BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC


LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT CÁC ĐẶC ĐIỂM CỦA Clostridium perfringens
PHÂN LẬP TỪ THỰC PHẨM

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Niên khóa: 2004 – 2008
Sinh viên thực hiện: PHAN THỊ KIỀU TRINH

Tháng 9/2008


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC


LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT CÁC ĐẶC ĐIỂM CỦA Clostridium perfringens
PHÂN LẬP TỪ THỰC PHẨM

Giáo viên hướng dẫn:
Ths. NGUYỄN TIẾN DŨNG
CN. PHẠM THỊ PHƯƠNG UYÊN

Tháng 9/2008

Sinh viên thực hiện:
PHAN THỊ KIỀU TRINH


LỜI CẢM ƠN
 Xin được gởi lời biết ơn sâu sắc đến ba mẹ và các thành viên trong gia đình đã luôn
quan tâm và động viên cổ vũ cho con trong suốt thời gian học tập và thực hiện khoá
luận.
 Xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh,
Ban chủ nhiệm Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả Quý Thầy Cô đã truyền đạt
kiến thức cho em trong suốt thời gian học tập tại trường.
 Xin được gởi lời cám ơn chân thành nhất đến Thạc sỹ Nguyễn Tiến Dũng và Cử nhân
Phạm Thị Phương Uyên đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện tốt nhất
cho em thực hiện khoá luận.
 Xin được cám ơn anh Lẫm (trưởng phòng vi sinh I5), các thầy cô và các anh chị cán

bộ nghiên cứu của Trung tâm phân tích trường Đại học Nông Lâm đã tận tình giúp đỡ,
hỗ trợ em về mặt cơ sở vật chất cũng như về mặt kỹ thuật.
 Xin được cám ơn các bạn Hồng Loan, Vân Kiều, Quế Mai và Hoa đã sát cánh cùng tôi

trong toàn bộ khoá luận.
 Xin cám ơn tất cả các bạn lớp Công nghệ sinh học 30 đã chia sẻ cùng tôi những vui
buồn cũng như hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ và góp ý cho tôi trong suốt thời gian học tập.
Sinh viên thực hiện
Phan Thị Kiều Trinh

iii



TÓM TẮT
Phan Thị Kiều Trinh, Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh
Đề tài nghiên cứu: Khảo sát đặc điểm của các chủng Clostridium perfringens phân
lập từ thực phẩm. Đề tài được thực hiện tại phòng thí nghiệm vi sinh, bộ môn Công nghệ
sinh học, Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh từ tháng 4/2008 đến tháng 8/2008.
Giáo viên hướng dẫn:
ThS. Nguyễn Tiến Dũng
CN: Phạm Thị Phương Uyên.
Nội dung nghiên cứu:
1. Khảo sát đặc điểm các chủng Clostridium perfringens phân lập từ mẫu thực phẩm.
2. Khảo sát tỷ lệ biểu hiện của 2 enzym: acid phosphatase và β -galactosidase ở các
chủng Clostridium perfringens phân lập.
3. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự biểu hiện của 2 enzym acid phosphatase và β –
galactosidase.
Kết quả:
1. C. perfringens phân lập từ thực phẩm ổn định về các đặc điểm: tế bào hình que; bào tử
hình trứng; khuẩn lạc trên thạch TSC tròn và đen; làm tan máu, không di động và lên men
lactose. Các đặc điểm có thể thay đổi: kích thước khuẩn lạc trên thạch TSC; khả năng khử
nitrate và thủy giải gelatin.
2. Cả 5 chủng C. perfringens phân lập từ thực phẩm đều có biểu hiện ổn định hoạt tính 2
enzym β-galactosidase và acid phosphatase.
3. Các yếu tố ảnh hưởng, làm chậm sự biểu hiện hoạt tính 2 enzym β-galactosidase và
acid phosphatase gồm: nền mẫu thực phẩm (cá khô và nước mắm pha), nhiệt độ nuôi ủ
(340C).

iv


SUMMARY

PHAN THI KIEU TRINH, Nong Lam University of Ho Chi Minh City.

Graduating thesis topic “Investigating the characters of the Clostridium perfringens
isolated from food”, carried out at the laboratory of Microbiology of Department of
Biotechnology, Nong Lam University, from April 2008 to August 2008.
Supervisor:
Master of Microbiology: Nguyen Tien Dung
Bachelor of science: Pham Thi Phuong Uyen
Contents:
1. Investigating the characters of the C. perfringens isolated from food.
2. Investigating the ratio of expression the activities of enzyms β- galactosidase and
acid phosphatase.
3. Investigating the factors, have delayed the expression of enzyms β- galactosidase
and acid phosphatase.
Results:
1. Several properties of investigated C. perfringens are stable such as: rod shape,
ovoid spore, round and black colony, haemolysis, non- motility and lactose
fermentation. Some changeable properties such as size of colony on TSC agar,
nitrate reduction and gelatin liquefaction.
2. All investigated C. perfringens express the activities of enzyms β- galactosidase
and acid phosphatase stabely.
3. Some factors delayed the expression of enzyms are matrices and incubation
temperature (34oC).

