BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HCM
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

************

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN SỰ TÁI SINH
CHỒI, HÌNH THÀNH RỄ VÀ CỦ LILY (Lilium sp.)
NUÔI CẤY IN VITRO

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Niên khóa: 2004 – 2008
MSSV: 04126080

Sinh viên thực hiện: ĐÀO THỊ THƯƠNG

Tháng 9/2008


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HCM
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
************

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP

KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN SỰ TÁI SINH
CHỒI, HÌNH THÀNH RỄ VÀ CỦ LILY (Lilium sp.)
NUÔI CẤY IN VITRO

Giáo viên hướng dẫn:

Sinh viên thực hiện:

ThS. NGUYỄN NGỌC TRÌ

ĐÀO THỊ THƯƠNG

Tháng 9/2008


LỜI CẢM TẠ
Tôi xin chân thành cảm tạ:
 Ban Giám hiệu trường Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, Ban chủ
nhiệm Bộ môn Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả Quý Thầy Cô đã truyền đạt kiến
thức cho tôi trong suốt quá trình học tại trường.
 Ths Nguyễn Ngọc Trì đã hết lòng hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực
tập tốt nghiệp tại trường.
 Cô Khanh cùng các anh chị tại Bộ môn CNSH đã tận tình giúp đỡ, tạo điền kiện
thuận lợi cho tôi trong suốt thời gian thực tập tốt nghiệp.
 Các bạn bè thân yêu của lớp CNSH K30 đã chia sẻ cùng tôi những vui buồn trong
suốt thời gian học cũng như hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực
tập.
 Cảm ơn chị tôi, bạn bè tôi- những người luôn giúp đỡ và chia sẻ buồn vui.
 Cuối cùng, con thành kính ghi ơn công lao của bố mẹ đã sinh thành, dạy dỗ và
động viên con trong suốt bốn năm học này.

Sinh viên thực hiện
Đào Thị Thương


iii


TÓM TẮT
ĐÀO THỊ THƯƠNG, “KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN SỰ TÁI SINH
CHỒI, HÌNH THÀNH RỄ VÀ CỦ LILY (Lilium sp.) NUÔI CẤY IN VITRO”.
Giáo viên hướng dẫn: ThS. Nguyễn Ngọc Trì.
Đề tài được thực hiện từ 3/2008 đến 9/2008 tại phòng nuôi cấy mô - Bộ môn Công
nghệ Sinh học - Trường Đại học Nông Lâm Tp. Hồ Chí Minh.
Nguyên liệu là vảy củ lily giống Sorbonne. Tất cả các thí nghiệm được bố trí theo
kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên với 3 lần lập lại.
Đề tài gồm những thí nghiệm sau:
Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của nồng độ BA, TDZ và Kinetin lên sự tái sinh chồi trực tiếp
từ vảy củ lily.
Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của nồng độ Kinetin đến khả năng nhân cụm chồi.
Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của nồng độ NAA và TDZ đến khả năng nhân cụm chồi.
Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của nồng độ NAA và than hoạt tính đến sự hình thành rễ.
Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng của nồng độ đường và môi trường đến sự hình thành củ.
Thí nghiệm 6: Khảo sát tỉ lệ sống, tỉ lệ nảy mầm của củ đem ra vườn ươm.
Những kết quả đạt được:
1. Môi trường nuôi cấy tốt nhất cho sự tái sinh chồi từ vảy củ lily là môi trường ½ MS có
bổ sung BA 0,2 mg/l kết hợp với NAA 0,1 mg/l.
2. Nhân chồi tốt ở môi trường MS bổ sung Kinetin 0,1 mg/l và NAA 0,1 mg/l.
3. Nhân chồi tốt ở môi trường MS bổ sung NAA 1 mg/l và TDZ 1 mg/l.
4. Môi trường ½ MS bổ sung NAA 0,5 mg/l và BA 0,1 mg/l thích hợp nhất cho hình
thành rễ.
5. Môi trường nuôi cấy ½ MS bổ sung đường saccarose 75 g/l thích hợp cho hình thành
củ.
6. Tỉ lệ sống của cây con 76,6 %, tỉ lệ nảy mầm cao nhất ở là củ nhỏ 66,7 %.


iv


SUMMARY
Dao Thi Thuong, September 2008. “A study some factor effect to shoot regeneration, root
and bulb formation lily (Lilium sp.) culture in vitro”.
Guide teacher: Nguyen Ngoc Tri.
The study has conducted in laboratory from March 2008 to September 2008, at
Biotechnology department of Nong Lam University in Ho Chi Minh City. The material is
scale bulbs of lily Sorbonne. These experiments were laid out in randomized complete
design (RCD) with three replicates.
Experiment 1: Effect of BA, TDZ and Kinetin concentration on directly shoot regeneration
from lily scale bulbs
Experiment 2: Effect of Kinetin concentration on shoot multiplication
Experiment 3: Effect of NAA and TDZ concentration on shoot multiplication
Experiment 4: Effect of NAA concentration and activated charcoal on root formation
Experiment 5: Effect of sugar and medium concentration on bulb formation
Experiment 6: Survival ratio of plantlet, germination ratio of bulb
The result of this study:
1. The best culture medium to directly shoot regeneration from scale bulbs is ½ MS
supplemented with BA 0,2 mg/l and NAA 0,1 mg/l.
2. The best culture medium to shoot multiplication is MS supplemented Kinetin 0,1 mg/l
and NAA 0,1 mg/l.
3. The best culture medium to shoot multiplication is MS supplemented NAA 1 mg/l and
TDZ 1 mg/l.
4. The best culture medium to root formation is ½ MS supplemented NAA 0,5 mg/l and
BA 0,1 mg/l.
5. The best culture medium to bulb formation is ½ MS supplemented 75 g/l sugar.
6. Survival ratio of plantlet is 76,6 %, germination ratio of small bulb is 66,6 %.


