BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
***000***

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

CHẾ TẠO THIẾT BỊ NHÂN ĐOẠN DNA (THIẾT BỊ PCR) THEO
CÔNG NGHỆ LUÂN NHIỆT PELTIER
Ngành học : CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Niên khóa : 2004 – 2008
Sinh viên thực hiện : ĐOÀN THÀNH VŨ

Tháng 9/2008


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
***000***

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

CHẾ TẠO THIẾT BỊ NHÂN ĐOẠN DNA (THIẾT BỊ PCR) THEO
CÔNG NGHỆ LUÂN NHIỆT PELTIER

Giáo viên hướng dẫn:

Sinh viên thực hiện:

TS.BÙI MINH TRÍ

ĐOÀN THÀNH VŨ

ThS.LÊ VĂN BẠN

Tháng 9/2008


LỜI CẢM TẠ
Tôi xin chân thành cảm tạ:
Ban Giám Hiệu trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, Ban chủ
nhiệm Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả Quý Thầy Cô đã truyền đạt kiến thức cho
tôi trong suốt quá trình học tại trường.
Thầy Bùi Minh Trí, Thầy Lê Văn Bạn đã tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện
giúp đỡ tôi hoàn thành khóa luận này.
Anh Châu Thanh Duy, các anh chị ở bộ môn Công nghệ Sinh học, Viện Công nghệ
Sinh Học, các bạn ở phòng thí nghiệm hóa sinh đã nhiệt tình giúp đỡ chúng tôi hoàn thành
khóa luận.
Các thành viên lớp Công Nghệ Sinh Học 30 đã động viên, giúp đỡ tôi trong thời
gian thực tập.

Sinh viên thực hiện
ĐOÀN THÀNH VŨ

iii


TÓM TẮT KHÓA LUẬN
Đề tài: “Chế tạo thiết bị nhân đoạn DNA (Thiết bị PCR) theo công nghệ luân
nhiệt Peltier”. Đề tài được tiến hành tại Bộ môn Điều Khiển Tự Động trực thuộc

khoa Cơ Khí, Trung Tâm Phân Tích Hóa Sinh trường Đại Học Nông Lâm thành
phố Hồ Chí Minh với thời gian từ 3 / 2008 đến 8 / 2008.
Đề tài được thực hiện với mục đích hạ giá thành thiết bị PCR phục vụ nhu
cầu dạy và học.
Thiết bị được chế tạo với bộ phân luân nhiệt theo nguyên lý peltier
Qua quá trình thực hiện đã chế tạo được máy đạt được các thông số cơ bản sau:
– Máy hoạt động ở điện áp AC: 220 V – 190 V.
– Dãy nhiệt độ cài đặt của giếng nhiệt: 0C đến 102C.
– Tốc độ gia nhiệt của giếng nhiệt: 1C /s ± 0,1.
– Tốc độ giảm nhiệt của giếng nhiệt: 0.9C /s ± 0,1.
– Dãy nhiệt độ của nắp nhiệt: 100 – 130C.
– Tốc độ gia nhiệt của nắp 5C/s ± 0,5.
– Kiểu giếng nhiệt có 2 loại, 25 giếng hoặc 16 giếng.
– Giao diện sử dụng: Điều khiển thời gian, nhiệt độ bảng điều khiển
trên màn hình Graphic 128 x 64.
– Tất cả các thông số kĩ thuật của linh kiện không bị đổi khi thiết bị
hoạt động.
Việc chạy thử máy với phản ứng khuếch đại DNA vùng ech42 bộ gen
của nấm Trichoderma đã cho sản phẩm tương tự như kết quả thu được từ các
thiết bị do Eppendorff, BIO – RAD sản xuất.

iv


SUMMARY
Topic : “Create DNA multiplied equipment (PCR equipment) base on Peltier
technology”. This topic is taken on Automatic Control Department of Mechanics
Faculty, Biochemical Analysis Center of Agriculture And Forestry University, Ho
Chi Minh city. This topic is taken from Mar,2008 to Aug,2008.
The target of topic is reduced the prices of PCR equipment that use for

teaching.
This equipment is created by rotation of base on Peltier principle.
After proceeded, equipment is created to get the basic parameters:
–Voltage activities of equipment: AC 220V – 190V.
–Temperature band of thermal well: from 00C to 1020C
–Rate increasing temperature of thermal well: 10C/s ± 0.1
–Rate decreasing temperature of thermal well: 0.90C/s ± 0.1
–Temperature band of thermal cover: from 1000C to 1300C
–Rate increasing temperature of thermal cover: 50C/s ± 0.5
–Thermal well has two type: 25 wells or 16 wells.
–Interface in use: control the time or temperature by control board on
graphic screen 128 x 64
–All technical parameters are constant when equipment runs.
Test equipment with DNA multiplied reaction of Trichoderma ech42 fargment
genome is got as similar product as equipment of Eppendorff and Bio – Rad
company.

v


MỤC LỤC
Trang tựa

Trang

Lời cảm tạ.................................................................................................................. iii
Tóm tắt khóa luận...................................................................................................... iv
Summary .....................................................................................................................v
Mục lục...................................................................................................................... vi
Danh sách các bảng................................................................................................... xi

Danh sách các đồ thị ................................................................................................ xii
Danh sách các hình.................................................................................................. xiii
Chương 1: MỞ ĐẦU...................................................................................................1
1.1.

