BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

TRẦN THỊ QUỲNH MAI

TIẾP TỤC NGHIÊN CỨU
THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ MỘT SỐ
TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA CÂY
MUỒNG LÙN (CHAMAECRISTA
PUMILA (LAM.) K.LARSEN)

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ

HÀ NỘI – 2018


BỘ Y TẾ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC DƢỢC HÀ NỘI

TRẦN THỊ QUỲNH MAI
Mã sinh viên: 1301269

TIẾP TỤC NGHIÊN CỨU
THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ MỘT SỐ
TÁC DỤNG SINH HỌC CỦA CÂY
MUỒNG LÙN (CHAMAECRISTA
PUMILA (LAM.) K.LARSEN)
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƢỢC SĨ
Người hướng dẫn khoa học:
1. PGS. TS. Nguyễn Mạnh Tuyển
2. HVCH. Lê Minh Hằng

Nơi thực hiện:
1. Bộ môn Dƣợc học cổ truyền
2. Viện Hóa sinh biển – Viện Hàn lâm
Khoa học và Công nghệ Việt Nam

HÀ NỘI – 2018


LỜI CẢM ƠN

Lời đầu tiên em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới PGS.TS.
Nguyễn Mạnh Tuyển và DS. Lê Minh Hằng – HVCH 21, người đã hướng dẫn, hết
lòng truyền đạt những kiến thức quý báu và luôn tạo điều kiện tốt nhất để em có thể
hoàn thành khóa luận của mình.
Trong quá trình thực hiện đề tài, em cũng vô cùng biết ơn sự giúp đỡ nhiệt tình
của NCS. Phạm Thanh Bình cùng các anh chị đang công tác tại Phòng Hoạt chất sinh
học – Viện Hóa sinh biển – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Ngoài
ra, em cũng muốn gửi lời cảm ơn tới ThS.NCS. Vũ Thanh Bình và các thầy giáo, cô
giáo, các kĩ thuật viên đang giảng dạy và công tác tại Bộ môn Dược học cổ truyền nói
riêng và trường Đại học Dược Hà Nội nói chung. Một lần nữa, em xin chân thành cảm
ơn sự giúp đỡ của các thầy cô giáo và các anh chị.
Cuối cùng, em xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bạn bè, những người đã luôn bên
cạnh tạo điều kiện, động viên và khích lệ em trong suốt thời gian qua.

Hà nội, ngày 16 tháng 05 năm 2018
Sinh viên
Trần Thị Quỳnh Mai


MỤC LỤC


DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
DANH MỤC CÁC BẢNG
DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ
ĐẶT VẤN ĐỀ ............................................................................................................. 1
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN ...................................................................................... 2
1.1. Chi Cassia ......................................................................................................... 2
1.1.1. Vị trí phân loại ........................................................................................... 2
1.1.2. Đặc điểm thực vật và phân bố ................................................................... 2
1.1.3. Thành phần hóa học ................................................................................... 2
1.1.4. Tác dụng dược lí ........................................................................................ 4
1.2. Cây Muồng lùn (Chamaecrista pumila Lam.) ................................................. 6
1.2.1. Đặc điểm thực vật và phân bố .................................................................... 6
1.2.2. Thành phần hóa học ................................................................................... 7
1.2.3. Tác dụng dược lí .......................................................................................10
CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................... 12
2.1. Đối tƣợng nghiên cứu .................................................................................... 12
2.1.1. Nguyên liệu nghiên cứu ............................................................................12
2.1.2. Dụng cụ, hóa chất nghiên cứu. ..................................................................12
2.2. Nội dung nghiên cứu ...................................................................................... 13
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu .............................................................................. 13
2.3.1. Phương pháp chiết xuất và phân lập các hợp chất ......................................13
2.3.2. Phương pháp thử hoạt tính sinh học ..........................................................16
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ................................................................ 21
3.1. Kết quả nghiên cứu thành phần hóa học ...................................................... 21
3.1.1. Chiết xuất và phân lập ...............................................................................21
3.1.2. Nhận dạng cấu trúc các hợp chất phân lập được ........................................25
3.2. Kết quả thử hoạt tính sinh học ...................................................................... 30
3.2.1. Kết quả sàng lọc tác dụng chống viêm và khả năng gây độc tế bào ...........30
3.2.2. Kết quả sàng lọc tác dụng chống oxy hóa ..................................................31

CHƢƠNG 4. BÀN LUẬN........................................................................................ 32


4.1. Về thành phần hóa học .................................................................................. 32
4.2. Về tác dụng sinh học ...................................................................................... 34
CHƢƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ........................................................... 36
TÀI LIỆU THAM KHẢO
PHỤ LỤC


DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT
Kí hiệu

Giải thích

CC

Column chromatopraphy (Sắc kí cột)

d

Doublet

DCM

Dicholoromethane

dd

Double of doublet


DEPT

Distortionless Enhancement by Polarization Transfer

DMEM

Dulbecco's Modified Eagle's Medium

DMSO

Dimethyl sulfoxid

DPPH

1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl

dw

dry weight (khối lượng khô)

