BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP.HỒ CHÍ MINH
KHOA CHĂN NUÔI - THÚ Y
***

NGUYỄN NGỌC LAM QUỲNH

KHẢO SÁT MỘT SỐ VI KHUẨN ĐƯỜNG
RUỘT QUA PHÂN TRÊN CHÓ
BÌNH THƯỜNG
Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp bằng Bác sỹ thú y

Giáo viên hướng dẫn:
PGS. TS. NGUYỄN NGỌC HẢI

Tháng 06/2011

1


LỜI CẢM ƠN
Đầu tiên, tôi xin gửi lòng kính trọng và sự biết ơn đến Bố Mẹ là
những người sinh thành, dưỡng dục tôi để tôi có được ngày hôm nay, là
những người đã luôn hy sinh, tận tụy, luôn bên cạnh những lúc tôi cần để
chia sẻ, yêu thương và động viên tôi trong suốt những tháng năm học hành.
Tôi xin gửi đến thầy Nguyễn Ngọc Hải lời cảm ơn chân thành nhất,
thầy đã định hướng và luôn nhiệt tình hướng dẫn tôi từng bước để tôi hoàn
thành khóa luận tốt nghiệp này.
Xin cảm ơn quý thầy cô trường ĐH Nông Lâm, khoa Chăn Nuôi Thú
Y đã hết lòng dạy dỗ không chỉ là kiến thức mà còn những những bài học
kinh nghiệm quý giá để chúng tôi sống tốt hơn, vững vàng hơn khi bước vào

đời.
Xin gửi lời cảm ơn đến thầy Bảo, chị Xuân và những người bạn ở bộ
môn Vi Sinh Truyền Nhiễm đã đồng hành, giúp đỡ và động viên để tôi hoàn
thành khóa luận tốt nghiệp này.
Cuối cùng, tôi xin cảm ơn rất nhiều những người bạn của lớp TY32,
những người bạn cấp 3, nhóm Seeds đã sát cánh bên tôi, chia sẻ và động
viên rất nhiều.
Tp.HCM, ngày 30 tháng 06 năm 2011
Nguyễn Ngọc Lam Quỳnh

2


TÓM TẮT
Đề tài được thực hiện trên 60 mẫu phân được lấy từ 20 con chó từ 0 –
3 tháng tuổi, 20 con chó trên 3 tháng – 1 năm tuổi, và 20 con chó trên 1 năm
tuổi. Những con chó ở mỗi độ tuổi được nuôi dưỡng với ba hình thức khác
nhau là nuôi nhốt, nuôi trong nhà và thả tự do. Chúng tôi đã tiến hành khảo
sát một số chỉ tiêu trên hệ vi sinh đường ruột chó và ghi nhận được kết quả
như sau:
Số lượng vi khuẩn E. coli và các vi khuẩn sinh acid lactic được khảo
sát từ phân chó từ 0 – 3 tháng tuổi ở các hình thức nuôi dưỡng và thức ăn
khác nhau khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê.
Ở chó trưởng thành bình thường, số lượng vi khuẩn E. coli không có
sự khác biệt đáng kể giữa các hình thức nuôi dưỡng.
Số lượng vi khuẩn sinh acid lactic trên chó từ 0 – 3 tháng tuổi có sự
khác nhau giữa các loại thức ăn và môi trường sống.
Sau khi cai sữa cho đến khi trưởng thành, số lượng vi khuẩn sinh acid
lactic khảo sát được trong phân chó bình thường chênh lệch không có ý
nghĩa về mặt thống kê.


3


MỤC LỤC
Trang tựa ..................................................................................................................... i
Lời cảm ơn .................................................................................................................. ii
Tóm tắt ...................................................................................................................... iii
Mục lục....................................................................................................................... iv
Danh sách các bảng ................................................................................................... vii
Danh sách các hình ..................................................................................................... x
Danh sách các sơ đồ ................................................................................................... ix
Chương 1 ĐẶT VẤN ĐỀ ......................................................................................... 1
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................... 3
2.1 Sơ lược về hệ thống tiêu hóa của chó ................................................................... 3
2.1.1 Nguồn góc chó nhà...................................................................................... 3
2.1.2 Sơ lược về hế thống tiêu hóa của chó ......................................................... 3
2.1.2.1 Xoang miệng .................................................................................. 3
2.1.2.2 Thực quản ....................................................................................... 4
2.1.2.3 Dạ dày ............................................................................................. 4
2.1.2.4 Ruột ................................................................................................ 4
2.2 Sơ lược về vi sinh vật trong đường ruột chó ......................................................... 5
2.2.1 Sơ lược về nhóm vi khuẩn lactic. ............................................................... 7
2.2.1.1 Vi khuẩn lactic ................................................................................ 7
2.2.1.2 Sơ lược về phân loại vi khuẩn lactic .............................................. 8
2.2.2 Sơ lược về Escherichia coli. .................................................................... 10
2.2.3 Lượt duyệt các nghiên cứu có liên quan đến đề tài ................................... 11
Chương 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM ............................ 13

