BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT MULTIPLEX-PCR PHÁT HIỆN MỘT
SỐ GEN CỦA VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI NHÓM STEC
ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ PHÂN BÒ

Họ và tên sinh viên : LÊ THỊ NGỌC HÒA
Ngành

: Thú Y

Lớp

: DH03TY

Niên khóa

: 2003 – 2008

Tháng 09/2008


ỨNG DỤNG KỸ THUẬT MULTIPLEX-PCR PHÁT HIỆN MỘT SỐ GEN
CỦA VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI NHÓM STEC
ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ PHÂN BÒ

Tác giả

LÊ THỊ NGỌC HÒA

Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp bằng Bác sĩ
ngành Thú Y

Giáo viên hướng dẫn
PGS.TS NGUYỄN NGỌC TUÂN
BSTY BÙI THỊ THU TRANG

Tháng 09/2008
i


LỜI CẢM ƠN
 Quả thật tôi cảm thấy mình thật hạnh phúc khi được học tập dưới sự dạy dỗ của
Thầy Cô trong khoa Chăn Nuôi-Thú Y.
 Qua đây, cho tôi xin gửi lời biết ơn sâu sắc đến Ban giám hiệu trường Đại Học
Nông Lâm TP.HCM - Ban Chủ Nhiệm cùng Quý Thầy Cô khoa Chăn Nuôi Thú Y
đã tận tình giảng dạy và dìu dắt tôi trong quá trình học tập tại trường.
 Con mãi khắc ghi công ơn Thầy Nguyễn Ngọc Tuân, người thầy đã hướng dẫn,
dạy dỗ và là nguồn động viên cho con trong cuộc sống cũng như trong suốt thời
gian con thực hành tốt nghiệp.
 Em xin gửi tấm lòng chân thành của mình đến BSTY Bùi Thị Thu Trang, người
chị đã tận tình giúp đỡ và chia sẻ vui buồn cùng em trong thời gian thực tập.
 Tôi cũng gửi lời cảm ơn đến tất cả các anh chị em trung tâm phân tích thí
nghiệm Hóa Sinh trường Đại học Nông Lâm, Thầy Lê Hữu Ngọc - phụ trách
phòng Thực hành Kiểm nghiệm thú sản và vật nuôi, em Minh Thành, bạn Bá Tài
đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi làm việc tốt.
 Và tôi không thể quên sự nhiệt tình, vui vẻ mà các cô chú, anh chị ở các trại
chăn nuôi bò đã đem đến cho chúng tôi trong thời gian lấy mẫu.

 Để có được ngày hôm nay, con xin kính dâng lên ông bà, cha mẹ - những người
đã tận tụy, hy sinh suốt đời cho con tấm lòng hiếu thảo.
 Tôi thật hạnh phúc khi có một người chị tốt, đã dành trọn vẹn tình thương cho
tôi.
 Còn một người mà công ơn của người suốt đời tôi ghi nhớ, đó là Bác Hai Nga,
người đã chăm lo, bảo ban và yêu thương tôi như con gái trong suốt ba năm
qua. Quả là một sự kỳ diệu mà tôi may mắn có được và tôi rất trân trọng điều
đó.

 Cuối cùng là những tình cảm thật dễ thương mà các bạn lớp Thú y 29 cùng bạn
bè thân hữu đã đem đến cho tôi trong những tháng năm qua. Tôi cảm ơn tất cả
và xin chúc cho những tình cảm đó càng thêm đẹp và bền chặt!

Lê Thị Ngọc Hòa

ii


TÓM TẮT
Sinh viên Lê Thị Ngọc Hòa, Đại học Nông Lâm Tp. HCM, tháng 09/2008
“ỨNG DỤNG KỸ THUẬT MULTIPLEX-PCR PHÁT HIỆN MỘT SỐ GEN
CỦA VI KHUẨN ESCHERICHIA COLI NHÓM STEC ĐƯỢC PHÂN LẬP TỪ
PHÂN BÒ”
Người hướng dẫn: PGS.TS Nguyễn Ngọc Tuân, BSTY. Bùi Thị Thu Trang
Đề tài được thực hiện nhằm phát hiện các gen độc lực stx1, stx2, eae, hlyA, rfbE và
fliC của vi khuẩn E. coli được phân lập từ 55 mẫu phân bò, trong đó gồm 11 mẫu phân
bò ta bình thường, 24 mẫu phân bò sữa bình thường, 20 mẫu phân bò sữa tiêu chảy
bằng kỹ thuật multiplex- PCR. Quan sát và ghi nhận trên môi trường CTSMAC có 2 dạng khuẩn lạc của E. coli, khuẩn lạc trắng và khuẩn lạc hồng. Mỗi mẫu
phân chúng tôi chọn 3-5 khuẩn lạc riêng lẻ, cả trắng, cả hồng. Các khuẩn lạc này được
cho vào một eppendorf. Ly trích DNA nhóm khuẩn lạc bằng phương pháp nhiệt. Kết

quả multiplex – PCR được ghi nhận như sau:
(1) 29/55 (52,73%) mẫu phân bò có E. coli mang gen độc lực.
 Tần số phát hiện gen độc lực của E. coli trong phân bò sữa tiêu chảy cao nhất
(75%).
 Kế đến là phân bò sữa bình thường (45,8%).
 Thấp nhất là phân bò ta (27,3%).
 Ở phân bò ta bình thường: 3/11 mẫu có mang gen; trong đó, gen stx2 chiếm tỷ lệ
cao nhất (18%); hai gen stx1 và hlyA chiếm tỷ lệ ngang nhau (9%). Chưa phát hiện
được các gen eae, rfbE và fliC.
 Ở phân bò sữa bình thường: 11/24 mẫu có E. coli mang gen sản sinh độc tố. Gen
stx1 xuất hiện với tỷ lệ 37,5%. Gen hlyA 8,35%, gen stx2 và eae 4,3%. Chưa phát
hiện được gen rfbE và fliC mã hóa cho O157:H7 trong số 24 mẫu khảo sát.
 Ở phân bò sữa tiêu chảy: có 15/20 mẫu (75%) phát hiện được ít nhất mang một gen
độc lực. 12/20 mẫu phát hiện được gen stx; 3/20 mẫu phát hiện được gen eae; 2/20
mẫu phát hiện được gen hlyA. Chưa phát hiện gen rfbE và fliC.
(2) Tỷ lệ khuẩn lạc màu trắng mang gen độc lực (54,8%) cao hơn khuẩn lạc màu hồng
(45,8%).