v


MỤC LỤC
TRANG
LỜI CẢM ƠN ......................................................................................................... iii

TÓM TẮT ............................................................................................................... iv
SUMMARY............................................................................................................. v
MỤC LỤC ............................................................................................................... vi
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT .................................................................. viii
DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ................................................................. ix
DANH SÁCH CÁC BẢNG .................................................................................... x
Chương 1- MỞ ĐẦU .............................................................................................. 1
1.1. Đặt vấn đề ........................................................................................................ 1
1.2. Mục đích và ý nghĩa .......................................................................................... 2
1.2.1. Mục đích ......................................................................................................... 2
1.2.2 Ý nghĩa ............................................................................................................ 2
1.3. Nội dung nghiên cứu ......................................................................................... 2
Chương 2- TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................... 3
2.1. Đại cương về Clostridium perfringens.............................................................. 3
2.1.1. Lịch sử phát hiện Clostridium perfringens..................................................... 3
2.1.2. Tình hình lịch sử gây bệnh của Clostridium perfringens .............................. 3
2.1.3. Định nghĩa ...................................................................................................... 4
2.1.4. Phân loại Clostridium perfringens ................................................................. 5
2.1.5. Đặc điểm sinh học .......................................................................................... 5
2.1.6. Phân bố ........................................................................................................... 6
2.1.7. Các loại độc tố của Clostridium perfringens.................................................. 7
2.1.8. Biểu hiện lâm sàng khi nhiễm Clostridium perfringens................................. 8
2.1.9. Tiêu chuẩn Clostridium perfringens trong thực phẩm ................................... 9
2.2. Cơ chế chuyển hoá vật chất ............................................................................. 9
2.2.1. Cơ chế lên men lactose................................................................................... 9
2.2.2. Cơ chế thuỷ giải gelatin.................................................................................. 11
2.2.3. Cơ chế khử nitrate thành nitrite...................................................................... 12
2.3. Sự biểu hiện của enzym acid phosphatase và β-galactosidase ở C. perfringens ................... 14

vi



2.3.1. Enzym acid phosphatase................................................................................. 14
2.3.2. Enzym β – galactosidase ................................................................................ 16
2.4. Các nghiên cứu ứng dụng sự biểu hiện của enzym
trong việc chẩn đoán Clostridium perfringens ......................................................... 17
Chương 3- VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ...................................................... 18
3.1. Thời gian và địa điểm........................................................................................ 18
3.2. Vật liệu .............................................................................................................. 18
3.2.1. Nguyên vật liệu............................................................................................... 18
3.2.2. Thiết bị và dụng cụ ......................................................................................... 18
3.2.3. Hoá chất và môi trường .................................................................................. 18
3.3. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................... 19
3.3.1. Phương pháp nhuộm Gram............................................................................. 19
3.3.2. Phương pháp nhuộm bào tử............................................................................ 21
3.3.3. Phương pháp thực hiện thử nghiệm sinh hoá ................................................. 21
3.3.4. Phương pháp đổ đĩa đếm khuẩn lạc................................................................ 22
3.3.5. Quy trình thử nghiệm sự biểu hiện của 2 enzym acid phosphatase
và β – galactosidase .................................................................................................. 24
3.3.6. Phương pháp gây nhiễm chủng vào mẫu thực phẩm ..................................... 25
3.3.7. Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự biểu hiện của 2 enzym ...................... 27
Chương 4- KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN............................................................... 29
4.1. Kết quả khảo sát đặc điểm các chủng Clostridium perfringens
phân lập từ mẫu thực phẩm ...................................................................................... 29
4.2. Kết quả khảo sát tỷ lệ biểu hiện của 2 enzym: acid phosphatase

và β - galactosidase ở các chủng Clostridium perfringens phân lập ........................ 36
4.3. Kết quả khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự biểu hiện của
2 enzym β-galactosidase và acid phosphatase.......................................................... 39
Chương 5- KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................. 43

5.1. Kết luận.............................................................................................................. 43
5.2. Đề nghị ............................................................................................................. 43
TÀI LIỆU THAM KHẢO...................................................................................... 45
PHỤ LỤC

vii


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
PCR

Polymerase chain reaction

ELISA

Enzym- Linked Immuno sorbent Assay

UV

Ultra- violet

TSC

Tryptose Sulphite Cycloserine Agar

4- MUP

4 methyl umbelliferyl phosphate

ONPG


o-nitrophenyl-D-galactopyranoside

ONP

o-nitrophenol

BHI

Brain Heart Infusion

SPW

Saline Pepton Water

NMM

Buffered nitrate motility medium

LGM

Lactose gelatin medium

viii


DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ
HÌNH
Hình 2.1


TRANG
Hình dạng vi khuẩn Clostridium perfringens ...................................... 4