v


MỤC LỤC
NỘI DUNG

TRANG

Lời cảm tạ....................................................................................................................... i
Tóm tắt........................................................................................................................... ii
Summary ..................................................................................................................... iii
Mục lục .........................................................................................................................iv
Danh sách các chữ viết tắt ....................................................................................... viii
Danh sách các hình .......................................................................................................ix
Danh sách các bảng ......................................................................................................x
Chương 1: MỞ ĐẦU .....................................................................................................1
1.1 Đặt vấn đề..................................................................................................................1
1.2 Mục tiêu nghiên cứu .................................................................................................2
1.2.1 Mục đích .................................................................................................................2
1.2.2 Yêu cầu ...................................................................................................................2
Chương 2: TỔNG QUAN ............................................................................................3
2.1 Sơ lược về cây Lily...................................................................................................3
2.2.1 Phân loại cây hoa Lily ............................................................................................3
2.1.2 Phân loại thực vật học ............................................................................................3
2.1.3 Đặc điểm thực vật học ...........................................................................................3
2.1.4 Phân bố và sinh thái học.........................................................................................4
2.1.5 Sản xuất và tiêu thụ trong và ngoài nước ...............................................................4
2.1.5.1 Tình hình sản xuất hoa Lily trên thế giới ............................................................4
2.1.5.2 Tình hình sản xuất hoa Lily ở Việt Nam.............................................................5

2.2 Môi trường và điều kiện nuôi cấy mô tế bào thực vật .........................................7
2.2.1 Sơ lược lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật ..........................................................7
2.2.2 Môi trường nuôi cấy ...............................................................................................7
2.2.3 Điều kiện nuôi cấy.................................................................................................7
2.2.3.1 Ánh sáng ..............................................................................................................7

vi


2.2.3.2 Nhiệt độ ...............................................................................................................7
2.2.3.3 Môi trường in vitro ..............................................................................................8
2.3 Các chất điều hòa sinh trưởng ...............................................................................8
2. 3.1 Auxin .....................................................................................................................8
2. 3.2 Cytokinin ...............................................................................................................8
2. 3.3 Acid abscisic (ABA)..............................................................................................9
2. 4 Các yếu tố khác.......................................................................................................9
2.4.1 Nguồn carbon .........................................................................................................9
2.2.4.2 Tác nhân tạo gel (gelling agent) ........................................................................10
2.2.4.3 pH của môi trường.............................................................................................10
2.2.4.4 Than hoạt tính (Activated charcoal) ..................................................................10
2.2.4.5 Tính thẩm thấu của môi trường .........................................................................11
2.2.4.6 Aminoacid .........................................................................................................11
2.3.1 Các nghiên cứu ngoài nước ..................................................................................11
2.3.2 Các nghiên cứu trong nước...................................................................................13
Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ...........................................................16
3.1 Đối tượng thí nghiệm.............................................................................................16
3.2 Thời gian và địa điểm thưc hiện...........................................................................16
3.3 Vật liệu nghiên cứu................................................................................................17
3.3.1 Trang thiết bị và dụng cụ nghiên cứu...................................................................16
3.3.2 Mẫu sử dụng, điều kiện và môi trường nuôi cấy..................................................16

3.4 Phương pháp nghiên cứu ......................................................................................17
3.4.1 Chuẩn bị môi trường.............................................................................................17
3.4.2 Tạo nguồn mẫu cấy ban đầu.................................................................................17
3.4.3 Bố trí thí nghiệm...................................................................................................18
3.5 Chỉ tiêu theo dõi ......................................................................................................22
3.5.1 Thí nghiệm tái sinh chồi .......................................................................................22
3.5.2 Thí nghiệm nhân cụm chồi ..................................................................................22

vii


3.5.3 Thí nghiệm tạo rễ..................................................................................................23
3.5.4 Thí nghiệm tạo củ.................................................................................................23
3.5.5 Thí nghiệm vườn ươm..........................................................................................23
3.6 Xử lý số liệu ............................................................................................................23
Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN..................................................................24
4.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của nồng độ BA, TDZ và Kinetin lên sự tái sinh chồi trực
tiếp từ vảy củ lily ...........................................................................................................24
4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của Kinetin và NAA đến khả năng tạo cụm chồi
.......................................................................................................................................29
4.3 Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của TDZ và NAA đến khả năng tạo cụm chồi32
4.4 Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của nồng độ NAA và than hoạt tính đến sự hình thành rễ35
4.5 Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng của nồng độ đường và môi trường nuôi cấy đến sự hình
thành củ..........................................................................................................................38
4.6 Thí nghiệm 6: Khảo sát tỉ lệ sống sót, sinh trưởng và phát triển của cây và củ đem ra
vườn ươm.......................................................................................................................43
Chương 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .....................................................................45
5.1 Kết luận....................................................................................................................45
5.2 Đề nghị ....................................................................................................................45
TÀI LIỆU THAM KHẢO

PHỤ LỤC

viii


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
BA

:

6-Benzylaminnopurine

TDZ

:

1-Phenyl-3-(1,2,3-thidiazol-5-yl)urea

Ki

:

kinetin

NAA

:

α-Naphthaleneacetic acid


ĐC

:

đối chứng

CV

:

hệ số biến động

P

:

xác xuất sai lầm (mức độ tin cậy)

LSD

:

least significant difference

Ctv

:

cộng tác viên


1.
2.
3.
4.
5.
6.

ix


DANH SÁCH CÁC HÌNH
HÌNH

TRANG

Hình 2.1:Hoa lily giống sorbonne ....................................................................................3

