BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
ỨNG DỤNG KỸ THUẬT REAL TIME RT-PCR SỬ DỤNG
EVAGREEN ĐỊNH LƯỢNG VÀ ĐỊNH CHỦNG VI-RÚT
GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP
TRÊN HEO (PRRSV)

Ngành học

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Niên khoá

: 2007 – 2011

Sinh viên thực hiện

: NGUYỄN VĂN CHÍ

Tháng 7 năm 2011


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC


KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ỨNG DỤNG KỸ THUẬT REAL TIME RT-PCR SỬ DỤNG
EVAGREEN ĐỊNH LƯỢNG VÀ ĐỊNH CHỦNG VI-RÚT
GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP
TRÊN HEO (PRRSV)

Hướng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

PGS.TS. TRẦN THỊ DÂN

NGUYỄN VĂN CHÍ

KS. VÕ KHÁNH HƯNG

Tháng 7 năm 2011


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên mà tôi muốn nói đó là: “Con xin cảm ơn cha mẹ và các anh chị thật
nhiều!”. Gia đình mình đã luôn bên cạnh con, động viên và giúp đỡ con trong những
lần “té ngã” để đứng lên trong cả quá trình dài học tập trong như trong cuộc đời này.
Em xin cảm ơn các Thầy Cô của trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí
Minh – Bộ môn Công nghệ sinh học đã tận tình giảng dạy, truyền đạt cho em những
kiến thức khoa học, kiến thức chuyên ngành, cũng như những kinh nghiệm quý báu
trong những năm học tại trường tạo cho em nguồn động lực nghiên cứu khoa học.
Lòng biết ơn chân thành sâu sắc xin được gửi đến PGS.TS. Trần Thị Dân và
KS. Võ Khánh Hưng, người đã dành hết nhiệt tâm và trách nhiệm để hướng dẫn, chỉ

dạy em trong suốt quá trình thực hiện đề tài này.
Xin chân thành cảm ơn đến ban lãnh đạo Viện Công Nghệ Sinh Học và Môi
Trường và Công ty Nam Khoa đã giúp đỡ em trong quá trình thực hiện đề tài.
Xin gửi lời cảm ơn đến các bạn lớp DH07SH, Đại học chính quy khóa 2007 2011 đã quan tâm và động viên mình trong thời gian học tập và thực hiện đề tài. Đặc
biệt gửi lời cảm ơn đến KS. Nguyễn Phan Thành, chị Trang (công ty Nam Khoa)
nhóm nghiên cứu và bạn Lê Thị Thơm đã giúp đỡ về mặt tinh thần, một nguồn động
lực lớn trong quá trình học tập và nghiên cứu.

i


TÓM TẮT
Đề tài: “Ứng dụng kỹ thuật real time RT-PCR sử dụng EvaGreen nhằm định
lượng và định chủng vi-rút gây bệnh rối loạn sinh sản và hô hấp trên heo (PRRSV)” có
ý nghĩa quan trọng trong phòng chống và ngăn ngừa sự lây lan hội chứng rối loạn sinh
sản và hô hấp trên heo. Mẫu máu được thu thập trên các heo có dấu hiệu nghi ngờ
nhiễm bệnh PRRS được ly trích RNA của virus. Quy trình real time RT-PCR được
dùng để định lượng và định chủng RNA của virus PRRS trên các mẫu thu thập.
Phản ứng real time RT-PCR sử dụng chất phát huỳnh quang EvaGreen dựa trên đường
chuẩn plasmid DNA gắn khung đọc mở ORF7 đã được xây dựng. Kết quả thu được
gồm:
Đường chuẩn real time RT-PCR với DNA tạo bằng phương pháp plasmid
DNA. Toàn bộ vùng ORF7 của bộ gen PRRSV được gắn vào plasmid pGEM T Easy
và chuyển vào tế bào chủ E. coli DH5α.
Cặp mồi F7 và R7 sử dụng trong quy trình real time RT-PCR cho phép định
chủng và định lượng PRRSV trên hai chủng Bắc Mỹ (NA), Châu Âu (EU). Độ nhạy
trong quy trình real time RT-PCR là 101 bản sao. Tính đặc hiệu của phản ứng được
khẳng định với PCV (porcine circovirus).
Phân biệt chủng PRRSV châu Âu và PRRSV Bắc Mỹ dựa vào sự chệnh lệch về
nhiệt độ Tm khi phân tích đường cong nhiệt độ nóng chảy. Nhiệt độ Tm sản phẩm

khuếch đại PRRSV châu Âu là 83,4oC và PRRSV Bắc Mỹ là 84,4oC.
Lượng PRRSV trong máu nhiều hơn so với mẫu ngoáy hầu họng trong từ 4 – 8
tuần tuổi.
Như vậy quy trình real time RT-PCR sử dụng EvaGreen cho kết quả nhanh,
nhạy, chính xác trong việc định chủng và định lượng PRRSV trong mẫu bệnh phẩm.
Điều này giúp cho việc sử dụng vacxin hiệu quả hơn và giảm thiệt hại kinh tế cho
người chăn nuôi.

ii


SUMMARY
Recently, the Vietnam pig livestock industry has been influenced by infection
diseases. Especially, porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) which
caused by PRRSV is detrimental to economy. The thesis: “To establish EvaGreenbased real time RT-PCR assay for quantifying and genotyping porcine reproduction
and respiratory virus” plays an important role to control and prevent the widespread of
the virus. Blood and swab samples taken from swines suspected of PRRSV infection
were extracted to get virus RNA. The real time RT-PCR protocol was used to quantify
and genotype PRRSV RNA in the collected samples. A standard curve used in the
EvaGreen-based real time RT-PCR assay was created by a plasmid DNA template. All
the length of ORF7 of PRRSV genome was inserted into pGEM T Easy plasmid.
Results obtained from the study:
A pair of primers F7 and R7 used in the EvaGreen-based real time RT-PCR
assay could quantify and distinguish the genotypes of PRRSV. The sensibility of the
assay was 101 copies. The speciality of the assay was confirmed by using PCV
(porcine circovirus).
Genotyping of EU PRRSV and US PRRSV was based on the differences of Tm
when considering melt curve analysis. The Tm temperature of EU PRRSV
amplification product was 83,4oC and the Tm temperature of US PRRSV amplification
product was 84,4oC.

