BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP MỘT SỐ CHỦNG NẤM Beauveria
GÂY BỆNH VÔI TẰM DÂU Bombyx mori
HƯỚNG ỨNG DỤNG TRONG DƯỢC LIỆU

Ngành học:

CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện:

NGUYỄN THỊ THANH NGA

Niên khóa:

2007 - 2011

Tháng 07 năm 2011


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP MỘT SỐ CHỦNG NẤM Beauveria
GÂY BỆNH VÔI TẰM DÂU Bombyx mori
HƯỚNG ỨNG DỤNG TRONG DƯỢC LIỆU

Hướng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

TS. LÊ THỊ DIỆU TRANG

NGUYỄN THỊ THANH NGA

Tháng 07 năm 2011


LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên con xin dành cho ba mẹ- người đã không quản mọi khó khăn, vất vả nuôi
nấng cho con ăn học đến ngày hôm nay. Cảm ơn cả gia đình đã luôn bên cạnh chia sẻ
những niềm vui nỗi buồn, động viên, tiếp sức cùng con vượt qua mọi khó khăn.
Và để đạt kết quả ngày hôm nay tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến:
TS. Lê Thị Diệu Trang người đã theo suốt tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và tạo mọi
điều kiện để tôi hoàn thành khóa luận tốt nghiệp này.
Ban Giám Hiệu Trường Đại Học Nông Lâm TP.HCM, Ban chủ nhiệm Bộ môn
Công Nghệ Sinh Học, cùng tất cả quý Thầy Cô đã truyền dạy kiến thức cho tôi trong
suốt quá trình học tập tại trường.
Ban lãnh đạo cùng toàn thể quý Thầy Cô , Anh Chị và các bạn đang làm việc, thực
tập tại Viện Công Nghệ Sinh Học Và Môi Trường, Trường Đại học Nông Lâm TP
HCM đã giúp đỡ tôi trong thời gian thực tập tại Viện.
Tập thể lớp DH07SH đã đồng hành, giúp đỡ và chia sẻ những lúc tôi gặp trở ngại.
Những người bạn luôn sát cánh san sẻ mọi khó khăn, động viên và ủng hộ tôi.


Tp Hồ Chí Minh, ngày 10 tháng 7 năm 2011
Người viết
Nguyễn Thị Thanh Nga

i


TÓM TẮT
Bạch cương tàm (tằm vôi) là một trong những vị thuốc quý trong y học cổ truyền.
Người ta đã tìm ra nấm Beauveria bassiana là nguyên nhân gây bệnh vôi vào năm
1835 và nhiều chủng Beauveria khác cũng có khả năng này. Bạch cương tàm thường
rất khó tìm chỉ xuất hiện vào mùa mưa. Tuy nhiên, khả năng phát tán của nấm gây
bệnh rộng nên bệnh lây lan nhanh ảnh hưởng rất nhiều đến năng suất tơ tằm. Để có
thể sản xuất bạch cương tằm làm dược liệu mà không gây tác hại đến việc sản xuất tơ
kén ta cần có biện pháp nuôi và tạo tằm vôi trong phạm vi kiểm soát được nhằm hạn
chế việc lây lan ngoài tự nhiên. Trên cơ sở đó chúng tôi tiến hành đề tài “Phân lập
một số chủng nấm Beauveria gây bệnh vôi tằm dâu Bombyx mori. Hướng ứng dụng
trong dược liệu” đặt nền tảng cho những nghiên cứu sau này về sản xuất nguồn dược
liệu.
Nội dung nghiên cứu: phân lập các chủng nấm gây bệnh tằm vôi trên mẫu bệnh
thu thập tại địa phương, định danh chủng nấm kí sinh bằng giải trình tự đoạn gen 28S
rRNA so sánh với dữ liệu của GeneBank bằng công cụ Blast (NCBI) kết hợp với
quan sát hình thái, đặc điểm sinh trưởng phát triển. Phân tích thành phần một số axít
amin có trong mẫu tằm bệnh để khẳng định khả năng ứng dụng trong dược liệu.
Kết quả: Phân lập và định danh được chủng nấm Nomuraea rileyi (tên trước đây
là Beauveria rileyi). Ghi nhận được đặc điểm hình thái sợi nấm, bào tử, tốc độ sinh
trưởng của Nomuraea rileyi. Xác định được thành phần axít amin trong mẫu tằm vôi
thu thập.
Kết luận: Xác định thêm được chủng nấm Beauveria rileyi gây bệnh tằm vôi.

Đánh giá được các đặc điểm sinh trưởng phát triển. Trong môi trường PGA tốc độ
phát triển và khả năng hình thành bào tử của chủng nấm khá chậm. Do đó cần khảo
sát thêm trong nhiều điều kiện và môi trường nuôi cấy khác nhau để tìm ra điều kiện
tối ưu cho quá trình sinh bào tử phục vụ cho việc lây nhiễm nhân tạo trong sản xuất
bạch cương tàm .

ii


SUMMARY

The thesis title: Isolation of some trains of entomopathogenic fungi Beauveria cause
white muscardin disease on silkworm Bombyx mori. A perspective in pharmaceutial
material applying.
Bach cuong tam (white muscardin diseased silkworm), which has the first position on
“Ban Kinh” book, is one of the precious medicaments of China traditional medicine.
People discovered Beauveria bassiana which caused disease in 1835 and many other
Beauveria species also have this ability. Bach cuong tam is very difficult to find. It
only appears in rain reason and winter. However, due to its wide spread so rapidly
spread to affect a lot of silk production. Bach cuong tam contains protid 67.44%,
4.38% lipid, vitamins A, B2, D, beauvericin substances, amino axíts, sterols, steroids,
ammonium oxalate, ... According to some reseaches, Bach cuong tam has ability in
anti- inflammatory ,anti-bacteria, pain relief, convulsion inhibition. To produce white
muscardin silkworm as pharmaceuticals material we need to take measures and create
a culture within the reach of control to limit the spread in the wild. On that basis, we
conducted the project " Isolation of some trains of entomopathogenic fungi Beauveria
cause white muscardin disease on silkworm Bombyx mori. A perspective in
pharmaceutial material applying” to set up a background for the following reseach on
producing medicine.
Our research includes isolate strains of fungal pathogens reach the samples collected at

the local, parasitic fungal species identified by molecular biology techniques
sequenced 28S rRNA gene, compared with data from GeneBank using Blast
tools (NCBI) in combination with morphological observations and the characteristics
of growth development. Analysis of amino axít composition in some samples to
confirm the silkworm disease possibility in the pharmaceutical applications.
Results: Nomuraea rileyi (used to be called Beauveria rileyi before) has been
classified and identified. Structures, spores, characteristics and growing speed of
Nomuraea rileyi grown in Petri disc have been recorded.

iii


In conclusion, A entomopathogenic fungi strain, Nomuraea rileyi, has been
determined. The development of growth characteristics has been assessed. In the PGA
media growth and sporulation ability of fungal species slow. Therefore further
investigation in several conditions and different cultures to find the optimal conditions
for sporulation to is needed.
Key words: Entermopathogenic fungi, Nomuraea rileyi, Bombyx mori.