EtOAc

Ethyl acetat

FBS

Fetal bovine serum

HSQC


Heteronuclear Spectroscopy- Quantum Coherence

IC50

Inhibitory concentration 50% (nồng độ tối thiểu ức chế 50%)

LPS

Lipopolysacharide

MIC

Minimum Inhibitory Concentration (Nồng độ ức chế tối thiểu)

MS

Mass spectrometry (Phổ khối)

MTT

3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide

NMR

Nuclear Magnetic Resonance (Phổ cộng hưởng từ hạt nhân)

OD

Optical density (Độ hấp thụ)


PBS

Phosphate buffer saline

s

Singlet

TLC

Sắc kí lớp mỏng

TLTK

Tài liệu tham khảo

v/v

Thể tích/ thể tích


DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1. Thành phần hóa học của một số loài thuộc chi Cassia.................................. 3
Bảng 1.2. Hàm lượng (mg/g dw) một số nhóm chất trong loài Chamaecrista pumila ... 7
Bảng 1.3. Định tính một số hợp chất ở các phân đoạn của loài Chamaecrista pumila .. 8
Bảng 3.1. Dữ liệu phổ của chất TB3.5 và luteolin theo tài liệu tham khảo .................. 25
Bảng 3.2. Dữ liệu phổ của chất TB11.5 và piceatannol theo tài liệu tham khảo .......... 28
Bảng 3.3. Kết quả sàng lọc hoạt tính ức chế sản sinh NO trên tế bào RAW264.7 của

cao Muồng lùn .......................................................................................... 30
Bảng 3.4. Giá trị ức chế 50% sự sản sinh NO của cao Muồng lùn .............................. 30
Bảng 3.5. Kết quả sàng lọc tác dụng dọn gốc tự do DPPH của cao Muồng lùn .......... 31
Bảng 3.6. Giá trị ức chế 50% gốc tự do DPPH của cao Muồng lùn ............................ 31


DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ

Hình 2.1. Sơ đồ chiết xuất dược liệu Muồng lùn ........................................................ 14
Hình 3.1. Sơ đồ chiết xuất các phân đoạn phần trên mặt đất cây Muồng lùn .............. 22
Hình 3.2. Sơ đồ phân lập các hợp chất từ phân đoạn ethyl acetat cây Muồng lùn ....... 23
Hình 3.3. Sắc kí đồ của 2 chất TB3.5 và TB11.5 với hệ dung môi dichloromethane :
methanol (12:1)......................................................................................... 24
Hình 3.4. Hợp chất TB3.5 .......................................................................................... 25
Hình 3.5. Công thức cấu tạo của luteolin ................................................................... 27
Hình 3.6. Hợp chất TB11.5 ........................................................................................ 27
Hình 3.7. Công thức cấu tạo của piceatannol ............................................................. 29


ĐẶT VẤN ĐỀ

Được thiên nhiên ưu đãi nên Việt Nam có nguồn thực vật vô cùng phong phú và
đa dạng, nhất là cây làm thuốc. Từ ngàn đời nay, ông cha ta đã biết dùng cây cỏ từ
thiên nhiên để phòng bệnh cũng như chữa bệnh. Nguồn cây thuốc ở nước ta đã có một
vai trò quan trọng trong việc cung cấp thuốc bảo vệ sức khỏe cho toàn dân.
Trong đó có một cây được dân gian sử dụng tương đối nhiều, đó là cây Muồng
lùn. Cây thuộc chi Muồng (Cassia), chi có nhiều loài được sử dụng làm thuốc chữa
bệnh. Muồng lùn còn được biết đến với tên gọi là cây me đất, muồng đất. Chúng ta có
thể bắt gặp cây mọc hoang ở nhiều nơi như Hà Nội, Ninh Bình, Thanh Hóa, Gia Lai,
Đăk Lăk, Khánh Hòa, Bình Thuận, Đồng Nai… [11]

Hiện nay trong dân gian, cây Muồng lùn mới chỉ được sử dụng chủ yếu theo
kinh nghiệm. Rễ cây được dùng làm thuốc chữa lỵ, hạt của cây được sử dụng làm
thuốc xổ, phần trên mặt đất dùng đun nước uống giúp mát gan, giải độc gan, một số
nơi khác dùng chữa bệnh đau xương khớp. [11], [3]
Trên thế giới, đã có nhiều nghiên cứu về nhiều loài thuộc chi Cassia. Tuy nhiên,
đối với cây Muồng lùn thì mới có một số ít nghiên cứu. Ở Việt Nam, mới chỉ có
nghiên cứu của Đỗ Thị Thủy và HVCH. Đỗ Mạnh Trung (2017, Đại học Dược Hà
Nội) tiến hành nghiên cứu bước đầu về thực vật và thành phần hóa học của cây Muồng
lùn.
Vì vậy, để tiếp tục góp phần tìm kiếm thêm các hoạt chất có tác dụng sinh học
và làm sáng tỏ việc sử dụng cây Muồng lùn trong dân gian, qua đó nâng cao giá trị
tiềm năng của cây Muồng lùn trong kho tàng dược liệu Việt Nam, chúng tôi tiến hành
thực hiện đề tài: “Tiếp tục nghiên cứu thành phần hóa học và một số tác dụng sinh học
của cây Muồng lùn (Chamaecrista pumila (Lam.) K.Larsen)” với mục tiêu:
1. Chiết xuất, phân lập và nhận dạng 1 – 2 chất từ cây Muồng lùn.
2. Bước đầu đánh giá một số hoạt tính sinh học từ dịch chiết của cây Muồng lùn.