The number of virus in the blood sample was larger than that of the swab one in
the period of 4 – 8 weeks old.
In conclusion, by using the EvaGreen-based real time RT-PCR assay, we could
offer quick, sensitive and accurate results of testing for quantify and genotype PRRSV.
It helps for using vaccine more effectively and decreases the economic devastation.

iii


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN...................................................................................................................... i
TÓM TẮT...........................................................................................................................ii
SUMMARY...................................................................................................................... iii
DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT ......................................................................................vii
DANH SÁCH CÁC BẢNG ........................................................................................... viii
DANH SÁCH CÁC HÌNH ................................................................................................ix
Chương 1 MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1
1.1. Đặt vấn đề ................................................................................................................ 1
1.2. Yêu cầu..................................................................................................................... 2
1.3. Nội dung thực hiện ................................................................................................... 2
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................................. 3
2.1. Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở heo ........................................................... 3
2.2. Vi-rút gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở heo (PRRSV) .......................... 4
2.2.1. Các chủng PRRSV và sự phân bố của chúng .................................................... 5
2.2.2. Cấu trúc phân tử của PRRSV ............................................................................ 7
2.2.2.1. Cấu trúc virion ............................................................................................. 7
2.2.2.2. Tổ chức bộ gen của PRRSV ........................................................................ 8
2.2.3. Cơ chế sinh bệnh.............................................................................................. 10
2.3. Một số phương pháp chẩn đoán trong phòng thí nghiệm ...................................... 11
2.3.1. Chẩn đoán PRRSV trên môi trường nuôi cấy tế bào ....................................... 11

2.3.2. Phương pháp kháng thể huỳnh quang và hoá mô miễn dịch ........................... 12
2.3.3. Kỹ thuật huỳnh quang gián tiếp....................................................................... 12
2.3.4. Kỹ thuật RT-PCR chẩn đoán PRRSV.............................................................. 12
2.4. Kỹ thuật real time RT-PCR .................................................................................... 13
2.4.1. Kỹ thuật real time PCR .................................................................................... 13
2.4.1.1 Nguyên tắc kỹ thuật real time PCR ............................................................ 13
2.4.1.2. Hóa chất định lượng .................................................................................. 14
2.4.1.3. Công cụ phát hiện ...................................................................................... 19
2.4.1.4. Phân tích dữ liệu real time PCR ................................................................ 19
2.4.1.5. Ưu và nhược điểm ..................................................................................... 23
iv


2.4.1.6. Ứng dụng ................................................................................................... 23
2.4.2. Phương pháp tổng hợp cDNA với mồi ngẫu nhiên ......................................... 24
2.5. Sơ lược các nghiên cứu có liên quan ..................................................................... 24
2.5.1. Trên thế giới..................................................................................................... 24
2.5.2. Trong nước....................................................................................................... 25
Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................................... 26
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu.......................................................................... 26
3.2. Nội dung nghiên cứu .............................................................................................. 26
3.3. Vật liệu và hóa chất ................................................................................................ 26
3.3.1. Vật liệu nghiên cứu .......................................................................................... 26
3.3.2. Hóa chất ........................................................................................................... 26
3.4. Phương pháp tiến hành........................................................................................... 28
3.4.1. Thu nhận mẫu .................................................................................................. 28
3.4.2. Ly trích RNA từ huyết thanh ........................................................................... 29
3.4.3. Đánh giá đoạn mồi dùng trong phản ứng real time RT-PCR .......................... 30
3.4.3.1 Đánh giá khả năng khuếch đại của đoạn mồi ............................................ 32
3.4.3.2 Đánh giá khả năng khuếch đại của đoạn mồi ............................................. 32

3.4.4. Xây dựng đường chuẩn (standard curve) ........................................................ 32
3.4.5. Thực hiện phản ứng real time RT-PCR ........................................................... 34
3.4.5.1. Phản ứng phiên mã ngược (reverse transcription) .................................... 34
3.4.5.2. Phản ứng real time PCR ............................................................................ 34
3.4.5.3 Đánh giá khả năng định lượng của phương pháp real time RT-PCR ........ 35
3.4.5.4. Đánh giá khả năng định chủng của phương pháp real time RT-PCR ....... 36
3.4.6. Ứng dụng phương pháp real time RT-PCR để kiểm tra mầm bệnh PRRS ..... 36
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................................... 38
4.1. Đánh giá đoạn mồi dùng trong phản ứng real time RT-PCR ................................ 38
4.2. Xây dựng đường chuẩn .......................................................................................... 39
4.2.1. Phản ứng RT-PCR khuếch đại vùng gen chứa ORF7...................................... 40
4.2.2. Kiểm tra plasmid chèn đoạn gen ORF7........................................................... 40
4.2.2.1. Ly trích plasmid từ khuẩn lạc .................................................................... 41
4.2.2.2 Kiểm tra plasmid DNA bằng PCR ............................................................. 41
4.3 Kết quả thực hiện real time RT-PCR ...................................................................... 42
v


4.3.1. Đánh giá khả năng định lượng của phương pháp real time RT-PCR .............. 42
4.3.2 Tính đặc hiệu của phản ứng real time RT-PCR................................................ 45
4.3.3. Kết quả phân tích đường cong nhiệt độ nóng chảy định chủng PRRSV......... 46
4.4. Ứng dụng phương pháp real time RT-PCR để định chủng và định lượng PRRS . 47
4.4.1. Định lượng ....................................................................................................... 47
4.4.2. Định chủng....................................................................................................... 48
Chương V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................................ 52
5.1. Kết luận .................................................................................................................. 52
5.2. Đề nghị ................................................................................................................... 52
TÀI LIỆU THAM KHẢO ................................................................................................ 53
I. Tiếng Việt .................................................................................................................. 53
II. Tiếng Anh ................................................................................................................. 53

PHỤ LỤC

vi


DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT
aa

Acid amin

cDNA

Complementary deoxyribonucleotide acid

Ct

Threshold cycle

dNTP

Deoxyribonucleoside triphosphate

EDTA

Ethylene diamine tetra acetic acid

EU

European


IFA

Indirect flourescent antibody

IPMA

Immunoperoxidase monolayer assay

LOD

Limit of detection

MSD

Mystery swine disease

NA

North American

ORF

Open reading frame

PAMs

Porcine alveolar macrophage

PRRS


Porcine reproductive and respiratory syndrome virus

qPCR

PCR quantitative

RNA

Ribonucleic acid

RT-PCR

Reverse transcriptase polymerase chain reaction

TBE

Tris borate EDTA

TE

Tris EDTA

UTR

Untranlated region

vii


DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng 2.1 Tỉ lệ tương đồng về trình tự gen của các chủng PRRSV.................................6
Bảng 3.1 Nguồn mẫu nghiên cứu..................................................................................28
Bảng 3.2 Cặp đoạn mồi trong phản ứng real time RT-PCR. ........................................31
Bảng 3.3 Thành phần các chất trong phản ứng phiên mã ngược. .................................34
Bảng 3.4 Quy trình nhiệt của phản ứng phiên mã ngược. ............................................34
Bảng 3.5 Thành phần một phản ứng real time PCR .....................................................34
Bảng 3.6 Chu kỳ nhiệt phản ứng real time PCR ...........................................................35
Bảng 4.1 Phân tích sản phẩm khuếch đại 2 mẫu vacxin và các trình tự tham khảo .....39
Bảng 4.2 Hệ số biến động giá trị Ct ..............................................................................43
Bảng 4.3 Kết quả định lượng một số mẫu thực địa, vacxin, và dịch tế bào nuôi cấy...48
Bảng 4.4 Nhiệt độ nóng chảy sản phẩm khuếch đại của các mẫu xét nghiệm .............50