4



3.1 Địa điểm và thời gian thực hiện .......................................................................... 13
3.1.1 Địa điểm .................................................................................................... 13
3.1.2 Thời gian ................................................................................................... 13
3.2 Vật liệu thí nghiệm .............................................................................................. 13
3.2.1 Mẫu khảo sát ............................................................................................. 13
3.2.2 Môi trường ................................................................................................ 13
3.2.3 Hóa chất..................................................................................................... 13
3.2.4 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm ................................................................. 14
3.3 Nội dung đề tài .................................................................................................... 14
3.4 Phương pháp thí nghiệm ..................................................................................... 14
3.4.1 Phương pháp lấy mẫu ................................................................................ 14
3.4.2 Phương pháp nuôi cấy định danh và đếm số lượngvi khuẩn bằng
phương pháp pha loãng tới hạn (Most Propable Number – MPN) ................... 14
3.4.2.1 Đếm số lượng vi khuẩn Escherichia coli .................................... 14
3.4.2.2 Đếm số lượng vi khuẩn sinh acid lactic ....................................... 17
3.5 Xử lý số liệu ........................................................................................................ 18
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................................. 19
4.1 Kết quả đếm tổng số vi khuẩn Escherichia coli................................................. 20
4.1.1 Tổng số vi khuẩn E. coli ........................................................................... 21
4.1.2.1 So sánh số lượng vi khuẩn E. coli trên chó từ 0 – 3 tháng tuổi
ở ba hình thức nuôi ................................................................................... 22
4.1.2.2 So sánh số lượng vi khuẩn E. coli trên chó trên 0 – 3 tháng tuổi
ở hai loại thức ăn ...................................................................................... 24
4.1.2.3 So sánh số lượng vi khuẩn E. coli trên chó trên
3 tháng – 1 năm tuổi ở ba hình thức nuôi dưỡng...................................... 25

5



4.1.2.4 So sánh số lượng vi khuẩn E. coli trên chó trên 1 năm tuổi
ở ba hình thức nuôi dưỡng........................................................................ 26
4.1.2.5 So sánh số lượng vi khuẩn E. coli trên chó mọi lứa tuổi
ở ba hình thức nuôi dưỡng........................................................................ 26
4.2 Nhóm vi khuẩn sinh acid lactic ........................................................................... 27
4.2.1 Quan sát đại thể và vi thể .......................................................................... 27
4.2.2 So sánh số lượng các vi khuẩn sinh acid lactic trên chó
từ 0 – 3 tháng tuổi ở ba hình thức nuôi .............................................................. 28
4.2.3 So sánh số lượng các vi khuẩn sinh acid lactic trên chó
từ 0 – 3 tháng tuổi ở hai hình thức cho ăn.......................................................... 30
4.2.4 So sánh số lượng các vi khuẩn sinh acid lactic trên chó
trên 3 tháng – 1 năm tuổi ở ba hình thức nuôi ................................................... 30
4.2.5 So sánh số lượng các vi khuẩn sinh acid lactic trên chó
trên 1 năm tuổi ở ba hình thức nuôi ................................................................... 31
4.2.6 So sánh số lượng các vi khuẩn sinh acid lactic
trên chó mọi lứa tuổi ở ba hình thức nuôi dưỡng ............................................... 32
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................... 34
5.1 Kết luận .............................................................................................................. 34
5.2 Đề nghị ............................................................................................................... 34
TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................... 35
PHỤ CHƯƠNG ....................................................................................................... 37

6


DANH SÁCH CÁC BẢNG
2.1. Một số loại vi khuẩn lên men đồng hình, dị hình ................................................ 8
Định danh vi khuẩn E.coli bằng các phản ứng sinh hóa ........................................... 15
Bảng 4.1. Số lượng vi khuẩn E.coli khảo sát trên phân của chó

từ 0-3 tháng tuổi ............................................................................................. 21
Bảng 4.2. Số lượng vi khuẩn E.coli khảo sát trên phân của chó
từ 0-3 tháng tuổi ở hai hình thức cho ăn ........................................................ 23
Bảng 4.3. Số lượng vi khuẩn E.coli khảo sát trên phân của chó
trên 3 tháng – 1 năm tuổi ............................................................................... 24
Bảng 4.4. Số lượng vi khuẩn E.coli khảo sát trên phân của chó
trên 1 năm tuổi trở lên .................................................................................... 25
Bảng 4.5. Số lượng các vi khuẩn E. coli khảo sát trên phân của chó
theo lứa tuổi.................................................................................................... 25
Bảng 4.6. Số lượng vi khuẩn sinh acid lactic khảo sát trên phân của chó
từ 0 – 3 tháng tuổi .......................................................................................... 29
Bảng 4.7. Số lượng vi khuẩn sinh acid lactic khảo sát trên phân của chó
từ 0 – 3 tháng tuổi ở hai hình thức cho ăn ..................................................... 30
Bảng 4.8. Số lượng vi khuẩn sinh acid lactic khảo sát trên phân của chó
trên 3 tháng – 1 năm tuổi ............................................................................... 31
Bảng 4.9. Số lượng vi khuẩn sinh acid lactic khảo sát trên phân của chó
trên 1 năm tuổi trở lên .................................................................................... 32
Bảng 4.10. Số lượng vi khuẩn sinh acid lactic khảo sát trên phân của chó
theo lứa tuổi ở các hình thức nuôi .................................................................. 33

7


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 4.1: Vi khuẩn E.coli trên môi trường MC ........................................................ 19
Hình 4.2: Vi khuẩn E.coli trên môi trường EMB ..................................................... 20
Hình 4.3: Đặc điểm sinh hóa của E.coli .................................................................... 20
Hình 4.4: Hình thái của khuẩn lạc A trên môi trường MRSA .................................. 27
Hình 4.5: Hình thái của khuẩn lạc B trên môi trường MRSA .................................. 28
Hình 4.6: Hình thái vi thể của khuẩn lạc B .............................................................. 28