Đặt vấn đề ........................................................................................................1

1.2.

Mục đích và nội dung nghiên cứu....................................................................1

1.2.1. Mục đích...........................................................................................................1
1.2.2. Nội dung nghiên cứu........................................................................................1
Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .........................................................................3
2.1.

Kỹ thuật PCR ...................................................................................................3

2.1.1. Lịch sử của PCR...............................................................................................3
2.1.2. Nguyên tắc phản ứng PCR...............................................................................4
2.1.3. Thực nghiệm PCR............................................................................................4
2.1.4. Quy trình PCR..................................................................................................5
2.1.5. Tối ưu hoá PCR................................................................................................5
2.1.7. Yếu tố ảnh hưởng phản ứng PCR ....................................................................6
2.1.8. Phân loại kỹ thuật PCR ....................................................................................6
2.1.9. Ứng dụng của PCR ..........................................................................................7
2.2.

Thiết bị PCR.....................................................................................................7


vi


2.3.

Nguyên lý hiệu ứng Peltier ..............................................................................8

2.3.1. Hiệu ứng Peltier ...............................................................................................8
2.3.2. Thermoelectric module ....................................................................................8
2.3.3. Nguyên lý hoạt động của Thermoelectric module...........................................9
2.4.

Sensor nhiệt....................................................................................................10

2.4.1. Nhiệt điện trở Platin .......................................................................................10
2.4.2. IC cảm ứng nhiệt............................................................................................10
2.5.

Cấu trúc và đặc tính của chip AT90S8535 ....................................................11

2.5.1. Chip AT90S8535 của hãng ATMEL .............................................................11
2.5.2. Chức năng các chân .......................................................................................12
2.6.

Ngôn ngữ lập trình .........................................................................................13

2.6.1. Đối với hợp ngữ (Assembly Language).........................................................13
2.6.2. Đối với ngôn ngữ Pascal .................................................................................13
2.6.3. Đối với ngôn ngữ Basscom............................................................................13
2.6.4. Đối với ngôn ngữ Visual Basic......................................................................14

2.7.

Mạch điện.......................................................................................................14

2.8.

Một số loại máy PCR trên thị trường.............................................................14

2.8.1. Nguyên lý hoạt động của một số loại máy.....................................................14
2.8.2. Một số máy luân nhiệt theo công nghệ Peltier...............................................14
2.8.2.1. Máy nhân gen Gradien .................................................................................14
2.8.2.2. Máy chu trình nhiệt RapidPCR....................................................................15
2.8.2.3. Máy chu trình nhiệt SpeedCycler.................................................................16
2.8.2.4. TC–3000 Thermal Cycler.............................................................................16
Chương 3: VẬT LIỆU VÀ CÁCH THỨC TIẾN HÀNH.........................................18
3.1.

Thời gian và địa điểm tiến hành.....................................................................18

3.2.

Vật liệu ...........................................................................................................18

3.3.

Thiết bị và dụng cụ.........................................................................................18

3.3.1. Thiết bị và dụng cụ chế tạo máy ....................................................................18

vii



3.3.2. Thiết bị và dụng cụ kiểm tra máy ..................................................................18
3.4.

Hóa chất chạy PCR và dụng cụ điện di..........................................................18

3.5.

Nội dung thực hiện.........................................................................................19

3.5.1. Phần cơ khí.....................................................................................................19
3.5.1.1. Sơ đồ khối lắp ráp bộ phận giếng nhiệt........................................................19
3.5.1.2. Giếng nhiệt thiết bị PCR ..............................................................................19
3.5.1.3. Tấm silicon cách nhiệt .................................................................................20
3.5.1.4. Phần vỏ thiết bị PCR ....................................................................................22
3.5.1.5. Nắp nhiệt thiết bị PCR .................................................................................22
3.5.1.6. Các tấm cố định sử dụng trong thiết bị PCR................................................26
3.5.1.7. Tản nhiệt cho peltier.....................................................................................28
3.5.2. Phần điện – điện tử.........................................................................................28
3.5.2.1. Sơ đồ khối cơ chế hoạt động của thiết bị PCR.............................................29
3.5.2.2. Mạch nguồn và mạch công suất...................................................................29
3.5.2.3. Mạch điều khiển thiết bị...............................................................................31
3.5.2.4. Hình ảnh cấu trúc bên trong máy .................................................................33
3.5.3. Phần lập trình .................................................................................................35
3.6.

Các thử nghiệm ..............................................................................................36

3.6.1. Khảo sát các thông số kỹ thuật của máy ........................................................36

3.6.2. Khảo sát sản phẩm phản ứng PCR.................................................................36
Chương 4: KẾT QUẢ THẢO LUẬN .......................................................................39
4.1.

Một số thông số kĩ thuật của thiết bị VN – PCR ...........................................39

4.2.