iv


MỤC LỤC
Trang
LỜI CÁM ƠN.................................................................................................................. i
TÓM TẮT....................................................................................................................... ii
SUMMARY................................................................................................................... iii
MỤC LỤC ...................................................................................................................... v
DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT .................................................................................. vii
DANH SÁCH CÁC BẢNG ........................................................................................ viii

DANH SÁCH CÁC HÌNH .......................................................................................... viii
Chương 1 MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 1
1.1. Đặt vấn đề ................................................................................................................ 1
1.2. Mục đích và yêu cầu ................................................................................................ 2
1.2.1. Mục đích ............................................................................................................... 2
1.2.2. Yêu cầu ................................................................................................................. 2
1.3. Nội dung thực hiện .................................................................................................. 2
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU .............................................................................. 3
2.1. Lịch sử nghiên cứu nấm gây bệnh côn trùng .......................................................... 3
2.2. Sơ lược về bệnh vôi ở tằm dâu Bombyx mori.......................................................... 4
2.3. Công dụng của bạch cương tàm .............................................................................. 5
2.4. Tổng quan về nấm bất toàn kí sinh côn trùng ......................................................... 5
2.4.1. Sơ lược về nấm Beauveria bassiana .................................................................... 6
2.4.1.1. Đặc điểm hình thái............................................................................................. 6
2.4.1.2. Đặc điểm nuôi cấy ............................................................................................. 7
2.4.1.3. Hoạt tính sinh học của nấm Beauveria bassiana .............................................. 8
2.4.1.4. Tính an toàn của nấm đối với động vật máu nóng ............................................ 9
2.4.2. Sơ lược về nấm Nomuraea rileyi (Beauveria rileyi) ......................................... 10
2.4.3. Cơ chế xâm nhiễm của nấm gây bệnh côn trùng................................................ 11
2.4.4. Sự thay đổi bệnh và sự rối loạn chức năng trong cơ thể côn trùng .................... 12
2.4.5. Phương pháp định danh nấm .............................................................................. 13
2.4.6. Các nghiên cứu về nấm Beauveria ..................................................................... 14
2.4.6.1. Nghiên cứu ngoài nước ................................................................................... 14
2.4.6.2. Nghiên cứu trong nước .................................................................................... 15
v


Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ............................................................... 17
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ......................................................................... 17
3.1.1. Thời gian............................................................................................................. 17

3.1.2. Địa điểm ............................................................................................................. 17
3.2. Vật liệu thí nghiệm ................................................................................................ 17
3.2.1. Nguồn phân lập................................................................................................... 17
3.2.2. Thành phần môi trường sử dụng trong 1 lít (PGA) ............................................ 17
3.2.3. Dụng cụ và thiết bị ............................................................................................. 18
3.2.3.1. Dụng cụ............................................................................................................ 18
3.2.3.2. Thiết bị............................................................................................................. 18
3.3. Phương pháp nghiên cứu ....................................................................................... 18
3.3.1. Thu thập mẫu tằm nhiễm bệnh ........................................................................... 18
3.3.2. Chuẩn bị môi trường........................................................................................... 18
3.3.3. Phương pháp phân lập ........................................................................................ 18
3.3.4. Định danh loài nấm kí sinh ................................................................................. 19
3.3.6. Phân tích một số axít amin trong mẫu tằm vôi ................................................... 19
3.4. Phương pháp xử lý số liệu ..................................................................................... 19
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..................................................................... 20
4.1. Kết quả................................................................................................................... 20
4.1.1. Một số khuẩn lạc nấm thu được sau phân lập .................................................... 20
4.1.2. Khảo sát hình thái ............................................................................................... 21
4.1.3. Định danh bằng kĩ thuật phân tử ........................................................................ 24
4.1.4. Tốc độ phát triển của nấm Nomuraea rileyi trên môi trường PGA.................... 27
4.1.5. Thành phần axít amin trong mẫu tằm vôi........................................................... 28
4.2. Thảo luận ............................................................................................................... 29
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ......................................................................... 33
5.1. Kết luận.................................................................................................................. 33
5.2. Đề nghị .................................................................................................................. 33
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................ 34
PHỤ LỤC .........................................................................................................................

vi



DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT

DOR: Directorate of Oilseeds Research.
PDBC: Project Directorate of Biological control.
HPLC: High performance liquid chromatography.
PGA: Potato glucoza agar.
PMA: Potato maltoza agar.
CNSH - MT: Công nghệ sinh học - môi trường.
SDA: Sabouraud’s dextrose agar.
YPDA: Yeast extract potato dextrose agar.
PDA: Potato dextrose agar.
Nsc: Ngày sau cấy.

vii


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 4.1 Kích thước tản nấm đo trên môi trường thạch PGA..................................... 27
Bảng 4.2 Thành phần axít amin trong mẫu tằm vôi ..................................................... 29

DANH SÁCH CÁC HÌNH

Hình 2.1 Cuống sinh bào tử và bào tử nấm Beauveria bassiana................................... 7
Hình 2.2 Cấu trúc hóa học độc tố beauvericin............................................................... 8
Hình 2.3 Nấm Nomuraea rileyi gây bệnh trên sâu. ..................................................... 10
Hình 2.4 Hình thái Nomuraea rileyi và Nomuraea atypicola .................................... 11
Hình 3.1 Các mẫu tằm bệnh thu thập tại Bảo Lộc-Lâm Đồng .................................... 17
Hình 4.1 Một số khuẩn lạc nấm thu thập được sau phân lập ....................................... 20
Hình 4.1 (tt) Một số khuẩn lạc nấm thu thập được sau phân lập. ................................ 21

Hình 4.2 Cấu trúc sợi nấm khuẩn lạc (11) quan sát dưới kính hiển vi ........................ 22
Hình 4.3 Cấu trúc sợi nấm khuẩn lạc (12) quan sát dưới kính hiển vi ........................ 22
Hình 4.4 Cuống sinh bào tử và bào tử khuẩn lạc (11) ................................................. 23
Hình 4.5 Cuống sinh bào tử và bào tử khuẩn lạc (12). ................................................ 23
Hình 4.8 Khuẩn lạc nấm Nomuraea rileyi sau 30 ngày nuôi cấy. ............................... 28