Hình 2.2

Hình dạng và vị trí bào tử Clostridium perfringens trong tế bào......... 5

Hình 2.3

Hình dạng khuẩn lạc C. perfringens trên môi trường thạch ................ 6

Hình 2.4

Thử nghiệm lên men lactose ............................................................... 11

Hình 2.5

Cấu trúc phân tử gelatin ...................................................................... 11

Hình 2.6

Thử nghiệm gelatin ............................................................................. 12

Hình 2.7

Thử nghiệm nitrate.............................................................................. 13

Hình 3.1

Quy trình nhuộm Gram ....................................................................... 20


Hình 4.1

Khuẩn lạc chủng C. perfringens 1 trên môi trường thạch TSC. ......... 34

Hình 4.2

Hiện tượng tan máu ở chủng C. perfringens 1.................................... 34

Hình 4.3

Ảnh nhuộm Gram tế bào chủng C. perfringens 1............................... 35

Hình 4.4

Bào tử Clostridium perfringens dưới vật kính 100 X của kính hiển

vi quang học............................................................................................................ 35
Hình 4.5

Phản ứng ONPG dương tính ............................................................... 38

Hình 4.6

Phản ứng MUP dương tính. ................................................................ 38

SƠ ĐỒ
Sơ đồ 3.1

Quy trình khảo sát đặc điểm sinh hóa của C. perfringens .................... 23


Sơ đồ 3.2

Quy trình gây nhiễm chủng vào thực phẩm.......................................... 26

Sơ đồ 3.3

Quy trình khảo sát sự biểu hiện 2 enzym trên nền mẫu thực

phẩm ở những nhiệt độ và thời gian khác nhau........................................................ 28

ix


DANH SÁCH CÁC BẢNG
BẢNG

TRANG

Bảng 2.1

Số trường hợp ngộ độc và tử vong do C. perfringens ở Mỹ................ 4

Bảng 2.2

Tỉ lệ Clostridium perfringens nhiễm trong các loại
thực phẩm khác nhau ........................................................................... 4

Bảng 2.3


Các loại độc tố của các dòng C. perfringens ....................................... 7

Bảng 2.4

Các bệnh chính do độc tố gây ra.......................................................... 7

Bảng 2.5

Giới hạn cho phép của C. perfringens trong thực phẩm...................... 9

Bảng 2.6

Biểu hiện enzym phosphatase của các chủng vi khuẩn
ở những giá trị pH khác nhau ............................................................. 15

Bảng 4.1

Kết quả khảo sát hình dạng và các đặc điểm sinh hoá
của các chủng Clostridium perfringens .............................................. 31

Bảng 4.2

Kết quả khảo sát sự biểu hiện của 2 enzym β- galactosidase
và acid phosphatase ............................................................................ 37

Bảng 4.3

Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ nuôi cấy
lên sự biểu hiện của 2 enzym β-galactosidase và acid phosphatase
khi nuôi cấy trên nền mẫu là cá khô chỉ vàng..................................... 40


Bảng 4.4

Kết quả khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ nuôi cấy
lên sự biểu hiện của 2 enzym β-galactosidase và acid phosphatase
khi nuôi cấy trên nền mẫu là nước mắm............................................... 41

x


Chương 1

MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Xã hội ngày càng phát triển, nhu cầu đời sống con người ngày càng gia tăng. Nhận
thức của con người về vấn đề vệ sinh an toàn thực phẩm ngày càng cao và yêu cầu ngày
càng nghiêm ngặt. Vì vậy, vấn đề ngộ độc thực phẩm đang trở thành mối quan tâm hàng
đầu của mọi quốc gia.
Ở Việt Nam, khoảng vài năm trở lại đây, báo chí liên tục đưa tin về các vụ ngộ độc
thực phẩm mà hậu quả và mức độ thiệt hại vô cùng nghiêm trọng. Theo thống kê, mỗi
năm Việt Nam có khoảng 250-500 vụ ngộ độc thực phẩm với 7.000-10.000 nạn nhân và
100-200 ca tử vong. Nhà nước phải chi trên 3 tỷ đồng cho việc điều trị, xét nghiệm và
điều tra tìm nguyên nhân [27].
Ngộ độc thực phẩm do vi sinh vật không phải là vấn đề mới mẽ, nhưng do thói
quen ăn uống, quá trình chế biến không hợp vệ sinh và sự hiểu biết cơ bản về vi sinh thực
phẩm còn hạn chế nên dịch xảy ra thường xuyên và phổ biến ở mọi nơi trên cả nước.
Clostridium perfringens là đối tượng gây ngộ độc thực phẩm đứng hàng thứ ba ở
các nước phương Tây và Việt Nam. Vi khuẩn này gây ra các hậu quả và thiệt hại khá
nghiêm trọng ở người, gia súc và gia cầm do hệ độc tố mà nó tiết ra. Ngộ độc thức ăn do
bị nhiễm Clostridium perfringens được phát hiện sau khi ăn các loại thịt, đặc biệt là thịt