Kết quả thử nghiệm về nhiệt của giếng nhiệt thiết bị PCR............................39

4.2.1. Tốc độ gia nhiệt trung bình và tốc độ giảm nhiệt trung bình của giếng nhiệt.....39
4.2.1.1.Tốc độ gia nhiệt trung bình của giếng nhiệt..................................................39
4.2.1.2. Tốc độ giảm nhiệt trung bình của giếng nhiệt .............................................41
4.2.2. Sự ổn định nhiệt độ của giếng nhiệt khi thiết bị gia nhiệt giếng nhiệt lên các
điểm nhiệt độ khác nhau ...........................................................................................43

viii


4.2.3. Sự chênh lệch nhiệt tại các vị trí khác nhau của giếng nhiệt .........................44
4.2.4. So sánh nhiệt độ do máy hiển thị và nhiệt độ do nhiệt kế đặt trong giếng nhiệt
hiển thị.......................................................................................................................47
4.2.5. Sai lệch thời gian thực hiện phản ứng PCR của máy VN – PCR giữa các chu
kì

49

4.3.

Hoạt động của máy ........................................................................................51


4.4.

Kết quả PCR...................................................................................................51

Chương 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ.....................................................................54
5.1.

Kết luận ..........................................................................................................54

5.2.

Đề nghị ...........................................................................................................54

Tài Liệu Tham Khảo .................................................................................................55
Phụ Lục .....................................................................................................................56

ix


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng

Trang

Bảng 3.1: Cặp primer sử dụng và trình tự primer theo chiều 5’ – 3’........................36
Bảng 3.2: Thành phần phản ứng PCR và liều lượng dùng cho một phản ứng .........36
Bảng 3.3: Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR .....................................................................37
Bảng 4.1: Nhiệt độ trung bình của giếng nhiệt khi cho máy gia nhiệt giếng nhiệt từ
từ 34C – 36C đến 94C – 96C..............................................................................40

Bảng 4.2: Nhiệt độ trung bình của giếng nhiệt khi cho máy giảm nhiệt giếng nhiệt
từ 96C – 94C xuống 36C – 34C .........................................................................41
Bảng 4.3: Biên độ giao động của giếng nhiệt được đo bằng thiết bị kiểm chuẩn tại
các điểm nhiệt độ thử nghiệm ...................................................................................44
Bảng 4.4: Sự chênh lệch nhiệt tại 3 vị trí đo ở nhiệt độ cao (95C và 90C) ...........45
Bảng 4.5: Sự chênh lệch nhiệt tại 3 vị trí đo ở nhiệt độ trung bình (72C và 70C) ....46
Bảng 4.6: Sự chênh lệch nhiệt tại 3 vị trí đo ở nhiệt độ thấp (62C và 45C) ..............46
Bảng 4.7: Sự chênh lệch giữa nhiệt độ máy do máy hiển thị và nhiệt độ do nhiệt kế
đặt trong giếng nhiệt hiển thị ....................................................................................47
Bảng 4.8: Sai lệch thời gian thực hiện phản ứng PCR của thiết bị giữa các chu kì .49

x


DANH SÁCH CÁC ĐỒ THỊ
Đồ thị

Trang

Đồ thị 4.1: Nhiệt độ trung bình của giếng nhiệt khi cho máy gia nhiệt giếng nhiệt từ
từ 34C – 36C đến 94C – 96C ..................................................................40
Đồ thị 4.2: Nhiệt độ trung bình của giếng nhiệt khi cho máy giảm nhiệt giếng nhiệt
từ 96C – 94C xuống 36C – 34C .........................................................................42
Đồ thị 4.3: Sự chênh lệch nhiệt tại 3 vị trí đo ở nhiệt độ cao (95C và 90C) .........45
Đồ thị 4.4: Sự chênh lệch nhiệt tại 3 vị trí đo ở nhiệt độ trung bình (72C và 70C)...46
Đồ thị 4.5: Sự chênh lệch nhiệt tại 3 vị trí đo ở nhiệt độ thấp (62C và 45C) ........47
Đồ thị 4.6: Sự chênh lệch giữa nhiệt độ máy và nhiệt độ kế ....................................48
Đồ thị 4.7: Sai lệch thời gian thực hiện phản ứng PCR của thiết bị giữa các chu kì ....50

xi



DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình

Trang

Hình 2.1: Mô hình hoạt động của máy PCR ...............................................................7
Hình 2.2: Hình ảnh về Thermoelectric module...........................................................8
Hình 2.3: Cấu tạo Thermoelectric module..................................................................9
Hình 2.4: Sự truyền tải nhiệt .......................................................................................9
Hình 2.5: Sơ đồ chân của AT90S8535......................................................................12
Hình 2.6: Máy nhân gen Gradien..............................................................................15
Hình 2.7: Máy chu trình nhiệt RapidPCR.................................................................16
Hình 2.8: Máy chu trình nhiệt SpeedCycler .............................................................16
Hình 3.1: Sơ đồ vị trí các linh kiện cho giếng nhiệt .................................................19
Hình 3.2: Giếng nhiệt................................................................................................21
Hình 3.3: Tấm silicon cách nhiệt ..............................................................................21
Hình 3.4: Vỏ máy......................................................................................................22
Hình 3.5: Vỏ ngoài nắp nhiệt ....................................................................................24
Hình 3.6: Tấm cố định điện trở .................................................................................24
Hình 3.7: Hệ thống tạo áp lực cho ống eppendorff...................................................25
Hình 3.8: Tấm cố định bộ nguồn ..............................................................................26
Hình 3.9: Tấm cố định màn hình và bàn phím..........................................................27
Hình 3.10: Tấm cố định giếng nhiệt và nắp nhiệt.....................................................27
Hình 3.11: Tản nhiệt cho Peltier ...............................................................................28
Hình 3.12: Hình ảnh thực của tản nhiệt cho Peltier ..................................................28
Hình 3.13: Sơ đồ hoạt động của thiết bị PCR ...........................................................29
Hình 3.14: Mạch nguồn AC/DC và mạch công suất.................................................30
Hình 3.15: Hình ảnh thật của mạch nguồn và mạch công suất.................................31

