BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HCM
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
************

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
PHÁT HIỆN VIRUS GÂY BỆNH LÙN XOẮN
LÁ (RICE RAGGED STUNT VIRUS) TRÊN
CÂY LÚA (Oryza sativa) BẰNG PHƯƠNG
PHÁP ELISA VÀ RT-PCR

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Niên khóa: 2004 – 2008
Sinh viên thực hiện: TRỊNH QUANG VỸ

Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 10/2008


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HCM
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
************

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
PHÁT HIỆN VIRUS GÂY BỆNH LÙN XOẮN
LÁ (RICE RAGGED STUNT VIRUS) TRÊN
CÂY LÚA (Oryza sativa) BẰNG PHƯƠNG
PHÁP ELISA VÀ RT-PCR

Giáo viên hướng dẫn:

Sinh viên thực hiện:

ThS. TRẦN THỊ VIỆT HÀ

TRỊNH QUANG VỸ

ThS. NGUYỄN THỊ HOA
ThS. NGUYỄN VŨ PHONG

Thành phố Hồ Chí Minh
Tháng 10/2008


LỜI CẢM TẠ
Tôi xin chân thành cảm ơn:


Ban Giám Hiệu trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh đã tạo mọi điều
kiện cho tôi trong suốt thời gian học tập.



Các thầy cô trong Bộ môn Công Nghệ Sinh Học cùng các thầy cô đã trực tiếp
giảng dạy trong suốt bốn năm qua.



ThS. Trần Thị Việt Hà, ThS. Nguyễn Thị Hoa và ThS. Nguyễn Vũ Phong đã
tận tình hướng dẫn, truyền đạt những kinh nghiệm quý báu và tạo điều kiện tốt

nhất cho việc thực hiện và hoàn tất khoá luận tốt nghiệp.



Các anh chị thuộc Trung tâm Kiểm dịch sau nhập khẩu II, Cục Bảo vệ Thực
Vật đã quan tâm giúp đỡ trong suốt thời gian thực tập ở phòng thí nghiệm.



Các anh chị phụ trách phòng CNSH thuộc Viện nghiên cứu Công nghệ sinh học
và Môi trường, Đại học Nông Lâm Tp. HCM đã quan tâm giúp đỡ trong khoảng
thời gian thực tập phòng thí nghiệm.



Toàn thể lớp CNSH 30 và những người bạn tốt đã hỗ trợ, giúp đỡ, chia sẻ và
động viên tôi trong suốt thời gian làm đề tài.

Thành kính ghi ơn ba mẹ cùng những người thân trong gia đình luôn tạo điều kiện và
động viên con trong suốt quá trình học tập tại trường.
Tháng 10, năm 2008.

Trịnh Quang Vỹ

iii


TÓM TẮT
Trịnh Quang Vỹ, Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, tháng 10/2008.
“PHÁT HIỆN VIRUS GÂY BỆNH LÙN XOẮN LÁ (RICE RAGGED STUNT

VIRUS) TRÊN CÂY LÚA (Oryza sativa) BẰNG PHƯƠNG PHÁP ELISA VÀ RTPCR”
Hướng dẫn khoa học
ThS. TRẦN THỊ VIỆT HÀ - Trung tâm kiểm dịch sau nhập khẩu II
ThS. NGUYỄN THỊ HOA - Trung tâm kiểm dịch sau nhập khẩu II
ThS. NGUYỄN VŨ PHONG – Bộ môn Công Nghệ Sinh Học – Đại học Nông
Lâm Tp Hồ Chí Minh
Lúa gạo là cây trồng quan trọng ở nước ta. Bệnh vàng lùn, lùn xoắn lá gây tổn
thất đến năng suất và phẩm chất cây lúa mỗi năm. Bệnh rất khó phát hiện . Vì vậy yêu
cầu cấp thiết hiện nay là tìm phương pháp phát hiện bệnh nhanh nhạy và hiệu quả.
Nội dung nghiên cứu


Phát hiện virus RRSV bằng phương pháp ELISA



So sánh hiệu quả ly trích RNA tổng số của lá lúa theo qui trình Aurum TM
total RNA mini Kit và qui trình ly trích bằng TRIzol



Áp dụng phương pháp RT-PCR phát hiện virus RRSV

Kết quả đạt được


Phát hiện virus RRSV trên các mẫu lúa và mẫu rầy nhiều địa phương




Qui trình ly trích RNA tổng số bằng TRIzol có hiệu quả cao.



Đã bước đầu xây dựng qui trình RT-PCR phát hiện được virus RRSV với
cặp mồi RRSV-1.

iv


SUMMARY
Trinh Quang Vy, Nong Lam University, October, 2008. “DETECTION RICE
RAGGED STUNT VIRUS (RRSV) OF THE RICE (Oryza sativa) BY ELISA AND
RT-PCR METHOD”
Supervisor:
MSc.TRAN THI VIET HA
MSc.NGUYEN THI HOA
MSc.NGUYEN VU PHONG
Studying content


Detect RRSV by ELISA method



Extraction total RNA by Aurum TM total RNA mini Kit protocol and TRIzol
protocol




Detection RRSV by RT-PCR method

Result


Dectected RRSV in rice samples and brown planthopper (Nilaparvata
lugens) samples of many locations.