1


CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN
1.1. CHI CASSIA
1.1.1. Vị trí phân loại
Theo khung phân loại ngành Ngọc Lan, vị trí phân loại của cây Muồng lùn
(Chamaecrista pumila Lam.) được thể hiện như sau: [2], [3], [11]
Giới: Thực vật (Planta)
Ngành: Ngọc lan (Magnoliophyta)
Lớp: Ngọc Lan (Magnoliopsida)
Phân lớp: Hoa hồng (Rosidae)
Bộ: Đậu (Fabales)

Họ: Đậu (Fabaceae)
Phân họ: Vang (Caesalpinioideae)
Chi: Muồng (Cassia)
Loài: Pumila (Lam.) K.Larsen
1.1.2. Đặc điểm thực vật và phân bố
Cây gỗ, cây nhỡ hay cây cỏ không có gai.
Lá mọc lông chim rời, trên lá thường có các nốt hình đĩa hoặc tròn, hiếm khi lá
trơn; lá chét hình trứng, mọc ngược trở lại. Thường không có lá kèm.
Cụm hoa chùm ở nách hoặc chùy ở ngọn, rất ít khi hoa mọc đơn độc. Hoa lưỡng
tính, thường có màu vàng, mẫu 5; nhị 10 thường xếp thành 2 vòng; bao phấn dính lưng
hay dính gốc, mở bằng kẽ hay lỗ; bầu trên chứa nhiều noãn.
Quả loại đậu dẹt hay hình trụ. Hạt không có nội nhũ hoặc nội nhũ đơn giản. [1],
[3], [4]
1.1.3. Thành phần hóa học
Các nghiên cứu đã được tiến hành cho thấy chi Cassia là một nguồn tốt cung
cấp các chất như: flavonoid, anthranoid (rhein, chrysophanol, physcion…), coumarin,
gôm, chất nhầy, tannin... [16], [42]

2


Bảng 1.1. Thành phần hóa học của một số loài thuộc chi Cassia.
Tên loài

Bộ phận
dùng

Thành phần phân lập đƣợc

C.absus


Rễ

Chrysophanol; aloe-emodin

C.alata

Lá, quả,hạt Aloe-emodin; rhein; chrysophanol

C.angustifolia Lá, quả

C.fistula

C.italica

TLTK
[16], [12]
[16], [31]

Aloe-emodin,; chrysophanol; sennoside

[16], [22],

A,B; Epicatechin

[1], [5]

Lá, hạt,

Rhein glycoside; sennoside A,B;


[16], [51],

hoa

sterequinone

[14]

Lá, quả

Aloe-emodin; chrysophanol; rhein;

[16], [20]

sennoside A
C.glauca

Thân, lá

Chrysophanol; emodin; 8-hydroxy-6-

[16]

methoxy-3-methylanthraquinone
C.grandis

Hạt, thân

Emodin-9-anthrone; chrysophanol;


[16]

3-hydroxy-6,8-dimethoxy-2methylanthraquinone-3-O-β-Dglucopyranoside
C.javanica

Rễ, vỏ

Emodin-8-rhamnoside; 5-hydroxyemodin-

thân

8-rhamnosid; 1,2-dihydro-1,3-

[37], [16]

dihydroxyl,6,8-dimethoxy-2-methylanthtaraquinone
C.nomame

Phần trên

Chrysophanol; physcion; emodin

[16]

1,3-dihydroxy-3,7-diformylanthraquinone;

[36], [16]

mặt đất

C.obtusa

Rễ

1-3-dihydroxy-6-methoxy-7methylanthraquinone
C.pumila

Toàn cây

Emodin; chrysophanol; physcion;
sennosides
3

[49], [16]


C.siamea

Lá, vỏ thân Cassiamin A; chrysophanol;

[52], [16]

C.tora

Hạt, lá,

obtusifolin-2-O-β-D-glucoside; rhein; aloe-

[16], [1],


thân

emodin

[5]

Lá, vỏ rễ

Chrysophanol; 1,8-dihydroxy-3,6-

[3], [16]