viii


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 2.1 Sơ đồ phân bố bệnh PRRS tại các nước trên thế giới. .....................................4
Hình 2.2 Hình dạng bên ngoài PRRSV. .........................................................................5
Hình 2.3 Cây phân bố giống, loài của một số chủng PRRSV ........................................6
Hình 2.4 Cấu trúc bộ gen PRRSV ..................................................................................9
Hình 2.5 Đại thực bào trước và sau khi nhiễm PRRSV. ..............................................11
Hình 2.6 Thuốc nhuộm huỳnh quang SYBR Green I liên kết với DNA ......................15
Hình 2.7 Cơ chế hoạt động của mẫu dò Taqman..........................................................18
Hình 2.8 Hệ thống CFX96 REAL TIME PCR System. ...............................................19
Hình 2.9 Biểu đồ khuếch đại dựa trên hiệu số của tín hiệu nền huỳnh quang .............20
Hình 2.10 Đường chuẩn cho phản ứng định lượng. .....................................................21
Hình 2.11 Biểu đồ phân tích đường cong nhiệt độ nóng chảy .....................................22
Hình 3.1 Ví trí trình tự đoạn mồi F7 và R7. .................................................................31
Hình 3.2 Sự chệnh lệch về kích thước sản phẩm khuếch đại giữa 2 chủng PRRSV....32
Hình 3.3 Sơ đồ quy trình tạo DNA tái tổ hợp dùng trong xây dựng đường chuẩn. .....33

Hình 3.4 Sơ đồ thực hiện phản ứng real time RT-PCR. ...............................................37
Hình 4.1 Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR cặp đoạn mồi F7 và R7..........................38
Hình 4.2 Kết quả điện di sản phẩm RT-PCR vùng ORF7 với primer F3 và R3.. Error!
Bookmark not defined.
Hình 4.3 Kết quả điện di plasmid sau khi ly trích. .......................................................41
Hình 4.4 Kết quả kiểm tra plasmid DNA bằng PCR. ...................................................42
Hình 4.5 Biểu đồ khuếch đại các mức pha loãng từ 100 đến 108 bản sao. ....................42
Hình 4.6 Độ lập lại khuếch đại các mức pha loãng từ 100 đến 108 bản sao..................43
Hình 4.7 Đường tuyến tính đường chuẩn. ....................................................................44
Hình 4.8 Biểu đồ khuếch đại đối chứng dương ............................................................44
Hình 4.9 Biểu đồ khuếch đại mẫu PCV dương tính.. ...................................................45
Hình 4.10 Biểu đồ phân tích đường cong nhiệt độ nóng chảy .....................................46
Hình 4.11 Đồ thị đường cong nhiệt độ nóng chảy của mẫu PRRSV thực địa. ............49

ix


Chương 1 MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Ngành chăn nuôi chiếm một ví trí quan trọng trong nền kinh tế nước ta. Chăn
nuôi chiếm hơn 21% giá trị sản xuất nông nghiệp, trong đó chăn nuôi heo chiếm 60%
giá trị sản xuất toàn ngành. Tổng đàn heo Đông Nam Bộ là 2,63 triệu con, trong đó
ngành chăn nuôi TP.HCM chiếm 12,05% (hơn 317 ngìn con) (Cục Chăn nuôi, 2008).
Với sự phát triển mạnh mẽ như vậy thì các nhà chăn nuôi cũng phải đối mặt với rất
nhiều nguy cơ đặc biệt là mầm bệnh gây tổn thất rất nghiêm trọng. Một trong những
vấn đề nổi lên trong thời gian vừa qua, gây ảnh hưởng không nhỏ đến ngành chăn nuôi
là hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp trên heo (PRRS: porcine reproductive and
respiratory syndrome).
Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp (PRRS) hay còn gọi là bệnh heo tai xanh
đã trở thành đại dịch ở heo, gây rất nhiều thiệt hại về kinh tế cho người chăn nuôi. Đặc

biệt là trận dịch lớn xảy ra ở Trung Quốc năm 2006 với đột biến chủng mất 30 acid
amin vùng NSP2 tạo thành chủng độc lực cao gây thiệt hại nặng nề cho nền kinh tế
nước này. Chủng vi-rút này sau đó cũng được báo cáo xuất hiện tại Việt Nam. Theo
báo cáo của cục thú y tại Việt Nam dịch PRRS chính thức bùng nổ năm 2007, hiện vẫn
đang diễn biến phức tạp trên các tỉnh trong toàn quốc. Tính đến 25/9/2010 dịch PRRS
bùng phát trở lại với 32 tỉnh thành công bố dịch với đặc điểm của bệnh là lây lan
nhanh, khó khống chế, gây thiệt hại về chăn nuôi, nhất là đàn heo giống.
Để phát hiện PRRSV, các phương pháp huyết thanh học , nuôi cấy tế bào được
sử dụng phổ biến . Sự phát triển của sinh học phân tử cùng với các biện pháp kỹ thuật
xét nghiệm nhanh, hiện đại và độ chính xác cao như PCR, RT-RCR, nested-PCR,
LAMP, real time PCR. Gần đây kỹ thuật real time RT-PCR đang trở thành kỹ thuật
được ứng dụng rộng rãi trong việc định lượng vi-rút có vật chất di truyền RNA. Nhằm
phát hiện sớm, định chủng và định lượng vi-rút thực địa, góp phần nâng cao hiệu quả
sử dụng vacxin, cách thức bố trí nhập đàn, giảm thiệt hại kinh tế. Được sự hướng dẫn
của PGS.TS Trần Thị Dân và KS. Võ Khánh Hưng và góp phần xây dựng một quy
trình chuẩn định lượng và định chủng PRRSV phục vụ tiến trình nghiên cứu, chúng tôi
tiến hành thực hiện đề tài: “Ứng dụng kỹ thuật real time RT-PCR sử dụng EvaGreen

1


nhằm định lượng và định chủng vi-rút gây bệnh rối loạn sinh sản và hô hấp trên heo
(PRRSV)”.
1.2. Yêu cầu
Xây dựng quy trình định lượng vi-rút gây bệnh rối loạn sinh sản và hô hấp trên
heo (PRRSV) bằng kỹ thuật real time RT-PCR sử dụng EvaGreen định lượng và định
chủng PRRSV trên heo nhằm phục vụ công tác phòng chống dịch bệnh xảy ra.
1.3. Nội dung thực hiện
− Gắn đoạn gen ORF7 vào plasmid pGEM T Easy và chuyển vào tế bào chủ E.
coli DH5α, từ đó tạo dựng đường chuẩn trong real time RT-PCR sử dụng

EvaGreen.
− Xác định quy trình định lượng và định chủng PRRSV bằng real time RT-PCR
sử dụng EvaGreen.
− Đánh giá khả năng định lượng của phương pháp real time RT-PCR sử dụng
EvaGreen. Xác định độ nhạy, tính đặc hiệu.
− Khảo sát tỉ lệ nhiễm vi-rút trong mẫu máu và mẫu ngoáy hầu họng từ mẫu bệnh
phẩm thực địa.