Hình 4.7: Hình thái vi thể của khuẩn lạc C ............................................................... 28

8


DANH SÁCH CÁC SƠ ĐỒ
Sơ đồ 3.1 : Quy trình đếm tổng số các vi khuẩn sinh acid lactic .............................. 17

9


Chương 1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Chó là loài vật đầu tiên được con người thuần hóa, là bề tôi trung thành và
tận tụy. Vị luật sư Georges Graham Vest đã có một bài diễn văn tại một phiên tòa
xử vụ kiện người hàng xóm làm chết con chó của thân chủ ông: “…một chú chó có
thể luôn ở bên cạnh bạn, không quan tâm bạn giàu hay nghèo, xấu hay tốt, nó vẫn
luôn yêu thương, tôn trọng bạn. Làm tất cả những gì cho bạn vui… Và cho dù bạn
là một tên ăn mày, trắng tay, nó vẫn luôn nở nụ cười với bạn, luôn kề cận bạn…
một người bạn hoàn toàn không vụ lợi mà con người có được trong thế giới ích kỷ
này, người bạn không bao giờ bỏ ta đi, không bao giờ tỏ ra vô ơn hay tráo trở, đó là
chú chó của bạn…”.
Không phải tự nhiên mà bài diễn văn ấy được bình chọn là bài diễn văn về
loài chó hay nhất mọi thời đại mà vì con người thật sự công nhận chó đã trở thành
một người bạn quan trọng. Ở Việt Nam chó được nuôi để giữ nhà, săn bắt, canh
gác… cuộc sống khá hơn người ta nuôi chó để làm cảnh và làm một người bạn thân
thiết lúc về già. Theo thống kê của Chi cục Thú y TP.HCM năm 2009, số lượng chó
nuôi trên địa bàn thành phố lên đến 202.000 con. Sự phát triển nhanh về số lượng,
về các giống chó ngoại nhập cũng như số lượng người nuôi chó gia tăng, bên cạnh
đó kiến thức trong việc nuôi dưỡng chó còn rất hạn chế.

Một đường ruột khỏe mạnh luôn được duy trì bởi một số lượng các vi sinh
vật ổn định và cân bằng, vì vậy bất cứ tác động nào làm biến đổi sự cân bằng đó đều
dẫn tới rối loạn. Với phương châm “con chó không phải thùng rác”, chúng ta cần
phải chú trọng hơn nữa chế độ ăn uống và cách thức nuôi dưỡng tùy theo độ tuổi để
có thể bảo vệ sức khỏe, kéo dài tuổi thọ để chó mãi là một trợ thủ trung thành và là
một người bạn thân thiết của con người.

10


Để hiểu biết rõ ràng hơn về hệ vi sinh vật đường ruột của chó và mối liên
quan giữa chế độ ăn uống và môi trường sống với hệ vi sinh vật đường ruột, được
sự đồng ý của khoa chăn nuôi thú y và dưới sự hướng dẫn của PGS. TS Nguyễn
Ngọc Hải, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Khảo sát một số vi khuẩn đường
ruột qua phân trên chó bình thường”.
Mục tiêu:
Tìm hiểu về số lượng vi khuẩn đường ruột qua phân trên chó ở mọi lứa tuổi
ở ba hình thức: nuôi nhốt, nuôi trong nhà và thả tự do và mối liên hệ giữa các nhóm
vi khuẩn trong đường ruột trên chó ở những độ tuổi và các hình thức nuôi dưỡng
khác nhau.
Yêu cầu:
Xác định tổng số lượng Escherichia coli và nhóm vi khuẩn sinh acid lactic.
So sánh số lượng các vi khuẩn Escherichia coli và nhóm vi khuẩn sinh acid
lactic ở chó giữa các độ tuổi ở các hình thức nuôi.

11


Chương 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Sơ lược về hệ thống tiêu hóa của chó
2.1.1 Nguồn gốc chó nhà
Chó là vật nuôi thân thiết, gần gũi, gắn bó với con người trong suốt chiều dài
lịch sử phát triển của xã hội loài người. Chúng được thuần hóa cách đây khoảng
15.000 năm từ một loài chó sói sống hoang dã ở hầu hết các châu lục. Trung tâm
thuần hóa chó cổ nhất có lẽ là vùng Đông Nam Á. Sau đó, chó được du nhập vào
Châu Úc, lan ra khắp phương Đông và đến Châu Mỹ.
Chó được thuần hóa với mục đích trước hết là giúp con người săn bắt thú,
sau đó là để giữ nhà và làm bạn với con người. Ở Việt Nam, theo di tích xương hóa
thạch để lại, chó được nuôi từ trung kỳ đồ đá mới, khoảng 3.000 - 4.000 năm trước
công nguyên (cách đây 5.000 - 6.000 năm).
Tập hợp tất cả những giống chó nhà được nuôi hiện nay trên thế giới có hơn
4.000 giống, được gọi chung là loài chó nhà (Canis familiaris), thuộc họ chó
(Canidae), bộ ăn thịt (Carnivora), lớp động vật có vú (Mammilia) (theo Trương Thị
Thanh Thảo, 2008).
2.1.2 Sơ lược về hệ thống tiêu hóa của chó
2.1.2.1 Xoang miệng:
Xoang miệng bao gồm: miệng (mõm), răng và lưỡi.
Miệng nằm ở phần thấp hơn, phía trước mặt gồm: hàm trên và hàm dưới.
Lưỡi: nằm trên sàn miệng, cấu tạo là một cơ thon dài, bề mặt được bao phủ
bởi một cấu trúc giống như những chiếc nấm nhỏ được gọi là nhú. Trên nhú có
những nụ vị giác.