C.sophera

dimethoxy-2-methyl-7-vinylanthraquinone

1.1.4. Tác dụng dược lí
Trong dân gian dân gian, nhiều loài thuộc chi Cassia được sử dụng để chữa
nhiều loại bệnh: [3], [11], [5]
 Bệnh về tiêu hóa, nhuận tràng, ăn không tiêu, lỵ: Muồng lùn (C. pumila),
Muồng chét (C.garrenttiana), Muồng ngót (C. sophera), Muồng cô binh
(C.leschenaultiana), Muồng hoa vàng (C.glauca), Muồng lá khế
(C.occidentalis)…
 Bệnh về da như dị ứng, hắc lào, ghẻ lở: Muồng trâu (C.alata), Muồng trĩn
(C.abasus), Muồng trinh nữ (C.angustissima)…
 Huyết áp cao, tiểu đường: Muồng đen (C.siamea), Muồng biển
(C.sulfurea)…
 Viêm gan: Muồng trâu (C.alata), Muồng ngót (C.sophera)…
Ngày nay, các nghiên cứu khoa học trên thế giới đang nhận được động lực to
lớn để đánh giá tác dụng dược lí cũng như đặc tính y học của chi Cassia. Trên cơ sở

các nghiên cứu thực nghiệm khác nhau, đã có nhiều tác dụng dược lí của chi Cassia
được báo cáo:
1.1.4.1. Tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm
Năm 2013, Singh và cộng sự của ông đã chứng minh cao chiết nước từ lá loài
Cassia tora có tác dụng kháng khuẩn mạnh nhất trên vi khuẩn Gram (+) như S.aureus,
và yếu hơn trên vi khuẩn Gram (-) như E.Coli. Nó cũng có hoạt tính kháng nấm tốt.
[41]
Một báo cáo năm 2018 của Mehta và cộng sự cũng đã chỉ ra tác dụng kháng
khuẩn, kháng nấm của 2 loài Cassia siamea và Cassia javanica với 8 dịch chiết khác
4


nhau, sử dụng phương pháp pha loãng với nồng độ 1,0×103 mg/L đến 100 mg/L. Kết
quả cho thấy dịch chiết acetone của lá Cassia siamea thể hiện hoạt tính tốt chống lại
vi khuẩn E.coli với MIC là 25,0 mg/L. Dịch chiết chloroform của lá Cassia siamea thể
hiện tốt hoạt tính chống nấm Candida albicans với MIC là 250 mg/L.[25]
Một nghiên cứu năm 2017 của các nhà khoa học ở Ấn Độ cũng đã chứng minh
được tác dụng kháng nấm tuyệt vời từ các dịch chiết của loài Cassia fistula, trong đó
dịch chiết ethanol thể hiện hoạt tính mạnh nhất. Nghiên cứu này đã lần đầu tiên báo
cáo hoạt tính kháng nấm của loài Cassia fistula đối với các chủng Candida kháng
fluconazole và cũng kết luận rằng hợp chất polyphenolic gallic acid là một chất chống
nấm tự nhiên mạnh.[43]
1.1.4.2. Tác dụng chống oxy hóa và bảo vệ gan
Năm 2018, Rehman đã có một công bố về tác dụng chống oxy hóa của dịch
chiết ethanol của loài Cassia nemophila qua thử nghiệm dọn gốc tự do DPPH. Kết quả
là dịch chiết có khả năng dọn 43,3% DPPH ở nồng độ 80 μg/mL. [32]
Một báo cáo khác năm 2017 của Mehta và cộng sự cũng đã cho thấy tác dụng
chống oxy hóa của 2 loài Cassia javanica và Cassia siamea qua các thử nghiệm dọn
gốc tự do DPPH, khả năng làm mất màu β-caroten và ức chế H2O2. Các nhà khoa học
kết luận rằng các dịch chiết methanol, ethanol và nước từ các bộ phận khác nhau phần

trên mặt đất của 2 loài này đều có tác dụng chống oxy hóa. [26]
Tác dụng bảo vệ gan của dịch chiết n-heptan từ lá cây Cassia fistula được
chứng minh trên chuột bằng cách gây độc gan bằng CCl4 : paraffin lỏng (1:1). Dịch
chiết đã thể hiện tác dụng bảo vệ đáng kể bằng cách làm giảm nồng độ transminase
huyết thanh (SGOT và SGPT), bilirubin và phosphatase kiềm (ALP). Dịch chiết của
Cassia fistula ở liều 400mg/kg đã thể hiện tác dụng bảo vệ gan đáng kể so với tác nhân
bảo vệ gan chuẩn. [15]
1.1.4.3. Tác dụng chống viêm, giảm đau
Năm 2017, Mehta và cộng sự đã nghiên cứu và chứng minh được tác dụng
chống viêm ở một số loài thuộc chi Cassia. Dịch chiết ethanol phần trên mặt đất của
Cassia siamea và Cassia javanica ở mức liều 200 và 400mg/kg đã làm giảm phù