iii


MỤC LỤC
Trang
Trang tựa...........................................................................................................................i
Lời cảm ơn...................................................................................................................... ii
Tóm tắt........................................................................................................................... iii
Mục lục ...........................................................................................................................iv
Danh sách các chữ viết tắt..........................................................................................vii
Danh sách các bảng ..................................................................................................... viii
Danh sách các hình và sơ đồ ..........................................................................................ix

Phần 1. MỞ ĐẦU...........................................................................................................1
1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ ...........................................................................................................1
1.2. MỤC TIÊU ...............................................................................................................2
1.3. YÊU CẦU.................................................................................................................2
Phần 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU................................................................................3
2.1 Vi khuẩn E. coli .........................................................................................................3
2.2 Phân loại E. coli.........................................................................................................3
2.3. Đặc điểm nuôi cấy và sinh hóa.................................................................................3
2.4. Đặc điểm kháng nguyên và độc tố ...........................................................................4
2.5. Cơ chế chung về khả năng gây tiêu chảy của E. coli ...............................................5
2.6. Shiga toxigenic E. coli (STEC) ................................................................................5
2.6.1. Danh pháp..............................................................................................................5
2.6.2. Độc tố và các yếu tố ảnh hưởng đến đặc tính gây bệnh của STEC.......................6
2.6.2.1. Độc tố Shiga (Stx) ..............................................................................................6
2.6.2.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến đặc tính gây bệnh của STEC ...................................7
2.6.3. Nguồn lây nhiễm ...................................................................................................8
2.7. Serotype O157:H7 ....................................................................................................8
2.7.1. Đặc điểm sinh hóa .................................................................................................8
2.7.2. Nguồn lây nhiễm ...................................................................................................9
2.8. Tình hình ngộ độc thực phẩm ở nước ta trong những năm gần đây ......................10
2.9. Kỹ thuật PCR..........................................................................................................11
2.9.1. Nguyên tắc...........................................................................................................11
iv


2.9.2. Các giai đoạn của phản ứng PCR ........................................................................11
2.9.3. Số chu kỳ của phản ứng PCR ..............................................................................12
2.9.4. Các thành phần của một phản ứng PCR..............................................................12
2.9.5. Phân tích kết quả PCR.........................................................................................13
Phần 3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................................15

3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện.............................................................................15
3.1.1. Thời gian..............................................................................................................15
3.1.2. Địa điểm .............................................................................................................15
3.2. Nội dung nghiên cứu ..............................................................................................15
3.3. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................................15
3.3.1. Lấy mẫu ...............................................................................................................15
3.4. Phân lập và ly trích DNA của vi khuẩn E. coli ......................................................16
3.4.1. Môi trường nuôi cấy ............................................................................................16
3.4.2. Phân lập vi khuẩn ................................................................................................16
3.5. Ly trích DNA khuẩn lạc .........................................................................................16
3.6. Xác định các gen stx1, stx2, eae, hlyA, rfbE, fliC của E. coli phân lập được bằng
kỹ thuật m – PCR ...................................................................................................17
3.6.1. Trình tự primer sử dụng trong multiplex – PCR1 và multiplex – PCR2 ............18
3.6.2. Thành phần phản ứng PCR..................................................................................18
3.6.3. Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR .........................................................................18
3.6.4. Điện di trên gel agarose và đọc kết quả điện di...................................................19
Phần 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................................20
4.1. Kết quả phát hiện một số gen độc lực của vi khuẩn E. coli trên phân bình thường
của bò ta .................................................................................................................21
4.2. Kết quả phát hiện một số gen độc lực của vi khuẩn E. coli trên phân bình thường
của bò sữa...............................................................................................................22
4.3. Kết quả phát hiện một số gen độc lực của vi khuẩn E. coli trên phân tiêu chảy của
bò sữa .....................................................................................................................24
4.4. Tổng kết kết quả phát hiện gen độc lực của vi khuẩn E. coli trên phân của bò ta, và
bò sữa .....................................................................................................................25

v


Phần 5. KẾT LUẬN ....................................................................................................30

5.1. Kết luận...................................................................................................................30
5.2. Đề nghị ...................................................................................................................30
TÀI LIỆU THAM KHẢO...........................................................................................31

vi


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
A/E

Attaching and effacing

CT – SMAC

Cefixime Tellurite Sorbitol MacConkey

dNTP

Deoxyribonucleotide triphosphate

DNA

Deoxyribonucleic acid

Eae

E. coli attaching and effacing

EMB


Eosin Methylen Blue

FDA

Food and Drug Administration

HC

Haemorrhagic colitis

HUS

Haemolytic uraemic syndrome

IMViC

Indol, Methyl Red, Voges – Proskauer, Simmon Citrate

MAC

MacConkey

NA

Nutrient agar

PCR

Polymerase chain reaction


PVC

Môi trường pepton đệm có bổ sung vancomycin và cefixime

STEC

Shiga toxin- producing E. coli

Stx

Shiga toxin

TBE

Tris borate EDTA

UV

Ultra violet

vii


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Trang
Bảng 2.1: Danh pháp các thành viên trong họ Stx ..........................................................6
Bảng 4.1 Kết quả phát hiện gen độc lực của vi khuẩn E. coli trên phân bình thường của
bò ta ........................................................................................................................21
Bảng 4.2 Kết quả phát hiện một số gen độc lực của vi khuẩn E. coli trên phân bình
thường của bò sữa ..................................................................................................23