bò, thịt gà, thịt vịt và nước chấm mà không được bảo quản tốt và nấu chín trước khi sử
dụng. Chúng gây ra các triệu chứng như đau thắt vùng bụng và tiêu chảy, nặng có thể dẫn
đến tử vong. Kháng sinh không có hiệu quả trong các trường hợp nhiễm vi khuẩn này.
Hiện nay, trên thế giới có rất nhiều phương pháp chẩn đoán C. perfringens như
phương pháp đổ đĩa đếm khuẩn lạc, kỹ thuật PCR phát hiện gen gây bệnh mã hóa cho các
loại độc tố của C. perfringens, kỹ thuật ELISA,… Các quy trình phân tích này được xây
dựng bởi các nước có cơ sở vật chất và trình độ kỹ thuật tiến bộ dựa trên những nghiên
cứu cơ bản trước đó về C. perfringens. Tuy nhiên, nước ta chỉ mới áp dụng những quy
trình trên vào việc phân tích mẫu thực phẩm hay bệnh phẩm mà chưa có những nghiên
1


cứu cơ bản về C. perfringens để xác định xem ở điều kiện của Việt Nam, các đặc điểm cơ
bản của đối tượng có thay đổi hay khác biệt so với những gì thế giới đã nghiên cứu.
Với động cơ đó, và được sự cho phép của Bộ môn Công nghệ Sinh học, Trường
Đại học Nông Lâm cùng cán bộ hướng dẫn, chúng tôi tiến hành nghiên cứu “Khảo sát
đặc điểm của các chủng Clostridium perfringens phân lập từ thực phẩm”.
1.2. Mục đích và ý nghĩa
1.2.1. Mục đích
Khảo sát sự biến động đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của các chủng C.
perfringens phân lập từ thực phẩm.
Khảo sát sự biểu hiện của 2 enzym acid phosphatase và β-galactosidase ở các
chủng C. perfringens phân lập.
1.2.2. Ý nghĩa
Việc nghiên cứu đặc điểm sinh hóa, tính ổn định kiểu hình C. perfringens làm cơ
sở cho phương pháp phân tích C. perfringens trong thực phẩm đồng thời, cung cấp một
hướng tiếp cận mới để nghiên cứu về các chủng C. perfringens phân lập từ thực phẩm.
Ngoài ra, việc nghiên cứu đặc điểm biểu hiện của 2 enzym β-galactosidase và acid
phosphatase là cơ sở cho việc xây dựng phương pháp phân tích nhanh C. perfringens
trong thực phẩm theo đề xuất của Adcock và Saint, 2001.

1.3. Nội dung nghiên cứu
 Khảo sát đặc điểm các chủng Clostridium perfringens phân lập từ mẫu thực phẩm.
 Khảo sát tỷ lệ biểu hiện của 2 enzym: acid phosphatase và β - galactosidase ở các
chủng Clostridium perfringens phân lập.
 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự biểu hiện của 2 enzym acid phosphatase và
β – galactosidase.

2


Chương 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Đại cương về Clostridium perfringens
2.1.1. Lịch sử phát hiện Clostridium perfringens [11]
Năm 1892, nhà vi khuẩn học Welch (người Mỹ) đã phân lập được 1 loại vi khuẩn
kỵ khí, Gram dương từ vết thương bị hoại tử. Sinh vật này, đầu tiên ông gọi là Bacillus
aerogenes capsulatus, sau đó đổi thành Bacillus perfringens, rồi Clostridium welchii, và
cuối cùng là tên gọi Clostridium perfringens.
2.1.2. Tình hình lịch sử gây bệnh của Clostridium perfringens [12]
Năm 1890, hai nhà khoa học E.W.Andrewes và E.Klein đã phát hiện ra
Clostridium perfringens là nguyên nhân gây ngộ độc thực phẩm.
Năm 1943, Knox và Macdonald đưa ra cảnh báo đầu tiên về ngộ độc thực phẩm do
bào tử hình que, kỵ khí Clostridium perfringens, do việc tiêu thụ nước và thức ăn không
được xử lý nhiệt đúng cách.
Năm 1945, Mc.Clung mô tả sự bùng phát dịch Clostridium perfringens do tiêu thụ
thịt gà đã được hấp 24 giờ trước đó.
Năm 1948, vài trường hợp viêm dạ dày ruột dẫn đến tử vong xảy ra ở Đức, được
chứng minh là có liên quan tới Clostridium perfringens.
Năm 1953, nhóm nghiên cứu Hobbs và cộng sự chỉ ra rằng việc tiêu thụ thực phẩm

bị nhiễm Clostridium perfringens dẫn đến ngộ độc thực phẩm với triệu chứng là tiêu chảy
cấp.
Năm 1960-1970, có đầy đủ thông tin khẳng định rằng Clostridium perfringens gây
ngộ độc thực phẩm bằng cách tiết ra các độc tố trong quá trình hình thành bào tử ở vùng
ruột những người tiêu thụ thức ăn nhiễm khuẩn.

