BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC


LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT HỆ ENZYME THỦY PHÂN AMYLASE,
PROTEASE TỪ CÁC CHỦNG Bacillus subtilis VÀ
THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT CHẾ PHẨM
PROBIOTIC

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Niên khóa: 2004 – 2008
Sinh viên thực hiện: HUỲNH MINH THƯ

Tháng 9/2008


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HCM
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC


LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT HỆ ENZYME THỦY PHÂN AMYLASE,
PROTEASE TỪ CÁC CHỦNG Bacillus subtilis VÀ
THỬ NGHIỆM SẢN XUẤT CHẾ PHẨM
PROBIOTIC

Giáo viên hướng dẫn:
Ths. TRƯƠNG PHƯỚC THIÊN HOÀNG
CN. TRẦN TỪ DUY

Tháng 9/2008

Sinh viên thực hiện:
HUỲNH MINH THƯ


LỜI CẢM TẠ
 Xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cô Trương Phước Thiên Hoàng và anh Trần Từ
Duy, người đã tận tình chỉ bảo và tạo điều kiện tốt cho tôi hoàn thành tốt khóa
luận.
 Lời chân thành, xin cảm ơn ban Giám hiệu trường Đại học Nông Lâm thành
phố Hồ Chí Minh, Ban chủ nhiệm Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả
Quý Thầy Cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tập tại
trường.
 Lời cảm ơn gởi đến bộ môn Sinh hóa trường Đại học Khoa học Tự nhiên, công
ty Gia Tường, khoa Chăn nuôi Thú y trường Đại học Nông Lâm đã cung cấp
một số vật liệu cho tôi trong suốt quá trình thí nghiệm.
 Cùng lời cảm ơn đến các anh Quân, Nguyên đã có những ý kiến xác thực để
khóa luận được hoàn chỉnh.
 Cảm ơn em Trí - người đã cùng tôi thực hiện thí nghiệm.
 Xin cảm ơn tất cả những người bạn thân luôn bên tôi chia sẽ, giúp đỡ, động
viên và đồng hành cùng tôi suốt quá trình học tập tại trường.
 Ngàn lời biết ơn gởi đến ba má cùng gia đình kính yêu, người đã nuôi dạy con
nên người.

Huỳnh Minh Thư


iii


TÓM TẮT
Huỳnh Minh Thư, Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh, thực hiện đề tài
“Khảo sát hệ enzyme thủy phân amylase, protease từ các chủng Bacillus subtilis
và thử nghiệm sản xuất chế phẩm probiotic” tại phòng Nghiên cứu và Ứng dụng,
Bộ môn Sinh hoá, khoa Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên thành phố Hồ
Chí Minh, từ ngày 5/5/2008 đến ngày 5/9/2008.
Giáo viên hướng dẫn: Thạc sĩ Trương Phước Thiên Hoàng
Cử nhân Trần Từ Duy
Sử dụng phương pháp Heinkel xác định hoạt độ amylase, phương pháp Anson
xác định hoạt độ protease để khảo sát thời gian nuôi cấy, mật độ giống, hàm lượng ion
Ca2+ ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp enzyme. Chế phẩm probiotic là kết quả
phối trộn hai canh trường nuôi cấy Bacillus subtilis và Lactobacillus acidophilus.
Ngoài ra, chế phẩm probiotic được kiểm tra tính kháng khuẩn bằng phương pháp đục
lỗ thạch.
Kết quả nghiên cứu cho thấy:
 Chủng Bs5 có khả năng tổng hợp enzyme amylase, protease cao nhất
trong 10 chủng Bacillus subtilis khảo sát.
 Chủng Bs5 có thể tổng hợp enzyme cao nhất ở 60 giờ nuôi cấy với mật độ
giống tối ưu là 107 tế bào/ml, hàm lượng ion Ca2+ thích hợp là 0,15%.
 Trong 1g chế phẩm probiotic thử nghiệm có chứa 109 tế bào Bacillus
subtilis, 107 tế bào Lactobacillus acidophilus, 1,56% acid lactic, 1342,12
đơn vị amylase, 12,16 đơn vị protease.
 Chế phẩm thử nghiệm có khả năng kháng E.coli, Salmonella,
Staphylococcus aureus trên môi trường thạch đĩa nhưng rất yếu.

iv



SUMMARY
Huynh Minh Thu, Agricultur and Forestry University of Ho Chi Minh City.
September, 2008.
“RESEARCHING

ABOUT

THE

HYDROLYSIS

ENZYME

SYSTEM:

AMYLASE, PROTEASE FROM Bacillus subtilis SPECIES AND PRODUCING
PROBIOTIC”
Supervisor: Master Truong Phuoc Thien Hoang and Tran Tu Duy
Using Heinkel method to define amilase’s activity, Anson method to estimate
protease’s activity. Both of them used to research affection of time culture, seed
density, Ca2+ content to biosynthesis enzyme process. Probiotic product is combination
of Bacillus subtilis and Lactobacillus acidophilus and are texted antibacterian.
Researching results:
 Species Bs5 have the highest enzyme amylase, protease synthesis possibility
among 10 Bacillus subtilis species.
 Species Bs5 can be the best enzyme synthesis at time culture 60 hour, culture
density 107 cell/ml, Ca2+ content 0.15%.
 Have about 109 cell Bacillus subtilis, 107 cell Lactobacillus acidophilus, 1,56%

acid lactic, 1342,12 amylase activity, 12,16 protease activity.
 Probiotic product can resist E.coli, Salmonella, Staphylococcus aureus are
culture on aga disk. But the resistance is very weak.
Keyword: Bacillus subtilis, Lactobacillus acidophilus, amylase, protease,
probiotic.

v


MỤC LỤC
LỜI CẢM TẠ ................................................................................................................ iii
TÓM TẮT ......................................................................................................................iv
SUMMARY ....................................................................................................................v
DANH SÁCH MỘT SỐ TỪ VIẾT TẮT .......................................................................xi
DANH SÁCH CÁC BẢNG ......................................................................................... xii
DANH SÁCH CÁC HÌNH...........................................................................................xiv
DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ ....................................................................................xiv
DANH SÁCH CÁC ĐỒ THỊ ........................................................................................xv
DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ..........................................................................................xv