Bảng 4.3 Kết quả phát hiện gen độc lực của vi khuẩn E. coli trên phân tiêu chảy của bò
sữa ..........................................................................................................................24
Bảng 4.4 Tổng kết tần suất phát hiện gen độc lực của vi khuẩn E. coli trên phân của bò
ta, và bò sữa............................................................................................................26
Bảng 4.5. Mối liên quan giữa kết quả phát hiện gen độc lực và màu sắc khuẩn lạc E.
coli trên môi trường CT-SMAC.............................................................................28

viii


DANH SÁCH CÁC HÌNH VÀ SƠ ĐỒ
Trang
Hình 3.1 Kết quả điện di sản phẩm multiplex – PCR1 EDL933: Đối chứng dương
(stx1, stx2, eae, hlyA): giếng 1, 3 và 4 ...................................................................19
Hình 4.1 Kết quả điện di sản phẩm multiplex – PCR1 EDL933: Đối chứng dương
(stx1, stx2, eae, hlyA). Thang Lad chuẩn; giếng 1, 2 và 3: các mẫu xét nghiệm ..29
Sơ đồ 3.1 Phân lập, xác định E. coli và phát hiện gen độc lực .....................................17

ix


Phần 1
MỞ ĐẦU
1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ
Ngộ độc thực phẩm là vấn đề quan tâm của xã hội. Trong các nhóm vi khuẩn gây
bệnh qua thực phẩm thì vi khuẩn E. coli (Escherichia coli) là một trong những mối
quan tâm của cộng đồng (Bergamini, 2007).
E. coli được thải qua phân ra môi trường bên ngoài nên dễ gây vấy nhiễm vào
nguồn nguyên liệu chế biến thực phẩm hay nguồn nước. Nếu quy trình sản xuất không
đảm bảo điều kiện vệ sinh thì ngộ độc thực phẩm do E. coli hoàn toàn có thể xảy ra.

E. coli được chia thành nhiều nhóm như STEC, EPEC, ETEC, EAEC, EIEC...
Trong đó, nhóm STEC (Shiga toxin producing E. coli) được đề cập nhiều nhất do tác
hại trầm trọng của nó gây ra cho người và động vật. Nhóm này mang nhiều gen mã
hóa cho các yếu tố độc lực như gen eae mã hóa yếu tố bám dính và gây tổn thương
niêm mạc ruột; gen hlyA tiết ra độc tố haemolysin gây dung huyết; gen stx mã hóa độc
tố Shiga gây tiêu chảy nghiêm trọng trên người và gia súc, đặc biệt là gia súc non, gây
viêm kết tràng xuất huyết (HC = hemorrhagic colitis) và hội chứng huyết niệu (HUS =
hemolytic uraemic syndrome) trên người.
E. coli 0157:H7 là một serotype của nhóm STEC, lần đầu tiên được xác định vào
năm 1982 tại Michigan, Hoa Kỳ, từ đó đến nay đã không ngừng gây ngộ độc thực
phẩm nghiêm trọng ở khắp nơi trên thế giới. Trung tâm kiểm soát bệnh ở Mỹ (CDC)
ghi nhận tháng 7 năm 1996, tại thành phố Osaka (Nhật bản), một sự kiện quan trọng về
ngộ độc thực phẩm do E. coli O157:H7 đã làm trên 8000 người ngã bệnh, đa số là trẻ
em, học sinh. Năm 1997, công ty thực phẩm Hudson ở tiểu bang Nebraska phải cho
thu hồi khẩn cấp và hủy bỏ 25 triệu kg thịt hamburger đã bị nhiễm khuẩn E. coli
0157:H7. Cơ quan y tế chính phủ Canada cũng ước đoán mỗi năm có khoảng 1 triệu ca
ngộ độc thực phẩm các loại đã xảy ra tại xứ tuyết giá này.
Có nhiều phương pháp để xác định E. coli nhóm STEC như nuôi cấy, phân lập,
xác định kháng nguyên của vi khuẩn,...các phương pháp này thường tốn nhiều thời
1


gian và công sức (Fode - Vauhan và ctv., 2003). Ngày nay, với những tiến bộ của công
nghệ sinh học, phương pháp PCR (polymerase chain reaction) giúp chẩn đoán chính
xác, hiệu quả trong thời gian ngắn hơn so với những phương pháp truyền thống. Thông
qua việc tầm soát một số gen độc lực nhằm xác định sự hiện diện của nhóm STEC và
serotype E. coli 0157:H7, được sự đồng ý của khoa CNTY, với sự hướng dẫn của
PGS.TS. Nguyễn Ngọc Tuân, BSTY Bùi Thị Thu Trang, chúng tôi tiến hành thực hiện
đề tài: “Ứng dụng kỹ thuật multiplex-PCR phát hiện một số gen của vi khuẩn
Escherichia coli nhóm STEC được phân lập từ phân bò”.

1.2. MỤC TIÊU
Phát hiện một số gen stx1, stx2, eae, hlyA, rfbE, fliC của E. coli nhóm STEC
được phân lập từ phân bò.
1.3. YÊU CẦU
Phân lập E. coli nhóm STEC trong phân bò trên môi trường CT-SMAC.
Phát hiện các gen stx1, stx2, eae, hlyA, rfbE, fliC của nhóm STEC bằng
multiplex- PCR.

2


Phần 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Vi khuẩn E. coli
Vi khuẩn E. coli thuộc nhóm vi khuẩn đường ruột, họ Enterobacteriaceae, có
nhiều trong tự nhiên, trong đường ruột của người và gia súc. Chúng hiện diện nhiều ở
đại tràng nên còn gọi là vi khuẩn đại tràng. Vi khuẩn E. coli nhiễm vào đất, nước… từ
phân của động vật. Chúng trở nên gây bệnh khi gặp điều kiện thuận lợi.
E. coli là trực khuẩn, Gram âm, không tạo bào tử (spore), có hay không có vỏ
bọc. Kích thước trung bình (0,5µ x 1-3µ), hai đầu tròn. Một số chủng có lông bám
(pili) (Tô Minh Châu & Trần Thị Bích Liên, 2006).
2.2 Phân loại E. coli
Dựa vào đặc điểm gây bệnh, người ta phân chia E. coli thành các nhóm sau:
(1) STEC (Shiga toxigenic E. coli) hoặc VTEC (Vero toxigenic E. coli) hay
EHEC (Enterohaemorrhagic E. coli) là những E. coli gây xuất huyết đường ruột.
(2) ETEC (Enterotoxigenic E. coli) là những E. coli sinh độc tố đường ruột.
(3) EPEC (Enteropathogenic E. coli) là những E. coli gây bệnh đường ruột.
(4) EAEC (Enteroaggregative E. coli) là những E. coli gây kết dính và phá hủy tế
bào niêm mạc ruột.
(5)EIEC (Enteroinvasive E. coli) là những E. coli xâm lấn niêm mạc ruột.