3


Bảng 2.1. Số trường hợp ngộ độc và tử vong do C. perfringens ở Mỹ [12]
Trường hợp

Tỉ lệ (%)

Tử vong

Tỉ lệ (%)

C. perfringens

248520

1,8

7

0,4

Tổng khuẩn


4175565

30,2

1297

71,7

13814924

100

1809

100

Tổng số vụ
NĐTP

Bảng 2.2. Tỉ lệ C. perfringens nhiễm trong các loại thực phẩm khác nhau [12]
Loại thực phẩm

Tỉ lệ nhiễm (%)

Thịt lợn

0-39

Thịt lợn nấu


45

Thịt bò

22

Thịt gà

0-54

Hải sản

2

2.1.3. Định nghĩa
Clostridium perfringens là vi khuẩn gram dương, hình que tương đối ngắn kích
thước khoảng 1,0 – 1,5 m x 4,0 – 8,0 m, phần lớn không di động [5].
Là vi khuẩn sống kỵ khí bắt buộc [16].

Hình 2.1. Hình dạng vi khuẩn Clostridium perfringens [19]
4


Bào tử Clostridium perfringens có hình trứng, nằm ở tâm hoặc lệch tâm [16].

Hình 2.2. Hình dạng và vị trí bào tử Clostridium perfringens trong tế bào [20]
2.1.4. Phân loại Clostridium perfringens [6]
Giới: Bacteria
Ngành: Firmicutes
Lớp: Clostridia

Bộ: Clostridiales
Họ: Clostridiaceae
Giống: Clostridium
Loài: Clostridium perfringens.
2.1.5. Đặc điểm sinh học [5, 6]
Trên môi trường thạch TSC, khuẩn lạc Clostridium perfringens có hình tròn, màu
đen, ẩm, tâm đục, nhô lên; trên môi trường TSC có lòng đỏ trứng, khuẩn lạc sẽ có hình
dạng tròn, hơi bất thường, phẳng, có vùng tủa trắng mờ đục khoảng 2- 4 mm bao quanh
do vi sinh vật có khả năng thủy phân lecithin trong lòng đỏ trứng.
Nhiệt độ tăng trưởng tối ưu của C. perfringens là 350C – 370C, vẫn tăng trưởng ở
500C, nhiều bào tử có thể được kích hoạt bởi nhiệt [13]. Nhiều dòng C. perfringens có thể
tồn tại ở 100oC hơn 1 giờ [28].
PH phát triển tối ưu của C. perfringens là 5,0; vẫn phát triển ở pH 6,0-7,5.

5


Khả năng chịu mặn: ở nồng độ muối NaCl 6%, quá trình phát triển của C.
perfringens bị ức chế [2].

A

B

Hình 2.3. Hình dạng khuẩn lạc C. perfringens trên môi trường thạch [21]
A : khuẩn lạc C. perfringens trên môi trường TSC không có lòng đỏ trứng
B : khuẩn lạc C. perfringens trên môi trường TSC có lòng đỏ trứng
Có khả năng sản xuất ra các enzym ngoại bào như proteaza, lipaza, colagenaza và
hialuronidaza. Ngoài ra còn có khả năng sản xuất ra các loại độc tố đường ruột là nguyên
nhân chính gây ra các vụ ngộ độc thực phẩm [16].

Có khả năng sản xuất acetone, butanol, ethanol, acid butyric, cacbon dioxide và
hydrogen [12].
Có khả năng lên men đường, tinh bột và pectin [12].
2.1.6. Phân bố [13, 17]
Clostridium perfringens được xem là một trong những loài vi sinh vật có phân bố
rộng rãi nhất trong môi trường và thức ăn, được tìm thấy khắp nơi trong tự nhiên và
thường xuyên tìm thấy trong đường ruột của người, động vật có xương sống, côn trùng,
rau quả, trong đất, bùn đáy và những vùng ô nhiễm phân.

6


2.1.7. Các loại độc tố của Clostridium perfringens [6]
C. perfringens được chia thành 5 type (A, B, C, D, E) dựa vào khả năng tạo ra 1
hay nhiều độc tố gây chết: alpha, beta, epsilon và iota.
Bảng 2.3. Các loại độc tố của các dòng C. perfringens [12]
Độc tố

Dòng
C. perfringens

Alpha

Beta

Epsilon

Iota

A


+

-

-

-

B

+

+

+

-

C

+

+

-

-

D


+

-

+

-

E

+

-

-

+

Bảng 2.4. Các bệnh chính do độc tố gây ra [12]
Loại độc tố
A
B
C

Các bệnh chính do độc tố gây ra
Chứng hoại tử, bệnh về dạ dày ruột ở người, viêm ruột non
hoại tử ở gà, chim, heo, cừu, ngựa.
Bệnh lỵ, viêm ruột mãn tính ở cừu
Xuất huyết hoặc viêm ruột hoại tử ở heo con, cừu, dê.

