BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

CHU HUY KIÊN

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG
PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CELECOXIB
TRONG HUYẾT TƯƠNG BẰNG HPLC
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ

HÀ NỘI – 2018


BỘ Y TẾ
TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI

CHU HUY KIÊN
Mã sinh viên: 1301215

NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG
PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CELECOXIB
TRONG HUYẾT TƯƠNG BẰNG HPLC
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ
Người hướng dẫn:
1. TS. Nguyễn Thị Thuận
2. TS. Lê Đình Chi
Nơi thực hiện:
1. Bộ môn Hóa Dược
2. Trung tâm đánh giá tương đương sinh học
(Viện kiểm nghiệm thuốc TW)

HÀ NỘI – 2018


LỜI CẢM ƠN
Để hoàn thành quá trình nghiên cứu và hoàn thiện khóa luận này, lời đầu tiên em xin
gửi lời cảm ơn chân thành, sâu sắc nhất đến TS. Nguyễn Thị Thuận thuộc Bộ môn Hóa
Dược và TS. Lê Đình Chi thuộc bộ môn Hóa phân tích-Độc chất Trường Đại học Dược
Hà Nội – những người đã hướng dẫn và tận tình giúp đỡ em trong suốt quá trình thực
hiện khóa luận này.
Em xin được gửi lời cảm ơn tiếp theo đến ThS. Tạ Mạnh Hùng - Giám đốc Trung
tâm đánh giá tương đương sinh học, chị Phan Thị Nghĩa cùng toàn thế cán bộ công nhân
viên tại Trung tâm đánh giá tương đương sinh học – Viện kiểm nghiệm thuốc Trung
Ương đã tạo điều kiện và giúp đỡ, chỉ bảo em tận tình trong suốt quá trình thực hiện
khóa luận.
Cuối cùng, em xin cảm ơn những người thân, bạn bè đã luôn bên em, động viên em
hoàn thành khóa luận này.
Do thời gian thực hiện cũng như kiến thức của bản thân có hạn, khóa luận này còn
nhiều thiếu sót. Em rất mong nhận được sự góp ý của thầy cô, bạn bè để khóa luận được
hoàn thiện hơn.
Em xin trân trọng cảm ơn!
Hà Nội, ngày 26 tháng 04 năm 2018
Sinh viên

Chu Huy Kiên


MỤC LỤC

ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................... 1
1.1


Tổng quan về celecoxib ........................................................................ 2

1.1.1

Cấu tạo............................................................................................. 2

1.1.2

Tính chất vật lý, hóa học .................................................................. 2

1.1.3

Dược động học, tác dụng dược lý, cơ chế tác dụng .......................... 2

1.1.4

Chỉ định, chống chỉ định .................................................................. 4

1.2

Cơ sở lý thuyết của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ............ 4

1.2.1

Giới thiệu ......................................................................................... 4

1.2.2

Nguyên tắc cấu tạo của hệ thống HPLC ........................................... 4


1.2.3

Nguyên tắc của quá trình sắc ký....................................................... 6

1.2.4

Các đại lượng đặc trưng ................................................................... 6

1.2.5

Định lượng bằng HPLC ................................................................... 8

1.3 Các phương pháp phân tích celecoxib trong huyết tương bằng
HPLC ............................................................................................................. 8
CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............ 12
2.1

Nguyên vật liệu, thiết bị ..................................................................... 12

2.1.1

Đối tượng nghiên cứu: ................................................................... 12

2.1.2

Nguyên vật liệu, dung môi, hóa chất .............................................. 12

2.1.3


Thiết bị, dụng cụ ............................................................................ 12

2.2

Nội dung nghiên cứu .......................................................................... 12

2.3

Phương pháp nghiên cứu ................................................................... 12

2.3.1

Chuẩn bị mẫu phân tích ................................................................. 12

2.3.2

Khảo sát và xây dựng phương pháp ............................................... 14

2.3.3

Thẩm định phương pháp ................................................................ 15

2.4

Ứng dụng thực tế................................................................................ 19

2.5

Phương pháp xử lý kết quả ............................................................... 20


CHƯƠNG 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ..................... 21


3.1

Khảo sát xây dựng phương pháp ...................................................... 21

3.1.1

Các điều kiện cố định..................................................................... 21

3.1.2

Các điều kiện khảo sát ................................................................... 21

3.1.3

Khảo sát quy trình xử lý mẫu ......................................................... 23

3.1.4

Phương pháp chính thức ................................................................ 24

3.2

Thẩm định phương pháp ................................................................... 25

3.2.1

Độ chọn lọc, đặc hiệu..................................................................... 25


3.2.2

Độ phù hợp hệ thống...................................................................... 26

3.2.3

Đường chuẩn và khoảng tuyến tính ................................................ 27

3.2.4

Độ đúng, độ lặp lại......................................................................... 29

3.2.5

Giới hạn định lượng dưới LLOQ ................................................... 31

3.2.6

Độ ổn định ..................................................................................... 31

3.2.7

Nhận xét ........................................................................................ 35

3.3

Ứng dụng thực tế................................................................................ 36

CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................. 39

4.1

Kết luận .............................................................................................. 39

4.2

Kiến nghị ............................................................................................ 39

TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT
Ký hiệu

Chú thích

ADR

Phản ứng bất lợi của thuốc

CELE

Celecoxib

CHCl3

Cloroform

Cl


Hệ số thanh thải thuốc

Cmax

Nồng độ cực đại

COX

Cyclooxygenase

CV%

Độ lệch chuẩn tương đối

DET

Diethylether

FELO

Felodipin

Flow

Tốc độ dòng

HPLC

Sắc ký lỏng hiệu năng cao


HQC

Mẫu kiểm tra nồng độ cao

HT

Huyết tương

IS

Chuẩn nội

K

Hệ số phân bố

k’