Total RNA of TRIzol protocol is high quality



RT-PCR method can dectect RRSV with primers RRSV-1.

v


MỤC LỤC
Nội dung

Trang

Cảm tạ...........................................................................................................................................iii
Tóm tắt ........................................................................................................................................ iv
Mục lục........................................................................................................................................ vi
Danh sách các chữ viết tắt .........................................................................................................ix
Danh sách các hình..................................................................................................................... x
Danh sách các bảng ...................................................................................................................xii

PHẦN 1: GIỚI THIỆU ................................................................................................. 1
1.1.

Đặt vấn đề ............................................................................................................ 1

1.2.

Mục đích – Yêu cầu ............................................................................................. 2

1.2.1.

Mục đích ........................................................................................................... 2

1.2.2.

Yêu cầu ............................................................................................................. 2

PHẦN 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................. 3
2.1.

Sơ lược về cây lúa................................................................................................ 3

2.1.1.

Phân loại thực vật ............................................................................................. 3

2.1.2.

Nguồn gốc và phân bố ...................................................................................... 3


2.1.3.

Đặc điểm thực vật học ...................................................................................... 3

2.1.4.

Các thời kì sinh trưởng, phát triển của cây lúa................................................. 4

2.1.5.

Tầm quan trọng của cây lúa.............................................................................. 4

2.1.6.

Sơ lược về các bệnh trên lúa............................................................................. 4

2.2.

Sơ lược về bệnh lùn xoắn lá lúa và tác hại của nó............................................... 5

2.2.1.

Một số hiểu biết cơ bản vể virus thực vật......................................................... 5

2.2.1.1.

Đặc tính chung của virus hại thực vật........................................................... 5

2.2.1.2.


Sự xâm nhiễm và tổng hợp virus mới ........................................................... 6

2.2.1.3.

Sự truyền bệnh ở virus thực vật .................................................................... 6

2.2.2.

Virus gây bệnh lùn xoắn lá lúa (Rice ragged stunt virus - RRSV) .................. 7

2.2.2.1.

Tên gọi và phân loại...................................................................................... 7

2.2.2.2.

Cấu trúc thể virus .......................................................................................... 8

2.2.2.3.

Cấu tạo genome của RRSV........................................................................... 9

2.2.3.

Môi giới truyền virus gây bệnh lùn xoắn lá.................................................... 10
vi


2.2.3.1.


Mô tả rầy nâu (Nilaparvata lugens) ............................................................ 10

2.2.3.2.

Vòng đời rầy nâu......................................................................................... 10

2.2.3.3.

Đặc điểm gây hại của rầy nâu ..................................................................... 11

2.2.4.

Đặc điểm của bệnh lùn xoắn lá trên lúa ......................................................... 11

2.2.5.

Triệu chứng bệnh............................................................................................ 12

2.2.6.

Tác hại về kinh tế do virus gây bệnh lùn xoắn lá gây ra ................................ 13

2.2.7.

Các phương pháp xác định bệnh ....................................................................14

2.3.

Giới thiệu về kỹ thuật ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)..........14


2.3.1.

Khái niệm .......................................................................................................14

2.3.2.

Phân loại .........................................................................................................15

2.4.

Giới thiệu về kỹ thuật PCR và RT-PCR ............................................................ 15

2.4.1.

Giới thiệu về kỹ thuật PCR............................................................................. 15

2.4.2.

Giới thiệu về kĩ thuật RT-PCR (PCR ngược)................................................. 17

2.4.3.

Tối ưu hóa các điều kiện cho phản ứng PCR ................................................. 19

2.5.

Những nghiên cứu trong nước và trên thế giới về virus RRSV......................... 20

2.5.1.


Những nghiên cứu tại Việt Nam..................................................................... 20

2.5.2.

Những nghiên cứu trên thế giới......................................................................21

PHẦN 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .................................... 22
3.1.

Thời gian và địa điểm nghiên cứu .....................................................................22

3.2.

Vật liệu và phương pháp ....................................................................................22

3.2.1.

Phương pháp lấy mẫu .....................................................................................22

3.2.2.

Phương pháp chẩn đoán virus RRSV ............................................................. 22

3.2.2.1.

Dụng cụ và thiết bị ......................................................................................22

3.2.2.2.

Hóa chất.......................................................................................................23


3.2.2.3.

Qui trình thực hiện ......................................................................................24

3.2.2.3.1. Phương pháp ELISA ................................................................................... 24
3.2.2.3.2. Phương pháp RT-PCR ................................................................................ 25
PHẦN 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ....................................................................31
4.1.

Kết quả thu được từ thí nghiệm ELISA ............................................................. 31

4.1.1.

Đánh giá tình hình nhiễm virus ở một số địa phương .................................... 31

4.1.2.

Đánh giá độ nhạy của thí nghiệm ELISA giữa kiểm tra RRSV và RGSV .... 33

4.1.3.

Tỉ lệ nhiễm RRSV với các mẫu lúa có triệu chứng điển hình........................ 35
vii


4.2.

Kết quả thu được từ thí nghiệm RT-PCR .......................................................... 37


4.2.1.

Kết quả ly trích RNA bằng Aurum TM total RNA mini Kit (Bio-rad)............ 37

4.2.2.

Kết quả ly trích RNA tổng số bằng TRIzol (qui trình IRRI cung cấp) .......... 38

4.2.3.