5


trên bàn chân chuột gây ra bởi carrageenan. Ông cũng chỉ ra rằng dịch chiết ethanol
của 2 loài này an toàn lên đến liều 2000mg/kg. [26]
Năm 2010, Ntandou đã báo cáo tác dụng giảm đau, chống viêm đáng kể ở các
mức liều 100; 200 và 400 mg/kg của các dịch chiết ethanol và nước từ loài Cassia
siamea. Tác dụng này phụ thuốc liều, và báo cáo còn chỉ ra không có dịch chiết nào
gây độc trên các dòng tế bào KB và Vero [27]. Cũng trong một nghiên cứu mới đây
của tác giả (2018), ông đã chứng minh dịch chiết nước của lá cây Cassia siamea có
tác dụng đáng viêm đáng kể sau 1h với viêm cấp tính, và sau 7 ngày với viêm mạn
tính, ở liều 400 và 800mg/kg, trên mô hình phù bàn chân chuột gây ra bởi
carrageenan. [28]
1.1.4.4. Tác dụng chống đái tháo đƣờng
Có nhiều nghiên cứu đã chứng minh tác dụng này của chi Cassia. Mới đây
(2018), Tanty & Herlina đã nghiên cứu hoạt tính chống đái tháo đường của các
phân đoạn n-hexan và ethyl acetate của Cassia siamea bằng phương pháp ức chế αglucosidase sử dụng enzyme α-glucosidase và p-nitrophenyl α-D-glycopyranoside
(pNPG) làm chất nền. Kết quả thử nghiệm cho thấy các phân đoạn n-hexan, ethyl

acetate và ethanol đã ức chế men α-glucosidase với hoạt động 52.319%, 42.85% và
19.100% tương ứng ở nồng độ 1000ppm. [45]
1.2. CÂY MUỒNG LÙN (CHAMAECRISTA PUMILA LAM.)
1.2.1. Đặc điểm thực vật và phân bố
1.2.1.1. Đặc điểm thực vật
Muồng lùn còn gọi là me đất, có tên khoa học là Chamaecrista pumila Lam.
(tên đồng danh là Cassia pumila Lamk., Senna prostrate Roxb.) thuộc họ Đậu
(Fabaceae). Muồng lùn là cây thảo hàng năm, mọc nằm, dài 40cm. Thân có cạnh, có
lông, nâu lúc khô. Lá dài 4-5cm; lá chét 14-16 cặp, dài 1-1,5cm, rộng 1-4mm, có lông
mịn, không cân; gân gốc 3. Hoa ở trên nách lá, vàng; cuống 4-6mm. Quả dẹp, dài 2,53cm, rộng 4mm, có lông mịn. Hạt 9-10, gần hình thoi, màu nâu bóng lúc già. Hoa
tháng 8 – 9. Quả tháng 10 – 12. [3], [11], [4]

6


1.2.1.2. Phân bố
Loài phân bố trên toàn châu Á và châu Úc nhiệt đới. Ở nước ta, cây dọc đường
đi, trong ruộng, xavan, rừng thưa vùng đồng bằng tới độ cao 500m, từ Hòa Bình tới
Ninh Bình, Thanh Hóa, vào đến Gia Lai, Đăk Lăk, Khánh Hòa, Bình Thuận, Đồng
Nai, TP. Hồ Chí Minh…[3], [11]
1.2.1.3. Bộ phận dùng
Toàn cây [16]; hạt làm thuốc xổ; rễ chữa lỵ. [3], [11]
1.2.2. Thành phần hóa học
Hiện nay, chưa có nhiều nghiên cứu về thành phần hóa học của cây Muồng lùn.
Năm 2012, Sharma và các cộng sự đã có nghiên cứu [38] và công bố nồng độ các chất
chuyển hóa chính trong loài Chamaecrista pumila như sau:
Bảng 1.2. Hàm lượng (mg/g dw) một số nhóm chất trong loài Chamaecrista pumila
Chamaecrista pumila Lam.
Thành phần
Rễ


Thân

Lá

Hoa

Vỏ

Tinh bột

3.08

9.04

3.84

2.86

5.84

Đường

3.34

2.03

7.86

6.48


8.39

Acid
ascorbic

0.09

0.26

0.245

0.326

0.096

Lipid

3.89

3.48

17.67

12.68

31.68

Protein


39.40

30.43

13.33

27.68

76.46

Phenol

2.68

2.74

3.67

3.64

4.56

Chlorophyl

0.13

0.14

0.924


0.846

0.746

Carotenoid

0.30

0.146

0.846

0.246

0.301

Tác giả cũng đã định tính một số hợp chất ở các phân đoạn khác nhau của loài
Chamaecrista pumila.

7


Bảng 1.3. Định tính một số hợp chất ở các phân đoạn của loài Chamaecrista pumila
Phân đoạn
Dầu hỏa
Hợp
chất
Carbohydrat

Benzen


Aceton

Chloroform

Alcol

Nước

+

+

++

+++

+++

Lipid

-

-

-

-

-


Protein

-

-

-

-

++

++

Phenol

-

-

-

-

-

+

Tannin


-

-

-

-

++

-

Flavonoid

-

-

+

+

+

++

Phytosterol

++


++

-

+++

++

-

Sennosid

+

+

+

++

+

-

Anthraquinon

-

-


-

-

-

+

Theo một số nghiên cứu năm 2012 [39], [16], cho thấy trong cây Muồng lùn có
các thành phần anthranoid như: chrysophanol, emodin, physcion, sennosides….

