tạo vắc xin phòng bệnh do xoắn khuẩn Leptospira, tuy nhiên chúng
vẫn chưa được tiến hành thử nghiệm trong các mô hình động vật để phát triển thành vắc
xin.
Lipoprotein là protein quan trọng trong Leptospira, những protein có nhiều ở màng
ngoài và chúng được gắn thông qua các axit béo. Mặc dù khó khăn trong việc sản xuất
lipoprotein do hệ thống biểu hiện dị hợp, nhưng một số loại lipoprotein như LipL41 [26],
LipL32 [28], LipL45 [43] và LipL21 [17] đã được khẳng định là nguồn nguyên liệu thích
hợp cho việc tạo ra vắc xin lipoprotein tái tổ hợp. Ngoài ra, glucoproteins (GPLs) cũng
được dự đoán là một trong những gen tiềm năng, do khả năng sản xuất ra các yếu tố hoại tử
khối u, interleukin-10 và CD69 [21]. Loại GPLs này xuất hiện trong cả chủng gây bệnh L.
interrogans hoặc chủng không gây bệnh L. biflexa. Trong một vài công


trình nghiên cứu trước đây đã có báo cáo về yếu tố độc lực của Leptospira, bao gồm FlaA,
FlaB [52], Hsp58 [51], SphH [38], [39] và ChpK [53] đều có thể được coi là nguồn nguyên
liệu để sản xuất vắc xin phòng bệnh Leptospirosis. Gen mã hóa yếu tố độc lực FlaB (gen
flab) có thể được khuếch đại từ hệ gen DNA của nhiều chủng. Tuy nhiên, một số kết quả
nghiên cứu đã chỉ ra hàng loạt các protein ngoài màng (LAg42, Loa22, Lk73.5),
lipoprotein (LipL32, LipL45, LipL21 và GLP) và các yếu tố độc lực mới được phát hiện
(Hsp58, flaA, Flab, SphH và ChpK) có thể giúp chúng ta tìm thấy vắc xin phù hợp hơn
[44], [50], [67]. Bởi vì hệ gen của L. interrogans chủng Icterohaemorrhagiae Lai [55] và
L. interrogans chủng Copenhageni [45] có biểu hiện dị hợp của OMPs, điều này mở ra
một tiềm năng mới cho việc phát triển vắc xin [70]. Do vậy, vắc xin phòng bệnh xoắn
khuẩn nói riêng cũng như các loại vắc xin khác nói chung đã, đang và sẽ được nghiên

cứu xa hơn để tạo một bức tường bảo vệ con người và động vật khỏi những tác nhân gây
bệnh.
1.3. Tình hình nghiên cứu trong nước
1.3.1. Tình hình bệnh Leptospirosis
Tại Việt Nam, bệnh được Ragiot và Souchard phát hiện lần đầu tiên trên
người năm 1931. Tiếp đó, dịch bệnh bùng phát ở Lai Châu (1964) gây thiệt hại nhiều gia
súc và nhiễm cho cả người [3]. Bệnh Leptospirosis trên gia súc được nghiên cứu từ rất sớm
(1968-1978), đã có nhiều tác giả nghiên cứu về bệnh, như Đào Trọng Đạt (1966), Lê Đại
(1972), Phạm Quân (1976), Vũ Đình Hưng (1979), Nguyễn Thị Nhân (1999) và gần đây là
Vũ Đạt, Lê Huỳnh Thanh Phương (2001). Các tác giả đã tập trung nghiên cứu tình hình
nhiễm Leptospira ở một số loài gia súc, trong đó có bệnh xảy ra ở lợn. Theo một số tác
giả, các loại gia súc và người chăn nuôi nhiễm xoắn khuẩn Leptospira với tỷ lệ 21 56%. Các serovar Leptospira interrogans thường gặp ở gia súc là
Grippotyphosa, Australis, Icterohaemorrhagiae, Pomona, Hebdomadis [5].