Hình 3.16: Mạch điều khiển......................................................................................32

xii


Hình 3.17: Hình ảnh thật của mạch điều khiển.........................................................33
Hình 3.18: Cấu trúc linh kiện máy ............................................................................33
Hình 3.19: Bàn phím .................................................................................................34
Hình 3.20: Màn hình .................................................................................................34
Hình 3.21: Hình máy VN – PCR ..............................................................................38
Hình 4.1: Các vị trí đo nhiệt độ.................................................................................45

xiii


Chương 1

MỞ ĐẦU
1.1.

Đặt vấn đề
Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) từ khi được phát minh (1985) đã

tạo nên một tác động to lớn đối với các nghiên cứu sinh học trên toàn thế giới. Hiện
nay, kỹ thuật này đã được sử dụng rộng rãi trong nhiều nghiên cứu sinh học phân
tử, vi sinh, kiểm nghiệm, chẩn đoán…để phát hiện gene, mầm bệnh, vi sinh vật,
virus, phân type, tạo đột biến gene và xác định các mối quan hệ họ hàng về di
truyền của các sinh vật.
Người ta có thể nhân đoạn DNA với các hộp chứa nước ở các nhiệt độ khác
nhau nhưng phương thức này tốn nhiều thời gian và độ tin cậy thấp. Ngày nay, kỹ

thuật PCR được thực hiện trên các máy luân nhiệt (Thermocycler – PCR) và là công
cụ quan trọng không thể thiếu. Tất cả các máy PCR được sử dụng hiện nay tại Việt
Nam đều được sản xuất từ nước ngoài với giá thành cao, chi phí vận chuyển, lắp đạt
và bảo trì tốn kém. Vì thế, yêu cầu được đặt ra là nghiên cứu và chế tạo thiết bị PCR
nhằm sản xuất trong nước với giá thành hạ để phục vụ cho nhu cầu sử dụng trong
nước và tiến tới xuất khẩu ra thị trường thế giới. Dưới sự hướng dẫn của thầy Bùi
Minh Trí và thầy Lê Văn Bạn tôi thực hiện đề tài
"Chế tạo thiết bị nhân đoạn DNA (Thiết bị PCR) theo công nghệ luân
nhiệt Peltier".
1.2.

Mục đích và nội dung nghiên cứu

1.2.1. Mục đích
Đề tài được thực hiện với mục đích chế tạo thiết bị PCR có khả năng hoạt
động ổn định.
1.2.2. Nội dung nghiên cứu
– Thiết kế, chế tạo vỏ máy.
– Thiết kế, chế tạo mạch nguồn.

1


– Thiết kế, chế tạo mạch công suất.
– Thiết kế, chế tạo mạch điều khiển.
– Thiết kế, chế tạo khay đựng mẫu (giếng nhiệt).
– Viết phần mềm điều khiển.
– Hoạt động thử nghiệm thiết bị trên mẫu DNA thật.
– Điều chỉnh hoạt động của thiết bị.


2


Chương 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1.

Kỹ thuật PCR

2.1.1. Lịch sử của PCR
Kỹ thuật căn bản chạy PCR được Kary Mullis phát minh. Ông đã đoạt giải
Nobel về Hóa học vào tháng 10 năm 1993 cho thành tựu này chỉ sau 7 năm khi ông
đưa ra ý tưởng. Ý tưởng của Mullis là phát triển một quy trình mà DNA có thể nhân lên
nhiều lần một cách nhân tạo qua nhiều chu kỳ sao chép bởi enzyme DNA polymerase.
DNA polymerase có tự nhiên trong sinh vật sống, nơi mà enzym này thực
hiện chức năng nhân DNA khi tế bào phân chia. Trong tế bào, DNA polymerase
làm việc bằng cách nối với sợi DNA và tạo sợi bổ sung. Theo quy trình PCR gốc
của Mullis, enzyme phản ứng nhân bản DNA được thực hiện trong ống nghiệm (in
vitro). Sợi DNA đôi bị tách thành 2 sợi đơn (biến tính) khi đun nóng ở 96°C. Tuy
nhiên, ở nhiệt độ này DNA polymerase thông thường bị phá hủy vì vậy cần bổ sung
enzyme sau mỗi giai đoạn nung nóng của mỗi chu kỳ. Quy trình PCR gốc của
Mullis không có hiệu quả cao vì mất nhiều thời gian, cần một lượng lớn DNA
polymerase, và phải liên tục lưu ý suốt trong quá trình PCR.
Sau đó, quy trình gốc này được phát triển bằng cách dùng DNA–Polymerase
lấy từ vi khuẩn thermophilic (ưa nhiệt) sống trong mạch nước phun ở nhiệt độ trên
110°C. DNA polymerase từ sinh vật này ổn định ở nhiệt độ cao và khi dùng trong
PCR, DNA polymerase của chúng không bị phá vỡ khi hỗn hợp được làm nóng để
biến tính sợi DNA. Từ đó, không cần phải thêm DNA–polymerase vào mỗi chu kỳ,
quá trình sao chép DNA có thể đơn giản và tự động hơn.