12


Răng: gồm có thân răng và chân răng. Một chiếc răng có thể có một hay
nhiều chân răng, chân răng được cắm vào xương hàm. Thân răng được bao bọc bởi
nướu răng. Chó thường có 28 răng sữa (răng tạm thời) và 42 răng trưởng thành
(răng vĩnh viễn). Răng có nhiệm vụ xé nhỏ và nghiền nát thực phẩm (theo Bari

Spielman,

/>
teeth-and-mouth-in-dogs/page1.aspx).
2.1.2.2 Thực quản:
Thực quản là khoảng giữa vùng hầu và dạ dày, cấu tạo với ống cơ thẳng chạy
dài theo cổ được chấm dứt tại cơ vòng thượng vị cách cơ hoành vài centimet.
2.1.2.3 Dạ dày:
Dạ dày là chỗ phình ra của bộ máy tiêu hóa, nằm giữa thực quản và tá tràng.
Dạ dày có dạng chữ V hay chữ C và thay đổi theo sự đầy thức ăn. Với dung tích là
0,3-8 lít (100-150cc / kg thể trọng) dạ dày chia ra từng vùng không có giới hạn rõ
rệt bao gồm: thượng vị, đáy, thân dạ dày và hạ vị (Trần Thị Dân và Dương Nguyên
Khang, 2007).
2.1.2.4 Ruột:
Gồm ruột non và ruột già.
Ruột non bao gồm: tá tràng, không tràng và hồi tràng. Ruột non dài 2 – 4,8m,
đường kính 2,5cm.
*Sự tiêu hóa ở ruột non:
Các chất dinh dưỡng đều được phân hủy và hấp thu ở ruột non. Carbohydrate
và protein được phân hủy trong ruột non bởi enzyme dịch tụy và tế bào biểu mô
ruột. Sản phẩm phân hủy là hexose, peptite và acid amin. Sản phẩm tiêu hóa
carbohydrate và protein được hấp thu tích cực ở ruột non.

13


Ruột già bao gồm: manh tràng, kết tràng, trực tràng. Ruột già dài 0,6m,
đường kính 2,5cm và kích thước thay đổi tùy theo giống chó.
*Sự tiêu hóa ở ruột già:
Carbohydrate không được phân hủy và hấp thu ở ruột non sẽ được lên men ở

ruột già do các vi sinh vật. Ngoài ra ruột già còn hấp thu nước và ion (Trần Thị Dân
và Dương Nguyên Khang, 2007).

2.2 Sơ lược về hệ vi sinh vật trong đường ruột chó
Trước khi được sinh ra, dạ dày và đường ruột chó con không có vi sinh vật.
Trong khi sinh, thai tiếp xúc với vi sinh vật trong đường niệu dục của chó mẹ. Chỉ
24 giờ sau khi sinh số lượng vi khuẩn được tìm thấy ở chó con sơ sinh tương đương
với một con chó trưởng thành, và mặc dù mật độ vẫn ổn định trong tất cả các giai
đoạn phát triển, nhưng vẫn luôn có sự thay đổi trong tỷ lệ tương đối của các nhóm
khác nhau của vi khuẩn. Trong thời gian bú mẹ, có thể phân lập được lactobacilli,
bifidobacteria và clostridia từ phân chó con, và dần dần được thay thế bởi các vi
sinh vật khác như bacteroidies (Buddington, 1998). Có những thay đổi về số lượng
các vi khuẩn liên quan đến độ tuổi của chó, có thể đó là sự thay đổi các thành phần
của chế độ ăn uống, đặc biệt là trong thời gian cai sữa. Giá trị dinh dưỡng mà sữa
đem lại là sự gia tăng số lượng bifidobacteria, cho đến khi chó cai sữa, mật độ của
những vi khuẩn này giảm dần (Guglielmelli A., 2009).
Thành phần của chế độ ăn uống ảnh hưởng đến mật độ của vi khuẩn trong
đường tiêu hóa. Với chế độ ăn giàu protein có thể thúc đẩy sự phát triển của vi
khuẩn thủy phân protein, đặc biệt là clostridia, trong khi có một số loại thức ăn lên
men kích thích sự phát triển của vi khuẩn sử dụng đường, chẳng hạn như
bifidobacteria và lactobacilli.

14


Để có thể tồn tại các vi sinh vật đường ruột đều có hai đặc tính quan trọng:
khả năng bám dính và khả năng sống còn, được đảm bảo bởi việc sản xuất các
enzyme, chất độc và khả năng liên kết với sắt. Sau đó, mỗi loài có một sự trao đổi
chất khác nhau, có sự kiểm soát khác nhau cùng tồn tại và ảnh hưởng đến sự phát
triển của loài khác.