Nguồn lây là các súc vật mang xoắn khuẩn Leptospira và nước tiểu của chúng. Xoắn
khuẩn Leptospira bài tiết từ cơ thể gia súc ra bên ngoài cùng với nước tiểu làm ô nhiễm
môi trường xung quanh, trong đó có nguồn nước. Trong nước, xoắn khuẩn Leptospira
không chỉ tồn tại mà còn sinh sản và giữ nguyên đặc tính gây bệnh. Ổ chứa mầm bệnh
thường là các loài gặm nhấm (chuột), chúng luôn đào thải xoắn khuẩn Leptospira hoặc gia
súc (trâu, bò, ngựa…). Ở nước ta, bệnh hay gặp ở những người làm việc trong rừng và gần
rừng như bộ đội (biên giới), công nhân địa chất, lâm nghiệp, hầm mỏ, công nhân chăn nuôi
và nông dân qua da bị xây xát, qua vết thương hoặc qua niêm mạc do tiếp xúc trực tiếp hay
gián tiếp với nguồn lây.
Bệnh xoắn khuẩn vàng da cũng lưu hành rộng rãi ở nông thôn, thành thị, miền núi,
đồng bằng, ven biển... Các vùng sinh thái khác nhau có tỷ lệ nhiễm Leptospira khác nhau
và dao động từ 19,45% đến 31,31%. Khoảng 20 năm trước đây, nhiều nơi có dịch xoắn
khuẩn vàng da ở súc vật nuôi, nhất là lợn trong các trại chăn nuôi và lây sang người. Trong
những năm gần đây, nguy cơ bùng phát dịch bệnh nhiễm xoắn khuẩn Leptospira có chiều
hướng ngày càng gia tăng do tình hình vệ sinh môi trường thấp kém, úng ngập thường

xuyên, kéo dài và hệ thống kiểm soát bệnh gia súc còn yếu kém. Bệnh gây thiệt hại nặng
về kinh tế, đặc biệt ở những đàn gia súc sinh sản. Trên các đàn sinh sản, bệnh là nguyên
nhân gây giảm khả năng sinh sản, sẩy thai; lợn con sau khi sinh ra chậm lớn, còi cọc.
Ở người, theo bác sĩ Lê Công Tảo, Phó trưởng khoa Sốt rét, Ký sinh trùng động vật
(Trung tâm Y tế dự phòng Hà Nội) cho biết, Leptospirosis vốn được coi là bệnh ở các vùng
núi, đầm lầy, nông thôn, nhưng hiện nay đã tràn xuống vùng địa hình dân cư đông đúc,
nghèo nàn tại các thành phố lớn [4]. Mỗi năm ở Hà Nội có 10 - 15 người mắc. Từ tháng
4/1999 đến 12/2002, tại thành phố có
28 ổ dịch trên người. Tại các khu dân cư, bến xe, bến tàu (nơi cư ngụ lý tưởng của chuột)
nguy cơ bùng phát dịch nhiễm xoắn khuẩn Leptospira là rất lớn. Do


vậy, dịch bệnh xoắn khuẩn Leptospira vẫn là một vấn đề sức khỏe cấp thiết cần quan tâm
tại Việt Nam [2].
Hiện nay, Việt Nam vẫn nằm trong vùng dịch tễ học cao của bệnh xoắn khuẩn [6].
Nghiên cứu dịch tễ học mô tả sử dụng số liệu hồi cứu cho thấy, tổng số ca mắc xoắn khuẩn
được ghi nhận tại Việt Nam giai đoạn 2002-2011 là 369 ca và không có trường hợp tử
vong. Người mắc bệnh mang tính chất nghề nghiệp rõ: công nhân làm vệ sinh cống rãnh,
công nhân chăn nuôi, cán bộ địa chất, lâm nghiệp hay mắc bệnh. Mặc dù bệnh này luôn
tiềm ẩn nguy cơ lây nhiễm cao cho người và động vật, nhưng lâu nay ít được chú ý cả về
mặt pháp luật cũng như về nhận thức của nhân dân. Việc mua bán gia súc bừa bãi không
được kiểm tra chặt chẽ về mặt thú y làm cho nguy cơ nhiễm bệnh ở gia súc ngày một tăng,
đồng thời nguy cơ lây nhiễm sang người cũng tăng theo [1].
1.3.2. Tình hình nghiên cứu vắc xin phòng bệnh Leptospirosis
Như đã nói ở trên, việc điều trị bệnh này là rất khó khăn chính vì vậy cần có những
biện pháp phòng ngừa bệnh có hiệu quả cao. Do đó, sản xuất vắc xin phòng bệnh do xoắn
khuẩn Leptospira là một yêu cầu cấp thiết. Tại Việt Nam hiện có một số cơ sở đã sản xuất
các loại vắc xin Leptospirosis, như vắc xin Leptospira vô hoạt của Công ty cổ phần thuốc
thú y Trung ương (Vetvaco). Kháng nguyên là vi khuẩn Leptospira được vô hoạt bằng
methiolat bao gồm 6 chủng: L. interrogans serovar Pomona, L. interrogans serovar

