BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HCM
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
************

LUAÄN VĂN TOÁT NGHIEÄP

PHÂN LẬP VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG XỬ LÝ AMMONIUM
CỦA VI KHUẨN Nitrosomonas TỪ CÁC NGUỒN
NƯỚC THẢI GIÀU AMMONIUM

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Niên khóa: 2004 - 2008
Sinh viên thực hiện: TÔ VĂN HOA

Thaùng 9/2008


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HCM
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
************

LUAÄN VĂN TOÁT NGHIEÄP

PHÂN LẬP VÀ ĐÁNH GIÁ KHẢ NĂNG XỬ LÝ AMMONIUM
CỦA VI KHUẨN Nitrosomonas TỪ CÁC NGUỒN
NƯỚC THẢI GIÀU AMMONIUM

Giáo viên hướng dẫn:

Sinh viên thực hiện:

ThS. LÊ CÔNG NHẤT PHƯƠNG

TÔ VĂN HOA

Thaùng 9/2008


LỜI CẢM TẠ
Tôi xin chân thành cảm tạ:
 Ban Giám hiệu trường Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, Ban chủ
nhiệm Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt
kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tại trường.
 ThS. Lê Công Nhất Phương đã hết lòng hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt
thời gian thực tập tốt nghiệp.
 Các anh chị nhân viên tại Viện Sinh Học Nhiệt Đới tận tình giúp đỡ, tạo điều
kiện thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian thực tập tốt nghiệp.
 Các bạn bè thân yêu của lớp CNSH K30 đã chia sẻ cùng tôi những vui buồn
trong suốt thời gian học cũng như hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong suốt thời
gian thực tập.
 Con chân thành cảm ơn ba, mẹ cùng những người thân trong gia đình luôn
tạo điều kiện và động viên con trong suốt quá trình học tập.

Tô Văn Hoa

iii


TÓM TẮT

Đề tài nghiên cứu “Phân lập và đánh giá khả năng xử lý ammonium của vi
khuẩn Nitrosomonas từ các nguồn nước thải giàu ammonium” được tiến hành tại
Viện Sinh Học Nhiệt Đới, thời gian từ tháng 3/2008 đến tháng 8/2008. Thí nghiệm
được bố trí theo hai giai đoạn và đạt được một số kết quả sau:
- Giai đoạn 1: tiến hành phân lập vi khuẩn Nitrosomonas của các nguồn nước
thải từ hoạt động sản xuất nước tương, nguồn nước thải từ hoạt động đóng chai
nước mắm và nguồn nước rỉ rác. Kết quả là phân lập thành công vi khuẩn từ ba
nguồn trên, đồng thời nhận thấy mật độ và khả năng sinh trưởng của vi khuẩn
Nitrosomonas được phân lập từ nước rỉ rác là nhiều nhất và tốt nhất, kế đến là mẫu
được phân lập từ nước thải sản xuất nước tương.
- Giai đoạn 2 tiến hành hai mô hình thí nghiệm:
 Đánh giá khả năng xử lý ammonium của vi khuẩn Nitrosomonas được
phân lập từ nước rỉ rác trong điều kiện nước thải nhân tạo ở các nồng độ
ammonium từ 450 – 550 ppm và cho kết quả tương ứng với hiệu suất
của từng nồng độ là: 450 ppm đạt 49,1% , 500 ppm đạt 44,6 % và 550
ppm đạt 35,7 % sau 24 giờ. Với kết quả này là cơ sở thuận lợi cho các
phương pháp xử lý tiếp theo bằng nhóm vi khuẩn Anammox.
 Đánh giá khả năng xử lý ammonium của vi khuẩn Nitrosomonas được
phân lập từ nước thải hoạt động sản xuất nước tương trong điều kiện
nước thải nhân tạo ở các nồng độ ammonium từ 50 – 250 ppm. Và nhận
thấy nồng độ ammonium 50 ppm và 100 ppm thích hợp làm cơ chất cho
quá trình xử lý trong nước thải bằng phương pháp sinh học, do hiệu suất
tương ứng là khá cao, 50 ppm đạt 79,7 %, 100 ppm đạt 75,7 % sau 24
giờ. Mặt khác, kết quả hiệu suất xử lý ammonium ở các nồng độ 50 –
250 ppm là cơ sở thuận lợi cho các phương pháp xử lý tiếp theo bằng
nhóm vi khuẩn Anammox.

iv



SUMMARY
The topic “Subdividing and analyzing ammonium treatment ability of the
bacteria Nitrosomonas from wastewater source” was carried out at Institute of
Tropical Biological from March 2008 to August 2008. The experiment is carried out
in 2 stages and leads to some following results:
- The first stage: carry out subdividing bacteria Nitrosomonas from
wastewater source of soya-sauce manufacturing enterprises, fish sauce bottled
enterprise and leachate source. The experiment result of subdividing bacteria from
three sources is successful. In addition, we realize that the density and growing
ability of the bacteria subdivided from leachate source is the most and the best, the
next is one from soya-sauce manufacturing enterprises.
- The second stage: carry out two experiment models
 Evaluating ammonium treatment ability of bacteria Nitrosomonas
subdivided from leachate source in the condition of the artificial
wastewater with the concentration of ammonium 450 – 550 ppm. The
correlative productivity of each concentration is 49,1% for 450 ppm,
44,6 % for 500 ppm and 35,7 % for 550 ppm after 24 hours. This result
is the advantageous basic for next treatment method by bacteria
Anammox.
 Evaluating ammonium treatment ability of bacteria Nitrosomonas
subdivided from wastewater source of soya-sauce manufacturing
enterprises in the condition of artificial wastewater with the
concentration of ammonium 50 – 250 ppm. We realize that the
concentration from 50 -100 ppm is suitable for wastewater treatment
process by biological treatment method due to the correlative
productivity is quite high, 79,7 % for 50 ppm, 75,7 % for 100 ppm after
24 hours. In addition, the productivity of the ammonium treatment with
the concentration of ammonium 50 - 250 ppm is the advantageous basic
for next treatment method by bacteria Anammox.