Các nhóm vi khuẩn chính thường được tìm thấy ở người và chó, bao gồm cả
clostridia, bacteroides, liên cầu khuẩn, coliforms, enterococci, lactobacilli và
veillonella (Smith, 1965; Greetham và cộng sự, 2002; Buddington, 2003; Rinkinen
et al, 2004).
Số lượng vi khuẩn gia tăng từ tá tràng đến ruột già phụ thuộc vào một số yếu
tố, các yếu tố nội sinh và ngoại sinh, chẳng hạn như nhu động ruột, sự sẵn có của
chất nền, các chất tiết kìm khuẩn và diệt khuẩn như axit dạ dày, mật và tụy.
Maskell và Johnson (1993) cho rằng ruột già là một hệ thống phức tạp liên
quan đến nhiều loại vi sinh vật và hàng trăm loài vi khuẩn. Nhiều vi khuẩn kỵ
khí, Streptococcus, Lactobacillus, Bacteroides và Clostridium (theo Guglielmelli
A., 2009).
So với ruột non thì hệ vi sinh vật ở ruột già phân bố phức tạp hơn. Số loài vi
khuẩn tăng lên rất nhiều (Vũ Văn Ngữ, 1978). Ngoài vi khuẩn E. coli chiếm tới
75% tổng số vi khuẩn ở ruột già, còn có các vi khuẩn khác như: Enterococcus, trực
khuẩn có nha bào… Ngoài ra, trong ruột già còn có thể tìm thấy một số vi sinh vật
gây bệnh như: trực khuẩn phó thương hàn (Salmonella paratyphi), vi khuẩn thương
hàn (Salmonella typhi), Brucella, Clostridium spp.… những vi khuẩn này có thể
theo phân ra ngoài.
Theo Vũ Văn Ngữ (1978), có thể chia hệ vi sinh vật đường ruột thành hai
nhóm: nhóm vi sinh vật tùy nghi và nhóm vi sinh vật bắt buộc.

15


-

Nhóm vi sinh vật tùy nghi là những vi sinh vật được đi vào đường ruột bằng
thức ăn và nước uống. Chúng cư trú tạm thời và được thải ra theo phân gồm
cá loại cầu khuẩn, trực khuẩn đường ruột, nấm men, Proteus, E. coli gây
dung huyết và một số vi sinh vật khác.


-

Nhóm vi sinh vật bắt buộc là những vi sinh vật có thường xuyên trong đường
ruột, chúng hỗ trợ cho quá trình tiêu hóa và hấp thu thức ăn. Phần lớn là
những vi sinh vật kỵ khí và kỵ khí tùy nghi như Bifidobacterium bifidum,
Bacteriodes, E. coli, Enterococcus, Lactobacillus acidophilus…
Tô Minh Châu (2000) cho biết người ta cũng phân chia vi sinh vật đường

ruột thành 3 nhóm dựa vào số lượng của chúng trong đường ruột như nhóm hệ phổ
chính chiếm 90% (ví dụ như: Bifidobacterium, Bacteriode, Lactobacillus…), nhóm
hệ phổ vệ tinh chiếm gần 10% (phần lớn là vi khuẩn kỵ khí không bắt buộc như
Enterococci, Bacillus…) và nhóm tùy nghi chiếm khoảng 0,1% (bao gồm: nấm
men, Clostridium, Proteus, Salmonella…) (theo Chu Việt Cường, 2005).
Vai trò sinh lý của hệ vi sinh vật đường ruột
Tham gia vào quá trình phân giải chất xơ và tinh bột thành acid lactic và acid
succinic, đồng thời chúng sinh ra các loại khí H2, CH4, CO2 và tiếp tục phân giải tạo
ra các chất khác làm cho phân có mùi đặc biệt.
Thủy phân urea và làm giảm bilirubin ở ruột.
Tổng hợp vitamin nhóm B và vitamin K ở manh tràng.
Khử độc và phân hủy một số thuốc có độc tính thành các dẫn xuất không độc
(theo Chu Việt Cường, 2005).
Sự hiện diện của vi khuẩn đường ruột là một điều kiện tiên quyết cho sự phát
triển các chức năng tiêu hóa và hấp thụ chất dinh dưỡng trong ruột và để kích hoạt
sự hoạt động của hệ thống miễn dịch (theo Guglielmelli A., 2009).
2.2.1 Sơ lược về nhóm vi khuẩn lactic

16



2.2.1.1 Vi khuẩn lactic
Những vi khuẩn lên men lactic được gọi là vi khuẩn lactic. Vi khuẩn lactic
được đặc trưng bởi khả năng sinh lactic rất mạnh từ các loại đường khác nhau, đặc
biệt là đường lactose.
Năm 1780, nhà bác học người Thụy Điển Scheele lần đầu tiên tách axit lactic
từ sữa bò lên men chua. Năm 1878, Lister phân lập thành công vi khuẩn lactic đầu
tiên và đặc tên là Bacterium lactis (nay gọi là Streptococcus lactic). Về sau các nhà
khoa học liên tiếp phân lập được nhiều loại vi khuẩn sinh lactic khác nhau nữa (theo
Phạm Thị Trúc Phương, 2006).
2.2.1.2 Sơ lược về phân loại vi khuẩn lactic (theo Nguyễn Tuấn Nghĩa, 2009)
Vi khuẩn lactic có thể phân loại theo:
 Lượng sản phẩm tạo thành:
-

Lên men đồng hình: là con đường lên men tạo ra sản phẩm chủ yếu là acid
lactic không tạo ra rượu etylic và CO2. Một số chủng lên men lactic đồng
hình: Lactobacillus bulgaricus, Streptococcus thermophilus, Lactobacillus
acidophilus.