Hệ số dung lượng

LC MS/MS

Sắc ký lỏng khối phổ

LLOQ

Giới hạn định lượng dưới

LQC


Mẫu kiểm tra nồng độ thấp

MeCN

Acetonitril

MeOH

Methanol

MQC

Mẫu kiểm tra nồng độ trung bình

NSAIDs

Thuốc giảm đau hạ sốt chống viêm không steroid

NTN

Người tình nguyện

PG

Prostaglandin

QC

Mẫu kiểm tra


r

Hệ số tương quan

Rs

Độ phân giải


SKD

Sinh khả dụng

Spic

Diện tích pic

SOP

Quy trình thao tác chuẩn

TB

Trung bình

TKPT

Tinh khiết phân tích


TLTK

Tài liệu tham khảo

tR

Thời gian lưu

TĐSH

Tương đương sinh học

TW

Trung ương

t1/2

Thời gian bán thải của thuốc

ULOQ

Giới hạn định lượng trên

Vd

Thể tích phân bố của thuốc

WS


Dung dịch làm việc

α

Hệ số chọn lọc


DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1. 1: Một số nghiên cứu định lượng CELE trong HT................................. 8
Bảng 2. 1: Bảng nồng độ các mẫu QC .............................................................. 13
Bảng 2. 2: Cách chuẩn bị đường chuẩn ............................................................ 13
Bảng 2. 3: Cách chuẩn bị mẫu LLOQ............................................................... 14
Bảng 3. 1: Kết quả khảo sát các dung môi chiết ............................................... 24
Bảng 3. 2: Kết quả xác định độ chọn lọc, đặc hiệu ........................................... 26
Bảng 3. 3: Kết quả khảo sát độ phù hợp hệ thống ............................................. 27
Bảng 3. 4: Số liệu khảo sát đường chuẩn (Spic – mAu*s) .................................. 28
Bảng 3. 5: Kết quả xác định hệ số weighting .................................................... 28
Bảng 3. 6: Kết quả khảo sát đường chuẩn......................................................... 29
Bảng 3. 7: Kết quả độ đúng, độ lặp lại trong ngày ............................................ 29
Bảng 3. 8: Kết quả độ đúng, độ lặp lại khác ngày............................................. 30
Bảng 3. 9: Kết quả xác định giới hạn định lượng dưới (LLOQ)........................ 31
Bảng 3. 10: Kết quả độ ổn định dài ngày dung dịch chuẩn gốc CELE ở -400C . 32
Bảng 3. 11: Kết quả độ ổn định dung dịch IS thời gian dài ở nhiệt độ 2-80C .... 32
Bảng 3. 12: Kết quả độ ổn định của mẫu HT sau 3 chu kỳ đông–rã.................. 33
Bảng 3. 13: Kết quả độ ổn định của mẫu HT ở nhiệt độ phòng thời gian ngắn . 33
Bảng 3. 14: Kết quả độ ổn định dài ngày của mẫu HT ở nồng độ LQC ............ 34
Bảng 3. 15: Kết quả độ ổn định dài ngày của mẫu HT ở nồng độ HQC ............ 34
Bảng 3. 16: Kết quả độ ổn định của mẫu sau xử lý trong auto-sampler ............ 35
Bảng 3. 17: Kết quả xây dựng đường chuẩn ..................................................... 36

Bảng 3. 18: Nồng độ CELE trong HT người theo thời gian .............................. 37
Bảng 3. 19: Các kết quả nghiên cứu nồng độ CELE trong HT người trước đó . 38


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Hình 1. 1: Công thức cấu tạo CELE ................................................................... 2
Hình 1. 2: Sơ đồ hệ thống HPLC ........................................................................ 5
Hình 1. 3: Các lực tương tác trong quá trình sắc ký ............................................ 6
Hình 3. 1: Phổ hấp thụ UV của mẫu CELE trong MeOH ................................. 21
Hình 3. 2: Phổ hấp thụ UV của mẫu CELE trong huyết tương ......................... 21
Hình 3. 3: Sắc ký đồ của FELO (a) và hỗn hợp CELE, FELO (b) trong MeOH 22
Hình 3. 4: Sắc ký đồ với pha động MeCN : đệm KH2PO4 pH 4,0 = 80:20 ........ 22
Hình 3. 5: Sắc ký đồ với pha động MeCN : đệm KH2PO4 pH 4,0 = 70:30........ 22
Hình 3. 6: Sắc ký đồ với pha động MeCN : đệm KH2PO4 pH 4,0 = 60:40........ 23
Hình 3. 7: Sắc ký đồ HT trắng có pha IS .......................................................... 25
Hình 3. 8: Sắc ký đồ HT trắng có pha IS và chuẩn CELE ở nồng độ LLOQ.... 25
Hình 3. 9: Sắc ký đồ huyết HT có pha IS và chuẩn CELE ở nồng độ khoảng
giữa đường chuẩn (500 ng/ml) ......................................................................... 26
Hình 3. 10: Đồ thị nồng độ CELE trong HT người theo thời gian .................... 37
1


1

ĐẶT VẤN ĐỀ

Các thuốc chống viêm không steroid (NSAIDs) là một trong những nhóm thuốc được
dùng phổ biển và cũng là nhóm thuốc được kê đơn rộng rãi nhất với hàng chục triệu
người dùng trong một ngày trên toàn thế giới [5]. Tuy vậy, hạn chế lớn nhất của nhóm