Một trong những DNA–polymerase chịu nhiệt đầu tiên được phân lập là Taq.
Taq polymerase được dùng rộng rãi trong thực nghiệm PCR. Nhược điểm của Taq
là thỉnh thoảng Taq nhầm lẫn trong quá trình sao chép DNA, dẫn đến đột biến (sai)

3


trong chuỗi DNA, vì Taq thiếu tính sửa sai exonuclease 3’ – 5’. Các polymerase
như Pwo hay Pfu, được phân lập từ Archaea có cơ chế sửa sai (cơ chế kiểm tra lỗi
sai) và có thể làm giảm một cách đáng kể số đột biến xảy ra trong chuỗi DNA được
sao chép. Ngày nay, sự kết hợp giữa Taq và Pfu có thể cung cấp cả độ tin cậy cao
lẫn sự nhân bản chính xác của DNA.
2.1.2. Nguyên tắc phản ứng PCR
Kỹ thuật PCR dựa trên hoạt động của DNA polymerase trong quá trình tổng
hợp DNA mới từ mạch khuôn. Tất cả các DNA polymerase đều cần những mồi, là
những đoạn DNA ngắn có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn.
Ðoạn mồi này sau đó sẽ được nối dài ra nhờ hoạt động của DNA polymerase để
hình thành một mạch mới hoàn chỉnh.
Một phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm
ba giai đoạn:
– Giai đoạn biến tính (denaturation): Thường là ở 94C – 95C trong vòng
30 giây – 1phút.
– Giai đoạn lai (anealation): Khoảng 40C – 70C kéo dài từ 30 giây – 1 phút.
– Giai đoạn tổng hợp (elongation): nhiệt độ được tăng lên đến 72C thường
kéo dài từ 20 giây đến nhiều phút.
Trong phản ứng PCR, chu kỳ ba giai đoạn sẽ được lặp lại nhiều lần, mỗi lần
làm tăng số lượng bản sao lên gấp đôi. Sự khuếch đại của phản ứng là theo cấp số
nhân và theo tính toán, sau 35 chu kỳ, sự khuếch đại sẽ là 235 tương đương 34 tỉ lần
so với số lượng bản mẫu ban đầu.
2.1.3. Thực nghiệm PCR

PCR được dùng để khuếch đại một đoạn DNA ngắn, đó có thể là một gen
đơn, hay một phần của gen. Trái với sinh vật sống, quy trình PCR có thể copy một
đoạn DNA ngắn, có thể lên đến 10kb (kb = kilo cặp base = 1000 cặp base). Một vài
kỹ thuật có thể copy một mảnh kích thuớc lên đến 40kb ít hơn nhiều so với nhiễm
sắc thể DNA trong tế bào eukaryote – ví dụ như tế bào người chứa hơn 3 tỉ cặp base.
Những thành phần của phản ứng PCR cần có:

4


– DNA mẫu (template) chứa mảnh DNA cần khuếch đại
– Cặp mồi (primer), để làm điểm tựa cho Taq DNA polymerase.
– DNA–polymerase xúc tác cho việc tổng hợp DNA.
– Nucleotides (ví dụ dNTP) là nguyên liệu cho DNA–polymerase để xây
dựng DNA mới.
– Dung dịch đệm, cung cấp môi trường ổn định cho DNA–polymerase.
2.1.4. Chu trình của một phản ứng PCR
Quy trình PCR gồm 20 đến 30 chu kỳ. Mỗi chu kỳ gồm 3 bước
– Nhiệt độ tăng lên 94 – 96°C để tách hai sợi DNA ra. Bước này gọi là biến
tính, nó phá vỡ cầu nối hydrogen nối 2 sợi DNA. Trước chu kỳ 1, DNA thường
được biến tính đến thời gian mở chuỗi để đảm bảo mẫu DNA và mồi được phân
tách hoàn toàn và chỉ còn dạng sợi đơn. Thời gian: 1 – 2 phút
– Sau khi 2 sợi DNA tách ra, nhiệt độ được hạ thấp xuống để mồi có thể gắn
vào sợi DNA đơn. Bước này gọi là gắn mồi. Nhiệt độ giai đoạn này phụ thuộc vào
đoạn mồi và thường thấp hơn nhiệt độ biến tính (thường nằm trong khoảng 40 –
65°C). Sử dụng sai nhiệt độ trong giai đoạn này dẫn đến việc đoạn mồi không gắn
hoàn toàn vào DNA mẫu, hay gắn một cách tùy tiện. Thời gian: 1 – 2 phút.
– Cuối cùng, DNA polymerase gắn tiếp vào sợi trống. Nó bắt đầu bám vào
và hoạt động dọc theo sợi DNA. Bước này gọi là kéo dài. Nhiệt độ kéo dài phụ thuộc
DNA – polymerase. Thời gian của bước này phụ thuộc vào cả DNA – polymerase