-

Lên men dị hình: là con đường lên men tạo ra ít hơn 50% acid lactic và tạo ra
các sản phẩm khác như acid acetic, CO2 và etanol. Một số chủng lên men dị
hình như: Lactobacillus casei, Bifidobacterium. Đây là cách phân loại
thường được sử dụng vì nó đề cập đến cơ chế lên men đường – cơ chế có
ứng dụng lớn của vi khuẩn lactic.
Bảng 2.1. Một số loại vi khuẩn lên men đồng hình, dị hình
Đồng hình

Dị hình


Streptococcus lactic

Leuconotoc mesenteroider

Streptococcus cremoris

Leuconotoc cremoris

Streptococcus thermophilus

Betabacterium

Streptococcus diacetylactic

Lactobacillus brevis

17


Pediococcus cerevisiae

Lactobacilluc fermentatum

Lactobacillus lactic

Bifidobacterium

Lactobacillus heveticus
Lactobacillus acidophilus

Lactobacillus bulgaricus
Lactobacillus derdruckii
Lactobacillus casei
Lactobacillus plantarum
 Nhiệt độ phát triển:
-

Nhóm ưa ấm: nhiệt độ thích hợp 25 – 30oC, ví dụ: Lactobacillus casei.

-

Nhóm ưa nhiệt: nhiệt độ thích hợp 40 – 50oC, ví dụ Lactobacillus
bulgaricus, Streptococcus thermophilus.

-

Nhóm ưa lạnh: nhiệt độ thích hợp 0 – 15oC

 Nhu cầu oxi:
-

Yếm khí tùy tiện: có thể phát triển trong điều kiện hiếm khí và hiếu khí tuy
nhiên phát triển mạnh trong điều kiện yếm khí. Phần lớn vi khuẩn lactic
thuộc loại này.

-

Yếm khí: không thể phát triển trong điều kiện hiếu khí, ví dụ như
Bifidobacterium.


 Đặc điểm hình thái:
-

Cầu khuẩn: những tế bào có hình cầu hoặc hình ovan thường có đường kính
từ 0,5 – 2 µm, sắp xếp riêng biệt, thành cặp, thành chuỗi. Một số loại vi
khuẩn lactic dạng cầu như: Streptococcus, Lactococcus, Vagococcus,
Enterococcus, Pediococcus, Leuconostoc…

18


-

Trực khuẩn: những tế bào hình que có kích thước rộng 0,5 – 2 µm, dài 1 – 10
µm. Một số dạng vi khuẩn lactic hình que: Lactobacillus.
Ngoài ra vi khuẩn lactic còn được phân loại theo đặc điểm sinh lý sinh hóa,

đặc điểm cấu trúc, đặc điểm miễn dịch.
2.2.2 Sơ lược về Escherichia coli
Năm 1885, tại München (Đức), trong việc nghiên cứu về bệnh tiêu chảy,
Theodor Escherich đã phát hiện từ trong tã lót của trẻ em một loại vi khuẩn và vi
khuẩn đó được công bố với tên gọi đầu tiên là Bacterium coli commune. Chỉ 4 năm
sau vi khuẩn này được giới chuyên môn đổi tên thành Escherich nhằm tri ân người
có công khám phá. Tuy nhiên, vào năm 1895 nó được gọi bằng tên Bacillus coli và
Bacterium coli vào một năm sau đó. Năm 1991, vi khuẩn kia được định danh thống
nhất toàn cầu là Escherichia coli.
E. coli là những vi khuẩn ký sinh bình thường trong đường ruột của động vật
máu nóng (gồm chim và động vật có vú), vi khuẩn này cần thiết cho quá trình tiêu
hóa thức ăn và là một thành phần trong hệ vi sinh đường ruột. Bên cạnh đó E. coli
cũng là tác nhân gây bệnh khi chúng xâm nhập vào các cơ quan khác như đường

niệu, đường máu...và có một số chủng E. coli có khả năng gây bệnh ỉa chảy.
E. coli là trực khuẩn gram âm, hai đầu tròn, di động do có lông quanh thân,
một số chủng E. coli có vỏ polysaccharide, không sinh nha bào, kích thước trung
bình 0,5 x 1 – 3 µm.
E. coli là vi khuẩn hiếu khí hoặc kỵ khí không bắt buộc, phát triển dễ dàng
trên các môi trường nuôi cấy thông thường, một số có thể phát triển được ở môi
trường tổng hợp đơn giản. Nhiệt độ thích hợp 370C, pH thích hợp là 7 - 7,2.
Một số chủng E. coli hoạt động như tác nhân gây bệnh ở chó và mèo gây ra
các bệnh đường ruột và ngoài đường ruột. Các vi khuẩn E. coli gây bệnh được chia
làm năm nhóm:

19


-

Enterotoxigenic E. coli (ETEC) gây bệnh tiêu chảy bằng cách tiết ra 2 loại
độc tố: ST (độc tố chịu nhiệt) và LT (độc tố không chịu nhiệt).

-

Enteropathogenic E. coli (EPEC): gây tiêu chảy, không sinh độc tố đường
ruột nhưng có yếu tố kết dính bám vào màng nhầy ruột phá hủy nhung mao
ruột.