thuốc này là tác dụng phụ trên tiêu hóa [1], [2], [5]. Nhiều giải pháp để hạn chế tác dụng
phụ này đã được sử dụng nhưng các giải pháp này đều có những hạn chế nhất định.
Việc tìm ra 2 đồng dạng COX-1 và COX-2 của men COX (cyclooxygenase) tham gia
tổng hợp các protaglandin (PG) từ acid arachidonic đã mở ra hướng mới để khắc phục
tác dụng phụ trên đường tiêu hóa của các NSAIDs. Các thuốc ức chế chọn lọc COX-2
làm giảm PG gây viêm song vẫn duy trì quá trình tổng hợp các PG bảo vệ đường tiêu
hóa, từ đó làm giảm các tác dụng phụ trên đường tiêu hóa [1], [2]. Tuy nhiên, do sự gia
tăng nguy cơ huyết khối và nhồi máu cơ tim [1], một số NSAIDs ức chế chọn lọc COX2 đã bị rút khỏi thị trường. Hiện nay chỉ còn celecoxib, parecoxib, etoricoxib được lưu
hành, trong đó celecoxib được sử dụng rộng rãi nhất [2]. Việt Nam là một nước có khí
hậu nhiệt đới gió mùa; các bệnh thấp khớp, viêm xương khớp…. chiếm tỉ lệ khá cao nên
nhu cầu về các NSAIDs nói chung và celecoxib nói riêng khá lớn.
Để thực hiện được các nghiên cứu đánh giá sinh khả dụng và tương đương sinh học
các thuốc nói chung và celecoxib nói riêng, yêu cầu quan trọng là phải có quy trình phân
tích định lượng thuốc trong dịch sinh học. Trong đó, phương pháp thông dụng nhất là
sử dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Tuy nhiên, ở Việt Nam những nghiên cứu
ứng dụng phương pháp HPLC để định lượng celecoxib trong huyết tương còn hạn chế.
Vì vậy chúng tôi thực hiện đề tài “ Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng
celecoxib trong huyết tương bằng HPLC“ với các nội dung chính sau:
1. Xây dựng phương pháp định lượng celecoxib trong huyết tương.
2. Thẩm định phương pháp vừa xây dựng.
3. Ứng dụng xác định nồng độ celecoxib trong một số mẫu huyết tương người.

1


1

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Tổng quan về celecoxib

1.1.1 Cấu tạo

- Công thức phân tử: C17H14F3N3O2S [13], [16], [20].
- Trọng lượng phân tử: 381,4 g/mol [13], [16], [20].
- Công thức cấu tạo: [13], [16]

Hình 1. 1: Công thức cấu tạo CELE

- Tên khoa học: 4-[5-(4-methylphenyl)-3-(trifluoromethyl)-1H-pyrazol-1-yl]benzensulfonamide [16], [20].
1.1.2 Tính chất vật lý, hóa học

- Cảm quan: Dạng bột kết tinh hoặc vô định hình, màu trắng hoặc vàng nhạt [16].
- Nhiệt độ nóng chảy: khoảng 160°C.
- Độ tan: Celecoxib rất ít tan trong nước (3-7µg/ml; pH = 7,0; 40oC); tan tốt trong
methanol, methylene chloride, cloroform và aceton [16]. Celecoxib ở dạng vô định hình
dễ tan hơn dạng kết tinh.

- pKa: pKa = 11,1; độ tan thay đổi theo pH của môi trường hòa tan.
1.1.3 Dược động học, tác dụng dược lý, cơ chế tác dụng
Dược động học
Hấp thu: Hấp thu nhanh qua đường tiêu hóa [1], [2], [3]. Thức ăn chứa nhiều chất béo
làm tăng thời gian đạt Cmax trong huyết tương (tăng 1-2 giờ so với lúc đói) [3]. Cmax
thường đạt ở 3 giờ sau khi uống một liều duy nhất 200 mg lúc đói và trung bình bằng
705 nanogam/ml [3]. Ở người trên 65 tuổi, Cmax tăng 40-50%.
Phân bố: Vd khoảng 400 lít ( khoảng 7,14 lít/kg), thuốc phân bố nhiều vào mô. Ở
nồng độ điều trị,celecoxib gắn mạnh với protein huyết tương [1], [2], [3], [9].

2



Chuyển hóa: Celecoxib được chuyển hóa chủ yếu ở gan bởi isoenzym CYP 450 2C9
thành các chất chuyển hóa không có hoạt tính dược lý như các thuốc ức chế enzym
COX-1 và COX-2 [1], [2], [3], [9].
Thải trừ: T1/2 trong huyết tương của celecoxib sau khi uống lúc đói là 11 giờ [1], [9]
và hệ số thanh thải (Cl) trong huyết tương khoảng 500 ml/phút [3]. T1/2 của thuốc kéo
dài ở người suy thận là 13,1 giờ và suy gan là 11 giờ hoặc 13,1 giờ [3]. Celecoxib thải
trừ khoảng 27% trong nước tiểu, 57% trong phân, dưới 3% liều được thải trừ không thay
đổi [3], [9].
Phản ứng viêm và vai trò của enzym COX
Viêm là phản ứng tại chỗ của cơ thể do các mô bị kích thích hoặc tổn thương, gồm
4 yếu tố biểu hiện bên ngoài: sưng, nóng, đỏ, đau và gây ra các rối loạn chức năng cơ
thể. Khi bị tổn thương, màng tế bào giải phóng ra phospholipid màng [1]. Dưới tác
dụng của phospholipase A2, chất này bị chuyển thành axit arachidonic [1]. Tiếp theo
đó dưới tác dụng của cyclooxygenase (COX), axit này bị chuyển hóa thành các
prostaglandin [1]. Tác dụng của prostaglandin tùy thuộc vào vị trí tác dụng. Khi được
tạo ra tại nơi viêm, prostaglandin làm tăng tình trạng viêm cục bộ và làm tăng sự mẫn
cảm với đau. Ngược lại, đối với màng nhày của dạ dày và ruột, prostaglandin có tác
dụng bảo vệ và tăng tưới máu màng nhày.
Có 2 loại enzym COX:

- COX-1 có mặt ở hầu hết các mô, thận, dạ dày, nội mạc mạch, tiểu cầu, tử cung, tinh
hoàn… có tác dụng duy trì các hoạt động sinh lý bình thường của tế bào, tham gia vào
quá trình sản xuất các PG sinh lý, tạo chất nhày bảo vệ dạ dày [1], [2].