Sennoside A

Sennoside B

8


Sennoside C

Sennoside D

Rhein-8-O-glycoside

Physicon

Chrysophanol

Emodin


Theo Ankita Yadav và các cộng sự, các hợp chất phytosterol trong
Chamaecrista pumila được phân lập và xác định cấu trúc là β-sitosterol, lanosterol,
campersterol, stigmasterol. Các phytosterol này có hàm lượng khác nhau trong các bộ
phận khác nhau của Chamaecrista pumila. Tổng phytosterol được đo trong quả của
Chamaecrista pumila là 1,15 mg/g dw và thấp nhất trong hoa là 0,38 mg/g dw. Hàm
lượng cao nhất của β-sitosterol và lanosterol, được tìm thấy trong quả tương ứng là
0,23 mg/g dw và 0,24 mg/g dw, trong khi campersterol có tỷ lệ cao nhất đã được tìm
thấy trong lá là 0,24 mg/g dw. [49]

9


β-Sitosterol

Lanosterol

Campesterol

Stigmasterol

Một số hợp chất có cấu trúc flavonoid cũng đã được Singh và cộng sự phân lập
từ dịch chiết của loài Chamaecrista pumila vào năm 2012. [40]

Kaempferol-7-O-glucoside

Quercetin

Kaempferol
1.2.3. Tác dụng dược lí

Hiện nay trên thế giới có rất ít nghiên cứu công bố về tác dụng sinh học của loài
Muồng lùn (Chamaecrista pumila), mới chỉ có một vài nghiên cứu tập trung vào tác
dụng kháng khuẩn và kháng nấm.
10


Năm 2012, R A Sharma và các cộng sự đã phân lập được một số sennoside và
chứng minh được tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm trên các phân đoạn dược liệu
cũng như một số hợp chất phân lập được. Hoạt tính kháng khuẩn mạnh được thấy ở
sennoside D tại 140µg/ml kháng Streptococcus pneumonia và sennoside B kháng nấm
mạnh nhất với Rhizoctonia bataticola tại liều 170µg/ml. [39]
Trong nghiên cứu năm 2014 của Yadav và Sharam, cho thấy các phytosterol
phân lập có hiệu quả chống lại tất cả các vi khuẩn và nấm được thử nghiệm. Trong đó,
β-sitosterol cho thấy hoạt tính cao hơn đối với nấm và vi khuẩn, giá trị MIC ghi nhận
được là 2×103 mg/đĩa. Trong khi giá trị MIC của lanosterol, campersterol và
stigmasterol là 3×103 mg/đĩa. [49]
Trong một nghiên cứu khác, Daulat Singh cùng các cộng sự đã phân lập được
một số flavonoid từ các phần khác nhau của loài Chamaecrista pumila và thử hoạt tính
kháng khuẩn của chúng. Kết quả cho thấy tất cả các flavonoid phân lập được đều có
hiệu quả chống lại các vi khuẩn thử nghiệm. Quercetin có hiệu quả hơn đối với E.coli,
A.flavus, A.niger, F.moniliformae và R.bataticola với giá trị MIC 2×103mg/đĩa và giá
trị MIC cho các chủng vi khuẩn và nấm khác là 3×103mg/đĩa. Kaempferol có hiệu quả
hơn đối với A.flavus, A.niger, F.moniliformae và R.bataticola với giá trị

MIC

2×103mg/đĩa. Kaempferol-7-O-glucoside cho giá trị MIC là 2×103mg/đĩa với E.coli,
A.flavus và A.niger nhưng giá trị MIC cho S.aureus, P.aeruginosa và S.typhi là
3×103mg/đĩa. [40]


11


CHƢƠNG 2. ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. ĐỐI TƢỢNG NGHIÊN CỨU
2.1.1. Nguyên liệu nghiên cứu
Phần trên mặt đất của cây Muồng lùn thu hái tại Hòa Bình được rửa sạch, sấy
khô ở 50oC (đạt độ ẩm 12%), thái nhỏ, đặt trong 2 lớp nilon kín làm nguyên liệu
nghiên cứu thành phần hóa học và tác dụng sinh học. (loài được giám định tên khoa
học bởi ThS. Nghiêm Đức Trọng – phụ lục 1)
2.1.2. Dụng cụ, hóa chất nghiên cứu.
2.1.2.1. Hóa chất nghiên cứu
 Ethanol 96°, methanol
 n-hexan, dichloromethan, ethyl acetat, NH3
 Quercetin (Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương)
 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH)
 Dimethyl sulfoxid (DMSO, Merck)
 Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM, Gibco, Mỹ)
 Phosphate buffer saline (PBS, Gibco, Mỹ)
 Fetal bovine serum (FBS, Gibco, Mỹ)
 MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide)
(DUCHEFA biochemie, Hà Lan)
 LPS ( lipopolysacharide) (Sigma, Mỹ)
 H2NC6H4SO2NH2 (Sulfanilamide) (BDH Chemical, Anh)
 C10H7NHCH2CH2NH2.2HCl (N-alpha-naphthyl-ethylenediamine) (BDH
Chemical, Anh)
2.1.2.2. Thiết bị, dụng cụ
 Cân phân tích, cân kĩ thuật
 Các dụng cụ thủy tinh thông thường có tại phòng thí nghiệm
 Tủ sấy