và chiều dài mảnh DNA cần khuếch đại. Như một quy tắc …, 1000bp/ 1 phút.
2.1.5. Tối ưu hoá PCR
Do PCR rất nhạy, nên phải tránh tạp nhiễm các DNA khác có trong phòng
thí nghiệm (vi khuẩn, virus, DNA, ...). Vì vậy các mẫu DNA, hỗn hợp phản ứng và
quy trình DNA và các phản ứng phân tích sản phẩm, nên được thực hiện trong một
khu vực riêng biệt. Ở giai đoạn chuẩn bị các thành phần của phản ứng PCR, phải
chuẩn bị phòng riêng biệt với đèn UV. Phải sử dụng găng tay sạch cho mỗi bước
PCR cũng như thay thế các đầu type. Các thành phần dùng trong PCR phải được
chuẩn bị riêng biệt và chỉ được dùng cho mục đích này. Các mẫu phải được giữ

5


riêng biệt với các mẫu DNA khác. Phản ứng có đối chứng (gồm đối chứng dương
và đối chứng âm), ngoại trừ DNA khuôn mẫu, phải luôn được thực hiện các đối
chứng để kiểm tra sự nhiễm bẩn.
2.1.7. Yếu tố ảnh hưởng phản ứng PCR
Mồi và nhiệt độ lai: Chỉ tiêu quan trọng nhất để đạt được sự khuếch đại đặc
trưng và có hiệu quả cao.
DNA mẫu: Kết quả phản ứng PCR lệ thuộc rất lớn vào DNA mẫu. Phản ứng
PCR tối ưu khi DNA thật tinh sạch cũng lệ thuộc vào lượng bản mẫu.
Enzyme: Enzyme được sử dụng đầu tiên là đoạn Klenow của DNA
polymerase I. Hiện nay, một số enzyme mới có hiệu quả hơn như Taq – polymerase
và Tth polymerase.
dNTP: Bốn loại nucleotid thường được sử dụng ở nồng độ là 20–200µM/mỗi
nucleotide.
Nồng độ ion Mg2+: Là cofactor cho hầu hết các DNA polymerase, đặc biệt là
các DNA polymerase chịu nhiệt thường dùng.
Số chu kỳ của phản ứng PCR: Trong thực tế, số lượng chu kỳ của phản ứng
PCR không vượt quá 40 chu kỳ.

2.1.8. Phân loại kỹ thuật và xu hướng phát triển thiết bị PCR
Phân loại kỹ thuật PCR:Hiện nay kỹ thuật PCR đã được cải tiến và phân
thành nhiều loại như: Asymmetric PCR, DD–PCR, Hot–start, In situ PCR, Long–
PCR, Multiplex PCR, Nested PCR, Real–Time PCR, RT–PCR, TAIL–PCR,
Touchdown PCR, Vectorette PCR,…
Hiện nay thiết bị PCR được phát triển theo xu hướng:
– Thiết bị hoạt động theo cụm (một phần điều khiển cho nhiều bộ phận luân nhiệt).
– Tốc độ gia nhiệt, giảm nhiệt nhanh nhằm tiến tới giảm thời gian thực hiện phản
ứng PCR. Giảm dao động nhiệt.
– Phần mềm điều khiển linh hoạt đáp ứng nhiều nhu cầu khác nhau.
– Thiết bị có thể điều khiển từ xa, điều khiển theo dõi qua mạng internet.

6


2.1.9. Ứng dụng của PCR
PCR được ứng dụng cho rất nhiều mục đích bao gồm: Định tính, định lượng,
tạo đột biến (PCR mutagenesis), ứng dụng trong cloning tái tổ hợp (cloning of
recombinant), nhân bản đoạn DNA mong muốn, dùng trong phát hiện các vi sinh
vật gây bệnh, tiến hóa và khảo cổ học, phát hiện các khiếm khuyết gene, việc định
loại các mô, việc xác định các dấu ấn di truyền, phát hiện trình tự chuỗi của một
đoạn DNA (DNA sequencing)
2.2.