- COX-2 được phát hiện ra vào năm 1991, enzym này có ở hầu hết các mô với nồng
độ thấp, ở các tế bào tham gia vào phản ứng viêm, có chức năng thúc đẩy quá trình
viêm [1], [2].
Do đó, các thuốc ức chế chọn lọc COX-2 sẽ có tác dụng chống viêm mạnh mà ít gây
tác dụng phụ như: viêm loét dạ dày, tá tràng, xuất huyết dạ dày,… [1], [2].
Tác dụng dược lý của celecoxib:

Celecoxib là 1 thuốc chống viêm không steroid, ức chế COX-2 mạnh hơn COX-1 từ
100 đến 400 lần, có tác dụng chống viêm, giảm đau, hạ sốt [1], [2].
Cơ chế tác dụng: Ức chế tổng hợp prostaglandin, chủ yếu thông qua tác dụng ức chế
COX-2. Celecoxib không ức chế COX-1 với các nồng độ điều trị ở người, nên ít có nguy

3


cơ gây các tác dụng phụ (xuất huyết, viêm loét dạ dày, kéo dài thời gian chảy máu),
nhưng có thể gây các tác dụng phụ ở thận tương tự như các NSAIDs khác. Celecoxib có
thể làm tăng nguy cơ huyết khối mạch máu ở một số bệnh nhân vì ức chế tổng hợp PG
(một chất kháng huyết khối) và không tác động đến thromboxan A2 (một chất dễ gây
huyết khối) [3].

1.1.3.1 Tác dụng không mong muốn
ADR của celecoxib ở liều thường dùng nói chung nhẹ và có liên quan chủ yếu đến
đường tiêu hóa. Một số phản ứng phụ thường gặp là nhức đầu, rối loạn tiêu hóa, choáng
váng, viêm ruột, viêm dạ dày, dị ứng, thiếu máu, viêm phế quản, viêm gan, vàng da;
hiếm hơn có thể phù mạch, sốc phản vệ [3].
ADR khiến phải ngừng dùng thuốc nhiều nhất gồm: khó tiêu, đau bụng [3].
1.1.4 Chỉ định, chống chỉ định
Chỉ định: Điều trị triệu chứng thoái hóa khớp ở người lớn, viêm khớp dạng thấp ở
người lớn, đau cấp (cả đau sau phẫu thuật, nhổ răng), thống kinh nguyên phát. Điều trị
bổ trợ để làm giảm số lượng polyp trong liệu pháp thông thường điều trị bệnh polyp
dạng tuyến đại – trực tràng có tính gia đình [2], [3].
Chống chỉ định: Mẫn cảm với celecoxib. Viêm loét dạ dày tá tràng tiến triển hoặc
xuất huyết tràng vị. Suy gan, thận nặng. Suy tim phù nề nặng [2], [3].
1.2 Cơ sở lý thuyết của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
1.2.1 Giới thiệu
Sắc ký là quá trình tách dựa trên sự phân bố liên tục của các chất phân tích lên hai

pha: một pha thường đứng yên có khả năng hấp phụ chất phân tích gọi là pha tĩnh, một
pha di chuyển qua pha tĩnh gọi là pha động. Sắc ký lỏng hiệu năng cao là một kỹ thuật
tách trong đó các chất phân tích di chuyển qua cột chứa các hạt pha tĩnh [4].
Mẫu phân tích hòa tan trong pha động được đưa vào cột, các thành phần trong mẫu
sẽ bị pha tĩnh giữ lại. Cho pha động liên tục chảy qua cột, các thành phần đó sẽ di chuyển
trên cột theo pha động với các tốc độ khác nhau và được tách ra khỏi nhau tùy thuộc vào
lực tương tác giữa pha tĩnh - pha động và chất tan [4].
1.2.2 Nguyên tắc cấu tạo của hệ thống HPLC
Hệ thống HPLC bao gồm các bộ phận chính sau đây:
Bộ phận cấp pha động: Thường gồm các dung môi được chứa trong các bình kín
riêng biệt. Các dung môi cần được lọc và đuổi khí trước khi bơm vào cột. Pha động có

4


thể là hỗn hợp nhiều dung môi và có 2 cách dùng pha động rửa giải là đẳng dòng (thành
phần pha động không đổi trong quá trình sắc ký) và gradient (thành phần pha động thay
đổi theo chương trình đã định) [4].
Bơm: Để bơm pha động vào cột phân tích. Bơm phải có khả năng hoạt động ở áp
suất đầu vào khoảng 5000 psi trở lên, đảm bảo lưu lượng lặp lại trong khoảng 0,01 ÷ 5,0
ml/phút và phải chịu được tác động của nhiều loại dung môi (không bị ăn mòn) [4].
Hệ tiêm mẫu:
Để tiêm mẫu phân tích vào cột phân tích trong quá trình sắc ký [4].
Cột phân tích: Cột phân tích là cột chứa pha tĩnh, là một trong những yếu tố quyết
định hiệu quả sự tách sắc ký của một hỗn hợp chất mẫu. Cột phân tích có nhiều cỡ khác
nhau, tuỳ thuộc vào mức độ sắc ký. Cột bảo vệ dùng để loại một số thành phần trong
pha động và trong mẫu phân tích có thể làm giảm tuổi thọ của cột sắc ký [4].
Detector: Dùng để phát hiện chất phân tích dựa vào đáp ứng chọn lọc với chất phân
tích khi hấp thụ bức xạ UV hoặc huỳnh quang. Detector cần đáp ứng nhanh và lặp lại,
độ nhạy cao, ổn định, khoảng hoạt động tuyến tính rộng [4].

Tuỳ theo chất phân tích mà chọn loại detector phù hợp để đạt độ nhạy cao khi phát
hiện và định lượng. Trong đó, detector hấp thụ phân tử vùng phổ UV hay UV-VIS được
dùng phổ biến nhất vì thích hợp cho nhiều loại chất và không quá đắt.
Hệ thống thu nhận và xử lý số liệu: Thường là hệ thống máy tính điện tử cài đặt
phần mềm nhận tín hiệu, xử lý số liệu và điều khiển toàn bộ hệ thống, có thể kèm theo
thiết bị in dữ liệu.