Hình 2.2: Một số lily lai Phương Đông ...........................................................................6
Hình 3.4: A: Mẫu củ ban đầu, B: Phần gốc của vảy củ sau 2 tuần nuôi cấy.................18
Hình 4.1: Ảnh hưởng của nồng độ BA, TDZ và Kinetin lên sự tái sinh chồi trực tiếp từ vảy

củ lily sau 6 tuần nuôi cấy .............................................................................................28
Hình 4.2: Ảnh hưởng Kinetin đến khả năng tao cụm chồi lily .....................................31
Hình 4.3: Ảnh hưởng TDZ và NAA đến khả năng tao cụm chồi lily ...........................34
Hình 4.4: Ảnh hưởng của nồng độ NAA và than hoạt tính đến sự hình thành rễ .........37
Hình 4.5: Ảnh hưởng nồng độ đường và môi trường đến khả năng hình thành củ ..........
.......................................................................................................................................42
Hình 4.6: Cây con và củ vườn ươm sau 4 tuần .............................................................43

x



DANH SÁCH CÁC BẢNG
BẢNG

TRANG

Bảng 4.1a: Ảnh hưởng của nồng độ BA, TDZ và Kinetin lên sự tái sinh chồi trực tiếp từ
vảy củ lily sau 4 tuần nuôi cấy ......................................................................................24
Bảng 4.1b: Ảnh hưởng của nồng độ BA, TDZ và Kinetin lên sự tái sinh chồi trực tiếp từ
vảy củ lily sau 6 tuần nuôi cấy ......................................................................................25
Bảng 4.1c: Ảnh hưởng của nồng độ BA, TDZ và Kinetin lên sự tái sinh chồi trực tiếp từ
vảy củ lily sau 6 tuần nuôi cấy ......................................................................................25
Bảng 4.2: Ảnh hưởng Kinetin đến khả năng tao cụm chồi ...........................................29
Bảng 4.3: Ảnh hưởng TDZ và NAA đến khả năng tao cụm chồi .................................32
Bảng 4.4: Ảnh hưởng của nồng độ NAA và than hoạt tính đến sự hình thành rễ..........35

Bảng 4.5: Ảnh hưởng nồng độ đường và môi trường đến khả năng hình thành củ
.......................................................................................................................................38

xi


Chương 1

MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Lily là một trong những cây hoa có giá trị hàng đầu thế giới về xuất khẩu và tiêu
thụ nội địa của nhiều nước, là một trong những loài hoa cắt cành đẹp và được nhân giống
thương mại trên diện rộng. Hoa lily mang lại lợi nhuận lớn ở nhiều nước như Hà Lan,

Nhật Bản…Tại Hà Lan sản phẩm củ giống lily tăng cao từ 100 ha năm 1966 đến 5.000 ha
năm 2001 khoảng 1.000 triệu củ (Van Tuyl và Van Holsteijn, 1996).
Ở nước ta, thị trường tiêu thụ hoa ngày càng gia tăng. Cùng với các loại hoa khác,
lily chiếm một phần không nhỏ bởi sức thu hút về màu sắc phong phú và hương thơm của
loài hoa này. Hiện nay hoa lily được trồng ở các vùng như Tam Đảo, Sapa, Mộc Châu, Đà
Lạt, một số ít ở vùng đồng bằng…nhưng sản lượng chưa cao, chưa được trồng và nhân
giống trên diện tích rộng như các loại hoa khác. Những người trồng hoa không có sẵn củ
giống do củ giống phải được bảo quản lạnh trong khoảng thời gian tùy theo loại giống từ
2 đến 6 tháng mới đem trồng, do đó họ phải mua củ giống nhập nội, giá hiện tại cho một
củ giống từ 7.000 - 10.000 đồng/củ tuỳ loại và màu sắc, do vậy sản phẩm của hoa thương
phẩm là rất đắt
Những phương pháp nhân giống truyền thống chưa đáp ứng nhu cầu hiện nay do
chất lượng củ giống chưa đảm bảo, tạo hoa thương phẩm không chất lượng, dễ mắc nhiều
bệnh.
Trên thị trường hoa lily hiện nay, muốn giảm giá hoa tiêu thụ thì trước tiên là giảm
giá nguyên liệu giống ban đầu. Ứng dụng kĩ thuật hiện đại nuôi cấy mô in vitro có thể đáp
ứng các nhu cầu hiện nay với ưu điểm vượt trội so với phương pháp truyền thống, tạo số
lượng nhiều, chất lượng nguồn giống ổn định, đồng đều, sạch bệnh, cây sinh trưởng và
phát triển tốt, giá thành phù hợp với người trồng hoa và đáp ứng phù hợp thị hiếu nhiều
người tiêu dùng.
Xuất phát từ mục đích trên và được sự đồng ý của bộ môn Công Nghệ Sinh Học
cùng với sự hướng dẫn tận tình của ThS Nguyễn Ngọc Trì, chúng tôi tiến hành nghiên

1


cứu đề tài “Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến sự tái sinh chồi, hình thành rễ và củ
lily (Lilium sp.) nuôi cấy in vitro”.
1.2 Mục tiêu nghiên cứu
1.2.1 Mục đích

Tái sinh chồi từ nguyên liệu ban đầu là vảy củ lily. Hình thành rễ và củ từ chồi.
1.2.2 Yêu cầu
- Ảnh hưởng của BA, TDZ, Kinetin lên sự tái sinh chồi từ vảy củ
- Ảnh hưởng của Kinetin và NAA đến khả năng nhân cụm chồi
- Ảnh hưởng của NAA và than hoạt tính đến sự hình thành rễ, nồng độ đường và
môi trường nuôi cấy đến sự hình thành củ
- Khảo sát tỉ lệ sống sót của cây con và tỉ lệ nảy mầm của củ ngoài vườn ươm

2


Chương 2

TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Sơ lược về cây lily
2.1.1 Phân loại cây hoa lily
Hoa lily có thể phân loại theo nhiều cách khác nhau như: phân loại theo nguồn gốc
xuất xứ, theo thời gian ra hoa và theo màu sắc hoa. Năm 1982, Hiệp hội lily quốc tế đề ra
hệ thống phân loại lily trên cơ sở hệ thống phân loại của Anh năm 1963. Hệ thống này
dựa vào nơi nguyên sản của bố mẹ, quan hệ huyết thống, đặc trưng hình thái, màu sắc hoa
mà quy các giống lily vào 8 nhóm: nhóm lily lai Châu Á, lily lai Tinh Diệp, lily lai hoa
trắng, lai lily Châu Mỹ, lai lily thơm, lily lai loa kèn, lai Phương Đông và lily nguyên
chủng (Đặng Văn Đông và Đinh Thế Lộc, 2003).
2.1.2 Phân loại thực vật học
Giới