viii


Chương 1 MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Bệnh tật, mối đe dọa nguy hiểm luôn rình rập đối với sức khỏe con người. Sự
phát triển như vũ bão của y học hiện đại, với những loại thuốc tân dược có thể giúp
con người ngăn ngừa cũng như điều trị những loại bệnh tật ấy. Tân dược với tác dụng
nhanh chóng, hiệu quả tức thì, tuy nhiên đó là những chất được tổng hợp nhân tạo, về
lâu dài sẽ ảnh hưởng đến sức khỏe. Chính vì vậy mà đến nay y học cổ truyền vẫn giữ
được vị thế. Nấm côn trùng là nhóm nấm đặc trưng trong giới nấm đã được nghiên
cứu và ứng dụng trong y học cổ truyền. Đông trùng hạ thảo, nhộng trùng thảo, bạch
cương tàm, … được biết đến là những vị thuốc có nguồn gốc hoàn toàn từ thiên
nhiên. Bạch cương tàm chứa 67,44% protid, 4,38% lipid, các vitamin A, B2, D, các
chất beauvericin, axít amin, sterol, corticoid, ammonium oxalate, … Theo các tài liệu
cổ, bạch cương tàm có vị mặn the, tính bình, không độc. Vào các kinh tâm, can, tỳ,
phế có tác dụng trừ phong, trấn kinh, giảm ho, tiêu độc, chống viêm, chữa kinh giản,
cổ họng sưng đau, mất tiếng, trúng phong, ho hen, khó thở … Bạch cương tàm
thường rất khó tìm và chỉ xuất hiện vào mùa đông. Theo tìm hiểu giá bạch cương tàm
tại các cửa hàng thuốc đông y cổ truyền khoảng 20.000 đồng/con. Vấn đề đặt ra hiện
nay là bằng cách nào đó tạo ra được bạch cương tàm phục vụ cho mục đích chữa
bệnh, giảm giá thành. Trước nay người ta chỉ đề cập đến nấm Beauveria bassiana gây
bệnh vôi tuy nhiên có nhiều loài Beauveria khác cũng có khả năng này. Trung Quốc
đã thành công trong việc phun bào tử nấm Beauveria bassiana lên tằm giai đoạn chín

để thu bạch cương tằm. Ở nước ta có nhiều nghiên cứu về nấm Beauveria nhưng chủ
yếu nghiên về hướng bảo vệ thực vật, giúp tiêu diệt côn trùng gây hại. Với hướng đi
mới, nghiên về ứng dụng trong dược liệu, đề tài: “Phân lập một số chủng nấm
Beauveria gây bệnh vôi tằm dâu Bombyx mori. Hướng ứng dụng trong dược liệu”
được thực hiện đặt nền tảng để tiến hành xây dựng quy trình lây nhiễm nấm
Beauveria trên tằm dâu Bombyx mori ứng dụng trong sản xuất nguồn dược liệu.

1


1.2. Mục đích và yêu cầu
1.2.1. Mục đích
Phân lập, xác định một số chủng nấm Beauveria gây bệnh vôi trên tằm dâu
Bombyx mori. Khảo sát đặc tính sinh trưởng, phát triển của nấm Beauveria làm cơ sở
cho việc xây dựng quy trình lây nhiễm nấm trên tằm dâu. Phân tích hàm lượng dinh
dưỡng và các hoạt chất sinh học có thể ứng dụng trong dược liệu.
1.2.2. Yêu cầu
Phân lập, định danh được loài nấm Beauveria gây bệnh vôi trên tằm dâu
Bombyx mori.
1.3. Nội dung thực hiện
 Phân lập chủng nấm gây bệnh vôi trên tằm dâu Bombyx mori.
 Quan sát, mô tả đặc điểm hình thái của các chủng nấm phân lập được.
 Định danh bằng kĩ thuật phân tử.
 Khảo sát đặc điểm sinh trưởng phát triển của các chủng nấm.
 Phân tích một số axít amin có trong tằm vôi.

2


Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU


2.1. Lịch sử nghiên cứu nấm gây bệnh côn trùng
Theo Steinhaus (1949), nấm kí sinh côn trùng trong tự nhiên có thể gây chết
thường xuyên với tỷ lệ cao cho nhiều loài côn trùng gây hại và là những tác nhân điều
hòa quần thể vi sinh vật trong tự nhiên rất hiệu quả. Côn trùng chết do nấm rất dễ nhận
biết bằng mắt thường vì các sợi nấm mọc qua vỏ cơ thể và bao phủ toàn bộ mặt ngoài
của cơ thể côn trùng. Cơ thể côn trùng chết do nấm không bị tan rã mà thường giữ
nguyên hình dạng ban đầu, toàn bộ bên trong cơ thể chứa đầy sợi nấm (trích dẫn bởi
Nguyễn Lân Dũng, 1981). Theo Steinhaus (1956), minh họa đầu tiên về nấm gây bệnh
côn trùng được Reaumur công bố năm 1726 với một loài nấm thuộc giống Cordyceps
gây bệnh cho sâu non họ Noctuidae. Và cũng theo ông ý tưởng sử dụng vi sinh vật trừ
côn trùng hại bắt nguồn từ các nghiên cứu bệnh tằm. Năm 1824, Cist nghiên cứu về
bệnh của sùng Melolontha do nấm Cordyceps gây ra. Torrubia (1974) đã ghi nhận một
loài cánh màng (có thể là Polistes) bị chết do nấm Cordyceps sphecocephala. Agostino
Bassi được coi là người đi đầu trong lĩnh vực bệnh lý học côn trùng, đã bỏ hơn 30 năm
nghiên cứu nấm trắng muscardine gây bệnh trên tằm dâu (Bombyx mori L.). Năm
1835, ông tìm ra nấm Beauveria bassiana là nguyên nhân gây bệnh. Khám phá của
ông không chỉ đặc nền móng cho nghiên cứu về vi sinh vật gây hại mà còn ảnh hưởng
đáng kể đến nghiên cứu của Louis Pasteur, Robert Koch và nhiều người đi đầu trong
lĩnh vực vi sinh vật học. Năm 1836, cũng chính Bassi là người đầu tiên gợi ý sử dụng
vi sinh vật gây bệnh để trừ côn trùng hại. Năm 1837, Oduen cũng cho rằng nấm bạch
cương không chỉ gây bệnh cho tằm, có thể dùng nấm này để trừ các côn trùng khác.
Nhà bác học người Pháp Louis Pasteur (1822-1895) đã tìm ra nguyên nhân gây
bệnh trên tằm và đề ra biện pháp phòng tránh sự lây lan bệnh. Nghiên cứu của ông
được coi là kết quả thực nghiệm đầu tiên trong ngành bệnh lý học côn trùng (Nguyễn
Lân Dũng, 1981). Chính Pasteur (1874) đã đề xuất tìm kiếm nấm côn trùng thích hợp
để trừ rệp hại nho Phylloxera.
Năm 1892 F. Tangl đã nuôi cấy nhân tạo thành công nấm bạch cương
Beauveria bassiana rồi dùng bào tử của chúng tiêu diệt sâu róm (Porthetriadisper)
(Nguyễn Lân Dũng, 1981).