Đánh giá chất lượng RNA thu được............................................................... 39

4.2.4. So sánh hiệu quả ly trích giữa qui trình ly trích bằng kit Bio-rad và qui trình
ly trích bằng TRIzol .....................................................................................................40
4.2.5.

Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu của mồi dựa vào trình tự trên Genbank........... 41

4.2.6.

Kết quả RT-PCR.............................................................................................43

PHẦN 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ.........................................................................49
5.1.

Kết luận ..............................................................................................................49

5.1.1.

Kết quả thu được từ thí nghiệm ELISA.......................................................... 49


5.1.2.

Kết quả ly trích RNA tổng số .........................................................................50

5.1.3.

Kết quả RT-PCR.............................................................................................50

5.2.

Đề nghị...............................................................................................................50

TÀI LIỆU THAM KHẢO.......................................................................................................51
PHỤ LỤC

viii


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
RRSV:

Rice Ragged Stunt Virus

RGSV:

Rice Grassy Stunt Virus

ELISA:


enzyme linked immunosorbent assay.

ctv:

Cộng tác viên

DAS-ELISA: double antibody sanwich-enzyme linked immunosorbent assay
RT-PCR:

Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction

cDNA:

complementary DNA

dsRNA :

double strand RNA

DNA

deoxyribonucleic acid

dNTP

deoxyribonucleotide triphosphate

Ta:

Annealing temperature


Tm:

Melting temperature

UV:

Ultra violet

RNase:

Ribonuclease

OD:

Optical density

mRNA:

Messenger RNA

dNTP:

Deoxynucleotide triphosphate

bp:

Base pair

µg:


microgram

µl:

microlite

µM:

micromol/lite

ix


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình

Trang

Hình 2.1. RRSV quan sát dưới kính hiển vi điện tử. ...................................................... 8
Hình 2.2. Hình dạng và kích thước của RRSV ............................................................... 8
Hình 2.3: Sơ đồ cấu trúc bộ gene của RRSV. ................................................................. 9
Hình 2.4. Một số hình ảnh về rầy nâu ........................................................................... 10
Hình 2.5. Vòng đời của rầy nâu .................................................................................... 11
Hình 2.6. Triệu chứng của cây lúa nhiễm RRSV.......................................................... 13
Hình 2.7. Nguyên tắc phản ứng PCR ............................................................................16
Hình2.8. Tiến trình thực hiện RT – PCR một bước ...................................................... 17
Hình 2.9. Tiến trình thực hiện phản ứng RT – PCR hai bước ...................................... 18
Hình 2.10: Sơ đồ tổng hợp cDNA................................................................................. 18
Hình 3.1: sơ đồ bố trí các mẫu thí nghiệm kiểm tra virus RRSV bằng phương pháp

ELISA............................................................................................................................24
Hình 4.1. Phản ứng màu của thí nghiệm ELISA kiểm tra RRSV................................. 31
Hình 4.2. Bảng ELISA thử nghiệm RRSV và RGSV.................................................. 33
Hình4.3. Kết quả đo OD của các mẫu kiểm tra RGSV................................................. 34
Hình 4.4. Kết quả các mẫu kiểm tra RRSV .................................................................. 35
Hình 4.5. cây lúa có triệu chứng điển hình nhiễm RRSV thu thập ở Tiền Giang.........36
Hình 4.6. Mẫu lúa được lây nhiễm RRSV nhân tạo ở đại học Cần Thơ....................... 36
Hình 4.7. Kết quả ly trích RNA từ mẫu lá lúa bằng Aurum TM total RNA mini Kit ....37
Hình 4.8. Kết quả ly trích RNA từ mẫu lá lúa bằng TRIzol có chất lượng kém ......... 38
Hình 4.9. Kết quả điện di RNA tổng số với RNA markers........................................... 39
Hình 4.10: Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu của cặp mồi 1 ............................................... 42
Hình4.11: Kết quả kiểm tra độ đặc hiệu của cặp primer 2........................................... 42
Hình 4.12. Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi RRSV-1 và RRSV-2 ............ 43
Hình4.13. Kết quả điện di sản phẩm PCR với hai cặp mồi RRSV-1 và RRSV-2 ........ 44
Hình 4.14. kết quả điện di sản phẩm PCR với hóa chất và qui trình chuẩn của BioRad................................................................................................................................. 44
Hình 4.15. Kết quả điện di sản phẩm PCR với cặp mồi RRSV-1 cũ và RRSV-1 được
tổng hợp mới theo hóa chất Invitrogen ......................................................................... 45
x


Hình 4.16. Kết quả điện di sản phẩm PCR theo chu trình nhiệt mới............................ 47
Hình 4.17: Kết quả điện di sản phẩm PCR với các điều kiện đã được tối ưu hóa và
theo chu trình nhiệt cũ với 35 chu kì............................................................................. 48

xi


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng


Trang

Bảng4.1. Kết quả nhiễm virus trên các mẫu lúa của một số địa phương...................... 32
Bảng 4.2. Kết quả nhiễm virus trên các mẫu rầy của một số địa phương..................... 32
Bảng 4.3: Kết quả kiểm tra các mẫu thu thập ở Tiền Giang và Cần Thơ ..................... 37
Bảng 4.4: Kết quả đo OD hai mẫu RNA tổng số lần 1 ................................................. 40
Bảng 4.5: Kết quả đo OD hai mẫu RNA tổng số lần 2 ................................................. 41

