BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU TẠO DÒNG BIẾN DỊ IN VITRO
BẰNG PHƯƠNG PHÁP CHIẾU XẠ CÂY LAN HÀI HỒNG
(PAPHIOPEDILUM DELENATII) ĐẶC HỮU
QUÝ HIẾM CỦA VIỆT NAM

Ngành học

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện

: NGUYỄN HỒNG ÂN

Niên khóa

: 2007-2011

Tháng 7/2011


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

NGHIÊN CỨU TẠO DÒNG BIẾN DỊ IN VITRO
BẰNG PHƯƠNG PHÁP CHIẾU XẠ CÂY LAN HÀI HỒNG
(PAPHIOPEDILUM DELENATII) ĐẶC HỮU
QUÝ HIẾM CỦA VIỆT NAM

Hướng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

TS. LÊ QUANG LUÂN

NGUYỄN HỒNG ÂN

Tháng 7/2011

ii


LỜI CẢM ƠN
Có được kết quả như ngày hôm nay, con xin cảm ơn ba mẹ, đã sinh thành dưỡng
dục con nên người, cho con được học hành, luôn ủng hộ con và làm chỗ dựa cho con
trong cuộc sống.
Em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc đến giáo viên hướng dẫn, TS. Lê
Quang Luân, thầy đã tận tình hướng dẫn em trong thời gian thực tập và hoàn thành đề tài
tốt nghiệp.
Em xin cám ơn thầy cô trường Đại học Nông Lâm nói chung và Bộ môn Công
Nghệ Sinh Học nói riêng, đã tận tâm dạy dỗ em trong suốt bốn năm đại học.
Em xin cám chị Uyên, chị Hạnh, chị Trang, chị Nhã đã giúp đỡ em rất nhiều trong
thời gian thực tập tại Phòng Sinh học, Trung tâm Hạt nhân Thành phố Hồ Chí Minh.
Tôi cũng xin cám ơn tập thể lớp DH07SH, các bạn đã đồng hành cùng tôi trong

suốt những năm đại học.

i
iii


TÓM TẮT
Lan Hài Hồng (Paphiopedilum delenatii) là một loài lan đặc hữu vô cùng quý
hiếm đang có nguy cơ tuyệt chủng nhiều lý do khác nhau. Với mong muốn góp phần bảo
tồn đồng thời tạo nguồn biến dị in vitro làm nguyên liệu cho công tác tạo giống loài lan
Hài quý hiếm này, đề tài “Nghiên cứu tạo dòng biến dị in vitro bằng phương pháp chiếu
xạ cây lan Hài Hồng (Paphiopedilum delenatii) đặc hữu quý hiếm của Việt Nam” được
thực hiện.
Mục tiêu của đề tài là xây dựng quy trình nhân giống in vitro Lan Hài Hồng và tạo
ra các dòng biến dị in vitro bằng phương pháp chiếu xạ. Để đạt được mục tiêu này, các
nội dung chính được thực hiện trong đề tài bao gồm: nghiên cứu điều kiện khử trùng mẫu,
nghiên cứu xây dựng quy trình nuôi cấy in vitro lan Hài Hồng, chiếu xạ mẫu và chọn lọc
sau chiếu xạ.
Các kết quả đạt được đã đáp ứng mục tiêu ban đầu đề ra, cụ thể là đã xây dựng
hoàn chỉnh quy trình nhân giống in vitro lan Hài Hồng từ tạo vật liệu ban đầu đến tái sinh
cây in vitro, đã khảo sát tác động của bức xạ ion hóa lên sự sinh trưởng và phát triển của
mẫu in vitro, đã gây tạo và chọn lọc được 12 dòng biến dị in vitro ở cây lan Hài Hồng.
Giới hạn của đề tài: chỉ khảo sát những biến dị kiểu hình của cây lan Hài trong giai
đoạn in vitro.