2.3. Đặc điểm nuôi cấy và sinh hóa
- Là loại hiếu khí hay hiếu khí tùy nghi.
- Nhiệt độ thích hợp 370C, pH thích hợp 7,4.
- Trên môi trường thạch dinh dưỡng NA, tạo khuẩn lạc tròn ướt (dạng S) màu
trắng đục, nếu để lâu khuẩn lạc trở nên khô, nhăn (dạng R). Kích thước khuẩn lạc 23mm.
- Trên thạch máu: Có chủng dung huyết β, có chủng không (Trần Thị Bích Liên,
2006).
3


- Trên môi trường chuyên biệt EMB (Eosin Methyl Blue) tạo khuẩn lạc tím ánh
kim.
- Trên môi trường Endo, MAC (MacConkey) tạo khuẩn lạc hồng đỏ.
- Trên môi trường thạch nghiêng TSI tạo acid/acid (vàng/vàng).
- Trên các môi trường đường: lên men sinh hơi lactose, glucose, galactose, lên
men không đều saccharose và không lên men dextrin, glycogen.
- Các phản ứng sinh hóa: indol dương/ âm tính, methyl red (MR) dương tính,
Voges-Proskauer (VP) âm tính và citrat âm tính, H2S âm tính, hoàn nguyên nitrat
thành nitrit (Tô Minh Châu & Trần Thị Bích Liên, 2006).
2.4. Đặc điểm kháng nguyên và độc tố
Gồm 4 loại kháng nguyên: O, K, H, F và độc tố gây tan huyết và phù thủng, độc
tố gây tiêu chảy.
 Kháng nguyên
- Kháng nguyên thân O (somatic), có trên 160 loại, chịu nhiệt, phân bố trên thành
tế bào, bao gồm hỗn hợp: lipid, polysaccharide và protein.
- Kháng nguyên giáp mô K (capsul), có hơn 100 loại, kém chịu nhiệt, thành phần
chủ yếu là polysaccharide. Kháng nguyên này có tính chất ngưng kết chéo với kháng
nguyên thân O (Trần Thị Bích liên, 2006).
- Kháng nguyên lông di động H (flagella), có khoảng 60 loại, bản chất là protein,
ít có ý nghĩa trong chẩn đoán (Tô Minh Châu, 2005).

- Kháng nguyên lông bám F (pili), có nhiều loại, đến nay chưa xác định rõ, bản
chất là protein. Kháng nguyên này có ở 1 số dòng E. coli gây độc (Tô Minh Châu,
2005).
 Độc tố
- Độc tố đường ruột: gồm 2 loại chịu nhiệt và không chịu nhiệt. Cả hai loại này
đều gây tiêu chảy. Loại chịu nhiệt ST (thermostable) gồm STa, STb. Loại không chịu
nhiệt LT (thermolabile) gồm các loại LT1, LT2.
- Độc tố hướng mạch máu, gây nên hiện tượng phù thủng (Trần Thị Bích Liên,
2006). Độc tố Vero hay Shiga là độc tố tiêu biểu cho nhóm STEC.

4


2.5. Cơ chế chung về khả năng gây tiêu chảy của E. coli
Có ba cơ chế chung về khả năng gây tiêu chảy của E. coli: (1) Sản xuất độc tố:
gồm các nhóm như ETEC, EAEC, STEC; (2) Tấn công – xâm lấn: nhóm EIEC; (3)
Bám dính, truyền tín hiệu qua màng: gồm các nhóm EPEC, STEC. Tuy nhiên, tác
động qua lại giữa cơ thể vật chủ và màng nhày ruột thì đặc hiệu cho mỗi loại (Nataro
và Kaper, 1998).
2.6. Shiga toxigenic E. coli (STEC)
Trung tâm kiểm soát bệnh ở Mỹ cho biết bệnh số và tử số liên quan với nhiều đợt
dịch bệnh viêm dạ dày ruột gây ra do STEC, đã đe dọa sức khỏe cộng đồng. Những ổ
dịch này có tiềm năng lấn át những nguồn bệnh cấp tính khác cần được chăm sóc, điều
này xảy ra ngay cả trên các quốc gia có hệ thống chăm sóc sức khỏe tiên tiến. Vào
những năm đầu thập niên 1980, các dòng STEC gây ra những đợt dịch liên quan đến
hội chứng viêm kết tràng xuất huyết (HC) và hội chứng huyết niệu (HUS). HUS biểu
hiện ba triệu chứng điển hình là suy thận cấp, giảm tiểu cầu và thiếu máu tan huyết do
tổn thương mao mạch. Bao gồm nhiều type huyết thanh khác nhau như O26, O111,
O113, O124, O145, O157,...(Bộ môn vi sinh, Khoa Y, Đại học Y Dược Tp. Hồ Chí
Minh, 1996). Hiện nay, người ta nghiên cứu các dòng STEC gây bệnh nghiêm trọng

cho con người, đặc biệt O157:H7 là serotype chính của STEC gây nhiều ổ dịch lớn
trên khắp thế giới (Smith và ctv, 1998).
2.6.1. Danh pháp
Qua nghiên cứu các nhà khoa học đã đưa ra những danh pháp khác nhau để đặt
tên cho nhóm E. coli này:
- Konowalchuk và cộng sự đặt cho nhóm này với các tên Verotoxigenic E. coli
hoặc Vero cytotoxin producing E. coli (VTEC) khi phát hiện chúng sản xuất độc tố
gây độc cho dòng tế bào vero vào năm 1997.
- Năm 1998, Nataro và Kaper cho biết nhóm này gây bệnh nghiêm trọng trên
người như gây viêm kết tràng xuất huyết (HC: haemorrhagic colitis) và hội chứng
huyết niệu (HUS: haemolytic uraemic syndrome). Họ đặt tên cho nhóm này là
Enterohaemorrhagic E. coli (EHEC).
- Trong các tạp chí khoa học ở Mỹ, nhóm này còn được sử dụng với tên là Shiga
toxin - producing E. coli (STEC) (trước đây gọi là Shiga like toxin - producing E. coli
5