-

Enteroaggregative E. coli (EaggEC): gây viêm tế bào ruột dẫn đến tiêu chảy.

-


Enteroinvasive E. coli (EIEC): bám vào niêm mạc ruột làm tróc niêm mạc,
gây loét dẫn đến tiêu chảy có lẫn máu.

-

Enterohemorrhagic E. coli (EHEC): chỉ tác dụng lên ruột già, xâm nhập và
khuếch tán qua tế bào niêm mạc ruột gây đau bụng quặn, tiêu chảy lẫn máu.
Chỉ EPEC và ETEC là liên quan đến bệnh trên đường ruột ở chó (theo
Lothar Beutin, 1998).

2.3 Lượt duyệt các nghiên cứu có liên quan đến đề tài
Năm 2003, Buddington R. K., Sở Khoa học sinh học, trường Cao đẳng Nghệ
thuật và Khoa học, trường Cao đẳng Thú y, Đại học bang Mississippi đã nghiên cứu
về “Những thay đổi trong các quần thể vi khuẩn ở đường tiêu hóa của chó con sau
khi sinh”. Ông đi đến kết luận: vào ngày thứ nhất sau khi sinh, toàn bộ đường tiêu
hóa của chó đã hiện diện tất cả các nhóm vi khuẩn được nghiên cứu. Trong quá
trình phát triển tiếp theo, có những thay đổi tương đối trong tỷ lệ của các nhóm vi
khuẩn khác nhau, các nhóm kỵ khí ngày càng tăng trong số lượng tuyệt đối và
tương đối.
Năm 2005, Suchodolski và Jan S. (Mỹ) có một nghiên cứu “Đánh giá hệ vi
sinh đường ruột chó bằng cách sử dụng phương pháp phân tử và đánh dấu huyết
thanh”. Mục đích của nghiên cứu này là để mô tả thành phần và động lực của vi

20


sinh đường ruột chó bằng cách sử dụng các phương pháp phân tử dựa trên việc xác
định DNA ribosome 16S (16S rDNA) và đánh giá việc sử dụng lâm sàng của xét
nghiệm 13C-glycocholic máu acid (13CGCBT) như dấu hiệu huyết thanh cho sinh

khối vi khuẩn ở ruột non.
Năm 2007, Biagi G. và cộng sự đã nghiên cứu “Hiệu lực của chủng
Lactobacillus animalis trên thành phần và quá trình trao đổi chất của vi sinh đường
ruột ở chó trưởng thành”. Họ đạt được kết quả: chủng LA4 có thể tồn tại trong
đường tiêu hóa, bao phủ bề mặt ống tiêu hóa ảnh hưởng đến thành phần và quá trình
trao đổi chất của hệ vi sinh đường ruột, trở thành một probiotic tiềm năng cho chó.
Năm 2010, các nhà nghiên cứu tại Đại học Illinois (theo Jennifer Shike,
2010) đã có những bước tiến trong việc đưa ra biện pháp can thiệp bằng chế độ ăn
uống để chống sự nhiễm trùng đường tiêu hóa trên chó thông qua công nghệ tiên
tiến DNA. Sau khi sử dụng khoảng 1.000.000 trình tự DNA, nhóm nghiên cứu đã
xác định con đường trao đổi chất tồn tại trong vi khuẩn đường ruột của động vật
khỏe mạnh gồm quá trình trao đổi các chất dinh dưỡng, độc lực và phản ứng lại với
stress.

21


Chương 3
NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM
3.1 Địa điểm và thời gian thực hiện
3.1.1 Địa điểm
Phòng vi sinh bộ môn Vi Sinh Truyền Nhiễm, khoa Chăn Nuôi Thú y,
trường Đại Học Nông Lâm TP.HCM
3.1.2 Thời gian
Từ tháng 2/2011 đến tháng 6/2011
3.2 Vật liệu thí nghiệm
3.2.1 Mẫu khảo sát
20 mẫu phân của chó con từ 0 – 3 tháng tuổi
20 mẫu phân của chó trên 3 tháng – 1 năm tuổi
20 mẫu phân của chó trên 1 năm tuổi

Tất cả các mẫu đều lấy trên chó nuôi ở các hộ dân.
3.2.2 Môi trường
Eosin Methylene Blue Agar (EMB), Methyl Red (MR), Voger Proskauer
(VP), Kligler Iron Agar (KIA), Simmons Citrate Agar, Escherichia coli broth.
De Man Rogosa Sharpe Broth (MRSB), De Man Rogosa Sharpe Agar
(MRSA).
3.2.3 Hóa chất
Thuốc thử Kowacs, methyl red, NaOH 40%, H2O2 3%, bromorezol tím…

22


3.2.4 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm
- Thiết bị: tủ ấm, tủ sấy, bình yếm khí…
- Dụng cụ: que cấy vòng, que cấy thẳng, que trang, ống đong, đĩa petri, đèn
cồn…
3.3 Nội dung đề tài
Đếm số lượng vi khuẩn E. coli và các vi khuẩn sinh acid lactic.
So sánh số lượng vi khuẩn E. coli và các vi khuẩn sinh acid lactic trên chó ở
mọi lứa tuổi và giữa các hình thức nuôi dưỡng.
3.4 Phương pháp thí nghiệm
3.4.1 Phương pháp lấy mẫu
Lấy mẫu trực tiếp trên phân khi thú vừa thải phân, bỏ vào hủ đã được hấp tiệt
trùng rồi cho vào thùng có đá ướp lạnh để bảo quản và vận chuyển. Xử lý mẫu trong
vòng 24h kể từ khi lấy mẫu.
3.4.2 Phương pháp đếm số lượng vi khuẩn bằng phương pháp pha loãng tới
hạn (Most Propable Number – MPN)
3.4.2.1 Đếm số lượng vi khuẩn Escherichia coli
*Vật liệu:
Dịch mẫu pha loãng bậc 10 ở 3 nồng độ liên tiếp nhau.