Canicola, L. interrogans serovar Mitis, L. interrogans serovar Icterohaemorrhagiae, L.
interrogans serovar Bataviae và L. interrogans serovar Grippotyphosa. Chúng tương đồng
về mặt kháng nguyên với đa số các chủng gây bệnh Leptospirosis đang lưu hành tại Việt
Nam. Với 2 lần tiêm cho gia súc, nhưng thời gian tạo miễn dịch bảo hộ chỉ trong vòng 6
tháng. Hoặc vắc xin vô hoạt PALATO.VACL của Công ty cổ phần Nanovet, có thể phòng 3
bệnh: khô thai, sẩy thai truyền nhiễm và Leptospirosis. Tương lai của việc phát triển vắc
xin


phòng bệnh Leptospirosis là tìm ra một loại có khả năng phòng bệnh cho một số lượng lớn
người khỏe mạnh và động vật để làm tăng khả năng kháng bệnh, như vậy, vắc xin phải có
độ an toàn cao [19], [24]. Tuy nhiên, hiện nay tại Việt Nam chỉ đang lưu hành 2 loại vắc
xin Leptospirosis vô hoạt và nhược độc phòng bệnh cho gia súc. Trong đó, các vắc xin
nhược độc được thực hiện bằng cách tiêm truyền các xoắn khuẩn đã được giảm độc lực vào
vật chủ với hi vọng giúp vật chủ tạo kháng thể chống lại bệnh xoắn khuẩn nhưng không
kích thích sự phát triển của các loại xoắn khuẩn này đủ để gây bệnh cho cơ thể đó. Vắc xin
vô hoạt Leptospirosis đã được nghiên cứu rộng rãi trong thập kỷ 70-80 của thế kỷ 20.
Những năm gần đây, việc sử dụng kết hợp cả vắc xin nhược độc và vô hoạt trong phòng
bệnh cho hiệu quả phòng bệnh cao hơn nhưng để đảm bảo an toàn cho vật nuôi cũng như
cho con người, chúng ta cần đầu tư nhiều hơn nữa cho lĩnh vực nghiên cứu, sản xuất vắc
xin Leptospirosis.

CHƯƠNG II
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu nghiên cứu
6 chủng xoắn khuẩn đang được sử dụng chế vắc xin vô hoạt phòng bệnh xoắn khuẩn
Leptospirosis tại Việt Nam được nuôi cấy trong môi trường EMJH


tại Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung ương, Cục Thú y, bao gồm: L. interrogans

serovar Pomona, L. interrogans serovar Canicola, L. interrogans serovar Mitis, L.
interrogans serovar Icteroheamorrhagiae, L. interrogans serovar Bataviae và L.
interrogans serovar Grippotyphosa.
2.2. Hóa chất, thiết bị
2.2.1. Hóa chất
- Hóa chất tách DNA tổng số: gồm có đệm tách (Tris HCl 1M, pH=8,NaCl
5M, EDTA 0,5M, CTAB 4% H2O), đệm rửa (Tris HCl 1M , EDTA 0,5M, pH=8, H2O),
dung dịch phenol-chloroform-isoamyl 25:24:1, dung dịch Isopropanol,...
- Hóa chất điện di: Đệm TAE 50X: 57,1 ml CH3COOH, 100ml 0,5M EDTA, 242g
TRIS - BASE, đệm TAE 1X, agarose, loading dye, ethidium bromide (EtBr).
- Các hóa chất phục vụ nhân gen: Taq polymerase (Fermentas). Cặp mồi đặc hiệu
được thiết kế dựa trên trình tự gen đã được công bố trên ngân hàng gen quốc tế.
- Bộ kit dùng cho tinh sạch sản phẩm PCR GeneJETTM PCR Purification
Kit (Thermo Fisher Scientific Inc., USA),…và một số hóa chất khác.