Chương 1. MỞ ĐẦU .......................................................................... 1
1.1. Đặt vấn đề ...................................................................................................................... 1
1.2. Mục đích .......................................................................................................................... 2
1.3. Yêu cầu ............................................................................................................................ 2

Chương 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................... 3
2.1. Khái quát về vi khuẩn Bacillus subtilis........................................................................ 3
2.1.1. Lịch sử phát hiện ......................................................................................................... 3
2.1.2. Đặc điểm của Bacillus subtilis.................................................................................... 3
2.1.2.1. Đặc điểm phân loại .................................................................................................... 3

2.1.2.2. Đặc điểm phân bố ...................................................................................................... 3
2.1.2.3. Đặc điểm hình thái ..................................................................................................... 4
2.1.2.4. Đặc điểm sinh hóa...................................................................................................... 4
2.1.2.5. Đặc điểm nuôi cấy ..................................................................................................... 5
2.1.2.6. Bộ gen của Bacillus subtilis...................................................................................... 5
2.1.2.7. Bào tử và khả năng tạo bào tử .................................................................................. 5
2.1.3. Một số enzyme quan trọng được tổng hợp bởi Bacillus subtilis ............................ 6
2.1.4. Tính đối kháng của Bacillus subtilis .......................................................................... 6
2.1.4.1. Với đồng loại .............................................................................................................. 7
2.1.4.2. Với vi sinh vật gây bệnh ........................................................................................... 7
2.1.5. Ứng dụng ....................................................................................................................... 7

vi


2.1.5.1. Trong công nghiệp ..................................................................................................... 7
2.1.5.2. Trong nông nghiệp ..................................................................................................... 7
2.1.6. Tác hại của Bacillus subtilis ....................................................................................... 8
2.1.6.1. Đối với người ............................................................................................................. 8
2.1.6.2. Đối với động thực vật ................................................................................................ 8
2.2. Khái quát về vi khuẩn Lactobacillus acidophilus ...................................................... 8
2.2.1. Lịch sử phát hiện .......................................................................................................... 8
2.2.2. Đặc điểm về Lactobacillus acidophilus .................................................................... 9
2.2.2.1. Đặc điểm phân loại ................................................................................................... 9
2.2.2.2. Đặc điểm phân bố ...................................................................................................... 9
2.2.2.3. Đặc điểm hình thái ..................................................................................................... 9
2.2.2.4. Đặc điểm sinh hóa ................................................................................................... 10
2.2.2.5. Đặc điểm nuôi cấy ................................................................................................... 10
2.2.3. Hoạt động trao đổi chất ............................................................................................. 11
2.2.4. Ứng dụng của vi khuẩn Lactobacillus acidophilus ................................................ 11

2.2.4.1. Trong công nghiệp ................................................................................................... 11
2.2.4.2. Trong nông nghiệp ................................................................................................... 12
2.2.4.3. Trong bảo quản và chế biến thực phẩm ................................................................ 12
2.2.4.4. Trong y dược ............................................................................................................ 12
2.2.5. Tác hại của Lactobacillus acidophilus .................................................................... 12
2.3. Khái quát về enzyme amylase ..................................................................................... 13
2.3.1. Lịch sử nghiên cứu ................................................................................................... 13
2.3.2. Phân loại ...................................................................................................................... 13
2.3.3. Cơ chất của amylase ................................................................................................. 13
2.3.4. Nguồn thu nhận amylase ........................................................................................... 14
2.3.4.1. Amylase từ thực vật (malt) ..................................................................................... 14
2.3.4.2. Amylase từ vi sinh vật ............................................................................................. 14
2.3.5. Thu nhận amylase từ vi sinh vật ............................................................................... 15
2.3.5.1. Sinh tổng hợp amylase ở vi sinh vật ...................................................................... 15
2.3.5.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp amylase ............................. 15
2.3.6. Ứng dụng của amylase .............................................................................................. 16
2.3.6.1. Trong công nghiệp thực phẩm................................................................................ 16
vii


2.3.6.2. Công nghiệp dệt may ............................................................................................... 17
2.3.6.3. Sản xuất thức ăn gia súc giúp cải thiện tiêu hóa .................................................. 17
2.3.6.4. Trong y học ............................................................................................................... 18
2.4. Khái quát về enzyme protease .................................................................................... 18
2.4.1. Lịch sử nghiên cứu .................................................................................................... 18
2.4.2. Phân loại ...................................................................................................................... 18
2.4.3. Cơ chất ......................................................................................................................... 19
2.4.4. Các nguồn thu nhận protease .................................................................................... 19
2.4.5. Ứng dụng ..................................................................................................................... 20
2.4.5.1. Trong chế biến thực phẩm ...................................................................................... 20

2.4.5.2. Ứng dụng trong công nghiệp thức ăn gia súc ....................................................... 21
2.4.5.3. Trong công nghệ sản xuất chất tẩy rửa ................................................................. 21
2.4.5.4. Trong công nghiệp da .............................................................................................. 21
2.4.5.5. Sản xuất insualin cho người từ insulin heo ........................................................... 21
2.4.5.6. Dịch thủy phân vi sinh vật ...................................................................................... 21
2.5. Khái quát về probiotic .................................................................................................. 22
2.5.1. Các định nghĩa về probiotic ..................................................................................... 22
2.5.2. Thành phần của probiotic .......................................................................................... 22
2.5.3. Tiêu chí chọn lựa vi sinh vật probiotic .................................................................... 22
2.5.4. Cơ chế tác động của probiotic .................................................................................. 23
2.5.4.1. Tác động kháng khuẩn của probiotic..................................................................... 23
2.5.4.2. Tác động của probiotic lên biểu mô ruột .............................................................. 23
2.5.4.3. Tác động miễn dịch của probiotic.......................................................................... 24
2.5.4.4. Tác động của probiotic đến vi khuẩn đường ruột ................................................ 24
2.5.4.5. Tác động tăng khả năng hấp thu thức ăn của probiotic....................................... 24
2.5.5. Yếu tố ảnh hưởng đến hiệu quả của probiotic ........................................................ 24
2.5.6. Tác dụng của probiotic .............................................................................................. 24
2.5.7. Ứng dụng của probiotic ............................................................................................. 25
2.5.7.1. Chăn nuôi .................................................................................................................. 25
2.5.7.2. Nuôi trồng thủy sản ................................................................................................. 25
2.5.7.3. Y học.......................................................................................................................... 26
2.5.8. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng probiotic trong và ngoài nước...................... 26
viii