3


Sau năm 1939, các tài liệu xuất bản của thế giới đã xuất hiện một lượng rất lớn
công trình nghiên cứu về các nấm Beauveria bassiana và Metarhizium anisopliae,
trong đó chủ yếu với nấm Beauveria đã có hơn 200 công trình. Sự chú ý nhiều đến tác
nhân gây bệnh cho côn trùng này chứng tỏ khả năng gây bệnh rất hiệu quả của nó và
nấm Beauveria đã được coi là một chất diệt sâu vi sinh vật. Người ta thấy rằng nấm
Beauveria đã đáp ứng được những đòi hỏi chủ yếu: gây bệnh cho côn trùng, không
độc với người và động vật máu nóng, có thể sản xuất lớn. Đến năm 1987, trên thế giới
đã mô tả được hơn 750 loài nấm gây bệnh côn trùng trong tổng số 100.000 loài nấm
(Pavlyuskin, 1987).
2.2. Sơ lược về bệnh vôi ở tằm dâu Bombyx mori
Bệnh được biết do nấm Beauveria bassiana gây ra, rất phổ biến và thường thấy
ở tất cả các nước có nghề trồng dâu nuôi tằm. Nấm Beauveria bassiana có thể nhiễm
ở tất cả các giai đoạn phát triển của tằm dâu Bombyx mori. Sự xâm nhiễm của bào tử
nấm là do tiếp xúc qua da, nguồn bệnh chủ yếu là xác tằm chết, giấy lót, khay tằm bị
nhiễm bệnh, sâu của các loài bướm dại bị chết từ đồng dâu. Bệnh lây lan nhanh do
các bào tử phát tán trong không khí thông qua các hoạt động phóng bào tử bằng cơ
học (chúng có khả năng bắn bào tử tới khoảng cách gấp hàng nghìn lần lớn hơn kích
thước của chúng), lan truyền nhờ dòng nước, không khí và côn trùng. Bệnh này
thường xuất hiện trong mùa đông và mùa mưa, ở điều kiện nhiệt độ và ẩm độ cao.
Điều kiện thuận lợi cho bệnh vôi phát sinh:
• Nhiệt độ trung bình 18 - 220C, ẩm độ cao 90 - 100%. Mật độ tằm dày, nong tằm
ẩm ướt.
• Trường hợp nhiệt độ thích hợp nhưng ẩm độ 90 - 100%, nếu có nấm gây bệnh
vôi, sau 13 giờ toàn thân tằm sẽ bị nhiễm bệnh vôi.
• Nếu ẩm độ 80% chỉ có một bộ phận tằm bị nhiễm bệnh vôi.
• Nếu ẩm độ 60 - 70% thì nấm không có tác dụng gây bệnh.
Khi mới bị xâm nhiễm, triệu chứng không rõ nhưng lúc này tằm kén ăn và ít

hoạt động. Tằm mới bị bệnh da bạc màu, nhìn kĩ có chấm đen nhỏ, nhiều chấm nhỏ
hợp lại thành nốt lớn. Trước khi chết xuất hiện triệu chứng tiêu chảy và ói. Khi mới
chết thân tằm mềm sau 2 - 3 giờ thân tằm sẽ cứng dần. Trong quá trình trao đổi chất,
sợi nấm bệnh tiết vào cơ thể tằm một lượng muối Oxalat Canxi màu hồng nên khi tằm
bị bệnh mới chết có màu hồng. Sau đó muối oxalat canxi tích tụ lại cùng với muối
4


amon magie tạo nên hợp chất muối oxalatcanxi magie amon, kết tinh màu trắng. Sau
1 - 2 ngày toàn thân phủ một lớp phấn trắng, sau 4 ngày toàn thân trắng toát như vôi
(trích dẫn Nguyễn Văn Long và ctv, 2005).
2.3. Công dụng của bạch cương tàm
Theo các sách thuốc cổ: Bạch cương tàm vị mặn cay tính bình. Qui kinh Can phế.
•

Sách Bản kinh: vị mặn bình.

•

Sách Danh y biệt lục: cay bình không độc.

•

Sách Dược tính bản thảo: hơi ôn có độc ít.

•

Sách Bản thảo cương mục: nhập kinh quyết âm, dương minh.

•


Sách Lôi công bào chế dược tính giải: nhập 4 kinh: tâm, can, tỳ, phế.
Thành phần chủ yếu trong Bạch cương tàm gồm: ammonium oxalate, chitinase,

beauverician, asparagine, fibrinolysin. Theo phân tích chung Bạch cương tàm có
khoảng: 67,44% chất protid; 4,38% chất béo; 6,34% tro và 11,34% độ ẩm.
Theo y học cổ truyền Bạch cương tàm có tác dụng: tức phong chỉ kinh (chống
co giật), khu phong chỉ thống (giảm đau), giải độc tán kết. Chủ trị các chứng: đàm
nhiệt kinh phong, động kinh co giật, trúng phong liệt mặt, đau đầu mắt đỏ, cổ họng
sưng đau, phong trùng nha thống (đau răng), đàm hạch loa lịch (lao hạch lâm ba), đinh
nhọt đơn độc.
Theo kết quả nghiên cứu dược lý hiện đại:
• Tác động lên hệ thần kinh trung ương: thí nghiệm trên súc vật, Bạch cương tằm
có dấu hiệu gây ngủ. Có tác dụng ức chế co giật do Strychnin gây ra làm giảm
tỷ lệ chết của chuột bạch (Trung Dược Học).
•

Tác dụng kháng khuẩn : trong ống nghiệm, thuốc có tác dụng ức chế nhẹ đối
với tụ cầu vàng, trực khuẩn đại tràng, trực khuẩn mũ xanh. (Hiện Đại Thực
Dụng Trung Dược) (Nguồn />
2.4. Tổng quan về nấm bất toàn kí sinh côn trùng
Phân loại khoa học
Lớp:

Deuteromycetes.

Bộ nấm sợi:

Moniliales.


Họ:

Moniliaceae.

5


2.4.1. Sơ lược về nấm Beauveria bassiana
Nấm Beauveria có phạm vi kí chủ rất rộng có thể gây bệnh cho hơn 700
loài thuộc 149 họ, 15 bộ côn trùng, hơn 10 loài nhện (Zhang, 1999). Năm 1954,
Macloed phân nấm bạch cương ra 2 loài chính là Beauveria bassiana có bào tử
hình cầu (hoặc trên 50% bào tử hình cầu) và Beauveria tenella còn có tên khác là
Beauveria brongniarti có bào tử hình trứng (2% bào tử hình cầu).
Theo Hoogde G.S. (1972) thì giống Beauveria có 3 loài trong đó 2 loài đầu
là tác nhân gây bệnh côn trùng
• Beauveria bassiana (Bals) Vaill.
• Beauveria brongniarti (Sacc) Petch.
• Beauveria alba (Lomber) Sarcas.
Sau đó, Carmichae (1980) và Samson (1982) lại công bố thêm 3 loài mới là
Beauveria afelina, Beauveria levata, Beauveria amorpha như vậy nấm bạch
cương đã có tới 7 loài. Về sau năm 1984 ở Nhật Bản đã phân lập được rất nhiều
loài nấm bạch cương có bào tử hình ống và hình que ở giữa thắt lại và hơi uốn
cong, tế bào sinh bào tử hình bình, đuôi hình chữ Z, kích thước bào tử từ 3,4 - 4,7
x 1,2 - 1,8 µm.
2.4.1.1. Đặc điểm hình thái
Đặc điểm cơ bản của nấm Beauveria bassiana là thể sợi nấm màu trắng, dạng
lông, sợi nấm mảnh đường kính 1,5 - 2µm, cuống bào tử mọc đơn hoặc phân nhánh.
Tế bào sinh bào tử hình bình, hình ống hoặc hình cầu, thẳng hoặc hơi uốn cong. Trục
sợi uốn hình chữ “Z” bào tử mọc trên đầu góc chữ “Z”cùng với cuống rất nhỏ (trích
dẫn bởi Trần Văn Mão, 2008).