xii


CHƯƠNG 1
GIỚI THIỆU
1.1. Đặt vấn đề
Lúa gạo từ lâu đã là cây lương thực chính của nhiều nước trên thế giới. Lúa gạo
còn là mặt hàng xuất khẩu thu ngoại tệ đáng kể cho nhiều nước trên thế giới như: Thái
Lan, Trung Quốc, Ấn Độ,… trong đó có Việt Nam. Gần đây khi cuộc khủng hoảng
lương thực trên thế giới đang đe dọa gây ra nạn đói các nước nghèo, làm ảnh hưởng
đến tình hình kinh tế, xã hội, và chính trị của nhiều nước có nền nông nghiệp không
thể tự đáp ứng được nhu cầu trong nước và phải nhập khẩu từ nước ngoài. Chính phủ
Việt Nam đã xác định lúa gạo là mặt hàng nông nghiệp xuất khẩu chủ lực của Việt
Nam. Năm 2007, Việt Nam đã xuất khẩu 4,5 triệu tấn trị giá lên đến 1,4 tỉ USD
(Heong và Escalada, 2008).
Với tầm quan trọng như vậy, nhà nước Việt Nam đã, đang rất chú trọng đầu tư
cho các nghiên cứu cây lúa để đảm bảo năng suất phẩm chất của nó. Tuy nhiên, các vụ
lúa luôn bị đe dọa bởi sâu và bệnh hại, trong đó đặc biệt là bệnh vàng lùn, lùn xoắn lá.
Đây là bệnh do tác nhân là hai virus RRSV (Rice ragged stunt virus) và RGSV (Rice
grassy stunt virus) gây ra. Bệnh lây lan thông qua môi giới truyền bệnh là rầy nâu
(Nilaparvata lugens) vì thế phát tán rất nhanh chóng trên phạm vi rất lớn. Bệnh khó có
thể kiềm chế khi đã phát dịch, làm cho cây lúa bị lùn, không phát triển được, cây lúa

trưởng thành không có hoa hoặc hoa trổ bị nghẹn đòng gây thiệt hại rất nặng nề đến
năng suất và phẩm chất hạt lúa. Trước tính chất nghiêm trọng của bệnh vàng lùn và
lùn xoắn lá, phương pháp chẩn đoán nhanh hiệu quả có độ nhạy cao để phát hiện virus
gây bệnh phục vụ cho công tác dự báo phòng chống dịch bệnh đang là vấn đề cấp
thiết.
Từ đó, đề tài “Phát hiện virus rice ragged stunt gây bệnh lùn xoắn lá trên lúa
(Oryza sativa) bằng kĩ thuật ELISA và RT- PCR” được tiến hành.

1


1.2. Mục đích – Yêu cầu
1.2.1. Mục đích
Phát hiện virus RRSV gây bệnh lùn xoắn lá trên lúa bằng phương pháp DASELISA và RT-PCR.
1.2.2. Yêu cầu
Đánh giá tình hình nhiễm virus RRSV trên các mẫu của các địa phương gửi về
Đánh giá được độ ổn định của phương pháp DAS-ELISA dùng để chẩn đoán
bệnh lùn xoắn lá.
Chọn được qui trình ly trích RNA tổng số có hiệu quả và độ tinh sạch cao.
Xây dựng qui trình phát hiện virus RRSV bằng phương pháp RT-PCR có tính
đặc hiệu, độ tin cậy cao và kết quả rõ ràng.

2


CHƯƠNG 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Sơ lược về cây lúa
2.1.1. Phân loại thực vật
Ngành thực vật có hoa: Angiospermae

Lớp một lá mầm: Monocotyledons
Bộ hòa thảo có hoa: Poales (Graminales)
Họ hòa thảo: Poaceae (Gramineae)
Họ phụ hòa thảo ưa nước: Pryzoideae
Chi lúa: Oryza
Loài lúa trồng: Oryza sativa
Loài phụ:
 Subsp: japonica: Loài phụ Nhật Bản
 Subsp: indica: Loài phụ Ấn Độ
 Subsp: javanica: Loài phụ Java
(Nguyễn Văn Hoan, 2003)
2.1.2. Nguồn gốc và phân bố
Người ta cho rằng tổ tiên của chi lúa Oryza là một loài cây hoang dại trên siêu
lục địa Gondwana cách đây ít nhất 130 triệu năm và phát tán rộng khắp các châu lục
trong quá trình trôi dạt lục địa. Hiện nay có khoảng 21 loài cây hoang dại thuộc chi
này và 2 loài lúa được đã thuần hóa là lúa châu Á (Oryza sativa) và lúa châu Phi
(Oryza glaberrima)
Tổ tiên của lúa châu Á O. sativa là một loại lúa hoang phổ biến (Oryza
rufipogon) dường như có nguồn gốc tại khu vực xung quanh chân núi Himalaya, với
O. sativa thứ indica ở phía Ấn Độ và O. sativa thứ Japonica ở phía Trung Quốc. Hiện
nay đây là giống lúa chính được gieo trồng làm cây lương thực trên khắp thế giới.
2.1.3. Đặc điểm thực vật học
Lúa là các loài thực vật sống một năm, có thể cao tới 1-1,8 m, đôi khi cao hơn,
với các lá mỏng, hẹp bản (2-2,5 cm) và dài 50-100 cm. Các hoa nhỏ thụ phấn nhờ gió
3


mọc thành các cụm hoa phân nhánh cong hay rủ xuống, dài 30-50 cm. Hạt là loại quả
thóc (hạt nhỏ, cứng của các loại cây ngũ cốc) dài 5-12 mm và dày 2-3 mm.
2.1.4. Các thời kì sinh trưởng, phát triển của cây lúa (Nguyễn Văn Hoan, 2003)