: Plantae

Ngành


: Tracheophyta

Lớp

: Liliopsida

Bộ

: Liliales

Họ

:

Liliaceae

Giống

:

Lilium

Tên thông thường : Sorbonne
2.1.3 Đặc điểm thực vật học
Hình
2.1:thân
Hoavảy
lilyvà
giống
sorbonne

- Lily là cây thân thảo. Phần dưới mặt đất
gồm
rễ, phần
trên mặt đất

gồm lá, thân và mầm hạt (một số không có mầm hạt).
- Thân vảy: là phần phình to của thân tạo thành, nhiều vảy hợp lại trên cùng thân
vảy, màu sắc thay đổi tùy loài và giống.
- Rễ: gồm rễ thân và rễ gốc, rễ gốc là cơ quan hút nước và dinh dưỡng.
- Lá: mọc rải thành vòng thưa, hình kim, xòe, lá to, nhỏ tùy thuộc vào giống, điều
kiện trồng trọt. Trên lá có 1 - 7 gân, gân giữa rõ ràng hơn, lá mềm và xanh bóng.
- Củ con: nhiều củ con ở gần thân rễ, chu vi mỗi củ 0,5 - 3 cm.

3


- Hoa: hình dáng hoa to, màu sắc hoa phong phú, hoa có 3 cánh, 3 đài hoa, 6 bao
phấn (Đặng Văn Đông và Đinh Thế Lộc, 2003).
2.1.4 Phân bố và sinh thái học.
Lily có nguồn gốc từ các đảo phía Nam Nhật bản. Ở nước ta hiện có hai loài. Loài
thứ nhất là cây bách hợp (L. brownii F.E Brown var Colchsteri Wils) mọc hoang trên núi
đá, các đồi cỏ ở Bắc Thái, Cao Lạng. Loài thứ hai là L. poilanei Gagnep có ở đồi cỏ Sapa,
tỉnh Hoàng Liên Sơn.
Lily là cây ưa khí hậu ôn đới hay cận nhiệt đới, ánh sáng ở mức trung bình, có thể
chịu đựng nhiệt độ -2oC, nhiệt độ ban ngày không quá 22oC, nhiệt độ ban đêm 13 - 17oC
là thích hợp, lily ưa mọc đất ẩm thoáng, đất mùn, thoát nước tốt, pH thích hợp 5,5 - 7,0.
Dinh dưỡng phải được cung cấp phù hợp, nhất là trong thời kì cây còn non (Đặng Văn
Đông và Đinh Thế Lộc, 2003).
2.1.5 Sản xuất và tiêu thụ trong và ngoài nước
2.1.5.1Tình hình sản xuất hoa lily trên thế giới

Lily là một trong những hoa được ưa chuộng trên thế giới. Năm 1997, Hà Lan có
356 ha lily, đứng thứ hai trong tổng diện tích hoa cắt cành trồng bằng củ (sau tulip). Hiện
nay, mỗi năm Hà Lan trồng 18.000 ha hoa lily trong đó xuất khẩu 70 %.
Nhật Bản là nước có truyền thống dùng hoa cắm và là một trong những nước tiêu
thụ và nhập khẩu hoa cắt lớn nhất châu Á. Nhật cũng là nước sản xuất hoa lớn, diện tích
sản xuất hoa năm 1992 là 4.600 ha với 3.600 hộ, trong đó hoa lily đứng thứ 4.
Những năm gần đây, Hàn Quốc cũng phát triển hoa mạnh. Năm 2002, nước này có
15.000 ha trồng hoa, trong đó lily là loại cây có hiệu quả kinh tế cao nhất.
Kenia là nước sản xuất hoa chủ yếu ở châu Phi, và là nước xuất khẩu hoa tươi lớn
nhất châu lục này. Hiện nay nước này có tới 3 vạn nông trường với hơn hai triệu người
trồng hoa, mỗi năm nước này xuất khẩu sang châu Âu 65 triệu USD, riêng hoa lily chiếm
35 %.
Ở Đài Loan, năm 2001 nước này có 490 ha trồng lily, xuất khẩu lily cắt cành đạt
7,4 triệu USD (Đặng Văn Đông và Đinh Thế Lộc, 2003).

4


2.1.5.2 Tình hình sản xuất hoa lily ở Việt Nam.
Lily được trồng ở một số các tỉnh miền núi phía Bắc như Tam Đảo (Vĩnh Phúc),
Sapa (Lào Cai), Mộc Châu (Sơn La), ở Đà Lạt (Lâm Đồng).... với các tỉnh đồng bằng đặc
biệt là vùng đồng bằng sông Hồng. Nói chung, so với các loại hoa khác thì hoa lily chiếm
tỉ lệ cả về diện tích và số lượng còn quá nhỏ. Trong đó, Đà Lạt là nơi có diện tích trồng
hoa lily nhiều nhất (chiếm khoảng 8 % trong tổng diện tích trồng hoa) (Đặng Văn Đông
và Đinh Thế Lộc, 2003).
Theo Đặng Văn Đông, hiện nay nhiều giống lily được ưa chuộng phân thành 4
nhóm chính: lai Á châu, nhóm lai Phương Đông, nhóm lily thơm và nhóm các loại hình
khác. Các giống lily đang được ưa thích ở nước ta gồm có: TIBER cho hoa màu nâu
hồng, có 3 - 5 hoa/cành, hoa to, cây cao vừa phải (80 - 90 cm), SIBERIA cho hoa màu
trắng, có 4 - 5 hoa/cành, hoa to, thấp cây (60 - 70 cm), ACAPULCO cho hoa màu hồng

sẫm, có 3 - 5 hoa/cành, hoa vừa, cây cao 90 - 120 cm), SORBONNE cho hoa màu hồng
nhạt, có 6 - 7 hoa/cành, hoa nhỏ, cây cao 90 - 120 cm và một số giống màu vàng, sọc
hồng, lily thơm v.v (Nhà Nông, 2008).