v


MỤC LỤC
TRANG
Lời cảm ơn................................................................................................................. iii
Tóm tắt....................................................................................................................... iv
Summary..................................................................................................................... v
Mục lục ...................................................................................................................... vi
Danh sách các chữ viết tắt .......................................................................................... x
Danh sách các bảng ................................................................................................... xi
Danh sách các hình ................................................................................................... xii
Danh sách các đồ thị................................................................................................ xiii
Chương 1. MỞ ĐẦU................................................Error! Bookmark not defined.
1.1 Đặt vấn đề............................................................................................................. 1
1.2 Ý nghĩa đề tài........................................................................................................ 1
1.3 Mục tiêu đề tài ...................................................................................................... 2
1.4 Nội dung nghiên cứu ............................................................................................ 2
1.5 Phương pháp nghiên cứu ...................................................................................... 2
1.6 Phạm vi đề tài ....................................................................................................... 3
Chương 2. TỔNG QUAN......................................................................................... 4
2.1 Chu trình nitơ trong tự nhiên ................................................................................ 4
2.1.1 Sự cố định nitơ................................................................................................... 5
2.1.2 Sự đồng hóa nitơ................................................................................................ 5
2.1.3 Sự khoáng hóa nitơ............................................................................................ 5
2.1.4 Quá trình nitrate hóa .......................................................................................... 6
2.1.5 Quá trình hô hấp nitrate ..................................................................................... 7
2.2 Tổng quan về vi khuẩn oxi hóa ammonium ......................................................... 9
2.2.1 Vi khuẩn oxi hóa ammonium ............................................................................ 9
2.2.2 Cơ chế quá trình nitrite hóa của AOB ............................................................. 10

2.2.3 Vi khuẩn Nitrosomonas................................................................................... 11
2.2.3.1 Phân loại ....................................................................................................... 11
vi


2.2.3.2 Đặc điểm hình thái........................................................................................ 12
2.2.3.3 Cấu trúc tế bào.............................................................................................. 13
2.3 Sơ lược về các mẫu nước thải dùng trong phân lập ........................................... 14
2.3.1 Nước thải từ hoạt động sản xuất nước tương .................................................. 14
2.3.2 Nước thải từ hoạt động đóng chai nước mắm ................................................. 15
2.3.3 Nước rỉ rác ....................................................................................................... 15
2.4 Khái quát về phương pháp xử lý hợp chất nitơ .................................................. 17
2.5 Tổng quan tình hình nghiên cứu......................................................................... 21
2.5.1 Tình hình nghiên cứu trong nước .................................................................... 21
2.5.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước.................................................................... 22
Chương 3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................... 23
3.1 Vật liệu và các bước tiến hành đề tài nghiên cứu............................................... 23
3.1.1 Mẫu nước thải.................................................................................................. 23
3.1.2 Các bước tiến hành đề tài nghiên cứu ............................................................. 23
3.2 Phương pháp tiến hành ....................................................................................... 24
3.2.1 Phương pháp lấy mẫu nước ............................................................................. 24
3.2.2 Phương pháp pha loãng mẫu ........................................................................... 24
3.2.2.1 Nguyên tắc.................................................................................................... 24
3.2.2.2 Dụng cụ và hóa chất ..................................................................................... 24
3.2.2.3 Thao tác thực hiện ........................................................................................ 25
3.2.3 Phương pháp phân lập, thuần khiết giống vi khuẩn Nitrosomonas................. 25
3.2.3.1 Nguyên tắc.................................................................................................... 25
3.2.3.2 Vật liệu, dụng cụ........................................................................................... 25
3.2.3.3 Hóa chất....................................................................................................... 26
3.2.3.4 Thao tác thực hiện ........................................................................................ 26

3.2.4 Định danh vi khuẩn bằng phương pháp nhuộm Gram .................................... 28
3.2.4.1 Nguyên tắc.................................................................................................... 28
3.2.4.2 Vật liệu và dụng cụ....................................................................................... 28
3.2.4.3 Hóa chất ....................................................................................................... 28
3.2.4.4 Thao tác thực hiện ........................................................................................ 28

vii


3.2.5 Định danh vi khuẩn phân lập được bằng kiểm tra sinh hóa ............................ 29
3.2.5.1 Nguyên tắc.................................................................................................... 29
3.2.5.2 Vật liệu và dụng cụ....................................................................................... 30
3.2.5.3 Hóa chất........................................................................................................ 30
3.2.5.4 Thao tác thực hiện ........................................................................................ 30
3.2.6 Tăng sinh mẫu ................................................................................................. 30
3.2.6.1 Nguyên tắc.................................................................................................... 30
3.2.6.2 Vật liệu và dụng cụ....................................................................................... 30
3.2.6.3 Hóa chất........................................................................................................ 30
3.2.6.4 Thao tác thực hiện ........................................................................................ 31
3.3 Thử nghiệm khả năng xử lý ammonium của vi khuẩn Nitrosomonas được phân
lập ............................................................................................................................. 31
3.3.1 Mô hình thí nghiệm 1 ...................................................................................... 31
3.3.1.1 Vật liệu và dụng cụ....................................................................................... 31
3.3.1.2 Hóa chất........................................................................................................ 32
3.3.1.3 Thao tác thực hiện ........................................................................................ 32
3.3.2 Mô hình thí nghiệm 2 ...................................................................................... 33
3.3.2.1 Vật liệu và dụng cụ....................................................................................... 33
3.3.2.2 Hóa chất........................................................................................................ 34
3.3.2.3 Thao tác thực hiện ........................................................................................ 34
3.4 Phương pháp phân tích ....................................................................................... 35