Trong suốt quá trình sinh trưởng, phát triển, cây lúa trải qua 3 thời kì lớn. Ở
mỗi thời kì, cây lúa biến đổi cả về lượng và chất để hoàn thành chu kì phát triển.
Người ta phân biệt 3 thời kì sinh trưởng, phát triển của cây lúa là: thời kì sinh trưởng
sinh dưỡng, thời kì sinh trưởng sinh thực và thời kì hình thành hạt và chín .
Thời kì sinh trưởng sinh dưỡng (115-125 ngày): là thời kì cây lúa hình thành
nhánh, lá và một phần thân.
Thời kì sinh trưởng sinh thực (kéo dài khoảng 35 ngày): là thời kì cây lúa hình
thành hoa, tập hợp nhiều hoa thành bông lúa.
Thời kì chín (kéo dài khoảng 30 ngày): ở các hoa lúa được thụ tinh xảy ra quá
trình tích lũy tinh bột và sự phát triển hoàn thiện của phôi, phát triển thành hạt, sản
phẩm chủ yếu của cây lúa.
2.1.5. Tầm quan trọng của cây lúa
Lúa là cây lương thực chính của nhiều nước trên thế giới như Ấn Độ, Trung
Quốc, Thái Lan, Việt Nam…
Nước ta có nền nông nghiệp lâu đời, rất nhiều hộ gia đình thu nhập chủ yếu từ
cây lúa. Chính vì thế, cây lúa còn có ý nghĩa quan trọng đối với nền kinh tế nước ta.
Đặc biệt, hiện nay Việt Nam đứng thứ 2 trên thế giới về xuất khẩu gạo, cây lúa là
nguồn thu ngoại tệ đáng kể của Việt Nam với hàng tỉ USD mỗi năm. Cụ thể, năng suất
lúa gạo tăng 60% từ 1990-2000 với tốc độ tăng trưởng là 5%/ năm. Vào năm 1995,
Việt Nam xuất khẩu khoảng 2 triệu tấn lúa gạo và tăng lên 4,5 triệu tấn năm 1999
(Heong và Escalada, 2008). Xuất khẩu gạo năm 2007 của Việt Nam đạt 4 triệu 500
nghìn tấn, trị giá 1 tỷ 400 triệu USD ( />/2007/12/20/Rice_export_performance_may_affect_consumer_prices_NNguyen/19k).
2.1.6. Sơ lược về các bệnh trên lúa
Có rất nhiều tác nhân gây bệnh trên lúa đã được xác định gây bệnh nghiêm
trọng và phổ biến trên lúa như sau
Bệnh do virus
4


Các bệnh gây ra do virus thường đi kèm với tác hại gây ra bởi vector truyền

bệnh một số bệnh phổ biến thường gặp: Tungro (Nephotettix sp.), bệnh vàng lụi
(Nephotettix sp.), bệnh lúa lùn (Nephotettix sp.), bệnh đốm sọc đen lụi (Laodelphax
sp.), bệnh vàng lá (Nephotettix sp.).
Bệnh do vi khuẩn
Bệnh bạc lá (Xanthomonas oryzae), bệnh đốm sọc (Xanthomonas oryzicola),
bệnh thối bẹ (Pseudomonas oryzicola), bệnh thối đen hạt (Pseudomonas glumae).
Bệnh do nấm
Phổ biến và gây hại nghiêm trọng điển hình như các bệnh: Bệnh đạo ôn
(Piricμlaria oryzae), bệnh rỉ sắt (Puccinia graminis), bệnh mốc sương (Sclerophthora
macrospora).
Bệnh do tuyến trùng
Tuyến trùng thân (Ditylenchus angustus), bệnh khô đầu lá (Anphelenchoides
oryzea), bệnh nốt sần rễ (Meloidogyne graminicola), tuyến trùng lúa lùn
(Tμlenchorhynchus martini), tuyến trùng rễ (Hirschrmanuiella oryzae).
2.2. Sơ lược về bệnh lùn xoắn lá lúa và tác hại của nó
Bệnh lùn xoắn lá lúa do virus RRSV (rice ragged stunt virus) gây ra và có môi
giới truyền bệnh là rầy nâu (Nilaparvata lugens). Rầy nâu có khả năng di chuyển rất
rộng vì thế lây bệnh nhanh chóng, trên phạm vi rộng và rất khó kiểm soát.
2.2.1. Một số hiểu biết cơ bản vể virus thực vật (Vũ Triệu Mân, 1999)
2.2.1.1. Đặc tính chung của virus hại thực vật
Virus thực vật là những nucleoprotein rất nhỏ bé do đó phải quan sát dưới kính
hiển vi điện tử.
Virus có cấu tạo rất đơn giản, gồm hai thành phần chính là protein và nucleic
acid. Lõi nucleic ở bên trong và được bao bọc bằng một lớp vỏ protein (vỏ capsid).
Thường acid nucleic của virus thực vật là RNA và chỉ khoảng hơn 25 loài virus có lõi
là DNA. Virus gây bệnh cây thường chỉ có một loại protein.
Virus kí sinh ở mức độ tế bào. Một virus có thể nhiễm bệnh cho một hay nhiều
loài cây và một loài cây có thể nhiễm một hay nhiều loài virus khác nhau. Trong tế bào