Hình 1. 2: Sơ đồ hệ thống HPLC

5


1.2.3 Nguyên tắc của quá trình sắc ký
Trong quá trình sắc ký các phân tử chất tan luôn phân bố qua lại giữa hai pha trong
khi pha động luôn chảy qua cột tách với một tốc độ nhất định. Mặt khác, do cấu trúc và
tính chất của mỗi phân tử chất tan là khác nhau nên tốc độ dịch chuyển trung bình của
mỗi chất tan cũng khác nhau trong quá trình di chuyển từ đầu cột đến cuối cột sắc ký.
Khi ở trong pha động, phân tử chất tan dịch chuyển theo tốc độ của pha động; khi ở
trong pha tĩnh, phân tử chất tan bị giữ lại. Như vậy sẽ có một thời gian nhất định chất
tan bị lưu giữ lại trong cột sắc ký.
Vì vậy, trong quá trình sắc ký, có chất bị lưu giữ lâu trên cột, có chất tan ít bị lưu giữ.
Quyết định hiệu quả của sự tách sắc ký ở đây là tổng của các mối tương tác: giữa chất
phân tích và pha tĩnh (F1), giữa chất phân tích và pha động (F2), giữa pha tĩnh và pha
động (F3).

chất
phân tích
F1

F2


pha tĩnh

pha động
F3

Hình 1. 3: Các lực tương tác trong quá trình sắc ký
Tổng của 3 tương tác này sẽ quyết định chất nào được rửa giải ra khỏi cột trước. Đối
với mỗi chất, sự lưu giữ được quy định bởi ba lực F1, F2, F3. Trong đó F1 và F2 giữ vai
trò quyết định, còn F3 là yếu tố ảnh hưởng không lớn. Ở đây F 1 là lực giữ chất phân tích
trên cột, F2 là lực kéo của pha động đối với chất phân tích ra khỏi cột. Như vậy với các
chất khác nhau thì F1 và F2 là khác nhau. Kết quả là các chất khác nhau sẽ di chuyển
trong cột với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau khi ra khỏi cột [4].
1.2.4 Các đại lượng đặc trưng
Thời gian lưu (tR)
Các chất tan trong hỗn hợp mẫu phân tích, khi được nạp vào cột phân tích sẽ bị lưu
giữ ở trong cột (pha tĩnh) theo một thời gian nhất định. Thời gian lưu là thời gian tính
từ lúc bắt đầu bơm mẫu vào cột cho tới khi pic đạt giá trị cực đại [4].
Ý nghĩa: Chủ yếu dùng để định tính.

6


Hệ số phân bố (K)
Tốc độ di chuyển chất tan qua pha tĩnh được xác định bởi hệ số phân bố K [4]:
K = CS / CM
Với CM , CS lần lượt là nồng độ mol chất tan trong pha động và pha tĩnh.
Ý nghĩa: K càng lớn, chất tan di chuyển pha tĩnh càng chậm. Các chất trong hỗn hợp
có hệ số K khác nhau càng nhiều càng dễ tách nhau [4].
Hệ số dung lượng (k’)

Hệ số dung lượng k’ cho ta biết tỷ số khối lượng của chất tan i phân bố vào trong mỗi
pha là bao nhiêu [4].
k’ = ( CS.VS)/(CM.VM)
k’ = K.VS/VM
Trong đó: VS, VM là thế tích pha tĩnh và pha động.
Ý nghĩa: Nếu hệ số k’ << 1 quá trình rửa giải diễn ra quá nhanh, khó xác định chính
xác thời gian lưu. Nếu hệ số k’ quá lớn, quá trình rửa giải diễn ra quá dài.
Giá trị tối ưu: Nên chọn điều kiện sắc ký để k’ dao động từ 1 đến 5 [4].
Hệ số chọn lọc (α)
Hệ số chọn lọc α đặc trưng cho tốc độ di chuyển tỷ đối của 2 chất A và B [4]:
α = KB / KA
Trong đó: KA, KB là hệ số phân bố 2 chất A, B (theo quy ước, KB > KA ).
Ý nghĩa: Điều kiện cần thiết để hai chất A, B tách khỏi nhau là α > 1. Tuy nhiên nếu
α lớn quá, thời gian phân tích sẽ kéo dài [4].
Giá trị tối ưu: α dao động trong khoảng từ 1,05 đến 2 [4].
Độ phân giải (Rs)
Độ phân giải nói lên mức độ tách các cấu tử khỏi nhau trong một phép sắc ký. Hai
cấu tử A và B được tách khỏi nhau càng triệt để khi độ phân giải càng cao. Độ phân giải
của 2 pic chất A và B được tính theo công thức sau [4]:
R =

[(t ) − (t ) ]
1
(W + W )
2

Trong đó: (tR)A, (tR)B là thời gian lưu của 2 chất A, B.
WA, WB là độ rộng pic chất A, B.

7



Ý nghĩa: RS càng lớn, 2 pic chất càng tách xa nhau. Nhưng nếu RS quá lớn, quá trình
phân tích sẽ kéo dài. Điều kiện để 2 pic chất tách rõ nhau trên sắc ký đồ là R S ≥ 1,3 [4].
1.2.5 Định lượng bằng HPLC
Phương trình cơ bản để định lượng
Trong kỹ thuật HPLC, để định lượng một chất, người ta dựa theo hai phương trình
cơ bản sau đây về mối quan hệ giữa pic sắc ký (diện tích hoặc chiều cao) của chất với
nồng độ C của chúng được bơm vào cột phân tích.
H = a.C + b
S = a.C+ b
Trong đó:
H : Chiều cao pic sắc ký của chất.
S : Diện tích pic sắc ký của chất.
Để phân tích định lượng các chất theo kỹ thuật HPLC, chúng ta có thể dùng một trong
hai phương pháp chuẩn hoá là phương pháp đường chuẩn và phương pháp thêm chuẩn.
Việc lựa chọn phương pháp nào là tuỳ thuộc vào loại mẫu phân tích và hàm lượng chất
phân tích.
1.3 Các phương pháp phân tích celecoxib trong huyết tương bằng HPLC
Bảng 1. 1: Một số nghiên cứu định lượng CELE trong HT
TLTK