3.4.1 Xác định pH..................................................................................................... 35
3.4.2 Phân tích chỉ tiêu ammonium .......................................................................... 35
3.4.2.1 Nguyên tắc.................................................................................................... 35
3.4.2.2 Hóa chất........................................................................................................ 35
3.4.2.3 Tiến hành ...................................................................................................... 36
3.4.3 Phân tích chỉ tiêu nitrite................................................................................... 36
3.4.3.1 Nguyên tắc.................................................................................................... 36
3.4.3.2 Hóa chất ....................................................................................................... 36
3.4.3.3 Tiến hành ...................................................................................................... 37

viii


Chương 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN............................................................. 38
4.1 Kết quả phân lập ................................................................................................. 38
4.1.1 Đặc điểm chung của các khuẩn lạc phân lập được.......................................... 38
4.1.2 Số lượng khuẩn lạc của các mẫu nước thải được phân lập ............................. 39
4.2 Kết quả định danh............................................................................................... 40
4.2.1 Nhuộm Gram ................................................................................................... 40
4.2.2 Kiểm tra sinh hóa............................................................................................. 41
4.3 Kết quả tăng sinh mẫu ........................................................................................ 41
4.4 Kết quả các mô hình thí nghiệm khả năng xử lý ammonium của vi khuẩn
Nitrosomonas được phân lập .................................................................................... 42
4.4.1 Kết quả mô hình thí nghiệm 1 ......................................................................... 42
4.4.2 Kết quả mô hình thí nghiệm 2 ......................................................................... 45
Chương 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................. 50
5.1 Kết luận............................................................................................................... 50
5.2 Đề nghị ............................................................................................................... 50
TÀI LIỆU THAM KHẢO...................................................................................... 51
PHỤ LỤC


ix


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
AOB

-

Ammonium oxidizing bacteria

NOB

-

Nitrite oxidizing bacteria

AMO

-

Ammonium monooxygenase

amoA

-

Gene encoding the subunit A of AMO

pb


-

Base pair

HAO

-

Hydroxylamine oxidoreductase

SHARON

- Single reactor for High Activity Ammonium Removal Over Nitrite

CANON

-

Completely Autotrophic Nitrogen Removal Over Nitrite

SBR

-

Sequencing Batch Reactor

ANAMMOX -

Anaerobic ammonium oxidation


COD

-

Chemical oxygen demand

PCR

-

polymerase chain reaction

MFCs

- Microbial fuel cells

ctv

-

Cộng tác viên

ANOVA

-

Analysis of variance

x



DANH SÁCH CÁC BẢNG
BẢNG

TRANG

Bảng 2.1: Giống và số loài của các giống thuộc AOB

10

Bảng 2.2: Phân loại khoa học vi khuẩn Nitrosomonas

11

Bảng 2.3: Đặc trưng sự khác nhau giữa các loài của giống Nitrosomonas

12

Bảng 2.4: Thành phần và tính chất nước thải sản xuất nước tương.

15

Bảng 2.5: Thành phần nước rò rỉ ở các bãi rác tại Đông Nam Bộ

16

Bảng 3.1: Thành phần các chất dựng đường chuẩn ammonium

36


Bảng 3.2: Thành phần các chất dựng đường chuẩn nitrite

37

Bảng 4.1: Chỉ số pH của mô hình thí nghiệm

43

Bảng 4.2: Kết quả phân tích nồng độ ammonium (ppm) theo thời gian

43

Bảng 4.3: Hiệu suất (%) xử lý ammonium theo thời gian

43

Bảng 4.4: Thông số pH của mô hình thí nghiệm

46

Bảng 4.5: Kết quả phân tích nồng độ ammonium (ppm) theo thời gian

46

Bảng 4.6: Hiệu suất (%) xử lý ammonium theo thời gian

46

Bảng 4.7: Kết quả phân tích nồng độ nitrite (ppm) theo thời gian


48

xi


DANH SÁCH CÁC HÌNH
HÌNH

TRANG

Hình 2.1: Chu trình nitơ trong tự nhiên

Error! Bookmark not defined.

Hình 2.2: Sơ đồ tiến trình hô hấp nitrate

Error! Bookmark not defined.

Hình 2.3: Serge Winogradsky (1856 - 1953)

Error! Bookmark not defined.

Hình 2.4: Sơ đồ quá trình nitrite hóa của vi khuẩn NitrosomonasError! Bookmark not defined.
Hình 2.5: Vi khuẩn Nitrosomonas (Watson,2003)

Error! Bookmark not defined.

Hình 2.6: Qui trình sản xuất nước tương bằng phương pháp lên men.Error! Bookmark not define
Hình 2.7: Quá trình xử lí hợp chất nitơ trong nước thải.Error! Bookmark not defined.