Môi trường canh chuyên biệt EC dùng kiểm tra vi khuẩn E. coli. Chuẩn bị 3
ống môi trường có ống durham cho mỗi nồng độ của dịch pha loãng, mỗi mẫu
chuẩn bị 9 ống môi trường cho 3 độ pha loãng liên tục.
*Thực hiện:

23


Dùng pipette vô trùng, bằng thao tác vô trùng, lấy 1 ml dịch mẫu cho vào
ống môi trường canh chuyên biệt EC, nuôi cấy vi khuẩn ở 44oC trong 24h. Mỗi độ
pha loãng cấy 3 ống.
*Đọc kết quả:
Phản ứng dương tính: có bọt khí trong ống durham, nghĩa là có sự hiện diện
của vi khuẩn E. coli.
Phản ứng âm tính: không có bọt khí bên trong ống durham, nghĩa là không
có sự hiện diện của vi khuẩn E. coli.
*Quan sát hình thái khuẩn lạc và tế bào
Sau khi chọn những ống chứa môi trường canh chuyên biệt EC dương tính, chúng
tôi tiến hành xác định sự hiện diện của vi khuẩn E.coli bằng cách nuôi cấy và kiểm
tra IMViC.
-

Hình thái khuẩn lạc: tròn ướt, hơi lồi, để lâu có dạng khô rìa hơi nhăn.
Kích thước khuẩn lạc: 1 – 3 mm.

-

Hình thái tế bào: trực khuẩn Gram âm, nhìn chung kích thước trung bình
khoảng 0,5 x 1 – 3µm, 2 đầu tròn, không bào tử, có giáp mô, có tiên mao,
di động được.


*Định danh vi khuẩn E. coli bằng các phản ứng sinh hóa (Carter, 1975)
Đặc tính sinh hóa
Vi khuẩn

KIA

Indole

MR

VP

Citrat

Glucose

Lactose

H2S

Gas

E. coli

+

+

-


+

+

+

-

-

Klebsiella. spp

+

+

-

+

+/-

-

+/-

+

Enterobacter


+

+/-

-

+

-

-

-

+

Môi trường Kligler Iron Agar (KIA): dùng que cấy thẳng cấy vi khuẩn nghi
ngờ từ ống giống TSA vào ống nghiệm chứa thạch nghiêng KIA, giữ ở 37oC trong

24


24h. Kết quả: E. coli lên men đường lactose và glucose, sinh hơi nhưng không sinh
H2S.
Môi trường kiểm tra tính sinh indol: dùng que cấy vòng cấy vi khuẩn nghi
ngờ từ ống giống TSA vào ống nghiệm chứa môi trường TSB, giữ ở 37oC trong
24h. Nhỏ vào môi trường nuôi cấy vài giọt thuốc thử Kowacs. Kết quả: E. coli cho
phản ứng dương tính (+), trên bề mặt môi trường xuất hiện vòng màu đỏ.
Phản ứng MR (Methyl Red): dùng que cấy vòng cấy vi khuẩn nghi ngờ từ

ống giống TSA vào ống nghiệm chứa môi trường Clark – Lubs, ủ ở 37oC trong 24h.
Nhỏ vào môi trường 2 – 3 giọt methyl red. Kết quả: E. coli cho phản ứng dương
tính (+), màu của môi trường có màu đỏ.
Phản ứng VP (Voges – Proskauer): dùng que cấy vòng cấy vi khuẩn nghi
ngờ từ ống giống TSA vào ống nghiệm chứa môi trường TSB, giữ ở 37oC trong
24h. Cho vào môi trường nuôi cấy 0,5ml NaOH 40%, sau đó nhỏ thêm vài giọt α –
naphtol 10%, lắc kỹ, đợi 5 – 10 phút. Kết quả: E. coli cho phản ứng âm tính (-),
phần phía trên môi trường không có màu đỏ nhạt.
Phản ứng kiểm tra sự sử dụng citrate: dùng que cấy vòng cấy vi khuẩn nghi
ngờ từ ống giống TSA vào ống nghiệm chứa môi trường Simmon Citrate, giữ ở
37oC trong 24h. Kết quả: E. coli cho phản ứng âm tính (-), môi trường vẫn giữ
nguyên màu xanh lá ban đầu.
. *Cách tính:
_ Ghi số ống dương tính ở từng độ pha loãng theo thứ tự từ độ pha loãng thấp nhất
đến cao nhất.
_ Tra bảng Mac Crady theo số ống dương tính vừa ghi được để tìm chỉ số MPN.
_ Nhân chỉ số MPN vừa tìm được theo bảng Mac Crady với hệ số pha loãng của độ
pha loãng thấp nhất sẽ tính được số lượng tế bào vi khuẩn E. coli có thể có trong 1
ml dịch mẫu nguyên.

25