- SLTEC) nghiên cứu, nhóm này có khả năng sinh độc tố gây độc tế bào giống như
độc tố Shiga (Calderwood và ctv, 1997).
STEC và VTEC là hai thuật ngữ tương đương nhau của nhóm E. coli sản sinh ra
một hay nhiều loại độc tố gây độc tế bào. Thế nhưng, không phải lúc nào E. coli mang
gen sản sinh độc tố là có thể gây bệnh nếu không có sự kết hợp của các yếu tố độc lực
khác. Bằng chứng là một số dòng E. coli mang gen sản sinh độc tố cũng hiện diện
trong ruột gia súc khỏe mạnh với một số lượng rất ít, và những dòng này lại thiếu một
hay tất cả những yếu tố độc lực khác nhau của STEC (Beutin và ctv, 1995). Do đó,
không phải tất cả E. coli thuộc nhóm STEC đều có khả năng gây bệnh (Nataro và
Kaper, 1998).
2.6.2. Độc tố và các yếu tố ảnh hưởng đến đặc tính gây bệnh của STEC
2.6.2.1. Độc tố Shiga (Stx)
Năm 1897, nhà khoa học Kiyoshi Shiga phát hiện Shigella dysenteriae sản sinh

ra một loại độc tố, gọi là độc tố Shiga. Sau này người ta phát hiện ở STEC cũng sản
xuất độc tố tương tự như Shiga (Shiga- lilke toxin) (Calderwood và ctv, 1997).
Cấu trúc và tổ chức các gen stx: họ độc tố Stx ở STEC gồm hai nhóm chính
không phản ứng chéo với nhau là Stx1 và Stx2, được mã hóa bởi 2 gen stx1 và stx2.
Hai độc tố Stx1 và Stx2 được cấu tạo từ 1 tiểu đơn vị A và 5 tiểu đơn vị B. Trong khi
Stx1 có tính bảo tồn cao thì Stx2 rất thay đổi về trình tự. Ba dạng Stx2 được xác định:
Stx2, Stx2c và Stx2e (Pierard và ctv, 1998). Cả hai gen stx1 và stx2 đều được định vị
trên bacteriophage ôn hòa được chèn vào trong nhiễm sắc thể (NST) của STEC
(O’Brien & ctv, 1984). Mỗi dòng STEC chỉ có thể sản sinh hoặc độc tố Stx1 hoặc Stx2
hoặc cả 2, hoặc thậm chí nhiều dạng Stx2.
Bảng 2.1: Danh pháp các thành viên trong họ Stx
Tên gọi hiện nay

Tên gọi trước đây

Gen

Protein

Shiga toxin (Stx)

stx

Stx

Shiga like toxin I (SLT_I) hay Verotoxin 1 (VT1)

stx1

Stx1


SLT_II hay VT2

stx2

Stx2

STL_II c hay VT2c

stx2c

Stx2c

STL_II e hay VT2e

stx2e

Stx2e

(Nguồn: Calderwood và ctv, 1997)
6


Vai trò của Stx trong sinh bệnh: độc tố Stx gây độc cho tế bào bằng cách gây trở
ngại sự tổng hợp protein của tế bào mà chúng tấn công. Bề mặt tế bào nào có sự hiện
diện của Gb3 (globotriaosylceramide) thì tế bào đó sẽ là đích đến của Stx (còn đối với
Stx2e thì thụ thể là Gb4). Ngoài tế bào ruột, Gb3 hoặc Gb4 còn được tìm thấy ở tế bào
nội mô thận, tế bào Vero, tế bào Hela,…Nhờ tính đặc hiệu của tương tác giữa các thụ
thể đặc hiệu và độc tố, sự phân bố của các thụ thể thay đổi theo loại tế bào đã ảnh
hưởng nhiều đến cách sinh bệnh.

Sau khi làm hư hại các tế bào biểu mô, Stx xuyên qua hàng rào biểu mô, xâm
nhập vào dòng máu và tiến đến các mô đích khác nhau có chứa thụ thể glycolypid, gây
tổn thương tế bào nội mạch, tế bào thận,…Cụ thể là những tiểu đơn vị B sẽ giúp độc tố
kết hợp với các thụ thể đặc hiệu của nó. Sau khi sự gắn kết này xảy ra, tiểu đơn vị A
được đưa vào bên trong tế bào đích, đến tế bào chất và tác động lên tiểu phần 60S của
ribosome, rồi cắt một gốc adenin khỏi rRNA 28S của ribosome, từ đó gây trở ngại cho
sự tổng hợp protein. Các tế bào bị tấn công sẽ chết. Độc tố Stx kết hợp với các yếu tố
độc lực khác của STEC gây hư hại tế bào nhung mao ruột, gây tiêu chảy, hoặc nặng
hơn là gây viêm kết tràng xuất huyết (HC), hội chứng huyết niệu (HUS). Trong khi đó,
hậu quả do Stx2e là hiện tượng phù thủng ở heo cai sữa (trích dẫn của Lê Thị Mai
Khanh, 2004).
2.6.2.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến đặc tính gây bệnh của STEC
 Intimin (eae)
Yếu tố kết bám của STEC đóng vai trò quan trọng cho vi khuẩn định vị trên tế
bào ruột. Đó là intimin - một loại protein được mã hóa bởi gen eae (E. coli attaching
và effacing). Intimin gây tổn thương dạng bám dính và phá hủy (attaching - and –
effacing, A/E) ở ruột già do vi khuẩn bám chặt vào tế bào biểu mô (Donnerberg và ctv,
1993). Gen eae này cũng được tìm thấy ở nhóm EPEC. Gen eae là một trong số các
gen nằm trong vùng gây bệnh 35,5 kb (gọi là vùng gây hư hại tế bào ruột - locus of
enterocyte effacement, LEE).
 Enterohaemolysin (haemolysin) (hlyA)
Gen mã hóa hlyA nằm trên plasmid 60 – MDa mà plasmid này được tìm thấy ở
nhiều dòng O157:H7 và cũng hiện diện ở các dòng STEC không phải O157 (STECnon O157). hlyA là nguyên nhân làm hư hại tế bào vero, Hep-2 hoặc Hela trong phòng
7


thí nghiệm (Beutin và ctv, 1989). hlyA được tìm thấy trong nhiều dòng STEC, có liên
quan đến một số bệnh tiêu chảy không có máu và thường xuyên được tìm thấy ở
những người bị nhiễm STEC (Nataro và Kaper, 1998).
2.6.3. Nguồn lây nhiễm