Theo Nguyễn Văn Long và ctv (2005), bào tử nấm Beauveria bassiana dạng
hình cầu hoặc hình ovan không màu nhưng dưới kính hiển vi độ phóng đại 400 lần,
bào tử có màu xanh nhạt, chúng tập hợp lại thành dạng bột phấn trắng.
Theo Nguyễn Ngọc Tú và Nguyễn Cửu Thị Hương Giang (1997), nấm
Beauveria bassiana có bào tử trần hình cầu (đường kính 1 - 4 µm) đến hình trứng (1,5
- 5,5 x 1,3 µm). Sợi nấm hình ngang khoảng 3 - 5 µm phát triển dày đặt trên môi
trường, mang nhiều cuống sinh bào tử và bào tử. Mặt khuẩn lạc nấm dạng phấn trắng.
Trên cơ thể tằm và côn trùng khác, sợi nấm có dạng phấn trắng khi khô biến thành
màu vàng sữa.
6


Hình 2.1 Cuống sinh bào tử và bào tử nấm Beauveria bassiana.
Nguồn ( />2.4.1.2. Đặc điểm nuôi cấy
Do có hệ enzyme phong phú (lipaza, proteinaza, ureaza, aspatainaza, amylaza)
nên có khả năng phát triển trên nhiều loại môi trường dinh dưỡng với các thành phần
khác nhau. Trong đó môi trường thạch khoai tây hay được sử dụng và khả năng phát
triển của nấm trên môi trường này là tốt nhất (trích dẫn bởi Nguyễn Ngọc Tú và
Nguyễn Cửu Thị Hương Giang, 1997).
Nấm Beauveria bassiana nảy mầm tốt trong môi trường có đường mía và
pepton. Trong các loại đường nói chung, glucoza luôn luôn là nguồn cacbon rất tốt cho
các loài nấm kí sinh côn trùng. Nấm cũng cần nitơ hữu cơ và vô cơ, trong nitơ vô cơ
thích hợp với NO 3 - hơn NH 4 +. Phốt pho (P) là nhân tố quan trọng làm tăng số lượng
nấm, trong giai đoạn sinh trưởng nhu cầu cacbon (C), nitơ (N) của nấm rất rõ rệt
nhưng đến khi sợi nấm đứt ra hình thành bào tử đốt nhu cầu C, N giảm dần còn P lại
tăng lên (trích dẫn bởi Trần Văn Mão, 2008).
Theo Trần Văn Mão (2008) phạm vi nhiệt độ của nấm khoảng 5 - 350C, thích
hợp nhất cho sự nảy mầm, phát triển và tạo bào tử của nấm là 20 - 300C, nếu nhiệt độ
thấp nấm sinh trưởng chậm, nhiệt độ cao sinh trưởng nhanh nấm mau già yếu. Nhiệt
độ cũng ảnh hưởng đến sự hình thành bào tử. Brunno Schaerflen berg (1964), cho biết

sự nảy mầm và phát triển sợi nấm của Metarhizium anisopliae và Beauveria bassiana
đã bị ức chế mạnh ở nhiệt độ dưới 10C. Khi tăng nhiệt độ tốc độ phát triển của nấm
tăng và nhiệt độ thích hợp là 22 - 260C.
Độ ẩm cao có lợi cho bào tử nảy mầm và sinh trưởng của sợi nấm, nhưng nhiệt
độ thấp lại có lợi cho duy trì sự sống của nấm. Theo Phạm Thị Thùy (2004), ẩm độ
thích hợp trong phạm vi 80 - 90%, nếu trên hoặc dưới ngưỡng thì nấm phát triển yếu.
7


Nấm Beauveria bassiana có tính thích nghi rộng, phạm vi nảy mầm là pH 3,0 9,4. Ở pH 4,4 thì nảy mầm nhiều nhất, tốc độ nảy mầm cũng nhanh nhất. Sợi nấm sinh
trưởng ở pH 4,5 - 5,0, hình thành bào tử tốt nhất ở pH 6 (Trần Văn Mão, 2008).
Bào tử nấm Beauveria bassiana có tính thích nghi khá mạnh sau 91 giờ dưới
ánh nắng mới mất khả năng sống. Ở nhiệt độ 320C dưới ánh nắng trong 5 giờ có thể
mất sức sống, ánh sáng tán xạ có tác dụng kích thích bào tử nảy mầm, sinh trưởng sợi
nấm và hình thành bào tử của nấm. Trong tối sợi nấm sinh trưởng chậm nhưng khuẩn
lạc dày hơn, qua một thời gian chiếu sáng bào tử sẽ hình thành hàng loạt (trích dẫn
bởi Trần Văn Mão, 2008).
2.4.1.3. Hoạt tính sinh học của nấm Beauveria bassiana
Nấm Beauveria bassiana có khả năng tổng hợp một lượng lớn các enzyme
trong đó có ý nghĩa lớn nhất cho khả năng gây bệnh trên côn trùng có: chitinaza,
proteinaza, lipaza, ureaza, aspatainaza và amylaza. Trong đó amylaza có mức độ hoạt
tính gấp 3 lần hoạt tính enzyme khác.
Năm 1969, các nhà khoa học đã xác định được độc tố diệt côn trùng của nấm
bạch cương Beauveria bassiana và đặt tên cho độc tố này là beauvericin. Chất này
được chúng tiết ra khi bào tử nảy mầm.
Về mặt hoá học, beauvericin có danh pháp là xyclo (N - metyi - L - phenylalanin D - α - hydroxyizovaleryl) 3 . Đó là một loại depxipeptid vòng, có điểm sôi khoảng 93 940C. Từ một lít dung dịch môi trường nuôi cấy nấm Beauveria bassiana các nhà khoa
học Trường Đại học Tổng hợp Nam Khai (Trung Quốc) đã tách ra được 1,5 g độc tố
beauvericin và từ 1 kg môi trường đặc các tác giả đã tách ra được 3,8 g beauvericin.

Hình 2.2 Cấu trúc hóa học độc tố beauvericin.