Hình 2.8: Quá trình kết hợp SHARON và ANAMMOXError! Bookmark not defined.
Hình 3.1: Sơ đồ các bước tiến hành đề tài nghiên cứuError! Bookmark not defined.
Hình 3.2: Kính hiển vi Olympus – CX21

Error! Bookmark not defined.

Hình 3.3: Máy sục khí ACO - 003

Error! Bookmark not defined.

Hình 3.4: Máy so màu GENESYS 20

Error! Bookmark not defined.

Hình 3.5: Máy đo pH – 62K ( APEL)

Error! Bookmark not defined.

Hình 4.1: Khuẩn lạc phân lập từ nước thải sản xuất nước tươngError! Bookmark not defined.
Hình 4.2: Khuẩn lạc phân lập từ nước rỉ rác

Error! Bookmark not defined.

Hình 4.3: Khuẩn lạc phân lập từ nước thải đóng chai nước mắmError! Bookmark not defined.

Hình 4.4: Nhuộm Gram vi khuẩn phân lập từ nước thải sản xuất nước tươngError! Bookmark no
Hình 4.5: Nhuộm Gram vi khuẩn phân lập từ nước rỉ rácError! Bookmark not defined.

Hình 4.6: Nhuộm Gram vi khuẩn phân lập từ nước thải đóng chai nước mắmError! Bookmark no
Hình 4.7: Bố trí thí nghiệm 1


Error! Bookmark not defined.

Hình 4.8: Bố trí thí nghiệm 2

Error! Bookmark not defined.

xii


DANH SÁCH CÁC ĐỒ THỊ
ĐỒ THỊ

TRANG

Đồ thị 4.1: Nồng độ xử lý ammonium theo thời gian của Nitrosomonas được phân
lập từ nước rỉ rác

Error! Bookmark not defined.

Đồ thị 4.2: Hiệu suất xử lý ammonium theo thời gian của Nitrosomonas được phân
lập từ nước rỉ rác

Error! Bookmark not defined.

Đồ thị 4.3: Nồng độ xử lý ammonium theo thời gian của Nitrosomonas được phân
lập từ nước thải hoạt động sản xuất nước tương.

Error! Bookmark not defined.


Đồ thị 4.4: Hiệu suất xử lý ammonium theo thời gian của Nitrosomonas được phân
lập từ nước thải hoạt động sản xuất nước tương.

Error! Bookmark not defined.

Đồ thị 4.5: Nồng độ nitrite theo thời gian của Nitrosomonas được phân lập từ nước
thải nước tương.

Error! Bookmark not defined.

xiii


1

Chương 1

MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Những năm gần đây, cùng với sự phát triển của nền công nghiệp nước ta, tình
hình ô nhiễm môi trường cũng gia tăng đến mức báo động. Do đặc thù của nền công
nghiệp mới phát triển, chưa có sự quy hoạch tổng thể và nhiều nguyên nhân khác
nhau như: điều kiện kinh tế của nhiều xí nghiệp còn khó khăn, hoặc do chi phí xử lý
ảnh hưởng đến lợi nhuận nên hầu như chất thải công nghiệp của nhiều nhà máy
chưa được xử lý mà thải thẳng ra môi trường. Mặt khác, nước ta là một nước đông
dân, có mật độ dân cư cao, nhưng trình độ nhận thức của người dân về môi
trường còn chưa cao, nên lượng chất thải sinh hoạt thải trực tiếp ra môi trường
ngày càng nhiều. Điều đó dẫn tới sự ô nhiễm trầm trọng của môi trường sống,
ảnh hưởng đến sự phát triển toàn diện của đất nước, sức khỏe, đời sống của nhân dân
cũng như vẻ mỹ quan của khu vực.

Trong đó, ô nhiễm nguồn nước là một trong những thực trạng đáng ngại
nhất của sự hủy hoại môi trường tự nhiên. Và đây cũng là một vấn đề cấp bách cần
giải quyết của nước ta trong công cuộc công nghiệp hóa, hiện đại hóa. Nhiều xí
nghiệp có nước thải chứa hàm lượng muối khá cao. Hàm lượng muối cao sẽ làm cho
nguồn nước không còn hữu dụng cho mục đích cấp nước hay tưới tiêu, làm hoa màu
bị thiệt hại và đất bị ô nhiễm. Các loại muối có chứa nguyên tố nitơ và photpho làm
cho tảo phát triển nhanh gây hiện tượng tảo nở hoa dẫn đến mất mỹ quan vì chúng
tạo nên mùi và vị, và nguy hiểm hơn cả làm ảnh hưởng đến hệ thủy sinh vật. Chính
vì thế cho nên đòi hỏi phải có những giải pháp để cân bằng lượng nitrogen có trong
nước thải. Vì vậy tôi đã tiến hành tìm hiểu đặc tính và vai trò của giống vi khuẩn
Nitrosomonas có sẵn trong các nguồn tự nhiên, để tiến hành phân lập và ứng dụng
nguồn vi sinh này trong việc xử lý nước thải.
1.2 Ý nghĩa đề tài
 Củng cố và nâng cao những kiến thức, kỹ năng đã được học, các phương
pháp tư duy và nghiên cứu khoa học.