STEC có thể được tìm thấy trong phân nhiều loài động vật như trâu, bò, cừu, dê,
heo, chó, mèo (Beutin và ctv, 1993; Chapman và ctv, 1997) và ngựa (Chalmers và ctv,
1997) và ngay cả chim hải âu (Makino và ctv, 2000). Loài động vật quan trọng nhất
trong việc lây nhiễm cho người là bò. Đường lây nhiễm chủ yếu của STEC vào chuỗi
thực phẩm là việc vấy nhiễm những chứa vật trong ruột và phân trong quá trình giết
mổ (Butler, 1996). STEC thường lây truyền sang người qua thực phẩm, nước và từ
người này sang người khác. Hầu hết các trường hợp bệnh là do ăn thực phẩm đã bị
nhiễm, đặc biệt là thực phẩm có nguồn gốc động vật. Trong đó thịt bò là nguyên nhân
chủ yếu (Keskimaki, 2001).
2.7. Serotype O157:H7
O157:H7 là một serotype nằm trong nhóm STEC. Hầu hết các ổ dịch do STEC
gây ra bởi những dòng O157:H7, nên người ta cho rằng có thể serotype này độc hơn
và dễ lây truyền hơn những serotype khác.
2.7.1. Đặc điểm sinh hóa
Tính kháng acid (acid resistance – AR) đóng vai trò quan trọng cho khả năng
sống sót của vi khuẩn trong môi trường acid. E. coli O157:H7 có khả năng sống sót
trong môi trường pH 2 – 7 (O157:H7 có khả năng sống đến 56 ngày trong môi trường
TBS ở pH ≥ 4) (trích dẫn bởi Jay, 2000). Đặc tính này do gen rpoS quy định (Foster,
2004). Khả năng chịu mặn của O157:H7 khá tốt, vi khuẩn chỉ ngưng phát triển khi
nồng độ NaCl ≥ 8,5% (Jay, 2000).
Tính chất sinh hóa của E. coli O157:H7 cũng tương tự như những E. coli khác.
Một số đặc điểm khác biệt nổi bật của chúng là không lên men đường sorbitol, khoảng
93% chủng E. coli lên men đường sorbitol trong vòng 24 giờ, nhưng đa số các dòng
O157:H7 thì không có đặc tính này (Smith & Scotland, 1993). Để nâng cao xác suất
phân lập serotype O157:H7, người ta sử dụng môi trường MacConkey có bổ sung
thêm đường sorbitol (SMAC).

8



Chủng E. coli O157:H7 được xác định bằng cách phân lập vi khuẩn trên môi
trường SMAC. Những khuẩn lạc không lên men đường sorbitol sẽ được chọn để thử
sinh hóa, thử nghiệm huyết thanh học, thử nghiệm gây độc tế bào Vero (Cebula & ctv,
1995). Tuy nhiên, một số báo cáo cho thấy có một số O157 vẫn lên men đường
sorbitol (Fratamico & ctv, 1993), hoặc trong thử nghiệm huyết thanh có xảy ra hiện
tượng ngưng kết chéo giữa E. coli O157 và một số loài khác của giống Escherichia
coli (Rice & ctv, 1992).
Do đó, người ta sử dụng cặp mồi đặc hiệu để xác định các serotype O157 thuộc
nhóm STEC. Cặp mồi này được thiết kế dựa trên vùng trung tâm của gen rfb. Gen rfb
mã hóa kháng nguyên O của O157 (Paton & Paton, 1998a). Mcevoy (2003) dùng cặp
mồi rfbE và fliC mã hóa kháng nguyên O157 và H7 để chẩn đoán O157:H7.
2.7.2. Nguồn lây nhiễm
O157:H7 bị kết tội là nguyên nhân chính gây tiêu chảy xuất huyết trên người, gây
hội chứng huyết niệu, hội chứng thiểu năng thận cấp tính ở trẻ em, và hầu hết các ca
bệnh đều liên quan đến việc tiêu thụ thịt bò nấu không đủ chín (Trần Thanh Phong,
1996). Hằng năm, ở Mỹ có hơn 73 ngàn ca ngộ độc thực phẩm do nhiễm O157:H7,
trong đó có 71 trường hợp tử vong. Nguyên nhân của các trường hợp là do ăn phải thịt
bò đã bị vấy nhiễm mà chưa được nấu chín, hoặc do uống sữa tươi, do lây từ người
qua người sau khi bơi trong các hồ đã bị nhiễm (USA Department of Agriculture’s
Food Safety and Inspection Service, 2004). Liều gây nhiễm của O157:H7 rất thấp, từ
10 – 100 CFU (Griffin & ctv, 1995). Tuy nhiên, E. coli O157 hiện diện trong phân,
thực phẩm với tỉ lệ thấp hơn rất nhiều so với nhóm E. coli không thuộc O157 (Paton &
Paton, 1998b). Để tăng hiệu quả phân lập O157 người ta dùng môi trường tăng sinh
pepton có bổ sung thêm một số kháng sinh như cefixime, cefsulodin, vancomycine để
hạn chế sự tăng trưởng của những vi khuẩn gram dương và gram âm khác, tạo điều
kiện phát triển cho nhóm O157.
Như vậy, E. coli rất dễ vấy nhiễm ra môi trường bên ngoài, từ phân vào thực
phẩm, thịt (nhất là ở lò mổ); và là nguyên nhân của đa số các trường hợp ngộ độc thực
phẩm. Do đó, cần phải có phương pháp phù hợp để phát hiện kịp thời các vi khuẩn
này, cũng như các độc tố của chúng để góp phần chẩn đoán và kiểm soát bệnh do vi

khuẩn gây ra.
9


2.8. Tình hình ngộ độc thực phẩm ở nước ta trong những năm gần đây
Kết quả khảo sát của Cục An toàn vệ sinh thực phẩm cho thấy tỉ lệ thực phẩm
chín bày bán trên đường phố nhiễm E. coli với tỷ lệ rất cao:
- Tại TPHCM, kem ký bán ở cổng trường tiểu học có tỷ lệ số mẫu nhiễm E. coli
là 96,7%; kem que bán ở cổng trường tiểu học 83,3%; thức ăn sẵn bán ở đường phố
90,0%.
- Thức ăn chín đường phố Hà Nội có tỷ lệ nhiễm khuẩn E. coli cao: món nộm
thập cẩm với tỷ lệ 78,0%; nem chua 88,0%; giò, nem chạo 88,0%...
- Đặc biệt, tình trạng một số thức ăn chế biến sẵn nhiễm khuẩn 100% ở Nam
Định, như các món nem chạo, nem chua, lòng lợn chín.
Sở dĩ thực phẩm chế biến sẵn có tỷ lệ nhiễm E. coli cao là do việc chế biến không
đảm bảo, không tuân thủ quy trình vệ sinh. Thực phẩm đã chế biến sẵn bán tại các chợ,
đường phố là rất phổ biến, trong khi đó, điều kiện vệ sinh cơ sở, vệ sinh dụng cụ chế
biến và vệ sinh cá nhân người trực tiếp chế biến thực phẩm chưa bảo đảm.
Cũng theo một kết quả điều tra do Cục An toàn vệ sinh thực phẩm Việt Nam cho
thấy tỷ lệ bàn tay người làm dịch vụ thực phẩm nhiễm khuẩn E. coli cũng rất cao:
- Tại Hà Nội tỷ lệ bàn tay người làm dịch vụ thực phẩm thức ăn đường phố
nhiễm E. coli là 43,42%; người làm trong khách sạn, nhà hàng là 62,5%; trong bếp ăn
tập thể là 40%.
- Tại TPHCM, tỷ lệ bàn tay người chế biến thực phẩm nhiễm loại khuẩn này là
67,5%.
Với thực trạng chế biến thức ăn như thế, ngộ độc thực phẩm hay nhiễm bệnh
đường ruột, nhiễm các loại giun, sán qua thức ăn hè phố là điều khó tránh khỏi.
Không những thế, thức ăn hè phố còn sử dụng các chất bảo quản, chất chống
mốc, phụ gia không an toàn rất cao.
Trên thực tế, từ năm 1999 - 2005, số người bị ngộ độc thực phẩm luôn ở mức báo