Viêm ruột hoại tử ở người.

D

Viêm ruột ở cừu.

E

Viêm ruột ở cừu, thỏ, bê.

Độc tố Alpha: được tạo ra ở cả 5 type, bản chất là phospholipase C, xúc tác phản
ứng thủy phân lecithin thành phosphorylcholine và diglyceride. Đây được xem là loại độc
tố chính gây các bệnh lý ở mô tế bào. Độc tố này được sản xuất nhiều nhất ở C.
perfringens type A. Vì vậy, Clostrdium perfringens type A thường biểu hiện độc tính rất
mạnh, và việc nhiễm type A của Clostridium perfringens thường dẫn đến các hậu quả như
hoại tử cơ, tan máu, tăng tính thấm mạch máu và tụ huyết. Hậu quả nặng hơn, có thể gây

7


tử vong ở người do bệnh hoại thư sinh khí và ở động vật gây viêm ruột hoại tử, nhiễm độc
máu.
Độc tố beta: là độc tố gây chết chủ yếu ở type B và C của Clostridium perfringens.
Bản chất là chuỗi polypeptide đơn khoảng 40 kD, rất nhạy với trypsin. Độc tố này có vai
trò quan trọng trong việc gây bệnh viêm ruột hoại tử ở người và động vật. Ở người, bệnh
này có tên là “pig-bel”, do nhiễm phải Clostridium perfringens type C và có các biểu hiện
lâm sàng như nôn ói, đau bụng, tiêu chảy ra máu. Ngoài ra, Clostridium perfringens type
C còn gây viêm ruột hoại tử ở bê, cừu, lợn con. Clostridium perfringens type B là nguyên
nhân gây nhiễm độc máu hoặc viêm ruột hoại tử ở lừa, cừu và dê.
Độc tố epsilon: do C. perfringens type C và D tạo ra. Độc tố này gây nhiễm độc

máu mãn tính ở gia cầm. Nó được tiết ra ở dạng tiền độc tố bất hoạt và được hoạt hóa khi
enzym protease cắt bỏ gốc N- của đoạn polypeptide. Protein hoạt động này có độc tính
gây chết cao, gây phù và hoại tử da. Nghiêm trọng nhất là những ảnh hưởng gây hoại tử
mô não, phù não.
Độc tố iota: chỉ tạo ra bởi C. perfringens type E ở dạng tiền độc tố. Tiền độc tố
này thấm vào mạch máu nhờ khả năng thủy phân protein. Cấu trúc độc tố gồm 2 chuỗi
polypeptide độc lập nhau: Ia là enzym ADP transferase và Ib liên quan đến việc bám
dính, đưa độc tố vào bên trong tế bào. Tuy có cấu trúc riêng biệt, nhưng chúng hoạt động
tương hỗ và tạo nên độc tính. Độc tố này gây hoại tử da ở chuột và nhiễm độc máu ở bê
và cừu con.
2.1.8. Biểu hiện lâm sàng khi nhiễm C. perfringens
Sau khi tiêu thụ thức ăn có chứa một lượng lớn Clostridium perfringens khoảng
8 – 22 giờ, người bệnh thường có những triệu chứng như đau co thắt vùng bụng, tiêu chảy
cấp và sinh nhiều khí, sốt, nôn mửa; mức độ nhẹ có thể kéo dài 1-2 tuần [13], nặng hơn là
ruột non bị hoại tử có thể dẫn đến tử vong [18].
Đối với người già và trẻ em, do có hệ miễn dịch yếu nên triệu chứng bệnh có thể
kéo dài lâu hơn [18].

8


2.1.9. Tiêu chuẩn Clostridium perfringens trong thực phẩm
Bảng 2.5. Giới hạn cho phép của C. perfringens trong thực phẩm [7]
STT
1
2

Giới hạn cho phép

Sản phẩm


cfu/g (ml) sản phẩm
102

Thịt tươi đông lạnh
Thịt và sản phẩm thịt chế biến không xử lý nhiệt
(sử dụng trực tiếp)

102

3

Thịt và sản phẩm thịt đóng gói

10

4

Thịt và sản phẩm thịt không đóng gói

102

5

Thịt khô

102

6
7

8
9

Sản phẩm chế biến từ thịt cá đóng hộp, rau quả
đóng hộp
Cá và thuỷ sản tươi (xử lý nhiệt trước khi sử dụng)
Sản phẩm chế biến từ cá và thuỷ sản (không qua
xử lý nhiệt trước khi sử dụng)
Thủy sản khô sơ chế (xử lý nhiệt trước khi sử
dụng)