Thiết bị PCR

2.2.1. Nguyên lý hoạt động của thiết bị PCR
Yêu cầu của một thiết bị luân nhiệt PCR là các giếng nhiệt gắn liền với
Thermo electric. Tuy nhiên, để bộ phận này hoạt động cần các bộ phân hỗ trợ như: nguồn,
cảm biến (sensor), bộ điều khiển, bộ công suất,…


Sensor nhiệt cảm ứng nhiệt độ của Peltier và điện trở truyền tín hiệu về cổng
chuyển đổi được tích hợp trên vi xử lý của bộ điều khiển, tín hiệu điện được chuyển
sang dạng số. Vi xử lý nhận tín hiệu số này và xử lý theo chương trình được lập
trình. Kết quả vi xử lý xuất ra dạng số và được chuyển thành dạng tương tự
(Analog) là tín hiệu điều khiển bộ công suất, dựa vào đó mà bộ công suất cung cấp
điện áp và đảo cực cho thermoelectric module, cung cấp hoặc không cung cấp điện
áp cho điện trở của nắp nhiệt (Hình 2.1 trang 7).

Màn hình

Quạt

Bàn phím

Bộ điều khiển

Bộ công suất
Nguồn cung cấp

Cảm biến

Thermo electric,
điện trở

Hình 2.1: Mô hình hoạt động của máy PCR
2.2.2. Yêu cầu của một thiết bị PCR

7



– Nhiệt độ chính xác, ổn định, độ tuyến tính cao.
– Phần mềm dễ sử dụng.
– Có bộ phận báo lỗi khi máy gặp sự cố
– Sai số thời gian giữa các chu kỳ thấp.
2.3.

Nguyên lý hiệu ứng Peltier

2.3.1. Hiệu ứng Peltier
Năm 1834, nhà khoa học Pháp Jean Charles Althanase Peltier đã phát hiện
hiện tượng khi điện áp một chiều thông qua mạch điện tạo bởi hai mạch điện dẫn
điện khác nhau, điểm nối của nó sẽ sinh ra một hiện tượng hút nhiệt. Hiện tượng
này gọi là hiệu ứng Peltier.
2.3.2. Thermoelectric module
Thermoelectric module là ứng dụng cụ thể trong kỹ thuật của hiệu ứng
Peltier. Peltier Element hoặc còn gọi là Thermo Element (Hình 2.2 trang 8).
Các phần tử nhiệt điện thường có hình vuông và dẹp kích thước mặt bằng từ
15mm x 15mm đến 50mm x 50mm và dày từ 4¸ 5mm (tuỳ loại).

Hình 2.2: Hình ảnh về Thermoelectric module

8


Thermoelectric module, cấu tạo bởi hai loại bán dẫn loại P và N nối tiếp
nhau bởi các cầu nối thường được làm bằng kim loại đồng (Cu) có vai trò dẫn điện
và chuyển tải nhiệt. Để module hoạt động ổn định và độ bền cao, đòi hỏi cách điện
tốt và chống hơi nước ngưng tụ bên trong thermoelectric module trong quá trình
làm lạnh (Hình 2.3 trang 9).

Bên trong thermoelectric module các bán dẫn P và N nối tiếp nhau, có cùng
chiều truyền nhiệt tùy vào mục đích sử dụng mà nhà sản xuất tạo ra nhiều
thermoelectric có số lượng cặp PN khác nhau. Số lượng PN càng nhiều độ chênh
lệch nhiệt độ trên bề mặt càng thấp và chịu được lực nén cao.

Hình 2.3: Cấu tạo Thermoelectric module
2.3.3. Nguyên lý hoạt động của Thermoelectric module
Hoạt động dựa trên nguyên lý Peltier. Khi có dòng điện một chiều chạy qua, tùy
theo bán dẫn loại P hay N mà có sự truyền tải nhiệt khác nhau so với chiều dòng điện
đi qua. Đối với bán dẫn loại N sự truyền tải nhiệt ngược chiều với chiều dòng điện, đối
với bán dẫn loại P truyền tải nhiệt cùng với chiều dòng điện. Vì vậy, thermoelectric
một mặt nóng và một mặt lạnh khi có dòng điện một chiều đi qua (Hình 2.4 trang 9).

Hình 2.4: Sự truyền tải nhiệt

9


Công suất truyền tải nhiệt của thermoelectric module cao hay thấp phụ thuộc
vào vật liệu bán dẫn, dòng điện đi qua và độ chênh lệch nhiệt độ hai bề mặt của
thermoelectric. Nếu dòng điện quá thấp thì truyền tải nhiệt kém, nếu quá cao truyền
tải nhiệt cũng giảm do dòng điện có tác dụng sinh nhiệt theo định luật Jun-Lenxơ.
Tùy theo vật liệu cấu tạo và kết cấu của thermoelectric mà ΔTMax khác nhau. Nếu
chênh lệch nhiệt độ hai bề mặt của vật liệu bán dẫn vượt qua giới hạn này thì truyền
tải nhiệt bằng không, xét theo tác dụng truyền tải nhiệt của thermoelectric. Mỗi loại
thermoelectric chịu được nhiệt độ nóng trong giới hạn nếu nhiệt độ lớn hơn dẫn đến
hư hỏng. Vì vậy, dùng tản nhiệt cho mặt nóng của thermoelectric là cần thiết cho
quá trình làm lạnh, hoặc tăng nhanh làm nóng.
Máy PCR có đặc tính thay đổi nhiệt độ theo chu kỳ liên tục. Do đó đòi hỏi
thermoelectric dùng cho máy phải thích hợp. Thermoelectric thông thường dùng

cho làm lạnh hoặc làm nóng không đáp ứng cho sự thay đổi nhiệt độ theo chu kỳ.
Nếu dùng loại này cho máy PCR, máy sẽ hoạt động không ổn định sau một thời
gian, do điện trở của thermoelectric thay đổi lớn.
2.4.