2


Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở heo
Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp (PRRS) là bệnh xảy ra trên heo với đặc
điểm gây sẩy thai ở heo nái và rối loạn đư ờng hô hấp trên heo sơ sinh và heo choai
(Christianson và ctv , 1992). Năm 1987, bệnh được phát hiện lần đầu tiên ở Mỹ và
nhanh chóng bệnh lan sang Canada năm1988. Sau đó, các nước vùng châu Âu cũng
xuất hiện bệnh như ở Đức năm 1990, Hà Lan, Tây Ban Nha, Bỉ, Anh năm 1991 và
1992 ở Pháp. Năm 1998, bệnh được phát hiện ở châu Á như Hàn Quốc, Nhật Bản.
Do chưa xác định căn nguyên bệnh nên được gọi là “bệnh thần bí trên heo”
(mystery swine disease - MSD). Sau đó, bệnh lây lan rộng trên toàn thế giới và được
gọi bằng nhiều tên: hội chứng hô hấp và vô sinh của heo (swine infertility and
respiratory disease - SIRS), bệnh bí hiểm ở heo (MSD), hội chứng hô hấp và sẩy thai ở
heo (porcine epidemic abortion and respiratory syndrome-PEARS), hội chứng hô hấp
và sinh sản ở heo (PRRS), bệnh tai xanh (blue-eared pig disease). Năm 1992, Hội nghị
quốc tế về bệnh này đã nhất trí dùng tên PRRS (porcine reproductive and respiratory
syndrome) và được Tổ chức Dịch tễ thế giới (OIE) công nhận. Năm 2006, đại dịch
PRRS đã xảy ra ở Trung Quốc làm hàng triệu heo bị mắc bệnh. Trong trận dịch này đã
phát hiện sự biến chủng của vi-rút thành chủng độc lực cao, có khả năng lây lan và gây
chết rất nhanh trên heo. Cho đến nay, hội chứng PRRS đã xảy ra hầu hết các nước có

nền chăn nuôi heo công nghiệp phát triển trên thế giới. Gần đây các ổ dịch xảy ra tại
Thụy Điển, Nam Phi, Nga, Trung Quốc, và Việt Nam với chủng động lực cao, diễn
biến ngày càng phức tạp (FAO, 2007).
Ở Việt Nam, bệnh được phát hiện đầu tiên vào năm 1997 bằng kiểm tra huyết
thanh học trên đàn heo nhập từ Mỹ (10/51 con có huyết thanh dương tính). Năm 1999
một khảo sát của Cơ quan Thú Y Vùng 6 ở một số trại giống tại các tỉnh phía Nam cho
thấy tỉ lệ heo có huyết thanh dương tính với bệnh rất khác nhau, từ 1,3% cho tới
68,29%.
Ngày 12/3/2007, đợt dịch đầu tiên bùng nổ tại Hải Dương, chỉ trong vòng 1
tháng, bệnh đã lây lan sang 6 tỉnh lân cận như Hưng Yên, Bắc Ninh, Bắc Giang, Thái
Bình, Hải Phòng và Quảng Ninh (Trần Thị Bích Liên, 2008). Từ đó đến nay dịch vẫn
3


tiếp tục xảy ra ở một số địa phương trong cả nước. Tháng 7 năm 2007 tại Long An

cũng xác định có dịch với 91 heo mắc bệnh và 8 con chết, điều đó có nghĩa là
bệnh đã xuất hiện ở Đồng bằng sông Cửu Long. Theo đánh giá không chính thức,
hiện nay hội chứng PRRS có thể đã chuyển sang dạng mãn tính tại hầu hết các trại có
bệnh (Nguyễn Ngọc Hải và ctv, 2008). Kết quả giải trình tự và gây bệnh thực nghiệm
trên heo cho thấy chủng PRRSV tại Việt Nam hiện nay có mức độ tương đồng cao về
di truyền so với PRRSV chủng độc lực cao của Trung Quốc (Tô Long Thành và ctv,
2008).
Như vậy, tại Việt Nam, dịch PRRS có thể sẽ có những diễn biến phức tạp và có
nguy cơ bùng phát ở tất cả các địa phương trong cả nước.

Hình 2.1 Sơ đồ phân bố bệnh PRRS tại các nước trên thế giới
(Tổ chức dịch tể thế giới OIE, 2007).
2.2. Vi-rút gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở heo (PRRSV)
Vi-rút gây bệnh được phân lập vào năm 1991 tại Lelystad, Hà Lan. Tuy nhiên

việc phân lập được vi-rút trong các mẫu máu heo trữ cho thấy vi-rút đã hiện diện trong
đàn heo từ năm 1979 (hình 2.2).

4


Hình 2.2 Hình dạng bên ngoài PRRSV
(http//www.agraroldal.hu).
PRRSV thuộc giống Arterivirus, họ Arteriviridae, bộ Nidovirades. Ba đặc tính
quan trọng đáng lưu ý của giống Arterivirus nói chung và PRRSV nói riêng là gây
nhiễm trùng dai dẳng mà không thể hiện triệu chứng, nhân lên trong các đại thực bào
và có khả năng biến đổi gen rất lớn.
2.2.1. Các chủng PRRSV và sự phân bố của chúng
Hiện nay, PRRSV đã được xác lập với 2 kiểu gen chính là kiểu gen có nguồn
gốc từ châu Âu (EU) và kiểu gen có nguồn gốc từ Bắc Mỹ (NA) (Meulenberg và ctv,
1993). Ngoài ra, trong mỗi kiểu gen còn có nhiều chủng khác nhau đã được phân lập.
Việc so sánh trình tự gen đã cho thấy sự khác biệt di truyền quan trọng giữa hai nhóm
này. Ở Bắc Mỹ chỉ tìm thấy kiểu gen NA, mặc dù cũng có một số báo cáo đã cô l ập
được kiểu gen EU (Ropp, 2004). Ở Châu Âu thì kiểu gen EU trội hơn và cho đến năm
1998 vẫn chưa có chủng nào thuộc kiểu gen NA được xác lập ở phía Tây Âu (Madsen
và ctv, 1998). Ở Châu Á và Nam Mỹ cả hai kiểu gen trên đã được xác lập. Thông
thường, các chủng vi-rút này gây chết với tỷ lệ thấp, nhưng từ ổ dịch PRRS xảy ra năm
2006 trên heo tại Trung Quốc, người ta xác định rằng là do chủng vi-rút cường độc cao
có thể gây chết đến 20% heo bệnh, kể cả heo trưởng thành.
Sự khác nhau giữa các chủng được cho thấy trong bảng 2.1 và hình 2.3 bên
dưới. Hình 2.3 mô tả cây phân bố giống, loài của PRRSV theo số liệu trong bảng 2.1
trên. Trong đó có hai kiểu gen dòng Bắc Mỹ (với chủng VR2332 phân lập tại Mỹ,
chủng 807/94 Canada và Đài Loan) và kiểu gen châu Âu (với chủng I10 ở Hà lan và
chủng Olot Tây ban nha). Sự khác nhau giữa các chủng phụ thuộc vào sự khác nhau
trong chuỗi trình tự nuceotide hay chuỗi hợp chất hữu cơ của protein trong từng chủng