2.5.8.1. Trong nước................................................................................................................ 26
2.5.8.2. Ngoài nước................................................................................................................ 27
2.6. Kết luận ............................................................................................................................ 27

Chương 3. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM...... 28

3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài ....................................................................... 28
3.1.1. Thời gian ..................................................................................................................... 28
3.1.2. Địa điểm ...................................................................................................................... 28
3.2. Vật liệu ........................................................................................................................... 28
3.2.1. Các chủng vi sinh vật nghiên cứu ............................................................................ 28
3.2.1.1. Các chủng vi sinh vật khảo sát ............................................................................... 28
3.2.1.2. Các chủng vi sinh vật kiểm định ............................................................................ 29
3.2.2. Nguyên liệu và môi trường nuôi cấy ....................................................................... 29
3.2.2.1. Nguyên liệu ............................................................................................................... 29
3.2.2.2. Môi trường nuôi cấy ............................................................................................... 29
3.2.3. Thiết bị, dụng cụ và hóa chất .................................................................................... 29
3.2.3.1. Thiết bị và dụng cụ .................................................................................................. 29
3.2.3.2. Hóa chất .................................................................................................................... 30
3.3. Các phương pháp thực hiện trong đề tài .................................................................... 30
3.4. Phương pháp .................................................................................................................. 30
3.4.1. Phương pháp định tính và sơ bộ định lượng hoạt độ enzyme amylase, protease
bằng đường kính vòng phân giải .......................................................................................... 30
3.4.2. Khảo sát khả năng sinh enzyme amylase, protease của các chủng B. subtilis .. 31
3.4.3. Khảo sát ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến hoạt độ enzyme ........................ 31
3.4.4. Khảo sát mật độ giống cho vào nuối cấy................................................................. 32
3.4.5. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ ion Ca2+ ............................................................. 33
3.4.6. Nuôi cấy thu nhận chế phẩm Bacillus subtilis ........................................................ 33
3.4.7. Nuôi cấy thu nhận chế phẩm Lactobacillus acidophillus ..................................... 34
3.4.8. Kiểm tra khả năng kháng khuẩn của chế phẩm thử nghiệm ................................. 35
3.4.9. So sánh chế phẩm với các sản phẩm probiotic ngoài thị trường .......................... 35

ix


Chương 4. KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ........................................ 37

4.1. Kết quả định tính và sơ bộ định lượng hệ enzyme amylase và protease của các
chủng Bacillus subtilis ........................................................................................................... 37
4.1.1. Kết quả vòng phân giải tinh bột ............................................................................... 37
4.1.2. Kết quả vòng phân giải casein .................................................................................. 39
4.2. Kết quả khảo sát hệ enzyme amylase và protease của các chủng B.subtilis ......... 42
4.2.1. Đối với amylase .......................................................................................................... 43
4.2.2. Đối với protease.......................................................................................................... 44
4.3. Kết quả khảo sát thời gian nuôi cấy chủng Bacillus subtilis 5 ............................... 45
4.3.1. Đối với amylase .......................................................................................................... 46
4.3.2. Đối với protease.......................................................................................................... 47
4.4. Kết quả khảo sát mật độ giống cho vào nuôi cấy ..................................................... 49
4.4.1. Đối với amylase .......................................................................................................... 49
4.4.2. Đối với protease.......................................................................................................... 50
4.5.Kết quả khảo sát ảnh hưởng của ion Ca2+ đến sinh tổng hợp enzyme ...................... 51
4.5.1.Đối với amylase ............................................................................................................ 52
4.5.2.Đối với protease............................................................................................................ 53
4.6. Kết quả nuôi cấy thu nhận chế phẩm Bacillus subtilis ............................................ 54
4.7. Kết quả khảo sát chất mang bảo quản Lactobacillus acidophilus .......................... 55
4.7.1. Đối với mật độ tế bào.................................................................................................. 56
4.7.2. Đối với acid lactic ....................................................................................................... 57
4.8. Kết quả phối trộn canh trường nuôi cấy B. subtilis và L. acidophilus ................... 59
4.9. Kết quả kiểm tra tính kháng khuẩn của chế phẩm thử nghiệm ............................... 60
4.10.Kết quả so sánh chế phẩm với sản phẩm probiotic trên thị trường ........................ 64
4.10.1.Kết quả so sánh hệ enzyme và hàm lượng acid lactic ........................................... 64
4.10.2.Kết quả so sánh mật độ tế bào .................................................................................. 65
4.10.3.Kết quả so sánh tính kháng khuẩn ........................................................................... 66

Chương 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ........................................... 68
5.1. Kết luận ............................................................................................................................ 68
5.2. Đề nghị ............................................................................................................................. 68


TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................. 70
x


DANH SÁCH MỘT SỐ TỪ VIẾT TẮT
OD

Optical density

UI

Units International

gCT

Gam canh trường

gCP

Gam chế phẩm

% w/w

Nồng độ phần trăm khối lượng

tb/ml

Tế bào/mililit


TCA

Trichlocaetic acid

DAP

Diamoni photphate

CFU

Colony Forming Unit (đơn vị khuẩn lạc)

ATP

Adenozin tri photphate

HIV

Human Immuno – deficiency virus

MCU

Milk Clotting Units

TSA

Trypticase Soya agar

Ca2+ – DPA


Dipicolinate canxi

MRS

De man, Rogosa, Sharpe

SE

Standard error (sai số chuẩn)