2

 Sự nghiên cứu cơ bản của đề tài này tạo điều kiện cho những nghiên cứu
về sau đi sâu hơn nhằm giải quyết được mối bận tâm của người dân về
một nguồn nước trong sạch hơn.
 Tận dụng và phát triển được nguồn tài nguyên vi sinh vật vô tận của thiên
nhiên.
1.3 Mục tiêu đề tài
 Phân lập và thuần khiết vi khuẩn Nitrosomonas từ các nguồn nước thải
giàu ammonium.
 Thử nghiệm khả năng xử lý ammonium trên môi trường nước thải nhân
tạo bằng vi khuẩn sau phân lập.
1.4 Nội dung nghiên cứu

 Phân lập và thuần khiết thành công vi khuẩn Nitrosomonas từ các nguồn
nước thải giàu ammonium là: nước thải từ hoạt động sản xuất nước
tương, nước thải từ hoạt động đóng chai nước mắm và nước rỉ rác.
 So sánh, chọn lựa nhóm vi khuẩn sinh trưởng và phát triển mạnh nhất
trong 3 nguồn trên để tiến hành thí nghiệm xử lý ammonium trên môi
trường nước thải nhân tạo có nồng độ ammonium tương ứng với nguồn
nước thải có vi khuẩn Nitrosomonas được phân lập.
 So sánh, chọn lựa nhóm vi khuẩn sinh trưởng và phát triển mạnh thứ hai
trong 3 nguồn trên để tiến hành thí nghiệm khảo sát nồng độ ammonium
thích hợp cho Nitrosomonas hoạt động trên môi trường nước thải nhân
tạo.
1.5 Phương pháp nghiên cứu
 Phân lập vi khuẩn Nitrosomonas bằng môi trường thạch trên đĩa Petri.
 Chọn khuẩn lạc điển hình, cấy chuyền nhiều lần để thuần khiết hóa vi
khuẩn phân lập được.
 Nuôi tăng sinh vi khuẩn phân lập được trên môi trường lỏng.
 Thử nghiệm khả năng xử lý nitơ của vi khuẩn phân lập được trên môi
trường nước thải nhân tạo.


3

1.6 Phạm vi đề tài
Vì thời gian thực hiện ngắn nên đề tài có những hạn chế:
 Chỉ khảo sát được trên ba nguồn nước thải giàu ammonium là: nước thải
từ sản xuất nước tương, nước thải từ đóng chai nước mắm và nước rỉ rác.
 Thời gian tăng sinh chưa đủ để vi khuẩn tạo thành bùn nên phải thử
nghiệm khả năng xử lý nitơ của vi khuẩn phân lập được trên môi trường
nước thải nhân tạo bằng dịch tăng sinh của vi khuẩn.



4

Chương 2

TỔNG QUAN
2.1 Chu trình nitơ trong tự nhiên
Nitơ là thành phần quan trọng cấu thành nguyên sinh chất tế bào, tạo nên các
hợp chất hữu cơ cần thiết cho sự sống như amino acid, protein…

Hình 2.1: Chu trình nitơ trong tự nhiên.
Nguồn nitơ có dự trữ nhiều nhất trong tự nhiên là nguồn khí nitơ tự do (N2)
trong khí quyển. Chúng chiếm tỉ lệ rất cao trong không khí (75,5 % theo khối lượng
hay 78,16 % theo thể tích không khí tương đương 3,9 x 1015 tấn N2). Trong khí nitơ
(N2) hai nguyên tử N liên kết với nhau bằng liên kết ba rất bền vững. Chính vì vậy
mà N2 rất khó kết hợp với các nguyên tố khác dẫn đến cả con người, động vật lẫn
cây trồng đều ở trạng thái thiếu thốn thức ăn nitơ mặc dù là nó tồn tại rất nhiều xung
quanh [4].


5

2.1.1 Sự cố định nitơ
Quá trình khử N2 bằng con đường hóa học đòi hỏi rất nhiều năng lượng và
đắt tiền. Tuy nhiên có một số vi khuẩn có khả năng khử bằng con đường sinh học
hay nói khác đi là khả năng cố định nitơ, đó là quá trình chuyển hóa N2 thành NH3
nhờ hoạt động xúc tác của 1 hệ thống enzyme có tên gọi là nitrogenase. Các loại vi
sinh vật này bao gồm :
 Loại dị dưỡng hiếu khí: vi khuẩn Azobacter, Rhizobium, Beizerinokia,
Azotomonas, xạ khuẩn Nocardia, Actinomyces…

 Loại dị dưỡng kỵ khí: Clotridium, Methanobacterium,….
 Loại tự dưỡng: Chromatium. Rhodopseudomonas,…
 Vi khuẩn lam: Anabaena, Calothrix,…
Trong các loại vi khuẩn kể trên, quan trọng nhất là giống Rhozobium sống
cộng sinh trong rễ cây họ đậu và loài khuẩn lam Anabaena azolla sống cộng sinh
với bèo hoa dâu[3].
2.1.2 Sự đồng hóa nitơ
Một phần nitơ của muối amon và có khi cả nitơ của hợp chất hữu cơ, được
đồng hóa để tổng hợp vi khuẩn. Các vi khuẩn tự dưỡng và dị dưỡng sử dụng nitrate
và đồng hóa chúng thành ammonium. Các tế bào thực vật và tế bào tảo thích sử
dụng nitơ ở dạng ammonium. Trong đất, các phân bón có ammonium sẽ được ưa
thích hơn là phân bón nitrate. Tế bào sẽ chuyển hóa nitrate hoặc ammonium thành
protein.
2.1.3 Sự khoáng hóa nitơ
Sự khoáng hóa nitơ là sự chuyển hóa các hợp chất nitơ hữu cơ thành
amoniac (NH3) hay ammonium (NH4+) thông qua vi sinh vật.
R-NH2 + H2O

R-OH + NH3 + năng lượng

(2.1)