vi-rút.
5


Bảng 2.1 Tỉ lệ tương đồng về trình tự gen của các chủng PRRSV
Chủng

Nguồn gốc

Tỉ lệ

VR2332

Mỹ

100

Taiwan

Đài Loan

97

807/94

Canada

92

Olot


Tây Ban Nha

66

110

Newtherland

66

Dòng châu Mỹ (VR2332, Taiwan, 807/94) và dòng chủng châu Âu
(Nguồn: />
(Olot, I10)

Hình 2.3 Cây phân bố của một số chủng PRRSV dòng Châu Âu và Bắc Mỹ
(Nguồn: />Hội chứng PRRS đã xuất hiện ở Trung Quốc từ 1995 và đã nhanh chóng lan
rộng khắp các tỉnh thành gây thiệt hại to lớn cho ngành chăn nuôi heo của nước này
(Chen và ctv, 2006). Gần đây, chủng PRRSV Trung Quốc động lực cao đã được nhắc
đến nhiều do khả năng gây bệnh và chết với tỷ lệ cao. Nhiều công trình đã cung cấp
những thông tin quan trọng về quan hệ di truyền của PRRSV này với các chủng vi-rút
trên thế giới, đồng thời lập những giả thuyết cho sự tiến hóa của PRRSV tạo ra các
chủng vi-rút động lực cao như hiện nay (Gao và ctv, 2004; Chen và ctv, 2006; An và
ctv, 2007; Tian và ctv, 2007; Feng và ctv, 2009). Năm 2006, một đợt dịch PRRS lớn
bùng nổ ở Trung Quốc gây tỷ lệ chết lớn và chủ yếu ảnh hưởng đến heo nái và heo
trưởng thành. Theo Tian và ctv (2007) vi-rút gây bệnh vẫn là PRRSV nhưng với độc
lực cao hơn nhiều với đột biến thứ nhất là đột biến mất leucine ở acid amin (aa) 482 và
6



đột biến thứ hai là mất liên tục 29 aa, từ aa thứ 534 đến aa thứ 562. Từ các kết quả này,
Tian và ctv (2007) đã xây dựng nên những giả thuyết ban đầu về sự tiến hóa của các
chủng PRRSV độc lực cao ở Trung Quốc từ các chủng thuộc kiểu gen Bắc Mỹ với
vùng tiến hóa của các chủng vi-rút Bắc Mỹ lưu hành tại Trung Quốc chịu ảnh hưởng
về mặt địa lý hay môi trường như nhiệt độ và ẩm độ cao vào mùa hè hay sự nhiễm các
vi khuẩn thứ phát cũng góp phần lên sự hình thành chủng vi-rút độc lực.
Tại Việt Nam, toàn bộ chuỗi gen M của chủng vi-rút gây bệnh ”tai xanh” phân
lập từ heo bệnh tại Quảng Nam (Việt Nam) năm 2007, ký hiệu TXMT1 (Việt Nam),
có độ dài 525 bp đã được thu nhận và giải trình tự. Thành phần nucleotide, acid amin
biểu hiện từ gen M của chủng TXMT1 được sử dụng để phân tích và so sánh đồng
nhất về nucleotide và tương đồng về acid amin giữa chủng này với một số chủng của
Trung Quốc phân lập trong các năm 2006 - 2008 và thế giới. Chủng TXMT1 (Việt
Nam) được xác định thuộc vi-rút gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở heo
(PRRSV), type II (chủng Bắc Mỹ), có tỷ lệ đồng nhất (identity) về thành phần
nucleotide và tỷ lệ tương đồng (homology) về acid amin rất cao (99 - 100%) với các
chủng của Trung Quốc; thấp hơn (94% nucleotide; 96% acid amin) so với chủng
VR2332 và rất thấp (69% nucleotide; 79% acid amin) so với chủng Lelystad. Chủng
TXMT1 chỉ có 2 - 3 vị trí nucleotide khác biệt so với các chủng Trung Quốc, trong khi
đó có đến 28 vị trí khác so với chủng VR2332 (type II, chủng Bắc Mỹ) và rất nhiều so
với các chủng châu Âu (type I). Khác biệt V (valine)/I (isoleucine) ở vị trí 24 của
chuỗi polypeptide M là nét đặc trưng giữa chủng TXMT1 với tất cả các chủng thuộc
chủng Bắc Mỹ và châu Âu. Đặc tính gen M cho thấy, chủng TXMT1 của Việt Nam có
biến đổi di truyền cao, có thể có cùng nguồn gốc phát sinh cùng với các chủng PRRSV
của Trung Quốc, dẫn đến suy đoán, tác nhân gây PRRS cường độc cao này có tại Việt
Nam rất có thể là do từ Trung Quốc vào (Feng, 2009).
2.2.2. Cấu trúc phân tử của PRRSV
2.2.2.1. Cấu trúc virion
PRRSV là vi-rút dạng sợi đơn, thẳng, vỏ bao. Hạt PRRSV có dạng hình cầu với
đường kính khoảng 45 đến 65 nm đối với chủng PRRSV châu Âu (Wensvoort và ctv.,
1991) và từ 48 đến 83 nm đối với chủng Bắc Mỹ (Benfield và ctv., 1992; Dea và ctv,

1992). Virion của PRRSV gồm 3 phần. Thứ nhất , bộ gen là RNA sợi đơn (+) nằm
trong nhân. Thứ hai là vỏ capsid bao bọc bộ gen của vi-rút. Cấu trúc thứ ba là vỏ bao
7


ngoài, đây là màng lipid chứa glycoprotein vi-rút và phức hợp protein (Conzelmann,
1993) gồm: protein xuyên màng M