CV

Coefficient of Vestion (độ biến động số liệu)

P

Probability (mức độ tin cậy)

ctv

Cộng tác viên

xi


DANH SÁCH CÁC BẢNG
BẢNG

TRANG


Bảng 2.1

Phản ứng sinh hóa của Bacillus subtilis ............................................ 4

Bảng 2.2

Khả năng lên men một số loại đường của Lactobacillus
acidophilus ........................................................................................ 10

Bảng 2.3

Các phản ứng sinh hóa khác của Lactobacillus acidophilus ............. 10

Bảng 2.4

Hàm lượng amylose và amylopectin ở một số dạng tinh bột ............ 14

Bảng 2.5

Một số chủng vi sinh vật tổng hợp amylase ..................................... 15

Bảng 2.6

Một số nguồn thực phẩm giàu protein .............................................. 19

Bảng 2.7

Một số vi sinh vật có khả năng tổng hợp protease ............................. 20

Bảng 3.1


Các chủng vi khuẩn nghiên cứu ........................................................ 28

Bảng 3.2

Các chủng vi khuẩn kiểm định .......................................................... 29

Bảng 3.3

Bố trí thí nghiệm 1 ............................................................................................. 30

Bảng 3.4

Bố trí thí nghiệm 2 ............................................................................ 31

Bảng 3.5

Bố trí thí nghiệm 3 ............................................................................ 32

Bảng 3.6

Bố trí thí nghiệm 4 ............................................................................ 33

Bảng 3.7

Bố trí thí nghiệm 5 ............................................................................ 33

Bảng 3.8

Bố trí thí nghiệm 6 ............................................................................ 34


Bảng 3.9

Bố trí thí nghiệm 8 ............................................................................ 35

Bảng 4.1

Kết quả biến thiên đường kính vòng phân giải tinh bột của
10 chủng Bacillus subtilis nghiên cứu................................................ 36

Bảng 4.2

Kết quả biến thiên đường kính vòng phân giải casein của
10 chủng Bacillus subtilis nghiên cứu................................................ 38

Bảng 4.3

Kết quả biến thiên hoạt tính enzyme amylase của
10 chủng Bacillus subtilis nghiên cứu................................................ 42

Bảng 4.4

Kết quả biến thiên hoạt tính enzyme protease của
10 chủng Bacillus subtilis nghiên cứu................................................ 43

Bảng 4.5

Kết quả biến thiên hoạt tính enzyme amylase theo
thời gian nuôi cấy ............................................................................... 47


Bảng 4.6

Kết quả biến thiên hoạt tính enzyme protease theo

xii


thời gian nuôi cấy ............................................................................... 47
Bảng 4.7

Kết quả biến thiên hoạt tính enzyme amylase theo
mật độ giống nuôi cấy ........................................................................ 49

Bảng 4.8

Kết quả biến thiên hoạt tính enzyme protease theo
mật độ giống nuôi cấy ........................................................................ 50

Bảng 4.9

Kết quả biến thiên hoạt tính enzyme amylase theo nồng độ Ca2+ ..... 52

Bảng 4.10

Kết quả biến thiên hoạt tính enzyme protease theo nồng độ Ca2+

Bảng 4.11

Kết quả nuôi cấy thu nhận chế phẩm Bacillus subtilis....................... 55


Bảng 4.12

Biến thiên mật độ vi khuẩn Lactobacillus acidophilus ..................... 56

Bảng 4.13

Biến thiên hàm lượng acid lactic ....................................................... 58

Bảng 4.14

Kết quả xác định một số chỉ tiêu trong chế phẩm probiotic............... 59

Bảng 4.15

Biến thiên đường kính vòng kháng khuẩn của chế phẩm probiotic

53

thử nghiệm với một số vi khuẩn gây bệnh đường ruột ...................... 60
Bảng 4.16

Biến thiên đường kính vòng kháng khuẩn của Bacillus subtilis,
Lactobacillus acidophilus với một số vi sinh vật gây bệnh .............. 61

Bảng 4.17

Kết quả so sánh hoạt độ enzyme và hàm lượng acid lactic................ 64

Bảng 4.18


Kết quả so sánh số lượng tế bào trong chế phẩm............................... 65

Bảng 4.19

Kết quả so sánh tính kháng khuẩn của chế phẩm............................... 66

xiii


DANH SÁCH CÁC HÌNH
HÌNH

TRANG

Hình 2.1

Hình thái vi khuẩn Bacillus subtilis ................................................. 4

Hình 2.2

Hình thái vi khuẩn Lactobacillus acidophilus ............................... 19

Hình 2.3

Cấu trúc 3D của α – amylase ......................................................... 13

Hình 2.4

Cấu trúc 3D của một protease serin ............................................... 19


Hình 4.1

Hình vòng phân giải tinh bột và casein (1,2) ................................. 40

Hình 4.2

Đường kính vòng kháng khuẩn của chế phẩm thử nghiệm............ 66

Hình 4.3

Đường kính vòng phân giải của Bacillus subtilis........................... 63

DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ
BIỂU ĐỒ

TRANG

Biểu đồ 4.1 Biến thiên đường kính vòng phân giải tinh bột của
các chủng Bacillus subtilis ............................................................. 38
Biểu đồ 4.2 Biến thiên đường kính vòng phân giải casein của
các chủng Bacillus subtilis ............................................................. 39
Biểu đồ 4.3 Biến thiên hoạt tính enzyme amylase của 10 chủng
Bacillus subtilis .............................................................................. 43
Biểu đồ 4.4 Biến thiên hoạt tính enzyme protease của 10 chủng
Bacillus subtilis .............................................................................. 45
Biểu đồ 4.5 Biến thiên logarit mật độ tế bào Lactobacillus acidophilus
theo các phương pháp bảo quản .................................................... 57
Biểu đồ 4.6 Biến thiên hàm lượng acid lactic theo các phương pháp
bảo quản ......................................................................................... 58
Biểu đồ 4.7 Biến thiên đường kính vòng kháng khuẩn ..................................... 62