2.2.2. Thiết bị
Bảng 2.1. Danh mục các thiết bị đã sử dụng
STT

Thiết bị

Nguồn gốc, xuất xứ

1

Máy PCR

Applied Biosystem - Mỹ


2

Bộ điện di

Pharmacia Biotech, Scie-plas Ltd. - Anh

3

Bể ổn nhiệt

Memmert - Đức

4

Máy ly tâm

Thermo Sci Legend Micro 21R - Mỹ

5

Máy chụp ảnh gel

Gel Logic Kodak 1500 - Mỹ

6

Máy lắc Vortex

IKA Minishaker MS1 - Đức


8

Máy đo quang phổ định
lượng

NanoDrop Lite Spectrophotometer - Mỹ

10

Tủ lạnh -20oC

Sanyo - Nhật Bản

11

Tủ lạnh -4oC

Sanyo - Nhật Bản

13

Máy lắc ấm

Hàn Quốc

14

Máy giải trình tự AB 3500

Applied Biosystems, Mỹ


15

Lò vi sóng

Sanyo - Nhật Bản

Ngoài ra còn sử dụng các trang thiết bị sinh học phân tử cần thiết khác của Viện
Nghiên cứu hệ gen - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.3. Địa điểm nghiên cứu
Các thí nghiệm được thực hiện tại phòng thí nghiệm của Viện Nghiên cứu hệ gen Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.


2.4. Phương pháp nghiên cứu
2.4.1. Phương pháp tách chiết DNA tổng số
Lấy mẫu: 6 chủng xoắn khuẩn (L. interrogans serovar Pomona, L. interrogans
serovar

Canicola,

L.

interrogans

serovar

Mitis,

L.


interrogans

serovar

Icteroheamorrhagiae, L. interrogans serovar Bataviae và L. interrogans serovar
Grippotyphosa) sẽ được nuôi cấy trong các môi trường đặc hiệu (môi trường Ellinghausen
- McCullough-Johnson-Harris (EMJH) của hãng Difco (Detroit, USA) có bổ sung 8%
huyết thanh thỏ và 0.1% agarose trong một ống
5ml) ở 28oC trong điều kiện hiếu khí, sau bảy ngày nuôi cấy sẽ được chuyển về Viện
Nghiên cứu hệ gen để tiến hành tách chiết DNA cho các nghiên cứu tiếp theo.
Tách chiết DNA tổng số từ 6 chủng xoắn khuẩn sử dụng phương pháp
phenol- chloroform theo như hướng dẫn [57]. Cụ thể:
- Xoắn khuẩn sau khi được nuôi cấy, đạt yêu cầu về số lượng, cho dung dịch nuôi
vào ống eppendorf 2ml, ly tâm 13000 vòng/phút trong 10 phút ở 4oC. Loại bỏ dung dịch
nổi ở trên, thu lấy cặn vi khuẩn ở đáy ống.
- Chuẩn bị dung dịch đệm gồm: 10% SDS, Tris (100 mM), EDTA (50 mM), 3 µl của
proteinase - K 20 µg/ml, 5 µl của RNase A 20 µg/ml, cho vào ống eppendorf 1,5ml có
chứa cặn xoắn khuẩn, ủ ở 37oC trong 1 giờ.
- Thêm vào một lượng tương đương dung dịch phenol-chloroform- isoamyl , trộn
đều, ly tâm 12000 vòng/phút trong 5 phút ở 4oC.
- Thu lấy dung dịch bên trên cho vào ống eppendorf 1,5ml mới. Kết tủa DNA với
một lượng tương đương isopropanol, ủ ở - 20oC/30 phút. Sau đó ly tâm 12000 vòng/phút
trong 10 phút ở 4oC, lấy kết tủa sau khi ly tâm.
- Rửa kết tủa bằng ethanol 70 % được làm lạnh ở - 20 oC, nghiêng nhẹ