 Cột sắc kí, bình chạy sắc kí lớp mỏng, đèn tử ngoại.
 Bản mỏng silica gel GF254 (Merck)
12


 Máy đo phổ khối (Agilent 1100 Ion Trap)
 Máy đo phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Bruker Avance III HD)
 Máy đọc ELISA Bio-Rad (Laboratories, Mỹ)
 Bể ổn nhiệt, thiết lập ở 37oC
 Micropipet loại 10 μL, 20 μL, 200 μL, 1000 μL (Isolab, Đức)
 Đầu côn 20 μL, 200 μL, 1000 μL
 Đĩa 96 giếng (SPL Life Sciences, Hàn Quốc).
2.1.2.3. Địa điểm nghiên cứu
 Phòng thí nghiệm Bộ môn Dược học cổ truyền – Đại học Dược Hà Nội.
 Viện Hóa sinh biển – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam.
2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
 Nghiên cứu về thành phần hóa học:
 Chiết xuất dịch chiết ethanol toàn phần và các dịch chiết phân đoạn từ cây
Muồng lùn.
 Phân lập và xác định cấu trúc các hợp chất phân lập được từ dịch chiết ethyl
acetat của cây Muồng lùn.
 Nghiên cứu về tác dụng sinh học:
 Đánh giá khả năng gây độc tế bào và sàng lọc hoạt tính ức chế sản sinh NO
của dịch chiết ethanol cây Muồng lùn.
 Sàng lọc hoạt tính ức chế gốc tự do DPPH của dịch chiết ethanol cây Muồng
lùn.
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.1. Phương pháp chiết xuất và phân lập các hợp chất
2.3.1.1. Chiết xuất



Chiết toàn phần: Dược liệu khô được xay thô, chiết bằng ethanol 960 dùng
phương pháp ngâm ở nhiệt độ phòng, gạn và lọc lấy dịch chiết. Chiết 3 lần, dịch
chiết được gộp lại và bốc hơi dung môi dưới áp suất giảm thu được cắn toàn
phần.



Chiết xuất phân đoạn: chiết lỏng – lỏng lần lượt với các dung môi: n-hexan,
dichloromethane, ethyl acetat, nước. Bốc hơi dung môi dưới áp suất giảm được
13


cắn tương ứng của từng phân đoạn.
Dược liệu
Ethanol 960
Dịch chiết
ethanol
Cất quay áp suất giảm
thu hồi dung môi

Cắn ethanol

Nước nóng, n-hexan,
Cất quay áp suất giảm, sấy

Cắn n-hexan

lắc gạn


Dịch chiết nước
Dichloromethane, lắc

Cất quay áp suất giảm, sấy

gạn
Cắn DCM

Dịch chiết nước
Ethyl acetat, lắc gạn

Cất quay áp suất giảm, sấy

Cắn EtOAc

Dịch chiết nước
Cất quay áp suất giảm, sấy

Cắn nước

H nh 2.1. Sơ đồ chiết xuất dược liệu Muồng lùn

14


2.3.1.2. Phân lập sử dụng sắc kí
 Sắc ký cột: sử dụng phương pháp nhồi cột ướt với sắc ký hấp phụ.
Nguyên tắc: sắc ký cột hấp phụ dựa trên sự phân bố khác nhau của các thành
phần trong mẫu với hai pha không trộn lẫn, trong đó pha động là chất rửa giải, pha tĩnh
là chất hấp phụ dạng bột mịn được nhồi trong cột thủy tinh. Có thể triển khai liên tục

với các hệ dung môi khác nhau có độ phân cực thay đổi từ yếu đến mạnh. Chất nhồi
cột là silica gel pha thường hoặc silica gel pha đảo.
-

Chuẩn bị cột:

Chọn cột thủy tinh có đường kính thích hợp, thể tích cột gấp 3 lần thể tích silica gel
cần cho quá trình phân lập. Chèn bông thủy tinh ở đáy cột để giữ pha tĩnh sau đó đổ
nhẹ nhàng pha tĩnh vào trong cột, mở khóa đồng thời gõ nhẹ lên thành, để pha tĩnh ổn
định và cho dung môi chảy liên tục.
-

Cân bằng cột:

Cho pha động lên cột, không làm phần cột nhồi xáo trộn. Mở khóa cho dung môi
chạy liên tục, không có chỗ nào bị khô hay có bọt khí, để lại một chút dung môi ngay
phía trên bề mặt pha tĩnh, khóa van lại.
-

Nạp mẫu:

Lấy cao dược liệu trộn với silica gel cho đến khi được hỗn hợp khô tơi, đem sấy ở
60°C. Sau đó cho lên cột đã được luyện dung môi trước đó.
-

Rửa giải mẫu và hứng dịch rửa giải:

Rửa giải lần lượt qua hệ dung môi thích hợp. Hứng dịch rửa giải lần lượt vào các
bình hoặc ống nghiệm. Dựa vào TLC chấm dịch rửa giải để xác định hợp chất cần
tách.