5



chủ, nó sẽ điều khiển tế bào chủ dùng vật chất từ chính tế bào chủ để tạo thành nhiều
virus mới. Cơ thể thực vật bị kiệt quệ dần dẫn đến thoái hóa, suy tàn và có thể chết.
2.2.1.2. Sự xâm nhiễm và tổng hợp virus mới
Sự xâm nhiễm
Virus xâm nhập vào tế bào qua các vết thương nhẹ do xây xát và nhờ sự tiếp
xúc của các giọt dịch virus hoặc do cọ sát tiếp xúc giữa lá cây bệnh, cây khỏe mà virus
xâm nhập vào tế bào. Virus còn có thể truyền bệnh qua quá trình thụ phấn. Trong mô
cây đã bị nhiễm bệnh, virus di chuyển trong tế bào chất của tế bào và có thể đi sang tế
bào chất thông qua các sợi liên bào hay những vết thương mở ra ở vách tế bào.
Sự tái tổ hợp virus
Sau khi xâm nhiễm, ARN của virus trước tiên được giải phóng khỏi lớp vỏ
protein. Do cảm ứng với các acid nucleic, tế bào hình thành các men (enzyme) gọi là
ARN polymerase. Các enzyme này với sự biểu hiện của ARN virus (sợi +) như một
khuôn mẫu… giúp cho sự tổng hợp RNA virus (sợi – và sợi +) sau này.
Ở các virus có RNA (sợi -) thì chúng bắt buộc chuyển sang RNA thông tin
(sợi+). Khi xâm nhiễm vào cây chủ virus đã đưa sợi RNA (sợi -) và enzyme vào tế
bào.
Các virus có sợi RNA kép thì quá trình hình thành sợi RNA (sợi +) và RNA
(sợi-) được thực hiện nhờ enzyme polymerase khi virus xâm nhập vào tế bào cây chủ.
Với các virus chứa DNA thì từ các DNA virus như các khuôn mẫu đã được sự
giúp đỡ của các ezyme từ tế bào chủ.
Sự tổng hợp mới
Trong sự tổng hợp protein virus, đoạn RNA virus ghi mã cho protein virus giữ
vai trò của RNA thông tin, virus sử dụng amino acid, Ribosome và RNA vận chuyển
của tế bào cây kí chủ, nhưng lại biến thành RNA thông tin của chính nó và protein
được hình thành đã trở thành vỏ bọc.
2.2.1.3. Sự truyền bệnh ở virus thực vật
Virus có cơ chế truyền bệnh rất thụ động do virus là vật kí sinh tuyệt đối ở mức

độ tế bào. Vì vậy, sự lan truyền của bệnh có những đặc điểm riêng, khác các nhóm vi
sinh vật khác.
6


Sự truyền bệnh không nhờ môi giới
Truyền bệnh qua nhân giống vô tính thực vật: Chẳng hạn truyền qua nuôi cấy
mô tế bào; qua hom giống chiết từ cây bị bệnh, qua mắt ghép, cành ghép, chồi ghép,
gốc ghép bị nhiễm bệnh.
Truyền bệnh qua hạt giống và phấn hoa: Virus thường truyền qua hạt giống
song cũng có khoảng 100 virus lan truyền được qua hạt giống.
Truyền bệnh bằng cơ học, tiếp xúc: Thường xảy ra với các bệnh virus có tính
chống chịu cao với điều kiện môi trường.
Sự truyền bệnh nhờ môi giới
Côn trùng là nhóm môi giới truyền bệnh virus quan trọng nhất. Có thể chia các
kiểu truyền bệnh qua côn trùng và các động vật thành 3 nhóm virus
Nhóm truyền theo kiểu bền vững: Là những virus có thể sống bền vững trong
cơ thể côn trùng một thời gian dài từ một vài tiếng đến một tuần lễ mới có khả năng
lây bệnh cho cây.
Nhóm truyền bệnh theo kiểu không bền vững: Đó là những virus lây bệnh
nhanh chóng trong khoảng thời gian từ 15 giây đến 30 phút chích hút ở cây bệnh sau
đó có thể lây lan ngay.
Nhóm truyền bệnh nửa bền vững: Gồm các virus có đặc tính truyền trung gian
giữa hai nhóm trên.
Ngoài ra, virus còn có thể truyền bệnh thông qua môi giới là nhện, tuyến trùng,
nấm, dây tơ hồng (Cuscuto sp.).
2.2.2. Virus gây bệnh lùn xoắn lá lúa (Rice ragged stunt virus - RRSV)
2.2.2.1. Tên gọi và phân loại ( Hibino, 1996; Hồ Xuân Thiện, 2006)
Tên thông dụng
Virus gây bệnh lùn xoắn lá lúa (rice ragged stunt virus - RRSV)