(Nguồn />8


Theo nghiên cứu của các nhà khoa học đến từ Đại học Kitasoto - Nhật Bản
nhóm chất beauveriolide trong nấm Beauveria có khả năng ngăn chặn các đại thực bào
hấp thu cholesterol và axít béo. Beauveriolide thực hiện đồng thời hai nhiệm vụ: một
là không cho cholesterol và các axít béo cấu thành giọt nhỏ - hình thái cho phép các
đại thực bào dễ dàng hấp thu, hai là khống chế hoạt động của một loại enzyme có mặt
trong đại thực bào chịu trách nhiệm thu giữ những giọt chất trên. Thử nghiệm
beauveriolide trên những con chuột mắc chứng xơ vữa động mạch cho thấy sự tích tụ
cholesterrol và các chất béo giảm tới 50% so với những con khác. Nhóm nghiên cứu
khẳng định liệu pháp này không gây phản ứng phụ như tiêu chảy hay làm tổn thương
tuyến thượng thận điều mà các thuốc kiềm chế enzyme không thể làm được (Nguồn
/>
Trong công trình của West E. J và Briggs J. D (1968) đã xác định mối liên quan
giữa độc tố nấm diệt sâu và độc tính gây bệnh cho côn trùng. Họ cho biết rằng tiến
hành cấy chuyền Beauveria bassiana qua côn trùng vật chủ sống thì nồng độ độc tố
tạo thành tăng hơn so với Beauveria bassiana phân lập giữ trên môi trường tổng hợp.
Ngoài ra độc tố cao nhất với sâu được tạo thành khi nấm được nuôi trong cấy trên
chính côn trùng này. Như vậy nguồn dinh dưỡng của nấm có ý nghĩa quan trọng đối
với sự hình thành đặc tính độc tố chuyên hóa.
Ngoài ra, mô côn trùng bị nhiễm nấm thì bền vững dưới tác dụng của vi sinh vật gây
thối rửa chứng tỏ nấm này có khả năng tạo ra một số hợp chất trao đổi giống kháng
sinh. Evlachova (1970) đã nghiên cứu tính chất kháng khuẩn của một số nòi nấm
Beauveria và kết luận rằng phổ diệt khuẩn của chúng khá rộng (trích dẫn Nguyễn
Ngọc Tú và Nguyễn Cửu Thị Hương Giang, 1997).
2.4.1.4. Tính an toàn của nấm đối với động vật máu nóng
Nói chung nấm thường phát triển trong điều kiện nhiệt độ thấp và không ảnh
hưởng đến động vật máu nóng. Pian đã nêu rõ, nấm bạch cương trong cơ thể sống ở
nhiệt độ 350C, dù ở điều kiện ẩm độ nào đều ngừng phát triển và sau 28 ngày là mất

khả năng sống, cho nên chúng rất an toàn đối với con người (Trần Văn Mão, 2008).
Schaerffenberg (1968) đã làm thí nghiệm để thử tính độc của nấm trên chuột
bạch: Ông dùng dịch bào tử có 25 bào tử nấm tiêm vào tĩnh mạch chuột 1 lượng là 0,5
ml sau đó quan sát thấy những con chuột này không có biểu hiện gì khác thường, sau
9


đó thí nghiệm khác được lặp lại bằng cách dùng bột bào tử rắc vào hộp 4 mg/m 2 cho
chúng hít vào sau 2 tháng quan sát vẫn không thấy chuột có hiện tượng trúng độc.
Các nhà khoa học đã thử nghiệm tiêm dung dịch bào tử nấm Beauveria
bassiana lên chuột, lợn và cho chúng ăn, theo dõi sau 2 tháng vẫn không thấy chúng
có phản ứng. Điều này chứng tỏ nấm không có ảnh hưởng xấu đối với con người và
động vật máu nóng. Thí nghiệm độc lý cho thấy chúng có độ độc rất thấp LD 50 > 2500
mg/kg. Nhiều thí nghiệm đều chứng tỏ nấm bạch cương là loại nấm an toàn.
2.4.2. Sơ lược về nấm Nomuraea rileyi (Beauveria rileyi)
Nấm ký sinh côn trùng, Nomuraea rileyi (Farlow) Samson (trước đây còn gọi
Beauveria rileyi (Farl.) Gosswald). Nấm có khả năng gây bệnh cho hơn 30 loài côn
trùng hại khác nhau thuộc bộ cánh vảy và bộ cánh cứng. Gây dịch bệnh cho các loài
sâu bướm trên ruộng đậu, trên ấu trùng Heliothis zea, ấu trùng tằm dâu Bombyx mori.
Sợi nấm sinh dưỡng nhỏ, nhẵn có vách ngăn, trong suốt, đường kính 2,0 - 3,0
µm. Cuống bào tử đính thẳng đứng có vách ngăn, chiều dài khoảng 160 µm, đường
kính 2,0 - 2,5 µm. Trên cuống bào tử đính mang 2 hay 3 thể bình mọc xung quanh
cuống. Thể bình 4,7 - 6,5 x 2,3 - 3,0 µm thường hình trụ ngắn, đôi khi phình ra ở đáy.
Bào tử dạng chuỗi hạt, hình trái xoan, thỉnh thoảng hình trụ hay gần như vậy, bề mặt
nhẵn, bào tử màu xanh nhạt, sinh khối màu xanh 3,5 - 4,5 x 2,0 - 3,1 µm.
Trong tự nhiên nấm bao phủ ấu trùng côn trùng bởi sợi nấm tạo thành một lớp
mỏng màu trắng từ đó mọc lên dày đặc các đính bào tử, dạng tầng có màu hơi xanh
nhạt. Trong môi trường nhân tạo nấm phát triển chậm, mặt sau không có màu hay màu
vàng, không có mùi và dịch tiết, có thể xuất hiện thể bình không đúng dạng, hình dạng
kích thước bào tử thay đổi (theo Samson, 1974).


Hình 2.3 Nấm Nomuraea rileyi gây bệnh trên sâu.
(Nguồn />10


Hình 2.4 Hình thái Nomuraea rileyi và Nomuraea atypicola. a) cuống sinh bào tử,
b) bào tử nấm Nomuraea rileyi, c) cuống sinh bào tử, d) bào tử nấm Nomuraea atypicola.
(Nguồn />2.4.3. Cơ chế xâm nhiễm của nấm gây bệnh côn trùng
Khả năng nhiễm thành công với côn trùng khá lớn vì chúng có nhiều cách xâm
nhiễm khác nhau: qua lớp cutin, qua đường tiêu hóa, qua đường hô hấp và qua lỗ của
thân. Do khả năng xâm nhập vào bên trong cơ thể côn trùng qua lớp vỏ cơ thể nên nấm
có thể kí sinh được côn trùng chích hút và cả những pha phát triển của côn trùng như
trứng , nhộng mà các vi sinh vật khác không kí sinh được (trích dẫn Nguyễn Ngọc Tú
và Nguyễn Cửu Thị Hương Giang, 1997).
Nấm xâm nhập vào cơ thể côn trùng chủ yếu qua lớp vỏ cutin nghĩa là phải có
sự tiếp xúc của bào tử nấm với bề mặt cơ thể vật chủ. Quá trình này bắt đầu từ sau khi
vật chủ bị nhiễm bào tử khoảng 10 giờ và có thể kéo dài vài ngày sau. Sau khi xâm
nhiễm vào bắt đầu sinh trưởng và phát triển. Trong quá trình xâm nhiễm vào các bộ
phận, nội quan, nấm bị các tế bào bạch huyết tấn công, nấm tiêu diệt lần các tế bào
bạch huyết. Khi nấm tiêu diệt hết tế bào bạch huyết thì côn trùng vật chủ chết và nấm
tiếp tục sinh trưởng, phát triển. Lượng sợi nấm bên trong cơ thể vật chủ ngày càng
tăng và xác côn trùng trở nên rắn lại, khi gặp đủ ẩm, các sợi nấm mọc ra ngoài bề mặt
cơ thể vật chủ và tạo thành bào tử mới (Nguyễn Xuân Thành và ctv, 2003).
Khi gặp điều kiện nhiệt độ, ẩm độ thích hợp bào tử nấm phình lên, nảy nầm
thành ống mầm, ống mầm tiếp xúc với da côn trùng hình thành vòi bám. Vòi bám là
11