Các vi sinh tham gia vào quá trình phân giải các chất hữu cơ chứa nitơ trong
điều kiện hiếu khí hay yếm khí bao gồm:


6

 Vi khuẩn Bacillus mycoides, B.mesenteries, Pseudomonas flourescens,
E.coli, …

 Xạ khuẩn: Streptomyces griceus, Actomyces fradiac…
 Nấm mốc: Aspergillus oryzae, Rhizopus, Mucor…
2.1.4 Quá trình nitrate hóa
Sự nitrate hóa là sự chuyển hóa ammonium thành nitrite (N-NO2-) và nitrate
(N-NO3-). Quá trình này được tiến hành bởi 2 nhóm vi sinh vật khác nhau. Đầu tiên,
nhóm vi sinh vật oxi hóa ammonium (AOB – ammonium oxidizing bacteria) sẽ oxi
hóa ammonium thành nitrite, sau đó nhóm vi sinh vật oxi hóa nitrite (NOB – nitrite
oxidizing bacteria) sẽ oxi hóa nitrite thành nitrate.
Vi khuẩn oxi hóa muối ammonium thành nitrite bao gồm các giống
Nitrosomonas, Nitrosospira, Nitrosococcus, Nitrosolobus, Nitrosovibrio.
2NH4+ + 3O2

2NO2- + 2H2O + 4H+ + năng lượng

(2.2)

Vi khuẩn oxi hóa nitrite thành nitrate bao gồm các giống Nitrobacter,
Nitrosopina, Nitrococcus và Nitrospira.
NO2- + 0,5O2

NO3- + năng lượng

(2.3)

Sự oxy hóa ammonium thành nitrite và sau đó thành nitrate là quá trình sinh
năng lượng. Vi sinh vật dùng năng lượng này để đồng hóa CO2 . Nguồn carbon cần
cho vi khuẩn nitrate hóa là CO2, HCO3-, CO32-. Sự hiện diện của oxy và lượng kiềm
là để trung hòa ion H+ trong quá trình oxy hóa sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho quá
trình nitrate hóa.
Quá trình nitrate hóa chịu sự kiểm soát của các yếu tố:

 Nồng độ N-NH4/N-NO2: sự tăng trưởng của AOB và NOB tuân theo
động học của Monod và phụ thuộc vào nồng độ của ammonium và nitrite.
 Nồng độ oxy: để oxy hóa 1 mg N-NH4 cần 4,57 mg O2.
 Nhiệt độ: từ 80 – 300 C là thích hợp cho sự tăng trưởng của các vi khuẩn
nitrate hóa. Nhiệt độ tối ưu cho quá trình vào khoảng 300 C.
 pH: pH tối ưu cho Nitrosomonas và Nitrobacter nằm trong khoảng 7,5 8,5. Quá trình nitrate hóa ngừng lại ở pH thấp hơn 6.


7

 Sự ức chế của các chất độc hại: Quá trình nitrate hóa khá nhạy cảm với
một vài hợp chất độc có trong nước thải. Người ta thấy rằng những chất
này độc đối với Nitrosomonas hơn là đối với Nitrobacter. Các hợp chất
hữu cơ trong nước thải không gây độc trực tiếp cho các vi khuẩn nitrate
hóa. Sự ức chế của các hợp chất hữu cơ có thể là gián tiếp và có thể là do
sự suy giảm oxy do các vi khuẩn dị dưỡng. Các hợp chất gây độc nhất
cho vi khuẩn nitrate hóa là cyanide, thiourea, phenol và các kim loại nặng
(Ag, Hg, Ni, Cu, Zn, Cr).
2.1.5 Quá trình hô hấp nitrate
Đây là quá trình mà NO3- là chất nhận điện tử. Vi sinh vật tham gia quá trình
này có khả năng chuyển nitrate (NO3-) thành NH3 và N2. Sự giải phóng N2 là sản
phẩm ưu thế của quá trình hô hấp nitrate hóa.
Các vi sinh vật tham gia quá trình hô hấp nitrate phân bố rộng rãi trong tự
nhiên, điển hình là Pseudomonas denitrificans, Pseudomonas fluorescens, Bacillus
licheniformis, Thiobacillus, Micrococus denitrificans. Đại đa số các vi sinh vật này
là sinh vật dị dưỡng, nghĩa là nó sử dụng nguồn cacbon có thành phần là hữu cơ để
tiến hành quá trình sinh tổng hợp tế bào của chúng.[3, trang 148]
Quá trình hô hấp nitrate trải qua 4 bước (Thomsen và ctv, 1994). Đầu tiên là
khử nitrate thành nitrite thông qua enzyme nitrate reductase. Tiếp theo đó nhờ
enzyme nitrite reductase sẽ chuyển hóa nitrite thành nitrogen monoxide (NO). Sau

đó sẽ chuyển hóa thành dinitrogen oxide (N2O) bởi enzyme nitric oxide reductase.
Đối với một số giống vi sinh vật thì N2O là sản phẩm cuối cùng của quá trình bởi nó
thiếu enzyme nitrous oxide reductase (Stouthamer, 1988) vốn là enzyme chịu trách
nhiệm bước cuối cùng của quá trình hô hấp nitrate là tạo ra sản phẩm khí nitơ (N2)
của đại đa số các giống còn lại.
NO3-

NO2-

NO

N2O

Hình 2.2: Sơ đồ tiến trình hô hấp nitrate.