Vị trí phân loại
Họ: Reoviridae
Nòi: Oryzavirus
Loài: Rice ragged stunt virus

7


2.2.2.2. Cấu trúc thể virus
Thể virus của RRSV bao gồm một vỏ, một phần trung tâm, và một phức hợp
nucleoprotein.
Vỏ virus không có màng bao và mang nhiều thành phần nhỏ tạo thành các gai.
Thể virus hình tròn, có tính đối xứng, và có cấu trúc 20 mặt (icosahedral) (Hibino,
1996). Vỏ virus có 12 gai dạng “B” dài 8-10 nm, rộng 23-26 nm ở phần chân đế và 1417 nm ở phần trên. (Milne và Ling, 1982; Chen và ctv, 1997)

A

B

C
Hình 2.1. RRSV quan sát dưới kính hiển vi điện tử.
(A) Thể virus trong tế bào chất của tế bào nhu mô lúa, thanh ngang dài 1 μm
(); (B) Thể virus với các protein gai dạng B
(); (C) Các thể virus liên kết lại tạo thành sợi dài
xem trong uranyl acetate, thanh ngang dài 50 nm ()

B

A


Hình 2.2. Hình dạng và kích thước của RRSV
(A) Thể virus RRSV đã tinh sạch trong uranyl acetate, thanh ngang có chiều dài là 50 nm
(); (B) Tế bào lớp mỏng của rây nâu nhiễm cho thấy các hạt virus ở
tiểu quản, thanh ngang có chiều dài là 100 nm ()

8


2.2.2.3. Cấu tạo genome của RRSV
Phân tử RRSV có đường kính khoảng 57-65 nm và có 8 cấu trúc protein tiểu
đơn vị nhỏ nhất khác nhau với trọng lượng phân tử lần lượt là (KDa) 125, 97, 66, 64,
48, 43, 36 và 32 mỗi phân tử RRSV chứa khoảng 10 đoạn sợi đôi RNA (doubles trand
RNA -dsRNA) với kích thước từ 1,15-3,9kb (Milne, 1980; Hagiwara, 1986; Hibino,
1996). Một số protein sau khi được tạo ra sẽ tự phân cắt để cho ra một số protein nhỏ
hơn mang các chức năng riêng biệt (hình 2.3).
Tất cả 10 đoạn RNA của bộ gene virus đều đã được đọc mã
() và đã phát hiện được nhiều chức năng của các protein
(phụ lục 1).

Hình 2.3: Sơ đồ cấu trúc bộ gene của RRSV. (Hồ Xuân Thiện, 2006)
Các thanh đen hình sợi chỉ tượng trưng cho các RNA với chiều dài đã
được xác định. Các mũi tên đen tượng trưng cho các sản phẩm protein. Chiều mũi
tên là chiều của quá trình dịch mã để tạo ra chuỗi polypeptide. Một số protein sẽ
tự phân cắt để tạo ra các protein chức năng có kích thước nhỏ hơn.

9


2.2.3. Môi giới truyền virus gây bệnh lùn xoắn lá (Bùi Bá Bổng và ctv, 2006)
2.2.3.1. Mô tả rầy nâu (Nilaparvata lugens)

Rầy trưởng thành cánh dài (hình2.4 (A)) xâm nhập vào ruộng lúa và đẻ trứng
trên các bẹ lá hoặc ở các gân lá.
Trứng xếp hình nải chuối (hình 2.4 (B)). Rầy non tuổi 1 có màu trắng, các tuổi
sau có màu vàng nâu (hình 2.4 (C)). Rầy trưởng thành có hai loại: cánh dài (hình
2.4(A)) và cánh ngắn (hình 2.4 (D)).
Rầy trưởng thành cánh ngắn xuất hiện phổ biến trước lúc trổ bông, rầy cánh dài
thường xuất hiện vào giai đoạn lúa chín và di chuyển, phát tán.

A

B

C

D

Hình 2.4. Một số hình ảnh về rầy nâu (Bùi Bá Bổng và ctv, 2006)
(A) Rầy nâu cánh dài; (B) Trứng của rầy nâu
(C) Ấu trùng; (D) Rầy nâu cánh ngắn

2.2.3.2. Vòng đời rầy nâu
Vòng đời của rầy nâu kéo dài 25 - 28 ngày trong điều kiện nhiệt độ 25 - 30oC.
Chúng đẻ trứng bên trong bẹ lá, và nở sau 6-7 ngày. Rầy cám mới nở lột xác 5 lần (5
tuổi) trong khoảng 12-14 ngày và trở thành rầy trưởng thành. Rầy trưởng thành cánh
ngắn sống từ 7-14 ngày đẻ trứng sớm hơn , rầy trưởng thành cánh dài sống từ 7-14
ngày.
10


Hình 2.5. Vòng đời của rầy nâu (Bùi Bá Bổng và ctv, 2006)