một tế bào có kích thước gấp 2 - 3 lần bào tử, có dịch nhầy để dính vào da. Vòi bám
hình thành sợi nhỏ chọc thủng da. Sau khi xuyên qua da sợi nấm phình to thành dạng

bàn, mép bàn mọc sợi nấm rồi hình thành các sợi ngắn. Sợi ngắn nhờ áp lực đẩy vào
lớp trong cuối cùng đạt đến da thật. Nếu côn trùng lột xác chúng lại hình thành vòi
bám mới để tiến hành tái xâm nhiễm. Nấm thông qua áp lực cơ giới để xâm nhập vào
trong cơ thể côn trùng và nhờ tác dụng của enzyme phân giải mà chọc thủng biểu bì.
Những enzyme phân giải là proteaza, lipoaza và kitinaza. Muốn da phân giải trước hết
là nhờ proteaza, rồi lipoaza, cuối cùng mới có tác dụng của kitinaza. Nấm gây bệnh
cứng sâu tổng hợp rất nhiều enzym. Mỗi loài nấm khác nhau sẽ hình thành các enzym
khác nhau nhưng chúng đều có thể tự tạo ra enzym kitinaza (Trần Văn Mão, 2008).
Theo Robinson R. K (1996), sự xâm nhập của nấm diệt sâu qua lớp cutin ngoài
được thực hiện nhờ hoạt động của enzyme do chính nấm tiết ra. Ngoài ra Robinson R.
K cũng xác nhận rằng các nấm diệt sâu chuyên hóa cao tạo nên trên bề mặt cutin một
kiểu giác bám phồng lên dạng kim xuyên vào bên trong cutin của côn trùng. Sự xâm
nhập vào xoang thân côn trùng xãy ra khá nhanh chóng qua 32 - 48 giờ đã làm đầy cơ
thể côn trùng với những đoạn sợi nấm đơn bào tự do bơi trong huyết tương dẫn đến sự
phá hủy tiếp theo mô thân côn trùng. Nấm bắt đầu sinh sôi nảy nở trong huyết tương
thì côn trùng bắt đầu tê liệt.
Khi xâm nhập vào bên trong cơ thể qua đường tiêu hóa, bào tử từ miệng đi tới
ruột và qua thành ruột xâm nhiễm vào các tế bào nội quan để gây bệnh. Xâm nhiễm
kiểu này chủ yếu là bào tử của các loài nấm sống ở nước. Dưới tác động của độc tố do
nấm tiết ra có thể dẫn đến hiện tượng ngừng nhu động ruột của vật chủ. Bào tử còn có
thể xâm nhập qua lỗ thở hoặc cơ quan sinh dục để vào bên trong cơ thể côn trùng
nhưng rất ít.
2.4.4. Sự thay đổi bệnh và sự rối loạn chức năng trong cơ thể côn trùng
Sự sinh sản trong cơ thể côn trùng làm cho hoạt động trao đổi chất, các cơ quan
mô bị phá hoại, mất chức năng sinh lý và phát sinh sự rối loạn.
Sợi nấm trong xoang sinh trưởng phát triển, nấm tiết chất độc và enzyme để
giết chết vật chủ rồi sau đó trên xác côn trùng sinh trưởng phát triển, hình thành các
hạch nấm làm cho côn trùng cứng lại. Sinh sản của nấm trước hết là sự biến đổi thành
phần dịch thể làm giảm tác dụng oxy hóa khử limfa trong máu. Do sinh sản nhiều nấm
sẽ làm tắc hệ tuần hoàn côn trùng, gây đói tế bào sinh lý vật chủ, chất độc sinh ra làm

12


thay đổi sinh hóa cơ thể và làm tê liệt thần kinh từ đó làm mất đi và rối loạn cơ năng
sinh lý. Chúng sẽ biểu hiện hô hấp thất thường, giảm sức sinh sản, ức chế quá trình lột
xác. Sâu non bọ lá khoai tây sau khi bị bệnh nấm bạch cương cường độ hô hấp tăng
lên nhiều lần. Nhiều loài sâu hại khi bị nhiễm nấm bạch cương điều biểu hiện giảm sức
sinh sản rõ rệt. Ngài đục táo, mọt cà phê sau khi phun chế phẩm nấm bạch cương tỷ lệ
đẻ trứng của con cái giảm xuống 45 - 60%.
2.4.5. Phương pháp định danh nấm
• Định danh hình thái.
Quan sát đặc điểm khuẩn lạc trên môi trường thạch: hình dáng, kích thước, dạng
mặt (nhung mượt, mịn, len xốp, lồi lõm, có khía hay không,…). Màu sắc khuẩn lạc
mặt trên và mặt dưới, dạng mép khuẩn lạc (mỏng, dày, phẳng, nhăn nheo…), giọt tiết
nếu có (nhiều, ít, màu sắc), …
Quan sát các đặc điểm vi học: sợi nấm (có vách ngăn, không có vách ngăn, cố
mấu); bào tử trần (kiểu phát sinh bào tử trần, hình dạng, kích thước, màu sắc, bề
mặt…); kiểu sinh bào tử trần (thể bình, dạng có khuyên ở đính, dạng sinh bào tử trần
đồng thời, dạng sinh bào tử trần không đồng thời, bào tử đính kiểu nảy chồi, hình
dạng, kích thước, màu sắc, cách sắp xếp, vị trí …
Tiến hành định loại: căn cứ vào kết quả quan sát đầy đủ, chính xác các đặc điểm
khuẩn lạc và các đặc điểm vi học tiến hành xác định tên loài:
Dùng khóa phân loại của các nhóm phân loại bậc cao (ngành, ngành phụ, lớp, bộ, họ,
chi) để xác định lần lượt xem thuộc chi nào. Tiếp theo dùng khóa phân loại của chi đó
để xác định đến loài bằng cách so sánh tất cả các đặc điểm đã quan sát được của chủng
nấm đó với các đặc điểm tương ứng của loài nào đó trong khóa phân loại. Nếu các đặc
điểm so sánh phù hợp với đặc điểm của loài mô tả trong, ta xác định được tên loài nấm
cần định loại. Có hai khóa phân loại đến chi của lớp nấm bất toàn, khóa 1 của Robert
A. Samson, (1984) và khóa 2 của Katsuhiko Ando, (2000).
• Định danh phân tử:

Sử dụng kĩ thuật PCR và giải trình tự gen 28S rDNA. Phòng thí nghiệm NK-Biotek và
đơn vị R & D công ty Nam Khoa đã sử dụng phương pháp này để định danh. Nguyên
tắc của phương pháp này là sử dụng bộ