Phương pháp
phân tích

Điều kiện sắc ký
(cột, pha động, IS, detector …)

Xử lý mẫu


Cột: Nucleosil-NO2 (150 x 4,6mm; 5µm)
Pha động:
Hexan : CH2Cl2 : isopropyl alcohol = 70:25:5
[18]

HPLC-UV

Chiết pha rắn

Flow: 1,4 ml/phút
Detector: UV 260 nm
IS: Chất có cấu trúc tương tự CELE
Cột: Prontosil C18 AQ (150 x 3mm, 3µm)
Pha động: H2O : MeCN = 40:60

[19]

HPLC-FL

Flow: 0,35 ml/phút
Detector: Huỳnh quang (bước sóng kích thích
240nm, bước sóng phát xạ 380 nm)

8

Chiết lỏng - lỏng
bằng chloroform


IS: 4-[5-phenyl-3-(trifluoromethyl)-1Hpyrazol-1-yl]benzene-sulfonamide

Cột: Nucleosil CN (250mm × 4,6mm; 5µm)
Pha động: MeCN : H2O = 60:40
[12]

HPLC-UV

Flow: 0,9 ml/phút

Chiết lỏng - lỏng
bằng cloroform

IS: flutamide
Detector: UV 260nm
Cột: Aqua C18 (5µm; 75mm x 4,6mm)
Pha động:
[22]

HPLC-UV

MeCN : đệm KH2PO4 (pH 3,5) = 50:50

Tủa protein bằng

Flow: 1ml/phút

MeCN

Detector: UV 254nm
IS không có
Cột: RP-18e (100mm x 4,6mm)

Pha động: MeCN : MeOH : H2O = 45:10:45
[21]

HPLC-UV

Flow: 2 ml/phút

Tủa tạp bằng MeCN
và NaCl

Detector: UV 254nm
IS: acid mefenamic
Cột: C18 µ-Bondapak (250 × 3,9mm)

[10]

HPLC-UV

Pha động:

Chiết lỏng lỏng bằng

Đệm KH2PO4 (pH 4,0) : MeCN = 60:40

hỗn hợp dung môi n-

Flow: 1,5 ml/phút

hexan : isoamyl


Detector: UV 260nm

alcol = 97 : 3

IS: flutamide
Cột: C18 (55mm x 2mm; 3µm)
Pha động: MeOH : Đệm CH3COONH4 =
[17]

LC–MS/MS

75:25

Tủa tạp bằng dung

IS: celecoxib-D4

dịch IS trong MeOH

Flow: 0,2 ml/phút
Detector: UV 254nm

9


Cột: Luna HILIC (50mm x 2,0 mm; 3µm)
[15]

LC-MS/MS


Pha động:

chiết lỏng lỏng bằng

Đệm HCOONH4 (pH 3,0) : MeOH = 5:95

methyl tert-butyl

Flow: 0,2 ml/phút

ether

IS: artorvastatin calcium
Cột: Hypersil BDS C18 (250 x 4,6mm; 5µm)
Pha động MeOH : H2O = 75:25
[14]

HPLC-UV

Flow: 1,25 ml/phút
Detector: UV 250nm
IS không có
Cột: Phenomenex LUNA RP-18, 250 x 4,6
mm; 5 µm.
Pha động: MeOH : MeCN : H2O = 12:45:43

[6]

HPLC-UV


điều chình pH bằng CH3COOH tới 3,5.
Flow: 2 ml/phút.
Detector: UV 254nm

Chiết lỏng lỏng bằng
hỗn hợp dung môi nhexan : isopropanol
= 97 : 3

IS: acid mefenamic.
Nhận xét:
Các nghiên cứu trên sử dụng 2 phương pháp chiết là chiết pha rắn và phương pháp
chiết lỏng - lỏng. Phương pháp chiết pha rắn để xử lý mẫu cho hiệu quả cao nhưng việc
xử lý mẫu này tốn kém và phức tạp. Phương pháp chiết lỏng - lỏng tuy hiệu quả không
cao bằng nhưng phù hợp với điều kiện thực nghiệm của cơ sở nghiên cứu nên chúng tôi
sẽ áp dụng phương pháp này để tiến hành nghiên cứu của mình.
Hầu hết các nghiên cứu đều sử dụng cột C18 nên chúng tôi quyết định lựa chọn loại
cột này để tiến hành nghiên cứu của mình.
Các nghiên cứu sử dụng pha động gồm MeOH (hoặc MeCN) với H2O (hoặc đệm).
Trong đó, MeCN là dung môi được ưa chuộng hơn MeOH do nền mẫu thấp (hấp thu
UV kém), cho phép việc phân tích diễn ra ở áp suất thấp (ít ảnh hưởng đến độ bền cột).
pKa =11,1; pH pha động sẽ ảnh hưởng đến trạng thái phân ly của celecoxib và ảnh
hưởng đến thời gian lưu; vì vậy cần sử dụng đệm trong thành phần pha động để đảm

10


bảo độ lặp lại của phép phân tích. Vì vậy, chúng tôi quyết định chọn pha động gồm
MeCN, đệm KH2PO4 (pH = 4,0) để tiến hành phân tích Celecoxib trong huyết tương.

11



2

CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nguyên vật liệu, thiết bị
2.1.1 Đối tượng nghiên cứu:
Đối tượng nghiên cứu là Celecoxib trong huyết tương.
2.1.2 Nguyên vật liệu, dung môi, hóa chất
Chất chuẩn:
Celecoxib (QT138031210 - Hàm lượng 99,55% - Độ ẩm 0,04%)
Nơi sản xuất: Viện kiểm nghiệm thuốc Tp.Hồ Chí Minh.
Felodipin (01052006 - Hàm lượng 99,30% - Độ ẩm 0,06%).
Dung môi HPLC: Acetonitril, Methanol
Hóa chất TKPT: Kali dihydrophosphat, Chloroform, Dimethylether
Huyết tương trắng: Máu NTN từ viện huyết học - truyền máu TW đã thêm chất
chống đông, đem ly tâm tách lấy HT và bảo quản trong tủ lạnh sâu -40°C.
2.1.3 Thiết bị, dụng cụ
Các thiết bị, dụng cụ sử dụng: Cân phân tích, cân kỹ thuật, máy ly tâm lạnh, máy lắc
xoáy, tủ lạnh sâu -400C, micropipet, ống ly tâm 10ml, đầu tip cho micropipet, bình định
mức, pipet class A.
Thiết bị phân tích: Hệ thống HPLC Shimadzu LC 20A.
2.2 Nội dung nghiên cứu

- Khảo sát các điều kiện để xây dựng quy trình định lượng Celecoxib trong huyết tương
trên thiết bị HPLC (quy trình xử lý mẫu, điều kiện sắc ký).