Không có
102
10
20

10

Sản phẩm chế biến từ ngũ cốc (có xử lý)

102

11

Sản phẩm chế biến từ ngũ cốc (không qua xử lý)

10

12


Rau quả tươi, rau quả đông lạnh

13

Rau quả muối, rau quả khô

10

14

Nước chấm có nguồn gốc động và thực vật

10

15

Kem, nước đá

10

Giới hạn bởi GAP

2.2. Cơ chế chuyển hoá vật chất
2.2.1. Cơ chế lên men lactose [3, 5]
Các vi sinh vật dị dưỡng nói chung cần được cung cấp nguồn cacbon dưới dạng
chất hữu cơ, thường là carbohydrate. Các carbohydrate này được vi sinh vật sử dụng làm
nguồn năng lượng thông qua quá trình lên men. Clostridium perfringens có khả năng lên

9



men lactose dưới sự xúc tác của enzym β - galactosidase sẽ tạo ra các đường đơn theo
phản ứng sau:

Betagalactosid
galactosidase
aase

Lactose

galactose

glucose

Các đường đơn này sẽ được vi sinh vật sử dụng và lên men tạo ra một số sản phẩm
bao gồm rượu (CxHyOH), các acid hữu cơ (CxHyCOOH), CO2…Các sản phẩm này làm
giảm pH của môi trường. Do vậy, khả năng lên men đường được đánh giá thông qua sự
làm giảm pH của môi trường nuôi cấy, dẫn đến sự thay đổi màu của chất chỉ thị phenol
red.
Phản ứng lên men lactose được xem là dương tính khi màu môi trường nuôi cấy
chuyển từ đỏ sang vàng.

10


Hình 2.4. Thử nghiệm lên men lactose [22]
Ghi chú: (-) phản ứng âm tính có màu đỏ
(+) phản ứng dương tính có màu vàng
2.2.2. Cơ chế thuỷ giải gelatin [5]
Gelatin là một protein có kích thước phân tử lớn.


Hình 2.5. Cấu trúc phân tử gelatin [23]
Clostridium perfringens có khả năng tổng hợp nhóm enzym gelatinase ngoại bào
xúc tác sự thuỷ phân gelatin thành polypeptide và acid amin để có thể sử dụng chúng như
một nguồn cung cấp năng lượng hay vật liệu xây dựng để tổng hợp các thành phần khác
của tế bào.

11


Quá trình thuỷ phân gelatin qua 2 giai đoạn như sau:
gelatinase

Protein + H2O

polypeptid

gelatinase

Polypeptide + H2O

amino acid

Bản thân gelatin có khả năng tự đông đặc ở nhiệt độ 2-80C, nhưng khi cấu trúc
phân tử bị phá vỡ, gelatin sẽ hóa lỏng dù ở nhiệt độ tủ mát.

Hình 2.6. Thử nghiệm gelatin [24]
Ghi chú: A: phản ứng âm tính với gelatin (gelatin đông )
B, C: phản ứng dương tính với gelatin (gelatin hóa lỏng)
2.2.3 Cơ chế khử nitrate thành nitrite [5]

Clostridium perfringens có khả năng tổng hợp hệ enzym nitratase xúc tác sự khử
nitrate thành nitrite và nitơ phân tử. Sự khử nitrate này còn đựơc gọi là sự phản nitrate
hóa, diễn ra trong điều kiện không có oxi phân tử. Đây là cách biến dưỡng năng lượng
theo phương thức hô hấp kỵ khí. Quá trình chỉ thực hiện khi môi trường không có sự hiện
diện của oxi phân tử. Sản phẩm cuối cùng của sự khử này có thể là nitrite (NO2-); amonia

12


(NH3), nitơ phân tử, một hydroxyamine (NH2OH) hay nitric oxide (NO) tùy thuộc vào
từng loại vi sinh vật và điều kiện môi trường theo phản ứng sau:

NO
NO3
NO33

-

Nitratas
Nitratase
Nitratas
e
e

NH3
NH3

NO3-

NO2NO2

NO2-

N2
N2

-

NH
NH2O
NH2OH
2OH
H
NO
NO

Hoạt tính nitratase sẽ được định tính dựa trên sự tạo thành nitrite và sự cạn kiệt
nitrate. Nitrite được tạo ra từ nitrate sẽ phản ứng với sulphanilamide và Nnapthylethylenediamine hydrochloride ở pH acid cho hợp chất màu hồng, phản ứng được
xem là dương tính. Tuy nhiên, trong trường hợp vi khuẩn tiếp tục chuyển hóa nitrite thành
các hợp chất khác nên mặc dù có sự hiện diện của nitratase nhưng môi trường cũng không
xuất hiện màu hồng. Trường hợp này, ta tiến hành kiểm chứng sự cạn kiệt của nitrate
bằng bụi kẽm kim loại, nitrate sẽ có phản ứng với bụi kẽm tạo phức màu hồng.