Biểu đồ 4.8 So sánh hoạt độ enzyme giữa các chế phẩm probiotic................... 64
Biểu đồ 4.9 So sánh mật độ tế bào giữa các chế phẩm probiotic ...................... 65
Biểu đồ 4.10 So sánh tính khánh khuẩn của chế phẩm........................................ 66

xiv


DANH SÁCH CÁC ĐỒ THỊ
ĐỒ THỊ
Đồ thị 4.1

TRANG
Biến thiên hoạt tính enzyme amylase theo thời gian
nuôi cấy .......................................................................................... 46

Đồ thị 4.2

Biến thiên hoạt tính enzyme protease theo thời gian
nuôi cấy .......................................................................................... 48

Đồ thị 4.3

Biến thiên hoạt độ enzyme amylase theo mật độ giống
nuôi cấy .......................................................................................... 49

Đồ thị 4.4

Biến thiên hoạt độ enzyme protease theo mật độ giống
nuôi cấy .......................................................................................... 51


Đồ thị 4.5

Biến thiên hoạt độ enzyme amylase theo hàm lượng
ion Ca2+ ........................................................................................... 52

Đồ thị 4.6

Biến thiên hoạt độ enzyme protease theo hàm lượng
ion Ca2+ ........................................................................................... 54

DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ
SƠ ĐỒ

TRANG

Sơ đồ 2.1

Cơ chế lên men lactic đồng hình .................................................... 11

Sơ đồ 3.1

Quá trình tiến hành thí nghiệm....................................................... 36

Sơ đồ 5.1

Qui trình sản xuất probiotic............................................................ 69

xv



Chương 1

MỞ ĐẦU
1.1.

Đặt vấn đề
Khái niệm phát triển bền vững được con người bắt đầu quan tâm khi họ nhận ra

mặt tác hại của các hoạt động sản xuất, sinh hoạt của họ là đã quá lạm dụng và vượt
mức giới hạn của quy luật tự nhiên. Từ việc chặt phá rừng đến việc sử dụng thuốc bảo
vệ thực vật bừa bãi, sử dụng khoa học công nghệ tác động vào tự nhiên một cách
không khoa học,... đã gây ra nhiều hậu quả vô cùng nghiêm trọng. Đặt biệt những năm
gần đây, trong quá trình đẩy mạnh sản xuất, người ta đã sử dụng nhiều hơn các thuốc
kháng sinh để phòng và trị bệnh ở gia cầm, gia súc, thủy hải sản. Các kháng sinh này ít
nhiều vẫn tồn đọng trong sản phẩm, dư lượng được thải vào tự nhiên và tất nhiên điều
này sẽ tác động xấu đến hệ sinh thái tự nhiên và ảnh hưởng đến sức khỏe của con
người – đó là mối quan tâm hàng đầu của chúng ta.
Nói đến đây, để thấy rằng không có gì là lợi ích tuyệt đối, tuy nhiên con người có
thể điều chỉnh mặt tác hại đến mức thấp nhất. Xuất phát từ yêu cầu thực tế cùng với sự
phát triển của lĩnh vực Công nghệ sinh học, người ta bắt đầu nghiên cứu và đưa vào
ứng dụng rộng rãi các thành tựu để phục vụ cho phát triển “nền nông nghiệp xanh”
như chuyển gen Bt kháng sâu bệnh, nhân giống in vitro sản xuất cây sạch bệnh, chế
phẩm sinh học (probiotic),…Trong hàng loạt các ứng dụng, chế phẩm probiotic được
các ngành chăn nuôi gia cầm, gia súc, nuôi trồng thủy sản rất quan tâm, bởi lẽ chế
phẩm này phần nào hạn chế sử dụng thuốc kháng sinh, tăng cường khả năng tiêu hoá
của vật nuôi đồng thời đem lại hiệu quả kinh tế cao.
Vấn đề đặt ra ở hiện tại và trong tương lai là phải sản xuất nhiều hơn nữa, đa
dạng hóa sản phẩm các chế phẩm sinh học, hạ giá thành đến mức thấp nhất, đồng thời
nâng cao chất lượng, tính an toàn của sản phẩm để sử dụng rộng rãi hơn. Không ngoài
mục đích trên, dưới sự hướng dẫn của Ths. Trương Phước Thiên Hoàng và CN. Trần

Từ Duy, chúng tôi thực hiện đề tài: “Khảo sát hệ enzyme thủy phân amylase,
protease từ các chủng Bacillus subtilis và thử nghiệm sản xuất chế phẩm
probiotic”.

1


1.2. Mục đích
Mục đích thực hiện đề tài là khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzyme amylase và
protease của các chủng Bacillus subtilis. Từ đó, nuôi cấy và phối trộn sinh khối với
sinh khối của vi khuẩn Lactobacillus acidophillus để thử nghiệm sản xuất chế phẩm
probiotic.
1.3. Yêu cầu
Quá trình thực hiện đề tài cần phải giải quyết các yêu cầu sau:
 Khảo sát định tính, định lượng để chọn ra chủng Bacillus subtilis tổng hợp
amylase, protease cao nhất.
 Khảo sát một số điều kiện nuôi cấy: thời gian, mật độ giống, hàm lượng ion Ca2+
ảnh hưởng đến khả năng tổng hợp enzyme nhằm chọn ra điều kiện nuôi cấy thích
hợp.
 Nuôi cấy và khảo sát phương pháp chất mang để thu chế phẩm Lactobacillus
acidophillus.
 Xây dựng quy trình sản xuất thử nghiệm chế phẩm probiotic từ Bacillus subtilis
và Lactobacillus acidophilus.
 Kiểm tra khả năng kháng khuẩn của chế phẩm probiotic.
 So sánh với một số chế phẩm hiện bán ngoài thị trường.