động. Trong 5 năm, có trên 1.530 vụ ngộ độc thực phẩm với 35.010 người mắc, trong
đó, gần 400 trường hợp bị tử vong. Trong những số ca ngộ độc thực phẩm này, nguyên
nhân do thức ăn hè phố chiếm tỷ lệ rất lớn.
Ăn thực phẩm không đảm bảo vệ sinh rất dễ nhiễm các bệnh như tả, thương hàn,
tiêu chảy.... Số liệu thống kê tại Cục An toàn vệ sinh thực phẩm cho thấy, từ năm 1997
10


- 2005: tổng số người nhiễm bệnh tả do thực phẩm là 1.151 trường hợp, nhiễm bệnh
thương hàn là 99.054 trường hợp (tử vong 69 người), nhiễm bệnh tiêu chảy là
8.844.566 trường hợp (tử vong 183 người...).
- Ngoài ra, tỷ lệ nhiễm các bệnh sán lá gan, sán lá phổi, giun các loại và các bệnh
nhiễm trùng thực phẩm khác cũng chiếm một tỷ lệ rất cao trong cộng đồng.
Nghiên cứu gần đây nhất của Võ Thành Thìn và ctv (2008) về tình trạng nhiễm
E. coli sản sinh độc tố shiga phân lập từ thịt bò tại 3 chợ Vĩnh Hải, Vĩnh Thọ, Xóm
Mới và 1 lò mổ ở Thành phố Nha Trang thì ngoài Vĩnh Thọ ra, các địa điểm còn lại
đều phát hiện gen mã hóa độc tố shiga từ các mẫu thịt bò khảo sát.
Năm 2007, Nguyễn Vũ Trung và ctv đã nghiên cứu trên 310 mẫu bệnh phẩm
phân tiêu chảy của trẻ em dưới 5 tuổi có tới 90 mẫu nhiễm thuộc các nhóm E. coli gây
bệnh, trong đó có nhóm STEC.
2.9. Kỹ thuật PCR
2.9.1. Nguyên tắc
PCR (polymerase chain reaction – phản ứng tổng hợp dây chuyền nhờ
polymerase) do Karl Mullis và cộng sự phát minh năm 1985. Đây là kỹ thuật in vitro
cho phép nhân nhanh một gen mong muốn lên hàng triệu lần trong thời gian ngắn (tạo
dòng in vitro, không cần tế bào).
Tất cả các DNA polymerase khi hoạt động tổng hợp chuỗi DNA mới từ mạch
khuôn đều cần sự hiện diện của những mồi chuyên biệt.
2.9.2. Các giai đoạn của phản ứng PCR
Phản ứng PCR là một chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp nhau. Mỗi chu kỳ gồm 3 bước:

 Bước 1 (giai đoạn biến tính – denaturation): hai mạch của phân tử DNA tách rời
thành hai mạch đơn. Phân tử DNA được biến tính ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng
chảy (Tm) của phân tử, thường là 94-95oC trong vòng 30 giây đến một phút.
 Bước 2 (giai đoạn ủ bắt cặp – anealing): Nhiệt độ được hạ thấp (thấp hơn Tm của
các mồi) cho phép các mồi bắt cặp với khuôn, trong thực nghiệm nhiệt độ này dao
động trong khoảng 40-60oC tuỳ thuộc Tm của các mồi sử dụng và kéo dài từ 30
giây đến 1 phút.
 Bước 3 (giai đoạn kéo dài elongation hay extension): nhiệt độ ở giai đoạn này được
tăng lên 72oC giúp DNA polymerase hoạt động tổng hợp DNA tốt nhất với sự hiện
11


diện của bốn deoxyribonucleotide trisphosphate. Đoạn DNA nằm giữa hai mồi
được tổng hợp tạo thành chuỗi DNA.
Mỗi chu kỳ gồm 3 bước trên được lặp đi lặp lại nhiều lần và mỗi lần lại làm tăng
gấp đôi lượng DNA mẫu của lần trước. Tổng DNA khuếch đại được tính theo công
thức:
Tổng DNA khuếch đại = m*2n
Với n là số chu kỳ, m là số bản sao của chuỗi mã hoá.
2.9.3. Số chu kỳ của phản ứng PCR
Trong thực tế, không vượt quá 40 chu kỳ trong một phản ứng, vì phản ứng PCR
diễn ra qua hai giai đoạn:
- Giai đoạn đầu, số lượng bản sao tăng theo cấp số nhân, tỷ lệ với lượng mẫu ban đầu.
- Giai đoạn sau, hiệu quả khuếch đại giảm hẳn do:
 Phân huỷ và cạn kiệt các thành phần phản ứng
 Xuất hiện các sản phẩm phụ ức chế lại phản ứng
 Các bản sao vừa tổng hợp không kết hợp với mồi mà lại bắt cặp với nhau
Số chu kỳ của phản ứng tuỳ thuộc số lượng mẫu ban đầu.Số lượng bản mẫu 105
thì cần khoảng 25- 30 chu kỳ, số bản mẫu 102 – 103 thì số chu kỳ phải là 35 – 40.
2.9.4. Các thành phần của một phản ứng PCR