N2


8

Quá trình hô hấp nitrate chịu sự kiểm soát của các yếu tố:
 Nồng độ nitrate: tốc độ của quá trình phụ thuộc vào nồng độ nitrate theo
kiểu động học Monod.
 Oxy cạnh tranh với nitrate như chất nhận điện tử của quá trình hô hấp. Đó
là lý do tại sao sự nitrate hóa phải được tiến hành trong sự vắng mặt oxy.
 pH: hiệu quả ở pH từ 7,0 - 8,5 và pH tối ưu khoảng 7. Độ kiềm và độ pH
sẽ tăng theo quá trình khử nitrate.
 Nhiệt độ: quá trình khử nitrate có thể xảy ra trong khoảng 350 - 500C.
Quá trình này có thể xảy ra ở nhiệt độ thấp hơn 50 - 100C nhưng với tốc
độ chậm hơn.

 Ảnh hưởng của các nguyên tố vi lượng: quá trình khử nitrate được kích
thích khi có mặt Mo và Se, chúng hoạt động tạo thành formate
dehydrogenase, một trong những enzyme phức tạp nhất trong sự trao đổi
chất của methanol. Mo còn là nguyên tố chủ yếu trong việc tổng hợp
nitrate reductase.
 Các hóa chất độc hại: vi khuẩn khử nitrate ít nhạy cảm với hóa chất độc
hại hơn là vi khuẩn nitrate hóa.
Trên đây là chu trình nitơ tổng thể. Còn trong môi trường nước, sự chuyển
hóa của hợp chất nitơ có những nét đặc trưng riêng. Hợp chất nitơ ít có sẵn trong
nguồn nước, chủ yếu là do chất thải từ các hoạt động của con người dưới dạng hợp
chất hữu cơ chứa nitơ (axit amin, protein,…). Các chất này dễ dàng bị thủy phân tạo
thành ammonium.
Trong điều kiện nước chảy, amomonium sẽ chuyển hóa hoặc dịch chuyển
theo một trong các phương thức:
 Đóng vai trò chất dinh dưỡng cho tảo và các loại thủy thực vật có rễ để
tạo ra sinh khối.
 Bay hơi vào không khí dưới dạng khí amoniac. Mức độ bay hơi trước hết
phụ thuộc vào pH của môi trường. Amoniac là một bazơ yếu do đó pH
cao là điều kiện cần để amoniac trong nước tồn tại ở dạng bay hơi. Sục
khí và nhiệt độ cao thúc đẩy amoniac bốc hơi.


9

Trong các dòng nước chảy (sông, suối, mương…) có lớp nước nông, quá
trình oxy hóa diễn ra mạnh hơn so với các nguồn nước sâu cho nên có thể nói tốc độ
oxy hóa phụ thuộc vào tỉ lệ giữa diện tích tiếp xúc và thể tích của dòng chảy.
Trong các nguồn nước lặng (ao, hồ, đập…) sự biến động của hợp chất nitơ,
photpho luôn liên quan đến tảo và gây ra hiện tượng phú dưỡng. Ammonium và
nitrate được tảo, thực vật hấp thu tạo thành protein của bản thân sinh vật đó.

2.2 Tổng quan về vi khuẩn oxi hóa ammonium
2.2.1 Vi khuẩn oxi hóa ammonium
Vi khuẩn oxi hóa ammonium (AOB – ammonium oxidizing bacteria) được
phân lập lần đầu tiên vào cuối thế XIX (Frankland và Frankland, 1890;
Winogradsky, 1890).

Hình 2.3: Serge Winogradsky (1856 - 1953).
Mặc dù nhà khoa học Winogradsky liên tục nghiên cứu, tìm hiểu hoạt động
sinh lý của AOB và đã chỉ rõ AOB là vi khuẩn Gram âm (G-), dinh dưỡng vô cơ hóa
học, cũng như dự đoán rằng có rất nhiều loài tham gia quá trình oxi hóa ammonium,
nhưng mãi cho đến từ những năm cuối thập kỉ 1960 thì nhiều loài mới của AOB
mới được phân lập (Watson, 1965; Watson và ctv, 1971a,b,c; Harms và ctv, 1976;


10

Jones và ctv, 1988; Koops và ctv, 1990, 1991). Bảng 2.1 cho thấy các nhóm vi
khuẩn thuộc AOB và số loài tương ứng với các nhóm đó.
Bảng 2.1: Giống và số loài của các giống thuộc AOB (Féray, 2000).
Vi sinh vật oxi hóa ammonium
Tên giống
Nitrosomonas
Nitrosospira
Nitrosococcus
Nitrosolobus
Nitrosovibrio

Số loài
10
5

3
2
2

Ngày nay, với việc sử dụng đoạn trình tự 16S rDNA để tiến hành xác định
AOB, các nhà khoa học đã phát hiện AOB thuộc hai lớp của ngành Proteobacteria.
Trong đó, nhóm thứ nhất thuộc lớp γ-Proteobacteria bao gồm các loài Nitrosococus
oceani và Nitrosococus halophilus. Còn nhóm thứ hai thuộc lớp β-Proteobacteria
bao gồm các giống Nitrosomonas, Nitrosospira (Woese và ctv, 1984, 1985; Head và
ctv, 1993; Teske và ctv, 1994; Utaker và ctv, 1995; Purkhold và ctv, 2000), ngoài ra
còn có giống Nitrosolobus và Nitrosovibrio (Head và ctv, 1993; Teske và ctv,
1994), bên cạnh đó còn có loài Nitrosococcus mobilis.
Mặt khác, gen amoA được ứng dụng trong việc phân loại AOB như là phân
tử đánh dấu (marker phân tử) (Mc Tavish và ctv., 1993; Klotz và Norton, 1995;
Rotthauwe và ctv, 1995; Hommes và ctv, 1998; Purkhold và ctv, 2000, 2003).
Trong đó đoạn gen có chiều dài 453 pb được dùng để tiến hành PCR trong phương
pháp này (Rotthauwe và ctv, 1997 bổ sung bởi Stephen và ctv, 1999).
2.2.2 Cơ chế quá trình nitrite hóa của AOB
Đầu tiên ammonium được thủy phân thành hydroxylamine nhờ enzyme
AMO (ammonium monooxygenase). Sau đó hydroxylamine được oxy hóa thành
nitrite nhờ enzyme HAO (hydroxylamine oxidoreductase).
NH4+