(integral membrane protein ) tạo phức hợp với

glycoprotein chính của vi-rút - GP5 (major viral glycoprotein- GP5) xung quanh nhân.
Hai glycoprotein khác của vi-rút khác (GP2 và GP4) cũng đựơc gắn với màng và hiện
diện ít hơn so với GP5 (Nelson và ctv, 1995). Một glycoprotein thứ tư (GP3) được mô
tả như một phần của cấu trúc virion trên PRRSV dòng châu Âu Lelytad, trong khi ở
chủng PRRSV dòng Bắc Mỹ tại Quebec ngư ời ta cho rằng GP 3 được biểu hiện như
protein không cấu trúc hoà tan (Mardassi và ctv, 1998).
2.2.2.2. Tổ chức bộ gen của PRRSV
Chuỗi hệ gen đầy đủ của PRRSV được xác lập vào năm 1993, nó có kích thước
khoảng 15,1 đến 15,5 kb và chứa 9 khung đọc mở nằm hai đầu hai vùng không dịch
mã (untranslate region - UTR) 5’UTR và 3’UTR, và có cấu trúc mũ methyl tại đầu 5’
và đuôi poly (A) tại đuôi 3’ (hình 2.4). Gần đây, một protein cấu trúc không glycosyl
hóa đã được xác định và biểu hiện từ ORF2b (Snijder và ctv , 1999). Một khung đọc
mở nhỏ ORF2b nằm bao trọn trong ORF2a (Wu và ctv, 2001). ORF1a và ORF1b định
vị xuôi dòng từ đầu 5’-UTR, chúng chiếm giữ khoảng 75% của bộ gen và ghi mã
protein không cấu trúc , liên quan đến sự nhân bản của

vi-rút (Meulenberg và ctv .,

1997). ORF1a được dịch mã trực tiếp trong khi ORF1b được dịch bởi một khung dịch
chuyển ribosom. Vùng trùng lắp ORF1a/ORF1b chứa những tín hiệu thúc đẩy khung

dịch chuyển này (Snijder và ctv, 1998). ORF 2 - 7 định vị ngược dòng từ 3'-UTR, mã
hóa một loạt các protein cấu trúc của vi-rút như: protein vỏ ngoài (E) (envelop protein)
và protein vỏ nhân capsid (N) (nucleocapside protein) (Nelson và ctv, 1995). Chiều dài
của ‘5UTR là 190 nucleotide cho PRRSV chủng Bắc Mỹ (Nelsen và ctv, 1999) và 221
nucleotide cho PRRSV chủng châu Âu (Meulenberg và ctv, 1995). Vùng 3’UTR
chủng Bắc Mỹ và chủng PRRSV châu Âu lần lượt là 150 và 120 base (Meng và ctv,
1994).
Hạt PRRSV đuợc cấu thành từ

7 protein gồm

4 protein vỏ

(envelope

glycoprotein) là GP 2a (ghi mã bởi ORF 2a); GP3 (ORF3); GP4 (ORF4) và GP 5
(ORF5); protein màng, M (ORF6); protein vỏ nucleocapsid, N (ORF7); và protein vỏ
ngoài, E (ORF2b). Thành phần protein cấu trúc chính trong hạt vi-rút là protein N (14
- 15 kDa), M (18 - 19 kDa) và GP5 (24 - 26 kDa) (Dea và ctv, 2000; Rowland, 2003).

8


Hình 2.4 Cấu trúc bộ gen PRRSV (Yanjin Zhang, 2008). Vùng gen tái bản, nằm

ở vùng 5’ của bộ gen, bao gồm 2 vùng gối lên nhau ORF1a và ORF1b, mã hóa thành
polyprotein (sau đó polyprotein này sẽ hình thành 12 loại protein không cấu trúc
NSP1 - 12). ORF2 đến ORF5 mã hóa cho polyprotein GP2 đến GP5, ORF6 mã hóa
protein màng M, và ORF7 mã hóa cho protein nucleocapsid N. ORF2b nằm trọn
trong vùng ORF2a. Những protein này từ ORF2 - ORF7, tất cả biểu hiện thành

mRNA.

Protein vỏ nucleocapsid, N (14 – 15 kDa) của PRRSV , được qui định bởi
ORF7, là protein không glycosyl hóa, không chứa peptide tín hiệu (signal peptide), có
123 hay 128 aa tương ứng với 2 chủng của PRRSV: VR2332 hay Lelystad (Mardassi
và ctv, 1996). Protein N của PRRSV Bắc Mỹ và châu Âu chỉ giống nhau khoảng 63%
về mặ t aa, nhưng chúng có vùng kháng nguyên chung giữa

aa vị trí

52 và 69

(Meulenberg và ctv, 1998; Wootton và ctv, 1998). Protein N mang tính kháng nguyên
cao và là protein đa dạng nhất trong hạt vi-rút, và đựơc dùng trong chẩn đoán (Casal
và ctv ., 1998; Yang và ctv ., 2000). Protein N mang vùng chức năng gắn RNA đuợc
xem là giữ vai trò quan trọng trong sự sao chép (Rowland, 2003).
Protein GP5 (~ 26 kDa), do ORF5 qui định, là protein biến đ ổi nhiều nhất giữa
các chủng PRRSV. Protein GP5 và M (18 – 19 kDa) kết hợp chặt chẽ với nhau và tạo
ra nhị trùng dị hợp (heterodimeric) được liên kết bằng cầu nối disulfide trong hạt
virion (Mardassi, 1996). Người ta cho rằng sự hình thành nhị trùng này cần thiết ch o
sự lắp ráp của PRRS V, vì khi không có sự tạo thành phức hợp này do sự vắng mặt
hoặc là protein GP 5 hoặc là protein M thì không có những hạt vi-rút được giải phóng.
Tuy nhiên, sự phá vỡ cấu trúc nhị trùng giữa protein GP 5 và M không giảm tính gây
9


nhiễm của vi-rút (Lee C và ctv , 2005). Protein M được xem là có vai trò thiết yếu cho
miễn dịch tế bào đ ối với PRRSV vì nó gây ra đáp ứng mạnh nhất trong tất cả protein
cấu trúc của PRRS


V trong đáp ứng khá

ng nguyên đặc hiệu

(antigen-specific

proliferation responses) (Bautista, 1999).
Qua phân tích gen và theo dõi sự thay đổi trình tự nucleotide của các dòng
PRRSV người ta đã xác định rằng ở PRRS V Bắc Mỹ, các khung đọc mở ORF7 và
ORF6 có tính ổn định rất cao , chúng gần như không thay đổi trong suốt quá trình tiến
hoá của các dòng vi-rút này. Tuy nhiên sự khác biệt giữa dòng PRRS V châu Âu và
Châu Mỹ ở 2 khung đọc mở này là rất rõ , cụ thể , sự tương đồng về trình tự aa của
ORF7 giữa 2 dòng vi-rút này chỉ vào khoảng 57 đến 59% và của ORF6 là 70 đến 81%.
Trong khi đó khung đọc mở ORF 5 lại biến đổi nhiều giữa các chủng trong cùng một
dòng Bắc Mỹ (giống nhau chỉ từ 88 đến 97%) và chỉ tương đồng với dòng châu Âu
khoảng từ 51 đến 59% (Nguyễn Ngọc Hải, 2007).
Thành phần protein cấu trúc khác trong hạt virion PRRSV là protein GP 2 (29 –
30 kDa), GP3 (41 – 50 kDa), và GP4 (31 – 35 kDa) và protein vỏ E (10 kDa). Protein
GP2, GP3 và GP 4 được nhận định là tương tác với những protein cấu trúc khác và
được lắp ráp vào hạt virion như phức hợp