A

B

Hình 2.7. Thử nghiệm Nitrate [30]
Ghi chú: (+) phản ứng dương tính
(-) phản ứng âm tính


13


2.3. Sự biểu hiện của enzym β-galactosidase và acid phosphatase ở Clostridium
perfringens
Năm 2001, nhóm nghiên cứu Phillip W. Adcock và Christopher P. Saint đã thành
công trong việc xây dựng phương pháp khẳng định nhanh C. perfringens trong mẫu nước
dựa vào sự biểu hiện hoạt tính 2 enzym β - galactosidase và acid phosphatase, thay cho
các thử nghiệm sinh hóa khẳng định truyền thống. Nghiên cứu này đã được công bố trên
tạp chí Applied and Environmental Microbiology tháng 09 năm 2001 [6].
Ngoài ra, một số nghiên cứu cơ bản khác cũng chỉ ra rằng ở C. perfringens có sự
hiện diện của enzym β-galactosidase và acid phosphatase.
2.3.1 Enzym acid phosphatase [4, 15]
Trong hầu hết các vi khuẩn kỵ khí đều có sự hoạt động của enym phosphatase.
Richard K. Porschen và Earle H. Spaulding đã làm vài thử nghiệm kiểm tra sự hiện
diện của enzym phosphatase ở những vi sinh vật tồn tại trong những mẫu kiểm tra lâm
sàng. Vi sinh vật sẽ được nuôi cấy trong trong môi trường thạch BHI (brain heart infusion
agar) có bổ sung 5 % máu cừu, 0.5 % cao nấm men và 0.5 g menadione trên ml được ủ
trong bình kỵ khí có gaspak với áp suất là 85% N2, 10%H2, 5% O2 trong vòng 48 giờ ở
37oC. Kết quả thí nghiệm cho thấy trong hầu hết các vi sinh vật kiểm tra đều có sự hiện
diện của enzym phosphatase. Hoạt động của enzym thể hiện mạnh ở những loài như vi
khuẩn hình que gram âm, hình cầu gram dương, và vi khuẩn hình que gram dương có bào
tử.
Trong số đó thì Clostridium perfringens có biểu hiện enzym phosphatase mạnh
nhất. Tất cả các dòng Clostridium perfringens kiểm tra đểu có phản ứng dương tính mạnh
ở tất cả các giá trị pH khác nhau, trong khi những loài khác chỉ có biểu hiện enzym này ở
những giá trị pH nhất định.
Một vài nghiên cứu khác đã chỉ ra rằng nếu được nuôi cấy ở 370C trong 24 giờ
hoặc 440C trong 6 giờ thì 98,5% các chủng Clostridium perfringens đều có biểu hiện của
enzym phosphatase. Chính vì thế, dựa vào hoạt động của enzym phosphatase để xác định

C. perfringens được xem là phương pháp đáng tin cậy [15].

14


Bảng 2.6. Biểu hiện enzym phosphatase của các chủng vi khuẩn ở những giá trị pH khác
nhau [15]
pH

Vi khuẩn

4,0

5,2

6,0

7,2

8,6

+++

++++

++++

++++

++++


F. gonidiaformans

-

-

-

+

+

B. melaninogenicus

+

-

+

++

+++

B. pneumosintes

-

-


-

-

-

C. perfringens

Ghi chú:
(+), (++), (+++), (++++): mức độ biểu hiện dương tính với enzym phosphatase
ngày càng tăng.
(-): âm tính với enzym phosphatase.
Một vài nghiên cứu khác đã chỉ ra rằng nếu được nuôi cấy ở 370C trong 24 giờ
hoặc 440C trong 6 giờ thì 98,5% các chủng Clostridium perfringens đều có biểu hiện của
enzym phosphatase. Chính vì thế, dựa vào hoạt động của enzym phosphatase để xác định
C. perfringens được xem là phương pháp đáng tin cậy [15].
D.P. Sartory và cộng sự (2006) đã công bố nghiên cứu “Đánh giá phương pháp
phát hiện C. perfringens trong mẫu nước bằng thử nghiệm khẳng định dựa trên acid
phosphatase”. Nghiên cứu cho thấy, acid phosphatase được tạo ra bởi cả 10 dòng
C. perfringens kiểm tra. Trong số 114 chủng phân lập được định danh là C. perfringens,
có 108 chủng cho kết quả acid phosphatase dương tính (94,7%) [6].
Để kiểm tra sự hiện diện của enzym acid phosphatase, cơ chất 4-methyl
umbelliferyl phosphate (4-MUP) được bổ sung vào môi trường nuôi cấy C. perfringens.
Acid phosphatase tạo ra sẽ cắt 4-MUP tại gốc phosphate (-H2PO3) giải phóng ra 4methylumbelliferone, một chất có khả năng phát quang dưới kích thích của tia UV ở bước
sóng 365nm, theo phản ứng sau:
Phosphatase
Phosphatase

15