5


Woodriff’s Memory

Bernimi

Bergamo

Pesaro

Tiber

Barbaresco
Hình 2.2: Một số lily lai Phương Đông

6


2.2 Môi trường và điều kiện nuôi cấy mô tế bào thực vật
2.2.1 Sơ lược lịch sử nuôi cấy mô tế bào thực vật
Theo Phạm Thành Hổ (2006), sự phát triển của nuôi cấy mô thực vật có thể chia
làm 4 giai đoạn chính:
- GĐ I: (1902 - 1930) với những thử nghiệm ban đầu.
- GĐ II: (1934 - 1954) năm 1937, Gautheret đã nuôi cấy thành công mô tế bào cà
rốt. Phát hiện vai trò các vitamin, chất kích thích sinh trưởng auxin, cytokinin.

- GĐ III: (1957 - 1992) thực hiện tách và nuôi tế bào đơn. Biết vai trò tỉ lệ
cytokinin/auxin; tạo protoplast và tái sinh cây; tạo cây đơn bội từ nuôi cấy túi phấn và từ
những năm 1980 là sự phát triển công nghệ gen thực vật.
- GĐ IV: ứng dụng các thành tựu vào sản xuất quy mô lớn và diện rộng.
2.2.2 Môi trường nuôi cấy
Môi trường thường được sử dụng nhiều trong các thí nghiệm là môi trường MS với
đầy đủ thành phần dinh dưỡng, khoáng, thuận lợi cho mẫu nuôi cấy. Bao gồm:
- Nguyên tố đa lượng: K, N, S, P, Mg, Ca.
- Nguyên tố vi lượng: Fe, Co, Mn, Bo, Zn, Cu, Mo.
- Vitamin: thiamin (vitamin B1), pyridoxin (vitamin B6), glycine, nicotinic acid,
myo-Inositol.
½ MS, ¼ MS là môi trường có hàm lượng khoáng đa lượng giảm ½, ¼.
Môi truờng có bổ sung đường, agar, than hoạt tính và các chất điều hòa sinh trưởng
thuộc nhóm cytokinin hoặc auxin với nồng độ khác nhau.
2.2.3 Điều kiện nuôi cấy
2.2.3.1 Ánh sáng
Mẫu cấy được đặt trên môi trường chứa nguồn năng lượng sẵn sàng là đường, sẽ ít
tùy thuộc vào quang hợp. Tuy nhiên nhiều nghiên cứu cho thấy ánh sáng hấp thụ đóng vai
trò quan trọng trong phản ứng tạo hình cây nuôi cấy mô.
2.2.3.2 Nhiệt độ
Ngoài ánh sáng, yếu tố môi trường khác có ảnh hưởng rõ ràng là nhiệt độ. Tuy có
nhiều loại cây trồng có nhiệt độ tối ưu cho sự tạo hình nhưng hầu hết việc nuôi cấy thích
hợp ở nhiệt độ 20 – 25oC.
7


2.2.3.3 Môi trường in vitro
Môi trường in vitro là môi trường trên và dưới mặt thạch trong bình nuôi cấy. Môi
trường in vitro có ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển hình thái của cây
in vitro. Một số vấn đề của môi trường in vitro là mức độ quang hợp thấp không cân bằng

CO2, mức độ hấp thu và vận chuyển các chất dinh dưỡng hạn chế, ... Vì vậy cây con in
vitro sinh trưởng chậm, xuất hiện biến dị về hình thái và chất lượng, mẫn cảm với stress ở
giai đoạn thuần hóa.
Đặc tính của môi trường in vitro và phản ứng của cây con in vitro với môi trường
có mối tương quan. Do đó việc kiểm soát môi trường in vitro được đặt ra để điều khiển sự
sinh trưởng (Dương Công Kiên, 2002).
2.3 Các chất điều hòa sinh trưởng
2.3.1 Auxin
Auxin đầu tiên được phát hiện đó là hợp chất tương đối đơn giản: acid indol-3acetic là tác nhân của sự sinh trưởng kéo dài miền cận dưới đỉnh của bao lá mầm và thân
cây (Nguyễn Như Khanh, 2006). Hiện nay các auxin được đưa vào môi trường nuôi cấy
nhằm thúc đẩy sự sinh trưởng và giãn nở của tế bào, tăng cường các quá trình sinh tổng
hợp và trao đổi chất, kích thích hình thành rễ và tham gia vào cảm ứng phát sinh phôi vô
tính.
Các loại auxin có hàm lượng sử dụng từ 0,1 - 2 mg/l (ngoại trừ IAA ít được sử
dụng do kém bền với nhiệt và ánh sáng). Chúng có hiệu quả sinh lý ở nồng độ thấp. Tùy
theo loại auxin, hàm lượng sử dụng và đối tượng nuôi cấy…mà tác động sinh lý của auxin
kích thích sinh trưởng mô, hoạt hóa hình thành rễ hay thúc đẩy sự phân chia mạnh mẽ của
tế bào dẫn đến hình thành mô sẹo (callus) (Vũ Văn Vụ và ctv, 2006).

2.3.2 Cytokinin
Kinetin được Skoog và Miller đặt tên sau khi tách ra từ 500 g DNA của tinh dịch
cá trích (clupea). Cytokinin nói chung là một nhóm các chất tự nhiên và nhân tạo có tác
dụng kích thích sự phân chia tế bào, sự hình thành và sinh trưởng của chồi in vitro. Các
cytokinin có biểu hiện ức chế sự tạo rễ và sự sinh trưởng của mô sẹo nhưng có biểu hiện
8


dương tính rõ rệt đến phát sinh phôi vô tính của mẫu nuôi cấy, cảm ứng sự hình thành
chồi cây thông qua tác dụng của quá trình sinh tổng hợp các yếu tố tăng trưởng (Vũ Văn
Vụ và ctv, 2006).