đa trùng hợp (multimeric) (Lee và ctv .,

2005). Cấu trúc phức hợp này mang chức năng xâm nhập của vi-rút vì những hạt vi-rút
thiếu protein vỏ này không thể gây nhiễm (Wissink, 2005). Lee và ctv (2006) cho rằng
protein E (ORF2b qui định) cùng với những protein vỏ thứ yếu khác hình thành một
kênh làm cho việc cỡi áo của vi-rút trở nên dễ dàng, giúp phóng thích bộ gen của virút vào tế bào chất vật chủ. Protein GP3 của dòng châu Âu kết hợp chặt chẽ vào virion,
trong khi protein GP 3 của dòng Châu Mỹ là một protein ẩn và có thể hoà tan
(Mardassi, 1998). Sự tương đồng về trình tự aa qui đị nh bởi các khung đọc mở ORF 2,
3 và 4 giữa các dòng châu Mỹ và châu Âu tươn g ứng chỉ ở mức độ từ 63,58 và 68%

(Nguyễn Ngọc Hải, 2007).
2.2.3. Cơ chế sinh bệnh
Vi-rút rất thích hợp với đại thực bào đặc biệt là đại thực bào hoạt động ở vùng
phổi. Chúng xâm nhập vào tế bào bằng con đường nhập nội bào (endocytosis) qua
trung gian thụ thể. Người ta đã xác định heparan sulfate là thụ thể của đại thực bào phế
nang đối với vi-rút và hai thụ thể PRRSV được xác định trên môi trường tế bào FAM
(Duan và ctv., 1998b; Delputte và ctv., 2002). Một thụ thể PRRSV được xác định bằng
10


cách dùng hai kháng thể đơn dòng (Duan và ctv, 1998a) và trên MARC - 145 là
vimentin, vimentin là một yếu tố quan trọng trong việc làm ổn định cấu trúc của tế bào
chất trong nhiều loại tế bào khác nhau (Delputte, 2004). Bình thường đại thực bào sẽ
tiêu diệt được cả vi khuẩn, vi-rút xâm nhập vào cơ thể, riêng PRRSV có thể nhân lên
trong đại thực bào sau đó phá hủy và giết chết đại thực bào tới 40%. Do vậy, khi đã
xuất hiện PRRSV trong đàn, chúng thường có xu hướng duy trì sự tồn tại và hoạt động
âm thầm. Đại thực bào bị giết chết sẽ làm giảm chức năng của hệ thống bảo vệ cơ thể
từ đó làm tăng nguy cơ nhiễm các bệnh kế phát. Điều này có thể thấy rõ ở những đàn
heo vỗ béo hoặc chuẩn bị giết thịt có sự tăng đột biến về tỷ lệ viêm phổi kế phát do
những vi khuẩn vốn sẵn có trong đường hô hấp (Nguyễn Văn Thanh, 2007).

Hình 2.5 Đại thực bào trước và sau khi nhiễm PRRSV
(). a) Đại thực bào bình thường,
b)Đại thực bào bị phá hủy bởi PRRSV.

2.3. Một số phương pháp chẩn đoán trong phòng thí nghiệm
2.3.1. Chẩn đoán PRRSV trên môi trường nuôi cấy tế bào
Việc phân lập vi-rút gặp nhiều khó khăn vì PRRSV chỉ có thể nhân lên trên hai
loại tế bào, đó là: đại thực bào phế nang heo (porcine alveolar macrophage - PAM) và
các dòng tế bào thận khỉ mặt xanh Châu Phi (MARC - 145, CL2621). Tuy nhiên theo

Yoon và Stevenson (1999) không phải tất cả PRRSV đều phát triển ở cả hai loại tế bào
này. Han-Kook Chung và ctv (2002) cho rằng PRRSV kiểu gen Bắc Mỹ phát triển tốt
hơn trên MARC - 145, ngược lại PRRSV kiểu gen Châu Âu lại phát triển nhanh hơn
trên PAM.

11


2.3.2. Phương pháp kháng thể huỳnh quang (Fluorescent Antibody Staining - FA)
và hoá mô miễn dịch (immunohistochemistry staining - IHC)
Đây là phản ứng đầu tiên được sử dụng để phát hiện kháng thể kháng PRRSV
được gọi là kỹ thuật miễn dịch peroxidase một lớp (IPMA). Kỹ thuật này thực hiện
bằng cách gây nhiễm PRRSV trên các dòng tế bào PAM, CL2621, MARC - 145. Sau
đó tế bào được gây nhiễm sẽ được cố định và tác dụng với huyết thanh mẫu, ủ và được
cho tác dụng tiếp tục với kháng kháng thể heo cộng hợp HRPO (horseradish
peroxidase). Nếu mẫu huyết thanh có chứa kháng thể kháng vi-rút thì 30 - 50% tế bào
sẽ có màu đỏ khi cho lớp tế bào tác dụng với dung dịch tạo màu trong 30 phút. Trong
chẩn đoán phát hiện thú nhiễm sớm, người ta thường sử dụng IPMA do độ nhạy của
IPMA cao hơn ELISA. Xét nghiệm này cho phép xác định thú nhiễm sau 7 - 15 ngày
và có thể phát hiện kháng thể đặc hiệu từ 2 - 3 tháng sau khi nhiễm PRRSV. Sự thay
đổi kháng nguyên giữa các chủng có liên quan đến kết quả của phản ứng (Nguyễn
Ngọc Hải, 2007).
2.3.3. Kỹ thuật huỳnh quang gián tiếp

(Indirect Immunoflourescence assay –

IFA)
Giống như trong kỹ thuật IPMA, kỹ thuật IFA (kỹ thuật miễn dịch huỳnh quang
gián tiếp) cũng sử dụng nuôi cấy tế bào nhưng có tính đặc hiệu cao. Quá trình thực
hiện IFA cũng giống với IPMA, chỉ khác là kháng kháng thể heo sử dụng không cộng

hợp với HRPO mà cộng hợp với chất phát huỳnh quang FITC (fluorescein
isothiocynate). Sự hiện diện của màu huỳnh quang trong mẫu xét nghiệm chứng tỏ
mẫu có kháng thể kháng vi-rút. Phản ứng cho phép phát hiện kháng thể kháng vi-rút
đến 3 tháng sau khi nhiễm (Nguyễn Ngọc Hải, 2007). Ưu điểm của phương pháp này
là hiệu giá kháng thể có thể được xác định trong giới hạn rộng và hữu dụng trong các
trường hợp mới nhiễm hay cấp tính. Nhược điểm của IFA và IPMA là không thể làm
tự động nên khó thực hiện với quy mô lớn.
2.3.4. Kỹ thuật RT-PCR chẩn đoán PRRSV
Trong những năm gần đây, phương pháp RT-PCR (reverse transcriptase
polymerase chain reation) được sử dụng nhiều để phát hiện PRRSV trong huyết thanh
và các mẫu xét nghiệm khác (Christopher-Hennings và ctv, 1995; Legeay và ctv,
1997; Spagnuolo-Weaver và ctv, 2000; Christopher-Hennings và ctv, 2001) và phân
biệt hai chủng châu Âu và Bắc Mỹ (Mardassi và ctv, 1994; Egli và ctv, 2001). Kỹ
12


thuật RT-PCR có độ đặc hiệu và độ nhạy cao , thời gian cần thiết thực hiện xét nghiệm
ngắn vì thế đựơc dùng rộng rãi trong chẩn đoán phát hiện PRRSV