2


Chương 2


TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Khái quát về vi khuẩn Bacillus subtilis
2.1.1. Lịch sử phát hiện
Bacillus subtilis được phát hiện lần đầu tiên trong phân ngựa vào năm 1941 bởi
tổ chức y học Nazi của Đức. Lúc đầu, chúng được sử dụng chủ yếu để phòng bệnh lị
cho các binh sĩ Đức chiến đấu ở Bắc Phi.
Năm 1949 – 1957, Henry và các cộng sự tách được các chủng thuần khiết của
Bacillus subtilis. Ngày nay, Bacillus subtilis đã được nghiên cứu và sử dụng rộng rãi
trên thế giới (trích dẫn Bùi Thị Phi, 2007).
2.1.2. Đặc điểm của Bacillus subtilis
2.1.2.1. Đặc điểm phân loại
Theo phân loại của Bergey (1974), Bacillus subtilis thuộc:
Giới: Bacteria
Ngành: Firmicutes
Lớp: Bacilli
Bộ: Eubacillales
Họ: Bacillaceae
Giống: Bacillus
Loài: Bacillus subtilis
(trích dẫn Lý Kim Hữu, 2005)
2.1.2.2. Đặc điểm phân bố
Vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc nhóm vi sinh vật hiếu khí hay kỵ khí tùy nghi.
Chúng phân bố hầu hết trong tự nhiên, phần lớn chúng cư trú trong đất và rơm cỏ nên
còn được gọi là “trực khuẩn rơm cỏ”, thông thường đất trồng trọt có khoảng
106 – 107 triệu CFU/g (trích dẫn Bùi Thị Phi). Đất nghèo dinh dưỡng ở vùng sa mạc,
đất hoang thì sự hiện diện của vi khuẩn Bacillus subtilis rất hiếm . Ngoài ra, chúng còn
có mặt trong các nguyên liệu để sản xuất bột mì, bột gạo, trong các thực phẩm như
mắm, tương, chao,…


3


2.1.2.3. Đặc điểm hình thái
Bacillus subtilis là trực khuẩn nhỏ, hai đầu tròn, bắt màu gram dương,
kích thước 0,5 – 0,8 m x 1,5 – 3 m, đứng đơn lẽ hoặc thành chuỗi ngắn, có khả năng di
động. Sinh bào tử hình bầu dục, kích thước từ 0,8 – 1,8 m, bào tử có khả năng chịu
nhiệt, chịu ẩm, tia tử ngoại, tia phóng xạ (Bùi Thị Phi, 2007)

Hình 2.1. Hình thái vi khuẩn Bacillus subtilis
(URL://www.waterscan.co.yu/images/virusi-bakterije//Bacillus%20subtilis.jpg)
2.1.2.4. Đặc điểm sinh hóa
Theo trích dẫn của Lý Kim Hữu (2005), đặc điểm sinh hóa của Bacillus subtilis
được thể hiện ở bảng sau:
Bảng 2.1. Phản ứng sinh hóa của Bacillus subtilis
Phản ứng sinh hóa

Kết quả

Phản ứng sinh hóa

Kết quả

Hoạt tính catalase

+

Arabinose

+


Sinh indol



Xylose

+

Methyl red

+

Saccharose

+

Voges- Proskauer

+

Mannitol

+

Tan chảy gelatin

+

Glucose


+

Khử nitrate

+

Lactose



Phân giải tinh bột

+

Maltose

+

(Theo Holt, 1992)

4


2.1.2.5. Đặc điểm nuôi cấy
Vi khuẩn phát triển trong điều kiện hiếu khí, tuy nhiên vẫn phát triển được
trong môi trường thiếu oxy. Nhiệt độ tối ưu là 370C, pH thích hợp khoảng 7,0 – 7,4.
Vi khuẩn Bacillus subtilis phát tiển trên hầu hết các môi trường dinh dưỡng cơ
bản: Trên môi trường thạch đĩa TSA: khuẩn lạc dạng tròn, rìa răng cưa không đều,
màu vàng xám, đường kính 3 – 5 mm, sau 1 – 4 ngày bề mặt nhăn nheo, màu hơi nâu;

trên môi trường canh TSB: vi khuẩn phát triển làm đục môi trường, tạo màng nhăn,
lắng cặn, kết lại như vẩn mây ở đáy (trích dẫn Nguyễn Duy Khánh, 2006); trên môi
trường giá đậu – peptone: khuẩn lạc dạng tròn lồi, nhẵn bóng, đôi khi lan rộng, rìa
răng cưa không đều, đường kính đến 3– 4 cm sau 72 giờ nuôi cấy.
Nhu cầu dinh dưỡng: chủ yếu cần các nguyên tố C, H, O, N và một số nguyên
tố vi lượng khác. Vi khuẩn phát triển tốt trong môi trường cung cấp đủ nguồn carbon
(như glucose) và nitơ (như peptone).
2.1.2.6. Bộ gen của Bacillus subtilis
Năm 1997, người ta đã hoàn tất việc nghiên cứu về trình tự gen của Bacillus
subtilis và lần đầu tiên công bố trình tự gen của vi khuẩn này. Bộ gen chứa 4,2 megabase, xấp xỉ 4100 gen. Trong số đó, chỉ có 192 gen không thể thiếu được, 79 gen được
dự đoán là thiết yếu. Phần lớn gen thiết yếu đều có liên quan với quá trình trao đổi chất
của tế bào (theo tài liệu 33).
2.1.2.7. Bào tử và khả năng tạo bào tử
 Bào tử
Bào tử là một khối nguyên sinh chất đặc, có chứa các thành phần hóa học cơ
bản như ở tế bào sinh dưỡng nhưng có một vài điểm khác về tỉ lệ giữa các thành phần
và có thêm một số thành phần mới.
Bào tử Bacillus subtilis có dạng ellip đến hình cầu, kích thước 0,6 – 0,9 μm x
1,0 – 1,5 μm, được bao bọc bởi nhiều lớp màng với các thành phần lipoprotein,
peptidoglycan,…Bào tử Bacillus subtilis có khả năng chịu được pH thấp của dạ dày,
tiến đến ruột và nảy mầm tại phần đầu của ruột non. Đây là đặc điểm quan trọng trong
ứng dụng sản xuất probiotic từ Bacillus subtilis (trích dẫn Nguyễn Duy Khánh, 2006).