2.2.3.3. Đặc điểm gây hại của rầy nâu
Tác hại trực tiếp
Rầy cám và rầy trưởng thành cánh dài hoặc cánh ngắn đều chích hút nhựa cây
lúa gây ra hiện tượng cháy rầy khi mật số cao.
Tác hại gián tiếp
Là môi giới truyền virus gây bệnh vàng lùn, lùn xoắn lá cho cây lúa.
2.2.4. Đặc điểm của bệnh lùn xoắn lá trên lúa
Cây nhiễm RRSV ở giai đoạn cây mạ phát triển lá mới có triệu chứng có thể
nhận biết được sau hai tuần bị nhiễm và ở các giai đoạn tiếp theo sau đó lá phát triển
có biểu hiện ôn hòa hơn hoặc không nhận thấy được. Ở giai đoạn trổ bông, cây biểu
hiện triệu chứng một lần nữa ở những lá phía trên và lá đòng. (Hibino, 1996)
Thể virus có rất nhiều ở tế bào chất của các tế bào nhu mô của mạch rây và
thường liên kết với nhau tạo thành các sợi dài. Virus không được phát hiện ở các mô
khác (Hibino, H. 1979; Milne, 1980). Các tế bào nhu mô của mạch rây nhân lên và
phình ra, tạo thành các u sần trên lá và bẹ lá (Hibino, 1996). Hiện tượng tương tự cũng

11


được quan sát thấy tại các tế bào tuyến nước bọt của rầy nâu nhiễm virus, nhưng ở rầy
không có sự phình to của tế bào (Hibino, 1979).
Bệnh được truyền thông qua môi giới trung gian là rầy nâu Nilaparvata lugens
(N.lugens). Rầy vẫn truyền virus theo kiểu bền vững (Hibino, 1996). Rầy nâu chích
hút nhựa cây lúa bị bệnh lùn xoắn lá rồi mang mầm bệnh virus này trong cơ thể truyền
sang cho cây lúa khỏe mạnh khi chúng chích hút nhựa cây lúa đó.
Khoảng thời gian lấy virus tối thiểu của rầy nâu N. lugens là 3 giờ. Thời gian ủ
bệnh của rầy dao động từ 2 – 33 ngày (trung bình là 9 ngày) và thời gian truyền bệnh
tối thiểu là 1 giờ.
Triệu chứng bắt đầu thể hiện trên cây lúa bệnh lúc 10 – 36 ngày sau khi chủng.
Tỉ lệ rầy nâu có khả năng truyền khoảng 6 –76% (trung bình là 40%) (Hibino, 1979)

Bốn biotype của rầy nâu đều có khả năng truyền bệnh như nhau. Virus không
được truyền qua trứng rầy bị bệnh (Hibino, 1996). Virus không truyền qua hạt của cây
lúa bệnh (Ling và ctv, 1978). Virus không truyền qua phấn hoa, qua chủng bệnh bằng
tay, hoặc qua tiếp xúc giữa cây lúa khoẻ mạnh với cây lúa bệnh.
2.2.5. Triệu chứng bệnh
Ba loài lúa O. latifolia, O. nivara, và O. sativa bị nhiễm virus RRSV trong điều
kiện tự nhiên (Ling và ctv, 1978; Hibino, 1979).
Theo Ling và ctv (1978); Hibino (1996); Bùi Bá Bổng và ctv (2006), cây lúa
nhiễm bệnh thườngbiểu hiện các triệu chứng sau:
 lùn hơn so với cây lúa bình thường nhưng bộ rễ không hư.
 Lá lúa bệnh thường bị xoắn, mép lá bị rách và gân lá bị sưng to giống
như những u bướu.
 Khi bị nhiễm virus, các tế bào nhu mô của mạch rây nhân lên và phình
ra, tạo thành các u sần trên lá và bẹ lá.
 Bệnh lâu ngày, bụi lúa thường có chồi đâm ra từ đốt thân bên trên mặt
đất. Lá lúa vẫn xanh đậm và không bị vàng.
 Cây lúa không chết nhưng không trổ bông hay trổ không thoát (nghẹn
đòng) và cho nhiều hạt lép..

12


A

B

C

D


E

F

Hình 2.6. Triệu chứng của cây lúa nhiễm RRSV
(A) Cây lúa bệnh lùn hơn so với cây lúa bình thường. (IRRI);(B) Cây lúa bệnh lá bị xoắn,
không trổ bông hay trổ không thoát (nghẹn đòng) và cho nhiều hạt lép (IRRI); (C) Bộ rễ cây
lúa bệnh bình thường (IRRI); (D) Gân lá bị sưng to giống như những u bướu (Bùi Bá Bổng
và ctv, 2006);(E) Lá lúa bệnh bị xoắn, mép lá bị rách (hình chụp 15/09/2006);(F) Cây lúa
bệnh có chồi đâm ra từ đốt thân trên mặt đất ().

2.2.6. Tác hại về kinh tế do virus gây bệnh lùn xoắn lá gây ra
Cây lúa bị nhiễm bệnh ở giai đoạn còn non về sau có thể không trổ bông được,
năng suất giảm nghiêm trọng hoặc mất trắng. Cây lúa già bị nhiễm bệnh thì năng suất
cũng bị giảm đáng kể.
Thiệt hại trên thế giới
RRSV gây vấn đề nghiêm trọng cho lúa ở Thái Lan, Malaysia, Philippines, Ấn
Độ và Indonesia làm năng suất lúa giảm từ 50-100% (Hibino, 1996)
Vào năm 2005, rầy nâu có mật độ thấp kể từ năm 1980 đã gây nên dịch bệnh tại
Việt Nam, Trung Quốc, Hàn Quốc và Nhật Bản. Trận dịch gây thiệt hại lớn nhất ở
Trung Quốc, khoảng 7,5 triệu ha lúa bị nhiễm bệnh và làm giảm khoảng 2,8 triệu tấn
lúa gạo (Heong và Escalada, 2008)
13