- Thẩm định phương pháp vừa xây dựng.
- Ứng dụng xác định nồng độ celecoxib trong một số mẫu huyết tương của người tính

nguyện.
2.3 Phương pháp nghiên cứu
2.3.1 Chuẩn bị mẫu phân tích
Chuẩn bị các dung dịch chuẩn

- Dung dịch chuẩn gốc CELE: Cân chính xác khoảng 50,0 mg; hòa tan trong 50 ml
MeOH thu được dung dịch chuẩn gốc có nồng độ CELE chính xác khoảng 1000 g/ml.
Dung dịch chuẩn làm việc: Hút 1 ml dung dịch chuẩn gốc, pha loãng bằng MeOH
đến vừa đủ 100 ml thu được dung dịch CELE có nồng độ 10 g/ml. Hút 1 ml dung dịch

12


CELE 10 g/ml đem cô đến cắn dưới dòng khí N2 rồi thêm 10,0 ml huyết tương thu
được dung dịch CELE trong huyết tương có nồng độ 1 g/ml (1000ng/ml) (dung dịch
chuẩn làm việc - WS).

- Dung dịch chuẩn nội gốc Felodipin (IS): Cân chính xác khoảng 25,0 mg chất chuẩn
Felodipin; hòa tan trong 100 ml MeOH thu được dung dịch chuẩn nội gốc có nồng độ
IS chính xác khoảng 250 g/ml.
Dung dịch chuẩn nội làm việc: Hút 1ml dung dịch chuẩn nội gốc, thêm hỗn hợp dung
môi MeOH : H2O (1 : 1) định mức đến 10ml để thu được dung dịch chuẩn nội làm việc
có nồng độ IS chính xác khoảng 25 g/ml.

- Dung dich chuẩn QC: Tiến hành tương tự như pha chế dung dịch chuẩn gốc CELE
thu được dung dịch chuẩn gốc QC có nồng độ 1000 g/ml và dung dịch chuẩn QC làm
việc có nồng độ 1 g/ml (1000ng/ml). Từ dung dịch chuẩn QC làm việc pha thành 3
dung dịch QC có nồng độ tương ứng với LQC, MQC, HQC.
Bảng 2. 1: Bảng nồng độ các mẫu QC
Mẫu QC


Mã

Khoảng nồng độ

Mẫu kiểm tra nồng độ thấp

LQC

≤ 3 x LLOQ

Mẫu kiểm tra nồng độ
trung bình

Vws

VHT trắng

(ng/ml)

(µl)

(µl)

60

60

940


400

400

600

800

800

200

Gần điểm giữa của

MQC

Mẫu kiểm tra nồng độ cao

Giá trị

đường chuẩn

HQC

70 – 80 % ULOQ

Chuẩn bị các mẫu đường chuẩn:
Các mẫu đường chuẩn gồm 1 mẫu HT trắng (blank), 1 mẫu HT trắng có pha IS (zero)
và 7 mẫu huyết tương có pha chuẩn CELE và IS.
Bảng 2. 2: Cách chuẩn bị đường chuẩn

Nồng độ

Blank

Zero

20

50

100

200

500

700

1000

V HT trắng (µl)

1000

1000

980

950


900

800

500

300

0

VWS (µl)

-

-

20

50

100

200

500

700

1000


(ng/ml)

Mẫu đường chuẩn và mẫu QC được chuẩn bị từ các dung dịch chuẩn gốc độc lập.

13


Chuẩn bị mẫu LLOQ
Bảng 2. 3: Cách chuẩn bị mẫu LLOQ
QC

Nồng độ (ng/ml)

VWS (µl)

V HT trắng (µl)

LLOQ

20

20

980

Chuẩn bị mẫu huyết tương thử: Mẫu huyết tương để rã đông ở nhiệt độ phòng.
Sau đó được xử lý theo quy trình xử lý mẫu để tiêm sắc ký.
2.3.2 Khảo sát và xây dựng phương pháp
Tham khảo các tài liệu, chúng tôi lựa chọn các điều kiện cố định sau:


- Cột sắc ký: Rp 18, 250 x 4 mm, 5 µm.
- Cột bảo vệ: Rp 18, 4 x 3 mm, 5 µm.
- Thành phần pha động: MeCN và đệm KH2PO4 (pH = 4,0).
Cách pha đệm KH2PO4 pH 4,0: cân 1,36 g KH2PO4 hòa vào 800 ml H2O. Thêm 400
µl triethylamin. Điều chỉnh bằng H3PO4 đến pH 4,0. Bổ sung H2O cho đủ 1000 ml.