 Sắc ký lớp mỏng: sử dụng để thăm dò hệ dung môi tách và theo dõi quá trình
rửa giải xác định độ tinh khiết của chất phân lập được. Thực hiện với bản mỏng tráng
sẵn silica gel GF254.
Nguyên tắc: dựa trên cơ chế hấp phụ. Chất phân tích sau khi chấm lên bản
mỏng sẽ di chuyển trên một lớp chất hấp phụ mịn, theo một chiều nhất định. Quá trình
chạy sắc ký phụ thuộc vào hệ dung môi pha động và khả năng hấp phụ của thành phần
trong chất phân tích sẽ tạo ra các vệt sắc ký ở các vị trí khác nhau.
15


Các chất trên sắc ký đồ được phát hiện bằng đèn tử ngoại ở 2 bước sóng
254nm và 366nm hoặc dùng thuốc thử hiện màu đặc trưng. [8]
2.3.1.3. Xác định cấu trúc hóa học các hợp chất
Nhận dạng các hợp chất phân lập được dựa vào cảm quan, các dữ liệu phổ khối
1
13
MS, phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều ( H-NMR , C-NMR) và hai chiều
(DEPT, HSQC), sau đó đối chiếu với các tài liệu đã công bố. [8]
2.3.2. Phương pháp thử hoạt tính sinh học
2.3.2.1. Xác định hoạt tính kháng viêm
 Xác định khả năng gây độc tế bào
- Phƣơng pháp: Dùng thử nghiệm MTT (3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5
diphenyl tetrazolium bromide), là một phương pháp so màu, đo độ suy giảm màu để
đánh giá khả năng sống sót của tế bào. [7], [48]
- Nguyên tắc: Khả năng gây độc tế bào của cao chiết Muồng lùn được suy ra từ
việc đánh giá khả năng sống sót của tế bào. Ở các tế bào sống, hệ enzym
oxidoreductase hoạt động mạnh, những enzyme này có khả năng chuyển đổi MTT
thành dạng formazan không hoà tan, màu tím đậm. Nhờ đó, tỉ lệ tế bào sống sót được
suy ra từ lượng formazan tạo thành từ MTT. Lượng formazan tạo thành được hoà tan
bởi dung môi hữu cơ (DMSO, propanol) và đo độ hấp thụ ở bước sóng 570 mm.


MTT

Formazan (màu tím)

 Xác định khả năng ức chế sản sinh NO
- Phƣơng pháp: Dùng thử nghiệm Griess. [17], [18]
16


- Nguyên tắc: Gốc tự do nitric oxide (•NO) được sản sinh ở nhiều loại tế bào khác
nhau. Dạng •NO xuất tiết có mặt ở các tế bào như đại thực bào, nguyên bào sợi
hay tế bào gan, thường được sản sinh với lượng lớn khi xuất hiện các đáp ứng
viêm.
Một phương pháp được sử dụng để xác định gián tiếp •NO là xác định sản
phẩm oxy hóa của nó là nitrite (NO2 -). Sự hiện diện của nitrite được phát hiện bằng
cách tạo màu hồng đỏ với thuốc thử Griess.

Khi thêm axit sulphanilic, nitrite tạo thành muối diazonium, sau đó các thuốc
nhuộm azo (N-alpha-naphthyl-ethylenediamine) được thêm vào để tạo thành màu
hồng.
 Tiến hành:


Nuôi tế bào: Tế bào RAW264.7 được nuôi cấy 48 giờ trong môi trường DMEM
ở 37oC, 5% CO2 với 10% huyết thanh (FBS), 1% penicillin/ streptomycin
sulphate.




Chuẩn bị mẫu: Mẫu thử là cao ethanol Muồng lùn (được chiết xuất ở mục
2.3.1.1) được pha thành dung dịch gốc với nồng 100 mg/mL trong dimethyl
sulfoxid (DMSO). Chất đối chứng là cardamonin có nồng độ gốc là 100 mM
(chất sạch). Sau đó pha loãng ở các nồng độ khác nhau để được:

-

Dãy dung dịch mẫu thử có nồng độ: 100; 50; 25; 10 µg/mL

-

Dãy dung dịch chất đối chứng có nồng độ: 3; 1; 0,3; 0,1 µM



Sau 48 giờ tế bào được nuôi cấy trong đĩa 96 giếng với mật độ 2,5×105 tế
bào/200µL/giếng, thay toàn bộ môi trường trong giếng bằng 200µL dung dịch
mẫu thử (mẫu đối chứng) ở các nồng độ đã được pha loãng. Thêm 2µL LPS
(0.1mg/mL) để tế bào được kích thích trong 24 giờ.

17