Hàm lượng sử dụng của các loại cytokinin dao động từ 0,1 - 2 mg/l. Ở những nồng
độ cao hơn, cytokinin có tác dụng kích thích rõ rệt đến sự hình thành chồi bất định, đồng
thời ức chế mạnh sự tạo rễ của chồi nuôi cấy. Trong các loại cytokinin nói trên, Kinetin
và BAP là hai loại được sử dụng rộng rãi hơn cả (Vũ Văn Vụ và ctv, 2006).
TDZ là một chất điều hòa sinh trưởng tổng hợp, không là dẫn suất của cytokinin
nhưng có tác dụng như một cytokinin. Các thí nghiệm trước đã cho thấy TDZ có tác dụng
gấp 4 lần cytokinin. Ở nồng độ thấp TDZ cảm ứng tái sinh trực tiếp từ mô, nồng độ cao
cảm ứng tạo sẹo và phôi sinh dưỡng từ sẹo. Vì TDZ bền, có họat tính cao nên thường
được sử dụng trong nuôi cấy mô (Mai Trần Ngọc Tiếng, 2001).
Trong nuôi cấy có loại mẫu chỉ cần auxin hoặc cytokinin, hoặc không cần cả hai,
còn đa số trường hợp mẫu phải sử dụng phối hợp cả hai loại auxin và cytokinin.
2.3.3 Acid abscisic (ABA)
ABA là hormone thực vật quan trọng, là chất ức chế sinh trưởng tự nhiên. Nó tác
động như là chất điều hòa sinh trưởng âm tính, hoạt động trên sự rụng lá, điều tiết sự đóng
mở khí khổng, đặc biệt khi cây ở vào điều kiện môi trường bất lợi, đó cũng là hormone
điều tiết trạng thái ngủ của hạt, chồi, củ. Chất này được tìm ra đầu tiên trên thí nghiệm
của sự rụng trái bông vải (Nguyễn Như Khanh, 2006).
Trong nuôi cấy in vitro, acid abscisic ít được sử dụng, một phần tùy theo loại cây
và phần khác tùy vào điều kiện nuôi cấy, chất này sẽ gây các phản ứng rất khác nhau và
giải thích một cách khó khăn (Dương Công Kiên, 2002).
2.4 Các yếu tố khác
2.4.1 Nguồn cacbon
Các mẫu nuôi cấy mô thực vật nói chung không thể quang hợp, hoặc nếu có quang
hợp thì cường độ cũng rất thấp do thiếu chlorophyll, nồng độ CO2 và nhiều điều kiện
khác…Vì vậy phải đưa thêm những hợp chất hydratcarbon vào thành phần nuôi cấy.

9


Loại hydratcarbon được sử dụng phổ biến là đường saccarose với hàm lượng 2 - 6

% (W/v). Những loại đường khác như: fructose, glucose, maltose, lactose, rafinose,
sorbitol…chỉ dùng trong những trường hợp cá biệt (Vũ Văn Vụ và ctv, 2006).
2.4.2 Tác nhân tạo gel (gelling agent)
Tác nhân tạo gel quyết định trạng thái vật lý của môi trường nuôi cấy. Các môi
trường đặc có chứa đủ hàm lượng chất tạo gel làm cho chúng đông lại ở nhiệt độ bình
thường (25 - 30oC).
Chất tạo gel được sử dụng phổ biến là agar (thạch) gồm một số polysaccharide có khối
lượng phân tử cao, được lấy từ rong biển. Các polysaccharide kết hợp với các phân tử
H2O tạo thành polyme và đông lại thành gel ở nhiệt độ xấp xỉ 45oC.
Trong thành phần của agar có chứa một số thành phần vô cơ: Cu, Fe, Mg, Mn, Cl,
Zn.. và một số thành phần hữu cơ: acid hữu cơ, acid béo chuỗi dài…
Hàm lượng sử dụng của agar 0,5 - 10 % (W/v) tùy theo chất lượng của chúng và
loại môi trường sử dụng (Vũ Văn Vụ và ctv, 2006).
2.4.3 pH của môi trường
pH của đa số môi trường nuôi cấy được điều chỉnh trong phạm vi 5,5 - 6, dưới 5,5
làm agar khó chuyển sang trạng thái gel, còn pH lớn hơn 6 agar có thể rất cứng. Trong
quá trình nuôi cấy, pH của môi trường có thể giảm xuống do một số mẫu thực vật sản sinh
ra acid hữu cơ (Vũ Văn Vụ và ctv, 2006)
2.4.4 Than hoạt tính (Activated charcoal (AC))
Than hoạt tính được dùng để hấp thụ các chất màu, các hợp chất phenol, các sản
phẩm trao đổi chất thứ cấp,…trong trường hợp những chất đó có tác dụng gây ức chế sinh
trưởng của mẫu nghiên cứu.
Than hoạt tính cũng hút các chất hữu cơ như phytohormone, vitamin, sắt chelat,
kẽm. Hàm lượng sử dụng than hoạt tính là 0,2 - 0,3 % (W/v).
Than hoạt tính làm giảm hiệu quả các chất điều hòa sinh trưởng, làm thay đổi môi
trường ánh sáng, do môi trường trở nên sẫm khi có than hoạt tính, có thể kích thích sự
hình thành, sinh trưởng của rễ, và là một trong những chất chống oxi hóa tốt (Vũ Văn Vụ
và ctv, 2006).