AMO

NH2OH

HAO

NO2-


Hình 2.4: Sơ đồ quá trình nitrite hóa của vi khuẩn Nitrosomonas.


11

Phương trình phản ứng (2.4) và (2.5) miêu tả hai phần nhỏ của quá trình oxi
hóa ammonium thành hydroxylamine, và phản ứng chung của quá trình này được
thế hiện qua phương trình (2.6)
Hydroxylamine được oxi hóa không cần oxi (2.7) sẽ tạo ra 4 điện tử, trong
đó 2 điện tử sẽ được chuyển cho phản ứng (2.5), các điện tử còn lại sẽ dùng cho
chuỗi hô hấp (2.8). Tổng quát quá trình oxi hóa hydroxylamine thể hiện qua (2.9).
Tổng hợp tất cả các phản ứng trên, ta có phản ứng chung nhất (2.10) của toàn
bộ quá trình oxi hóa ammonium bằng phương pháp sinh học của AOB.
NH3 + 0.5 O2 → NH2OH

∆G0’ = +17 kJ /mol

(2.4)

0.5 O2 + 2H+ + 2e- → H2O

∆G0’ = -137 kJ /mol

(2.5)

NH3 + O2 + 2H+ + 2e- → NH2OH + H2O

∆G0’ = -120 kJ /mol


(2.6)

NH2OH + H2O → HNO2 + 4H+ + 4e-

∆G0’ = +23 kJ /mol

(2.7)

0.5 O2 + 2H+ + 2e- → H2O

∆G0’ = -137 kJ /mol

(2.8)

NH2OH + 0.5 O2 → HNO2 + 2e- + 2H+

∆G0’ = -114 kJ /mol

(2.9)

NH3 + 1.5 O2 → HNO2 + H2O

∆G0’ = -235 kJ /mol

(2.10)

Quá trình này sinh ra năng lượng và được vi khuẩn sử dụng cho hoạt động
sống của chúng.
2.2.3 Vi khuẩn Nitrosomonas
2.2.3.1 Phân loại

Về mặt phân loại học, các nhà khoa học đã sắp xếp Nitrosomonas như sau:
Bảng 2.2: Phân loại khoa học vi khuẩn Nitrosomonas.
Nitrosomonas
Giới

Vi sinh

Ngành

Proteobacteria

Lớp

Beta Proteobacteria

Bộ

Nitrosomonadales

Họ

Nitrosomonadaceae

Giống

Nitrosomonas


12


Trong quá trình nghiên cứu, phân lập AOB các nhà khoa học nhận thấy rằng
khi tiến hành phân lập AOB từ các nguồn nước thải thì chủ yếu phân lập ra giống
Nitrosomonas.
Đến nay, các nhà khoa học đã xác định được 10 loài của Nitrosomonas bao
gồm: N.europaea, N.eutropha, N.halophila, N.communis, N.marina, N.aestuarii,
N.nitrosa, N.ureae, N.oligotropha, N.cryotolerans.
Sự có mặt của nhiều loài đã được chỉ ra bằng sự khác nhau giữa những thí
nghiệm di truyền DNA. Lượng chứa G + C trong DNA vào khoảng 47,4 – 51,0 % .
Sự khác biệt đặc trưng giữa các loài này là G + C có trong DNA, hình dạng và kích
thước của tế bào, lượng muối yêu cầu, sử dụng urea, sự có mặt của hợp chất
carboxyl và protein tế bào. Đại diện cho sự khác nhau giữa các loài của
Nitrosomonas được làm rõ qua sự khác nhau giữa N.cryotolerans và N.europaea.
 N.crytolerans: kích thước 1,2 - 2,2 × 2,0 - 4,0 µm, không di động, sử
dụng urea, nhu cầu NaCl 2%, nhiệt độ thấp nhất phát triển – 50C, sống ở
biển.
 N.europaea: kích thước 0,8 – 1,1 × 1,0 – 1,7 µm, không di động, không
sử dụng urea, không cần muối, nhiệt độ thấp nhất phát triển 50C, sống ở
đất và nước ngọt.
Bảng 2.3: Đặc trưng sự khác nhau giữa các loài của giống Nitrosomonas.
Đặc trưng

N.cryotolerans

N.europaea

Kích thước (µm)

1,2- 2,2 x 2,0 -4,0

0,8 -1,1x 1,0-1,7


Di động

Không

Không

Sử dụng urea

Có

Không

Muối yêu cầu

NaCl 2%

Không

Nhiệt độ sống thấp nhất

- 5 0C

+50C

Phân bố

Biển

Đất và nước ngọt


2.2.3.2 Đặc điểm hình thái
Thông thường Nitrosomonas có tế bào dạng hình cầu hoặc trục ngắn, di động
hoặc không di động, một số loài di động bằng tiên mao ở đầu cực, đứng riêng rẻ,