NK

FUNGI-DNAPREP do đơn vị R & D của

công ty Nam Khoa chế tạo để tách chiết DNA toàn phần từ mẫu vi nấm hay mẫu thử
chứa vi nấm cần định danh, sau đó sử dụng PCR với cặp mồi được đặt tên là NK 28S-F
13


và

NK

28S-R đặc hiệu một đoạn DNA dài 260bps có chứa các trình tự đặc hiệu giống

và loài của vi nấm trên gen 28S rDNA. Và sau cùng là giải trình tự trực tiếp và 2 chiều
sản phẩm PCR để định danh vi nấm qua công cụ blast search trên ngân hàng dữ liệu
gen của NCBI.
2.4.6. Các nghiên cứu về nấm Beauveria
2.4.6.1. Nghiên cứu ngoài nước
Cuối thế kỷ 19 ở Hoa Kì đã dùng nấm Beauveria bassiana để trừ một loại bọ
xít cánh trắng. Nấm Beauveria bassiana có trong đất ít hơn Metarhizium anisoplia,
trong 100 mẫu đất chỉ có 22 mẫu nấm Beauveria bassiana (Phạm Văn Lầm, 2000).
Theo nghiên cứu của Vineet Kumar và ctv (1999) về sự nảy mầm, sự xâm
nhiễm của Beauveria bassiana trên tằm Bombyx mori chủng NB18, nuôi ở 26 ± 1°C,
độ ẩm tương đối 80 + 5% và chiếu sáng 16 giờ. Tiến hành lây nhiễm ở giai đoạn tằm

lột xác sang tuổi 5, liều lây nhiễm 1 x 106 bào tử nấm/ml. Độc tính Beauveria
bassiana chỉ 50 bào tử/ấu trùng, đã đủ mạnh để gây chết 100% ấu trùng. Bào tử nảy
mầm khoảng 8 giờ sau khi lây nhiễm, tạo thành một giác bám trong vòng 24 giờ và
các sợi nấm vào lớp biểu bì nhờ nấm có thể sản xuất enzym teolytic và lipolytic
exocellula giúp cho việc giải thể lớp da của ấu trùng. Các sợi nấm xâm nhập và trong
vòng 48 giờ nấm tăng trưởng mạnh tạo thành một phức hợp sợi nấm, gây ra cái chết
của ấu trùng trong khoảng 5 - 6 ngày. Sợi nấm phát triển tạo một tấm thảm màu trắng
nấm trên toàn bộ cơ thể ấu trùng trong 6 - 7 ngày. Sau khi vật chủ chết các sợi nấm di
chuyển ra ngoài để bắt đầu giai đoạn bào tử. Do đó, nấm hoàn thành vòng đời của nó
trên ấu trùng tằm trong 7 - 8 ngày. Nhiều lớp tinh thể khác nhau về hình dạng và kích
thước đã được quan sát trên da và xung quanh viền lỗ thở của ấu trùng. Các tinh thể
có thể là oxalat của amon và magie đã được tạo ra khi nấm nhiễm vào.
Đối với nấm Nomuraea rileyi (Farlow), theo nghiên cứu của Vineet Kumar và
ctv (1997) các bào tử trưởng thành sẽ nảy nầm trên da ấu trùng tằm sau 24 giờ và xâm
nhập vào lớp biểu bì trong vòng 36 giờ sau khi lây nhiễm ở nhiệt độ 24 ± 10C và ẩm
độ 80 ± 5%. Các sợi nấm nhân lên bắt đầu sinh sôi và hình thành vách ngăn trong
khoang máu, ấu trùng không chống cự lại nổi tác động sau 6 - 7 ngày. Các sợi nấm
mọc dài ra và đan xen với nhau trong mô biểu bì 7 - 8 ngày. Nhiều đính bào tử xuất
hiện tao thành một lớp bột phấn trắng trên bề mặt ấu trùng 9 - 10 ngày. Bào tử nấm

14


màu xanh nhạt phát triển, làm cho bề mặt ấu trùng có màu xanh nhạt. Vòng đời của
nấm trên tằm dâu Bombyx mori được hoàn thành trong 10 - 11 ngày.
Kamp và Bidochka (2002) tiến hành đánh giá sự sản xuất bào tử của 3 loại nấm
kí sinh côn trùng Metarhizium anisoplia, Beauveria bassiana và Verticillium lecanii
được đánh giá ở các độ sâu khác nhau (2 mm, 3 mm, 4 mm tương ứng với 10 ml, 15
ml, 20 ml) và các loại môi trường khác nhau (SDA, MEA, NA, CMA, YPDA, PDA)
cho biết sự sản xuất bào tử sau 14 ngày của nấm nảy mầm Metarhizium anisoplia và

Beauveria bassiana là tốt nhất trên môi trường PDA ở độ sâu 2mm, trong khi
Verticillium lecanii sản xuất bào tử tốt nhất trên môi trường YPDA và độ sâu của môi
trường thì không đáng kể.
Santa và ctv (2005), tiến hành nghiên cứu ”sản xuất bào tử Beauveria bassiana
từ phế phẩm công nông nghiệp” trong fermenter với điều kiện nuôi cấy được tối ưu
hóa: nhiệt độ nuôi cấy 26 0C, pH 6,0, mật độ 107 bào tử/gam và độ ẩm ban đầu 75%.
Trong điều kiện tối ưu có sục khí, bào tử tạo ra lớn nhất (1,07 x 1010 bào tử/gam) sau
10 ngày nuôi cấy.
Sonai Rajan và Muthukrishnan (2010), khảo sát ảnh hưởng của các loại môi
trường Potato boost agar, Potato horlicks agar, Potato maltoza agar, Potato viva agar,
Potato complan agar, Potato bournvita agar đến khả năng phát triển và hình thành bào
tử của chủng nấm Nomuraea rileyi (Farlow) Samson: PDBC, DOR và LOCAL.
Theo đó môi trường rắn cho đường kính và mật số bào tử cao nhất sau 15 ngày theo
dõi là Potato maltoza agar, tương ứng như sau: chủng nấm do PDBC phân lập (44,50
mm và 2,571 x 107 bào tử/ml); DOR phân lập (43,16 mm và 2,688 x 107 bào tử/ml);
LOCAL phân lập (44,00 mm và 2,7396 x 107 bào tử/ml); và thấp nhất là Potato
bournvita agar: PDBC (35,15 mm và 1,374 x 107 bào tử/ml); DOR (36,15 mm và
1,338 x 107 bào tử/ml); LOCAL (35,50 mm và 1,373 x 107 bào tử/ml).
2.4.6.2. Nghiên cứu trong nước
Từ giữa thập niên 1970, trường Đại học Lâm nghiệp bắt đầu nghiên cứu nấm
Beauveria bassiana để trừ sâu róm thông D. punctatus, nhưng chưa đưa được chế
phẩm nào vào ứng dụng trong sản xuất.
Theo Phạm Thị Thùy và ctv (1991-1995), nguồn nấm Beauveria ở nước ta khá
phong phú. Chế phẩm nấm Beauveria bassiana được sản xuất bằng phương pháp lên
men xốp, sinh khối nấm đạt 5 x 108 bào tử/gam, thời gian thu hoạch nấm tốt nhất theo
15