 DNA mẫu: là thành phần cần khuếch đại.
 Mồi (primer): mồi là những đoạn oligonucleotide mạch đơn, có trình tự bổ sung
với trình tự base của hai đầu mạch khuôn để khởi đầu quá trình tổng hợp DNA.
Việc chọn mồi là giai đoạn quyết định của phản ứng PCR, các mồi được chọn
phải đặc trưng cho trình tự DNA cần khuếch đại, không trùng với các trình tự
lặp lại trên gen, không có sự bắt cặp bổ sung giữa mồi xuôi và mồi ngược, cũng
không có những cấu trúc kẹp tóc do sự bắt cặp bổ sung trong cùng một mồi.
Chiều dài của các mồi tối thiểu cho hầu hết các ứng dụng PCR là 18 nucleotide
(thường là 18 – 24 nucleotide). Trình tự nằm giữa hai mồi xuôi và ngược không
quá lớn, phản ứng PCR sẽ tối ưu trên những trình tự nhỏ hơn 1 Kb.
 Taq polymerase: Taq polymerase là một DNA polymerase chịu nhiệt, được
chiết tách từ vi khuẩn Thermus aquaticus ở suối nước nóng. Taq DNA
polymerase không bị huỷ ở nhiệt độ cao và xúc tác sự tổng hợp từ đầu đến cuối
12


quá trình phản ứng dưới sự hiện diện của Mg2+. Taq DNA polymerase tổng hợp
DNA theo hướng 5’ → 3’ và hoạt động tốt nhất ở 70 – 720C.
 Các nucleotide (dNTP- deoxyribonucleotide phosphate) là hỗn hợp gồm 4 loại
dATP, dTTP, dCTP, dGTP làm nguyên liệu cho phản ứng tổng hợp DNA.
 Dung dịch đệm: thành phần dung dịch đệm có thể thay đổi tuỳ loại enzyme
được sử dụng, quan trọng nhất là ion Mg2+. Nó hình thành một phức hợp hoà
tan với dNTP, rất cần cho quá trình liên kết các dNTP, xúc tác cho enzyme
polymerase, làm tăng nhiệt độ nóng chảy (Tm) của DNA mạch đôi. Nồng độ
Mg2+ (thường được sử dụng ở dạng MgCl2) là một yếu tố ảnh hưởng mạnh đến
tính hiệu quả và tính đặc hiệu của phản ứng PCR. Ngoài ra nồng độ MgCl2 còn
ảnh hưởng đến quá trình bắt cặp của mồi, nhiệt độ để biến tính DNA thành dây
đơn, hoạt động của enzyme và sự trung thực của kết quả. Nồng độ Mg2+ phải
được xác định cho từng phản ứng qua nhiều thử nghiệm. Nồng độ Mg2+ trong
hỗn hợp phản ứng cuối cùng thường biến thiên từ 0,5 – 5mM (Hồ Huỳnh Thuỳ

Dương, 1998).
2.9.5. Phân tích kết quả PCR
- Sản phẩm của phản ứng PCR sẽ được phát hiện bằng phương pháp điện di.
- Nguyên tắc của phương pháp điện di là dựa vào đặc tính cấu trúc của các DNA.
DNA là đại phân tử tích điện âm trên khắp bề mặt nên khi chịu tác động của một điện
trường, chúng sẽ di chuyển về cực dương của điện trường. Sự di chuyển của phân tử
trong bản gel dưới tác động của một điện trường phụ thuôc vào khối lượng phân tử
(tức là số nucleotide) và nồng độ các chất cấu thành gel, điện thế.
- Điện di được thực hiện theo phương nằm ngang hoặc thẳng đứng. Các DNA
trong gel agrose được hiện hình dưới tia tử ngoại (UV) nhờ ethidium bromide, chất
này có khả năng gắn xen giữa các base của acid nucleic và phát huỳnh quang dưới tác
động của tia UV (bước sóng λ = 300nm) thành vạch màu đỏ da cam.
- Để ước lượng kích thước DNA bằng gel agarose, người ta sử dụng một yếu tố
đánh dấu trọng lượng phân tử (molecular weight marker – MWM) là một tập hợp
nhiều trình tự DNA có kích thước đã biết (DNA ladder).

13


- Multipex-PCR là một cải tiến của kỹ thuật PCR mà trong đó có thể nhân lên
đồng thời nhiều đoạn DNA mong muốn bằng cách sử dụng đồng thời nhiều cặp mồi
trong một phản ứng, mutiplex-PCR đầu tiên được mô tả bởi Chamberlain năm 1998 và
kể từ đó mutiplex-PCR được ứng dụng rất nhiều trong các lĩnh vực kiểm tra DNA
(Protocol online) (Lê Thị Mai Khanh, 2004).

14


Phần 3
NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện
3.1.1. Thời gian: Từ tháng: 02/2008 – 08/2008.
3.1.2. Địa điểm
 Mẫu: phân bò được lấy từ hộ hoặc trại chăn nuôi Quận 9, Quận Thủ Đức,
Huyện Dĩ An-Bình Dương.
 Nuôi cấy, phân lập vi khuẩn được thực hiện tại phòng thực hành Kiểm
nghiệm thú sản và Môi trường sức khỏe vật nuôi, khoa Chăn nuôi – Thú y,
Trường Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh.
 Phát hiện các gen độc lực được thực hiện tại Trung Tâm Phân Tích Thí
Nghiệm Hóa sinh Trường Đại học Nông Lâm TP. HCM.
3.2. Nội dung nghiên cứu
 Phân lập E. coli trên môi trường CT – SMAC.
 Thực hiện phản ứng multiplex – PCR để phát hiện gen stx1, stx2, eae, hlyA,
rfbE, fliC của E. coli.
3.3. Phương pháp nghiên cứu
3.3.1. Lấy mẫu
- Mẫu phân bình thường: dùng muỗng vô trùng lấy ở phần giữa cục phân gia súc
mới thải.
- Mẫu phân tiêu chảy: phân được lấy từ trực tràng bằng tăm bông vô trùng, sau
đó cho vào môi trường peptone đệm có bổ sung kháng sinh vancomycine (8mg/L) và
cefixime (0,0125mg/L), bảo quản ở 4-80C, chuyển nhanh về phòng thí nghiệm (mẫu
được giữ tối đa 24 giờ) (phục vụ cho quy trình phân lập nhóm STEC) (FDA, 2002).

15