- Thể tích tiêm: 50 µl
Các điều kiện khảo sát

- Chuẩn nội.
- Bước sóng phát hiện.
- Tỷ lệ pha động: khảo sát pha động MeCN : đệm KH2PO4 (pH 4,0) với các tỷ lệ
khác nhau (MeCN : đệm KH2PO4 pH 4,0 = 60:40; 70:30; 80:20).
Khảo sát quy trình xử lý mẫu
Dựa trên kinh nghiệm xử lý mẫu huyết tương với các chế phẩm khác tại cơ sở nghiên
cứu, chúng tôi tiến hành xử lý mẫu theo phương pháp chiết lỏng – lỏng với quy trình
tổng quát như sau:
Hút 1 ml dung dịch chuẩn làm việc trong huyết tương. Thêm 0,1 ml IS, lắc xoáy 5s.
Thêm 0,5 ml NH4OH 0,1M. Lắc xoáy 15s. Thêm 6,5 ml dung môi chiết thích hợp, lắc
cơ học ngang 5 phút. Ly tâm 3000 vòng/phút, trong 5 phút. Hút lấy lớp dung môi đem
cô dưới dòng khí N2. Hòa cắn trong 0,5 ml pha động (lắc xoáy 1 phút). Cho vào vial,
tiêm sắc ký.
Tham khảo các tài liệu [11], [18] chúng tôi chọn các hỗn hợp dung môi sau để khảo
sát: DET, DET : CHCl3 (các tỷ lệ 8 : 2, 7 : 3, 6 : 4, 5 : 5), CHCl3.

14


2.3.3 Thẩm định phương pháp
Chúng tôi tiến hành thẩm định phương pháp theo hướng dẫn của FDA-Mỹ [11] và

tham khảo SOP “Thẩm định phương pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học bằng
HPLC” [7] lưu hành tại Viện kiểm nghiệm thuốc TW với các chỉ tiêu:

- Độ chọn lọc/đặc hiệu của phương pháp.
- Độ phù hợp hệ thống
- Đường chuẩn và khoảng tuyến tính.
- Độ đúng, độ lặp lại.
- Giới hạn định lượng dưới ( LLOQ).
- Độ ổn định của mẫu phân tích bao gồm:
o Độ ổn định dài ngày của dung dịch chuẩn gốc và chuẩn nội
o Độ ổn định của mẫu huyết tương sau 3 chu kỳ đông – rã đông.
o Độ ổn định của mẫu huyết tương ở nhiệt độ phòng trong thời gian ngắn.
o Độ ổn định của mẫu huyết tương dài ngày.
o Độ ổn định của mẫu sau xử lý (trong auto-sampler).

2.3.3.1 Độ chọn lọc, đặc hiệu của phương pháp
Độ chọn lọc là khả năng của một phương pháp phân tích có thể nhận biết và định
lượng được chất phân tích, phân biệt với các chất khác có trong mẫu.
Tiến hành: Phân tích sắc ký các mẫu:
Huyết tương trắng với ít nhất 6 mẫu có nguồn gốc khác nhau.
Huyết tương trắng có pha chuẩn nội (IS).
Huyết tương trắng có pha chuẩn CELE ở nồng độ LLOQ (20 ng/ml) và IS.
Ghi lại sắc ký đồ [11], [7].
Yêu cầu: Phương pháp được coi là có tính chọn lọc khi:
Pic của CELE phải được nhận diện rõ ràng, tách hoàn toàn khỏi các pic tạp có trong mẫu.
Đáp ứng của mẫu trắng tại thời điểm trùng với thời gian lưu của CELE không được
vượt quá 20% đáp ứng của CELE ở nồng độ LLOQ.
Đáp ứng của mẫu trắng tại thời điểm trùng với thời gian lưu của IS không được vượt
quá 5% đáp ứng của IS [7].


15


2.3.3.2 Độ phù hợp hệ thống
Tiến hành: Phân tích sắc ký lặp lại 6 lần mẫu dung dịch hỗn hợp CELE (nồng độ ở
khoảng giữa đường chuẩn) và IS và xử lý theo quy trình. Ghi lại sắc ký đồ. Đánh giá
tính thích hợp của hệ thống về thời gian lưu và diện tích pic của các chất phân tích và
chuẩn nội [7].
Yêu cầu:
Thời gian lưu của CELE và IS: CV% ≤ 1,0%.
Đáp ứng của CELE và IS: CV% ≤ 2,0%.
Tỷ lệ đáp ứng CELE/IS: CV% ≤ 2,0% [7].

2.3.3.3 Đường chuẩn và khoảng tuyến tính
Mối quan hệ giữa tỷ số diện tích pic CELE/IS với nồng độ của CELE được đánh giá
bằng phương pháp bình phương tối thiểu và được biểu hiện qua phương trình hồi quy
tuyến tính. Khoảng tuyến tính là khoảng nồng độ từ thấp nhất đến cao nhất trong một
đường chuẩn có đáp ứng tuyến tính. Để thiết lập mối tương quan giữa nồng độ của chất
chuẩn với đáp ứng của thiết bị phân tích, số lượng điểm chuẩn phải đủ lớn (gồm một
mẫu trắng,một mẫu trắng có chuẩn nội và 6 - 8 mẫu chuẩn) và khoảng nồng độ khảo sát
phải bao hàm được khoảng nồng độ có thể đạt được trong quá trình phân tích mẫu (từ
1/10 – 1/30 Cmax đến 2 Cmax).
Đường chuẩn nên là đường đơn giản nhất mô tả chính xác mỗi quan hệ giữa nồng độ
và đáp ứng đo được. Khi phân tích dịch sinh học, khoảng nồng độ chất phân tích thường
rộng và trải dài trên nhiều khoảng tuyến tính khác nhau. Một đường hồi quy tuyến tính
không sử dụng hệ số weighting sẽ tạo ra sai số lớn vì mô hình này giả định SD tương
đương nhau trên toàn bộ phạm vi của các mẫu. Trong một đường cong hiệu chuẩn điển
hình, phương sai (SD2) tăng khi tăng nồng độ. Giải pháp để nâng cao độ chính xác cho
các dung dịch chuẩn có nồng độ thấp nhất là sử dụng hệ số weighting. Sử dụng hệ số
weighting phù hợp nhất (1; 1/x; 1/x1/2 hoặc 1/x2) nếu cần để phản ánh tốt nhất tương

quan giữa đáp ứng pic và nồng độ [7].
Cách xác định hệ số weighting:

- Dùng F-test để kiểm tra sự đồng nhất của tập hợp kết quả thu được.
- Tại hai mức nồng độ LLOQ, ULOQ tính toán độ biến thiên các giá trị về tỷ lệ đáp
ứng pic CELE/IS.

16