5


 Khả năng tạo bào tử
Nhờ khả năng tạo bào tử mà vi khuẩn có thể tồn tại được trong các điều kiện bất
lợi (dinh dưỡng trong môi trường cạn kiệt, môi trường tích lũy các sản phẩm trao đổi
chất có hại, nhiệt độ cao,…)

Quá trình hình thành bào tử gồm các bước sau:
 Hình thành những búi chất nhiễm sắc
 Tạo tiền bào tử
 Tiền bào tử hình thành hai lớp màng, tăng cao tính kháng bức xạ
 Tổng hợp các lớp vỏ bào tử
 Giải phóng bào tử. Khi gặp điều kiện thuận lợi thì bào tử sẽ nảy mầm và
phát triển thành tế bào sinh dưỡng mới (Nguyễn Lân Dũng và ctv, 2003).
 Sức đề kháng của bào tử
Bào tử có sức đề kháng cao đối với các yếu tố vật lý và hóa học như: nhiệt độ, tia
cực tím, áp suất và chất sát trùng, chất hút ẩm. Cơ chế kháng nhiệt của bào tử là do sự
chênh lệch cao về các canion và tính thấm nước giữa lớp áo và lớp vỏ bào tử. Cũng có
lý thuyết cho rằng việc tạo thành phức hợp của Ca2+ – DPA sẽ dẫn đến sự ngưng kết
các polyme sinh học trong bào tử và do đó làm tăng khả năng chịu nhiệt của bào tử
(Nguyễn Lân Dũng và ctv, 2003).
2.1.3. Một số enzyme quan trọng được tổng hợp bởi Bacillus subtilis
α–amylase: Ứng dụng trong công nghiệp dệt, sản xuất các chế phẩm sinh học bổ
sung vào thức ăn gia súc, sản xuất glucose, dextrin, malt,…
Protease: Ứng dụng trong nhiều ngành công nghiệp dày da, dệt, tận dụng phế liệu
giàu protein, y học, công nghiệp chế biến thức ăn gia súc.
Ngoài ra, còn có β–glucanase, xylanase, phytase, hemicellulase,…cũng được ứng
dụng nhiều trong công nghiệp thức ăn gia súc.
2.1.4. Tính đối kháng của Bacillus subtilis
Bacillus subtilis có khả năng tổng hợp hơn 20 loại kháng sinh khác nhau như:
subtilin, subtilisin A, TasA, sublancin, bacilisocin,…có khả năng kháng khuẩn và nấm
rất hữu ích (trích dẫn Đặng Ngọc Phương Uyên, 2007). Ngoài khả năng tổng hợp
kháng sinh, vi khuẩn Bacillus subtilis còn có khả năng cạnh tranh dinh dưỡng, do đó
chúng có tính đối kháng trên cả đồng loại và vi sinh vật gây bệnh.

6



2.1.4.1. Với đồng loại
Khi dinh dưỡng trong môi trường đã cạn kiệt, nó sẽ tiêu diệt những tế bào xung
quanh để hút chất dinh dưỡng, cho đến khi phải chuyển sang sống tiềm sinh.
Ngoài ra, theo nghiên cứu của nhóm chuyên gia Đại học Havard (Mỹ), trong giai
đoạn sớm hình thành bào tử, một số vi khuẩn Bacillus subtilis đã tạo ra kháng sinh giết
chết các tế bào bên cạnh, giải phóng chất dinh dưỡng và được tế bào đang hình thành
bào tử tiêu thụ (trích dẫn Nguyễn Duy Khánh, 2006).
2.1.4.2. Với vi sinh vật gây bệnh
Do Bacillus subtilis là vi khuẩn có trong đường ruột nên ngoài khả năng chịu
được acid dạ dày, các chất dịch tiêu hóa trong đường ruột, chúng còn có khả năng đấu
tranh chống lại các vi sinh vật gây bệnh ở đường ruột. Vi khuẩn Bacillus subtilis phát
triển nhanh trong 24 giờ, do đó có thể cạnh tranh dinh dưỡng, không gian sống đồng
thời tạo một số kháng sinh nên sự sinh trưởng của nấm và vi khuẩn gây bệnh bị ức
chế. Theo Đặng Ngọc Phương Uyên (2007), Bacillus subtilis giúp chuột bạch chống
lại bệnh tiêu chảy xuất huyết do E.coli O157: H7.
2.1.5. Ứng dụng
2.1.5.1. Trong công nghiệp
Bacillus subtilis được ứng dụng rộng rãi trong việc sản xuất ra enzyme và một số
sản phẩm cho công nghiệp như amylase, protease, aminoacid,…Trong đó, protease
được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp chất tẩy rửa.
2.1.5.2. Trong nông nghiệp
Bacillus subtilis được ứng dụng vào sản xuất các chế phẩm nhằm làm giảm tái
phát bệnh tiêu chảy gây ra trên heo so với điều trị bằng kháng sinh; bổ sung trong thức
ăn để cải thiện tiêu hóa, sức tăng trưởng; bổ sung vào ao nuôi nhằm duy trì chất lượng
nước ao, hạn chế bệnh cho thủy sản nuôi.
Bacillus subtilis được ứng dụng phòng trừ vi sinh vật gây bệnh như nấm
Rhizoctonia solani, Fusarium sp, Pylicularia oryzae... Ngoài ra, Bacillus subtilis còn
ứng dụng nhiều trong công tác bảo vệ nông sản sau thu hoạch vì chúng có thể tiêu diệt
vi khuẩn gây thối rau quả (trích dẫn Lê Văn Việt, 2007).