. Để gia tăng độ

nhạy trong chẩn đoán PRRSV có thể dùng kỹ thuật nested RT -PCR (RT-nPCR). RTPCR được thực hiện với các cặp mồi khác nhau cho phép phát hiện gen của các ORF 7,
ORF6 hay ORF1b của PRRSV. PRRSV có 2 chủng: Châu Âu và Châu Mỹ. Hai chủng
này có độ tương đồng về gen khoảng 52 đến 81%. Dựa trên cở sở đó nhiều cặp mồi đã
được thiết kế đề phát hiện PRRSV nói chung và để phân biệt dòng

PRRSV Bắc Mỹ

với châu Âu (Nguyễn Ngọc Hải, 2007).
2.4. Kỹ thuật real time RT-PCR

Kỹ thuật real time RT-PCR là sự kết hợp của phương pháp tổng hợp cDNA từ
mồi ngẫu nhiên và kỹ thuật real time PCR. Kỹ thuật này có ý nghĩa quan trọng trong
việc định lượng nhanh, hiệu quả các vật liệu di truyền có bản chất RNA. Đầu tiên,
RNA sẽ được chuyển thành cDNA nhờ reverse transcriptase và sản phẩm cDNA sẽ tạo
nguồn nguyên liệu cho phản ứng real time PCR.
2.4.1. Kỹ thuật real time PCR
Trong những phương pháp PCR truyền thống, sản phẩm khuếch đại được phân
tích tại điểm kết thúc phản ứng bằng cách điện di trên gel agarose. Trong khi đó, kỹ
thuật real time PCR có thể phân tích kết quả ngay khi phản ứng đang xảy ra.
2.4.1.1 Nguyên tắc kỹ thuật real time PCR
Định lượng vi-rút thường cung cấp thông tin giá trị cả những nghiên cứu về
chẩn đoán và mầm bệnh. Trong những năm gần đây, phương pháp real time PCR được
phát triển trong định lượng, và chẩn đoán mầm bệnh vi-rút. Cách tiếp cận cho phép
định lượng nhanh mục tiêu RNA, DNA đích trong một eppendorf đã cải thiện nhiều
tính đặc hiệu và cho phép phát hiện nhiều gen đích trong mẫu. Real time PCR định
lượng (qPCR) được xem là một trong những kỹ thuật cho phép định lượng chính xác
nhất số lượng trình tự DNA trong một mẫu xét nghiệm. Khác với việc định lượng khi
quá trình khuếch đại đã hoàn tất, kỹ thuật này cho phép kiểm soát và định lượng số
lượng DNA ngay khi phản ứng đang xảy ra (đây là ý nghĩa của từ ”real time”). Trong
kỹ thuật này, ở mỗi chu kỳ, lượng DNA được khuếch đại sẽ phát ra một lượng tín hiệu
huỳnh quang nhất định. Nói cách khác, lượng tín hiệu huỳnh quang sẽ tăng tỷ lệ thuận
với mỗi chu kỳ khuếch đại thành công của phản ứng real time PCR. Khả năng này
được thực hiện nhờ bổ sung vào phản ứng những phân tử phát huỳnh quang báo hiệu
13


sự gia tăng lượng DNA tỷ lệ với sự gia tăng tín hiệu quỳnh quang. Những hóa chất
phát huỳnh quang bao gồm thuốc nhuộm liên kết DNA và những trình tự gắn huỳnh
quang gọi là mẫu dò. Những máy luân nhiệt đặc biệt trang bị bộ phát hiện huỳnh
quang được sử dụng để kiểm soát tín hiệu huỳnh quang khi quá trình khuếch đại xảy

ra. Tín hiệu huỳnh quang được đo lường phản ánh số sản phẩm khuếch đại sau mỗi
chu kỳ. Kết quả của real time PCR có thể là kết quả định tính (hiện diện hay vắng mặt
một trình tự DNA) hay định lượng (số lượng bản sao DNA).
Như vậy, bằng cách ghi nhận lượng tín hiệu huỳnh quang phát ra sau mỗi chu
kỳ, ta có thể kiểm soát phản ứng PCR ngay trong giai đoạn khuếch đại tuyến tính của
chúng. Sự gia tăng đầu tiên của tín hiệu huỳnh quang sẽ tương ứng với lượng DNA
ban đầu của mẫu. Hiệu quả của kỹ thuật real time PCR dựa trên cả hóa chất dùng để
định lượng và kiểm soát phản ứng khuếch đại và công cụ để phát hiện các tín hiệu
huỳnh quang.
2.4.1.2. Hóa chất định lượng
Có nhiều loại hóa chất được sử dụng trong phản ứng real time PCR cho việc
định lượng DNA. Chúng có thể chia thành 2 loại chính:
- Thuốc nhuộm xen giữa DNA: ethidium bromide, SYBR Green I, EvaGreen.
- Mẫu dò lai: Taqman, Fluorescence Resonance Energy Transfer, Molecular Beacons,
Scorpions và Taqman Minor Groove Binder.
a) SYBR Green I
SYBR Green I là một loại thuốc nhuộm khá hiệu quả so với các loại thuốc
nhuộm khác, và tính dễ dàng sử dụng, cho phép tối ưu hóa cho bất cứ hóa chất qPCR.
Khi thuốc nhuộm SYBR Green I gắn với DNA mạch đôi, mà không gắn với DNA
mạch đơn. Kết quả là tín hiệu huỳnh quang (bước sóng kích thích khoảng 488 nm và
254 nm; bước sóng phát quang 560 nm) được gia tăng rất nhiều (khoảng 800 đến 1000
lần). Khi phản ứng PCR bắt đầu, sự gia tăng số lượng trình tự DNA mới được tổng
hợp sẽ làm tăng lượng tín hiệu huỳnh quang phát ra.
Ưu điểm của việc sử dụng thuốc nhuộm liên kết DNA là thiết kế phản ứng đơn
giản (chỉ cần 2 đoạn mồi, không cần thiết kế mẫu dò), kiểm tra được nhiều gen nhanh
chóng mà không cần thiết kế mẫu dò khác nhau, chi phí ban đầu thấp. Một điểm hạn
chế của việc định lượng bằng SYBR Green I là hóa chất này liên kết không đặc hiệu
với DNA mạch đôi. Vì vậy, mọi trình tự DNA mạch đôi trong phản ứng đều được định
14