10



2.4.5 Tính thẩm thấu của môi trường
Trong nuôi cấy mô, hấp thụ nước của tế bào, mô bị chi phối bởi thế năng của nước
trong dịch bào và trong môi trường dinh dưỡng. Các thành phần chính có ảnh hưởng đến
thế năng của nước trong môi trường bao gồm:
- Hàm lượng đường
- Hàm lượng agar
- Một số thành phần muối khoáng
Đường vừa là nguồn carbon cung cấp cho mẫu nuôi cấy đồng thời tham gia vào
điều chỉnh khả năng thẩm thấu của môi trường. Hàm lượng đường cao thì mô nuôi cấy
khó hút được nước còn hàm lượng đường quá thấp là một trong những nguyên nhân gây
ra hiện tượng thủy tinh thể. Đây là trở ngại chính cho việc chuyển cây từ ống nghiệm ra
vườn ươm (Vũ Văn Vụ và ctv, 2006).
Theo Trigiano và Gray (2000), hydratcarbon đóng góp khoảng 50 - 70 % vào khả
năng thẩm thấu của môi trường, phần còn lại do muối dinh dưỡng và các thành phần khác
gây ra. Vì thế có thể thay đổi thẩm thấu của môi trường qua thành phần hydratcarbon (Vũ
Văn Vụ và ctv, 2006).
2.4.6 Aminoacid
Đối với nhiều loại mẫu nuôi cấy, môi trường phải được bổ sung các aminoacid vì
chúng giữ vai trò quan trọng trong phát sinh hình thái. Tất cả các dạng tự nhiên của
aminoacid (dạng L) dễ dàng được mô nuôi cấy hấp thụ. Trong đó glycine là aminoacid
đơn giản nhất, nhưng là nguồn tổng hợp ra purin và một số thành phần cấu trúc của vòng
porphyrin trong các phân tử chlorophyll (Vũ Văn Vụ và ctv, 2006).
2.5 Các nghiên cứu trong và ngoài nước
2.5.1 Các nghiên cứu ngoài nước
Hoa lily đã được con người biết đến từ lâu nhưng những ứng dụng nuôi cấy mô lily
để nhân giống thương mại thì chỉ được thực hiện trong những thập niên gần đây.
- Năm 1982, Shinsaku Takayama và Masanaru Misawa đã nghiên cứu ảnh hưởng
của cytokinin và auxin lên sự phát sinh hình thái in vitro Lilium auratum Lindl (một loài

hoang dại ở Nhật Bản) và Lilium speciosum Thunb. cv. "Uchida". Nghiên cứu này đã chỉ
ra sự kết hợp NAA và Kinetin có hiệu quả tương hổ lẫn nhau. BA có tác dụng sinh lý
11


mạnh trong phát sinh hình thái hơn Kinetin và hoạt tính của Kinetin ảnh hưởng bởi nồng
độ đường và môi trường MS.
- Năm 1997, Qian Hou và ctv đã nuôi cấy Sego lily một loài lily hoang dại có
nguồn gốc miền Tây nước Mỹ. Ông đã thực hiện sự tái sinh chồi từ những phần cắt từ củ,
nuôi cấy trên môi trường Schenk và Hildebrandt bổ sung 88 mM đường và 8,9 µM BA.
Sự hình thành rễ đạt 94 % mỗi chồi, nuôi cấy ở nhiệt độ 13oC môi trường bổ sung 88 mM
đường và 2,7 µM NAA. Củ được hình thành từ chồi ở môi trường bổ sung 263 mM
đường
- Năm 2000, Chang và ctv đã thực hiện quy trình nuôi cấy mô tái sinh thực vật
trên Lilium speciosum Thunb. var. gloriosoides Baker. Mảnh mô từ hoa non (floret) được
cấy chuyền qua môi trường MS bổ sung 3 mg/l 2,4-D và 0,25 mg/l BA cho cảm ứng tạo
mô sẹo (callus). Mô sẹo có khả năng hình thành chồi, chúng được cấy chuyển sang môi
trường tạo cây con có bổ sung 0,1 mg/l NAA, 1 g/l than hoạt tính và 170 mg/l Na2HPO4,
nhân chồi trong 3 tháng. Cuối cùng 6.000 cây con được tạo ra trong 9 tháng. Khảo sát 200
cây con ngoài vườn ươm, tỉ lệ sống sót là 98 % sau 4 tuần theo dõi đã mở ra triển vọng
cho nhân giống lily ở Nhật Bản.
- Thí nghiệm của Bong Flee Han và ctv (2004), đã thực hiện vi nhân giống in vitro
Lilium longiflorum ‘Georgia’ nuôi cấy trên môi trường MS bổ sung BA. Sau 6 tuần, môi
trường được bổ sung với 2,2 µM BA có ảnh hưởng cao nhất hình thành chồi từ vảy củ. Sự
nhân chồi luôn đạt được hiệu quả cao trên môi trường bổ sung 2,2 µM BA và 2,9 µM
IAA trong 8 tuần (9 chồi). Sự thêm vào môi trường lỏng bổ sung với 5 - 10 g/l than hoạt
tính và 250 g/l đường đã kích thích sự hình thành và phát triển củ một cách đáng kể so
sánh với việc không thêm vào môi trường lỏng.
- Những năm gần đây, Gunta Jakobsone và ctv (2006) đã khảo sát các điều kiện
nuôi cấy ảnh hưởng sự phát sinh hình thái và đặc điểm sinh hóa của cây lily in vitro. Ông

đã thực hiện thí nghiệm trên hai cây: Asiatic lily clone ‘NS-94’ và Trompet lily cv.
‘Mezhare’. Thí nghiệm được thực hiện từ những phần cắt của vảy củ. Thông số hình thái
ảnh hưởng bởi điều kiện nuôi cấy, bảo quản nhiệt độ thấp, kéo dài thời gian tiền xử lí
trước khi xử lí lạnh cũng như chế độ ánh sáng, nồng độ đường. Thí nghiệm đã chỉ ra sự
kéo dài khoảng thời gian tiền xử lý làm gia tăng mạnh mẽ hoạt tính enzym peroxidase và
12