2.1.5.3. Trong y học
Một số chế phẩm sản xuất từ Bacillus subtilis có tác dụng chữa trị tiêu chảy và
một số bệnh đường ruột khác. Theo nghiên cứu của Đỗ Thị Hồng Tươi và cộng sự
7


(2005) thì vi khuẩn Bacillus subtilis có khả năng điều trị viêm xoang mũi trên chuột,
mở ra triển vọng lớn để ứng dụng trên người.
2.1.6. Tác hại của Bacillus subtilis
2.1.6.1. Đối với người
Một số chủng Bacillus subtilis cũng như những họ hàng gần của nó là Bacillus
licheniformis, Bacillus pumulis, Bacillus megaterium có khả năng sản xuất lecithinase,
một enzyme có khả năng phá vỡ màng tế bào động vật hữu nhũ. Tuy nhiên, vẫn chưa
có bằng chứng nào cho thấy lecithinase gây bệnh trên người.
Bacillus subtilis sản xuất độc tố ngoại bào là subtilisin, mặc dù subtilisin có độc
tính thấp nhưng cũng có khả năng gây dị ứng đối với những người tiếp xúc trong thời
gian dài gây những bệnh như: viêm da, viêm đường hô hấp,…(trích dẫn Đặng Ngọc
Phương Uyên, 2007).
2.1.6.2. Đối với động thực vật
Bacillus subtilis được phát hiện trong một số trường hợp bò và cừu sẩy thai. Tuy
nhiên, chúng vẫn không được cho là nguyên nhân gây bệnh.
Bacillus subtilis gây phân hủy pectin và polysaccharide của mô thực vật dẫn đến
thối củ ở khoai tây (bệnh “chảy nhớt khoai tây”). Gây những vết viêm loét trên một số
cây rừng (trích dẫn Lê Văn Việt, 2007).
Ngoài ra, Bacillus subtilis là thủ phạm gây hỏng các thực phẩm sữa, bánh ngọt,
chocolate, kẹo có nhân, nhất là khi bảo quản chúng ở nơi khí hậu nhiệt đới như ở nước
ta (trích dẫn Lê Văn Việt, 2007).
2.2. Khái quát về vi khuẩn Lactobacillus acidophilus
2.2.1. Lịch sử phát hiện
Năm 1780, nhà hóa học người Thụy Sỹ, Scheele lần đầu tiên tách được acid

lactic từ sữa bò lên men chua. Sau đó, năm 1857, Pasteur chứng minh được việc làm
chua sữa là kết quả hoạt động của một số nhóm vi sinh vật đặt biệt gọi là vi khuẩn
lactic. Năm 1878, Lister đã phân lập thành công vi khuẩn lactic đầu tiên và đặc tên là
Bacterium lactic (nay gọi là Streptococus lactic) (Nguyễn Lân Dũng và ctv, 2003).
Lactobacillus acidophilus lần đầu tiên được phân lập bởi Moro (1900) từ phân
của trẻ sơ sinh đã qua phẫu thuật. Ông đã mô tả được các đặc điểm trao đổi chất, phân
loại cũng như chức năng của vi khuẩn này.

8


2.2.2. Đặc điểm về Lactobacillus acidophilus
2.2.2.1. Đặc điểm phân loại (theo tài liệu 34)
Theo phân loại của Moro (1900), Hansen và Mocquoc (1970), Lactobacillus
acidophilus thuộc:
Giới: Bacteria
Ngành: Firmicutes
Lớp: Bacilli
Bộ: Lactobacillales
Họ: Lactobacillaceae
Giống: Lactobacillus
Loài: Lactobacillus acidophilus
2.2.2.2. Đặc điểm phân bố
Lactobacillus acidophilus phân bố rộng rãi trong tự nhiên, trên bề mặt rau quả,
thức ăn gia súc đã lên men, trong ruột người và động vật máu nóng, trong âm đạo, sản
phẩm lên men sữa, sản phẩm lên men chua,…(Nguyễn Thành Đạt và Nguyễn Duy
Thảo, 1986)
2.2.2.3. Đặc điểm hình thái
Lactobacillus acidophilus là trực khuẩn thuộc họ vi khuẩn lactic. Tế bào hình que
đầu tròn, kích thước 0,6 – 0,9 µm x 1,5 – 6 µm, tế bào có thể đứng riêng lẽ hoặc tập

trung, xếp thành đôi hay chuỗi ngắn, không di động, không hình thành bào tử và cũng
không có giáp mô. Tế bào non bắt màu gram dương, tế bào già bắt màu gram âm.

Hình 2.2. Hình thái vi khuẩn Lactobacillus acidophilus
URL: />
9


2.2.2.4. Đặc điểm sinh hóa (trích dẫn Phạm Đình Trúc Linh, 2007)
Lactobacillus acidophilus có một số enzyme phân giải một số loại đường và tạo
acid hữu cơ làm giảm pH môi trường, ngoài ra còn tạo ra các khí H2, CO2.
Bảng 2.2. Khả năng lên men một số loại đường của Lactobacillus acidophilus
Loại đường

Lên men sinh

Loại đường

acid

Lên men sinh
acid

Arabinose

−

Saccharose

+


Dextrin

±

Fructose

+

Glucose

+

Raffinosse

±

Maltose

+

Xylose

−

Lactose

+

Mannitol


−

Bảng 2.3. Các phản ứng sinh hóa khác
Phản ứng sinh hóa

Kết quả

Phản ứng sinh hóa

Kết quả

Sinh indol

−

Nitrate

−

Methyl red

+

Gelatin

−

Voges- Proskauer


−

Khả năng di động

−

Citrate

−

Đông vón sữa

+

Arginine

−

Catalase

−

2.2.2.5. Đặc điểm nuôi cấy
Vi khuẩn Lactobacillus acidophilus thường có đặc tính hiếu khí tùy nghi, phát
triển tốt ở 37 – 400C (không phát triển hoặc phát triển rất yếu ở nhiệt độ thấp hơn
200C), không sinh sắc tố hay độc tố, pH thích hợp 5,5 – 6,0 (trích dẫn Lê Văn Việt,
2007).
Trên môi trường thạch MRS agar, sau 48 giờ nuôi cấy ở 370C, xuất hiện những
khuẩn lạc nhỏ hình cầu, rìa dẹp, đường kính khoảng 0,25 mm, có màu vàng nhạt, ở
giữa hơi sậm màu. Trên môi trường MRS broth, sau 48 giờ nuôi cấy ở 370C, môi

trường trở nên đục, có cặn lắng ở đáy.

10