Sensor nhiệt
Để đo nhiệt độ ta có thể dùng nhiều phương pháp khác nhau. Dùng sensor

nhiệt là thích hợp nhất trong điều khiển. Để đo được nhiệt độ chính xác cao và gia
tốc biến thiên nhiệt nhanh, hai loại sensor nhiệt là “cặp nhiệt điện” và “điện trở
platin” đáp ứng tốt.
2.4.1. Nhiệt điện trở Platin
Nhiệt điện trở được dùng rộng rãi với dải đo nhiệt từ – 200 đến 850C. Nhiệt
điện trở platin có nhiều loại: Pt – 100 là trị số điện trở ở định mức 0C là 100Ω, Pt –
500, Pt – 1000. Các loại Pt – 500, Pt – 1000 có hệ số nhiệt độ lớn hơn. Do đó, độ
nhạy lớn hơn (điện trở thay đổi mạnh theo nhiệt độ). Với Pt – 1000, sự thay đổi
nhiệt khoảng chừng 4 Ω/ K.
Các tính chất của nhiệt điện trở này được qui định theo tiêu chuẩn quốc tế
DIN IEC 751.
2.4.2. IC cảm ứng nhiệt

10


Các IC cảm biến nhiệt độ có độ chính xác cao, dễ tìm và giá thành rẻ. Một
trong số đó là IC LM35, là loại thông dụng trên thị trường hiện nay, đồng thời nó có
những đặc tính làm việc phù hợp với thiết kế chi tiết của mạch.
Các thông số cơ bản của LM35:
– Điện áp cung cấp: từ +4V đến +30V.
– Dòng điện đầu ra: 10mA.

– Nhiệt độ đo: 0C100C.
– LM35 có độ biến thiên theo nhiệt độ: 10mV/1C.
– Tầng biến thiên điện áp tương ứng với nhiệt độ từ 0C100C là 1V.
– Độ chính xác cao, ở nhiệt độ 25C nó có sai số không quá 1%.
Nguyên lý hoạt động của LM35: LM35 là một mạch tích hợp nhận tín hiệu
nhiệt độ chuyển thành tín hiệu điện dưới dạng điện áp. Sự tác động của nhiệt độ tạo
ra điện tích tự do và các lỗ trống trong chất bán dẫn. Bằng sự phá vỡ các phân tử,
bứt các electron thành dạng tự do di chuyển qua vùng cấu trúc mạng tinh thể tạo ra
sự xuất hiện các lỗ trống. Làm cho tỷ lệ điện tử tự do vào lỗ trống tăng lên theo quy
luật hàm mũ nhiệt độ. Qua đó ta sẽ xác định được điện áp đầu ra của LM35
2.5.

Cấu trúc và đặc tính của chip vi điều khiển AT90S8535

2.5.1. Chip AT90S8535 của hãng ATMEL

– Điện áp nguồn nuôi: 4V– 6V.
– Có 118 lệnh mạnh hầu hết được thực hiện trong 1 chu kỳ xung nhịp.
– RAM flash 8 kbyte lập trình được trong hệ thống. Chịu được 100000 lần
ghi/xóa.
– Bộ nhớ EEPROM 512 byte. Chịu được 100000 lần ghi/xóa.
– Bộ nhớ SRAM bên trong 512 byte.
– Bộ biến đổi ADC 8 kênh, 10 bit.
– 32 đường vào/ra lập trình được.
– 32 thanh ghi đa năng.
– Bộ định thời gian watchdog lập trình được với bộ dao động bên trong.

11



Hình 2.5: Sơ đồ chân của AT90S8535
2.5.2. Chức năng các chân của chip vi điều khiển AT90S8535
VCC: Điện áp nguồn nuôi
GND: Round
Cổng A (PA0 đến PA7): Cổng vào/ra hai hướng 8 bit, có điện trở nối lên
nguồn dương bên trong. Cổng A cung cấp các đường địa chỉ dữ liệu vào ra theo
kiểu hợp kênh khi dùng bộ nhớ ở bên ngoài.
Ngoài ra cổng A còn thêm chức năng chuyển đổi từ dạng tỷ biến sang dạng số.
Cổng B (PB0 đến PB7): Cổng vào/ra hai hướng 8 bit, có điện trở nối lên
nguồn dương bên trong. Cổng B cung cấp các chức năng ứng với các tính năng đặc
biệt của AT90S8535.
Cổng C (PC0 đến PC7): Cổng vào/ra hai hướng 8 bit, có điện trở nối lên nguồn
dương bên trong. Cổng C cung cấp các địa chỉ lối ra khi dùng bộ nhớ ở bên ngoài.
Cổng D (PD0 đến PD7): cổng vào/ra hai hướng 8 bit, có điện trở nối lên
nguồn dương bên trong. Cổng D cung cấp các chức năng ứng với các tính năng đặc
biệt của AT90S8535.
RESET: lối vào được đặt lại

12