polyphenol oxidase trong củ con của ‘NS-94’ ở điều kiện ánh sáng yếu, ngược lại với kết
quả của Mezhare với thời gian xử lý ngắn đặc biệt có ánh sáng mạnh.
- Cùng năm 2006, một thí nghiệm khác của Nestor Curvetto và ctv, họ đã so sánh
phương pháp nuôi cấy truyền thống với quy trình mới với sự bổ sung những nồng độ thay
đổi 0,005; 0,01; 0,015 và 0,02 (%) p/v hydrogen perocide (H2O2) để kiểm soát mức độ ô
nhiễm in vitro và cấy chuyền. Những củ con xử lí 0,02 % H2O2 đạt sinh khối cao hơn so
với các nồng độ xử lí khác, tốc độ tăng trưởng tương đối cao hơn phương pháp truyền
thống, và chỉ ra trọng lượng tươi trung bình cao nhất. Sinh khối cao của củ con là kết quả
tốt khi chuyển ra vườn ươm.
- Gần đây nhất, Pejman Azadi và Morteza Khosh-Khui (2007) đã nghiên cứu ảnh
hưởng của các yếu tố điều hòa tăng trưởng, nồng độ đường, mùa vụ, xử lí lạnh của Lilium
ledebourii (Baker) Boiss dùng củ từ ba vụ mùa khác nhau (mùa xuân, hè, đông). Môi
trường MS bổ sung 0,1 mg/l NAA và 0,1 BA và 6 % đường sucrose. Kết quả trọng lượng
tươi, chỉ tiêu rễ, tỉ lệ sống sót sau khi chuyển ra vườn ươm đã đạt kết quả tốt ở những củ
thu hoạch sớm của vụ đông. Những củ thu hoạch mùa hè cho số củ con/mảnh mô cao
nhất. Củ con vào cuối thời kì nuôi cấy được xử lí lạnh ở 4oC từ 2 đến 8 tuần, và sau
chuyển cây ra vườn ươm trộn cát, than bùn, đất mục tỉ lệ 1:1:1, kết quả tốt cho củ thu
hoạch mùa đông xử lí lạnh 8 tuần.
2.5.2 Các nghiên cứu trong nước
Cùng với các nghiên cứu trên thế giới thì những nghiên cứu trong nước cũng đã
đạt một số thành công nhất định trong ứng dụng nuôi cấy mô lily tạo số lượng lớn giống
chất lượng.

- Năm 1998, Dương Tấn Nhật và ctv, đã tiến hành vi nhân giống lilium
longiflorum. Thí nghiệm nuôi cấy nốt thân của những cây phát triển từ nuôi cấy đỉnh chồi
trước đó. Sau 30 ngày, những cấu trúc tương tự như củ được tạo thành, cấu trúc đó gọi là
“pseudo bulblet” (củ giả) và trung bình có khoảng 32 pseudo-bulblet được hình thành trên
tất cả nốt thân. Nhân chồi được nuôi cấy ở môi trường ½ MS bổ sung 2,3 µM BA. Chồi ra
rễ tốt nhất ở môi trường ½ MS bổ sung 1,1 µM NAA. Thuần hóa trong nhà kính 3 tháng
và thử nghiệm ngoài vườn 8 tháng nhưng đó cũng chỉ dừng lại ở mức thử nghiệm chưa
đưa ra áp dụng diện rộng.
13


- Năm 2006, Dương Tấn Nhựt và ctv ở phân viện sinh học Đà Lạt, viện sinh học
Nhiệt Đới, trường Đại học khoa học tự nhiên TP.HCM vừa nghiên cứu thành công việc
nhân giống hoa lily bằng “kỹ thuật nuôi cấy lớp mỏng tế bào, thiết lập hệ thống nuôi cấy
vô trùng bằng bioreactor”. Thành công của việc ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy bằng
bioreactor trong nhân giống hoa lily, đã mở ra một khả năng tạo củ giống lily để có thể
sản xuất số lượng lớn củ giống.
Kết quả nghiên cứu cho thấy, trong hệ thống bioreactor không phải bất kỳ giống
hoa lily nào cũng có khả năng tạo củ. Các giống lily lai có ưu thế về khả năng hình thành
củ trong hệ thống bioreactor, có khả năng sinh trưởng khá tốt, từ một củ con ban đầu, sau
3 tháng nuôi cấy sẽ tạo được khoảng 3 - 4 củ mới.
- Cùng năm, Dương Tấn Nhựt và ctv đã tiến hành nuôi cấy vảy củ Lilium spp. Sau
45 ngày nuôi cấy họ quan sát thấy trong môi trường MS có bổ sung 0,5 mg/l TDZ 100 %
mẫu tạo chồi với số lượng chồi tối ưu 9 chồi/mẫu. Trọng lượng tươi của chồi là 723,7
mg/chồi. Sự tạo thành rễ tối ưu trong môi trường ½ MS bổ sung 0,2 mg/l NAA, trung
bình 32 rễ/chồi, chiều dài rễ là 60,7 mm/rễ, trọng lượng tươi là 1.340,5 mg/rễ.
- Một thí nghiệm khác của Nguyễn Thị Phương Thảo và Nguyễn Quang Thạch
(2005), họ đã nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy lớp mỏng tế bào đối với vảy củ và
đoạn thân cây Lilium formolongo. Vảy củ và đoạn thân được cắt với kích thước 1, 2, 3, 4,
5 mm cấy vào môi trường căn bản là MS + 0,25 mg/l α-NAA + 1 g/l than hoạt tính + 30 g

đường có bổ sung Kinetin hoặc BA với các nồng độ thay đổi từ 0, 1, 5 và 10 mg/l, để kích
thích mô nuôi cấy phát sinh hình thái. Khi sử dụng Kinetin, chồi tái sinh tốt nhất khi cắt
mỏng vảy củ với kích thước 1 mm, nuôi cấy trên môi trường bổ sung 1 mg/l Kinetin và
đối với đoạn thân, hiệu quả tạo chồi cao nhất khi mẫu cắt có kích thước 2 mm bổ sung
5mg/l Kinetin. Khi sử dụng BA, chồi tái sinh tốt nhất khi cắt lớp mỏng vảy củ với kích
thước 2 mm, nuôi cấy trên môi trường bổ sung 5 mg/l BA và với đoạn thân, hiệu quả tạo
chồi cao nhất khi mẫu cắt có kích thước 1 mm ở vị trí ngọn có bổ sung 1mg/ BA.
Tóm lại, cùng với sự phát triển công nghệ nuôi cấy mô trên thế giới, những giống
lily dần được phục hồi, gia tăng số lượng loài, giúp bảo quản nguồn giống quý và nhân số
lượng nhiều. Ở nước ta, hoa lily đang được người tiêu dùng ưa chuộng như vẻ đẹp và
hương thơm quyến rũ của loài hoa này. Công nghệ nhân giống lily đã và đang được
14