iv
ii


SUMMARY

The study namely "Study on the generation of in vitro variations of rare and
endemic orchid of Vietnam (Paphiopedilum delenatii) by irradiation
P. delenatii, a rare and endemic orchid species is under endangered condition by
many resoons. Wishing to contribute to preserving and creating in vitro variated materials
for breeding of this rare orchid, the mention study was carried out.
The targets of the project: Build a process in vitro propagation for P. delenatii and
gemerating in vitro variated lines by irradiation method. The main contents include study
of steriled condition, the in vitro propagation process, irradiation and screening the
variations of irradiated P. delenatii.
The obtained results embraces a completed process for in vitro propagation of P.
delenatii was built up, observation of the effect of radiation ionization on the growth and
development of in vitro sampled of P. delenatii, 12 variations of P. delenatii were
selected.
Limitations of study: the study was only carried out for the phenotypic variation of
P. delenatii.
Keywords: Paphiopedilum delenatii, radiation ionization, in vitro propagation,
mundation.

iii
v


MỤC LỤC
Trang

LỜI CẢM ƠN ...................................................................................................................... i
TÓM TẮT ..........................................................................................................................iv
SUMMARY ......................................................................................................................... v
MỤC LỤC ..........................................................................................................................vi
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT .............................................................................ix

DANH SÁCH CÁC BẢNG ................................................................................................ x
DANH SÁCH CÁC HÌNH ................................................................................................xi
Chương 1 MỞ ĐẦU ............................................................................................................ 1
1.1. Đặt vấn đề ................................................................................................................................ 1
1.2. Yêu cầu của đề tài ................................................................................................................... 2
1.3. Nội dung thực hiện ................................................................................................................. 2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ................................................................................. 3
2.1. Giới thiệu chung ..................................................................................................................... 3
2.1.1. Lan Hài (Paphiopedilum) ..................................................................................................... 3
2.1.1.1. Phân loại ............................................................................................................................ 3
2.1.1.2. Sinh thái ............................................................................................................................. 3
2.1.1.3. Hiện trạng cây lan Hài Việt Nam .................................................................................... 4

2.1.2. Lan Hài Hồng ............................................................................................................ 5
2.1.2.1. Giới thiệu ........................................................................................................................... 5
2.1.2.2. Phân loại ............................................................................................................................ 6
2.1.2.3. Hình thái học ..................................................................................................................... 6
2.1.2.4. Đặc điểm sinh thái ............................................................................................................ 6
2.2. Nuôi cấy mô tế bào thực vật ................................................................................................. 7

2.2.1. Khái quát chung về nuôi cấy mô tế bào thực vật .................................................. 7
2.2.2. Môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật ................................................................ 8
2.2.2.1. Các loại muối khoáng. ...................................................................................................... 8
2.2.2.2. Vitamin .............................................................................................................................. 8

vi
iv



2.2.2.3. Chất điều hòa sinh trưởng ............................................................................................... 8
2.2.2.4. Các chất bổ sung ............................................................................................................... 9

2.2.3. Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô trong nghiên cứu và sản xuất ........................... 9
2.3. Chọn tạo giống cây trồng mới bằng phương pháp chiếu xạ ............................................. 10

2.3.1. Thành tựu chọn tạo giống đột biến bằng phương pháp chiếu xạ ...................... 10
2.3.2. Khái quát chung về đột biến .................................................................................. 10
2.3.3. Cơ chế gây đột biến do phóng xạ .......................................................................... 12
2.3.3.1. Tác dụng của bức xạ ion hóa lên cơ thể sống ............................................................... 12
2.3.3.2. Cơ chế gây đột biến ........................................................................................................ 13

2.3.4. Gây đột biến bằng bức xạ ion hóa và ứng dụng trong tạo giống ....................... 14
2.3.4.1. Nguyên tắc gây đột biến bằng bức xạ ion hóa .............................................................. 14
2.3.4.2. Một số ưu nhược điểm của phương pháp chọn tạo giống bằng bức xạ .................... 15
2.3.6.3. Chọn lọc dòng biến dị ..................................................................................................... 16

Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................... 18
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ....................................................................................... 18
3.2. Vật liệu ................................................................................................................................... 18
3.3. Các phương pháp nghiên cứu.............................................................................................. 18

3.3.1. Nghiên cứu điều kiện khử trùng mẫu ................................................................... 18
3.3.2. Nghiên cứu xây dựng quy trình nuôi cấy in vitro lan Hài................................... 19
3.2.2.1. Khảo sát môi trường hình thành callus của lan Hài ................................................... 19
3.3.2.2. Khảo sát môi trường nhân nhanh protocorm like body (PLB) .................................. 20
3.3.2.3. Khảo sát môi trường nhân nhanh chồi ......................................................................... 21
3.3.2.4. Khảo sát môi trường tái sinh cây lan Hài in vitro ........................................................ 23

3.3.3. Khảo sát ảnh hưởng bức xạ ion hóa lên mẫu lan Hài in vitro ............................ 23

3.3.3.1. Chiếu xạ mẫu .................................................................................................................. 24
3.3.3.2. Khảo sát ảnh hưởng mẫu sau khi chiếu xạ .................................................................. 24
3.3.3.3. Tạo và xác định các dòng biến dị .................................................................................. 24

3.3.4. Chọn lọc sau chiếu xạ ............................................................................................. 24
3.3.5. Xử lý thống kê số liệu ............................................................................................. 25
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ........................................................................ 26
4.1. Khảo sát điều kiện khử trùng và nuôi cấy mô lan Hài...................................................... 26

vii
v


4.1.1. Điều kiện khử trùng mẫu ....................................................................................... 26
4.1.2. Khảo sát môi trường tạo callus ............................................................................. 27
4.1.3. Khảo sát môi trường nhân nhanh PLB ................................................................ 28
4.1.4. Khảo sát môi trường nhân nhanh chồi ................................................................. 30
4.1.5. Khảo sát khả năng tái sinh cây hoàn chỉnh.......................................................... 32
4.2. Chiếu xạ tạo các dòng biến dị lan Hài Hồng trong điều kiện in vitro .............................. 33

4.2.1. Khảo sát ảnh hưởng của chiếu xạ tia gamma và chùm ion lên mẫu ................ 33
4.2.1.2. Tác động của bức xạ chùm ion lên mẫu lan Hài in vitro ............................................. 35

4.2.2. Gây tạo và chọn lọc các biến dị in vitro ................................................................ 36
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................................ 39
5.1. Kết luận ................................................................................................................................. 39
5.2. Đề nghị ................................................................................................................................... 39

TÀI LIỆU THAM KHẢO................................................................................................ 40
PHỤ LỤC


vi
viii


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

2,4D

2,4-dichlorophenoxyacetic acid

BA

Benzyladenine

CITES

Convention on International Trade in Endangered Species of Wild Fauna
and Flora

DES

Diethylsulfate

DMS

Dimethylsulfate

DNA


Deoxyribonucleic acid

EDTA

Ethylenediaminetetraacetic acid

EL

Ethylenimine

EMS

Ethylmetansulphonate

FAO

Food Argiculture Organization

IAEA

The International Atomic Energy Agency

IUCN

The International Union for Conservation of Nature

KeV

Kilo electron volt


LD50

Lethal Dose of 50

MeV

Mega electron volt

MS

Murashige and Skoog

NAA

α-naphthaleneacetic acid

NMU

Nitrozomethylurea

OD

Optical Density

P.

Paphiopedilum

PLB


Protocorm lile body

TBE

Tris-Boric acid - EDTA

TDZ

Thidiazuron

UV

Ultraviolet

ix
vii


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Trang
Bảng 3.1 Nghiệm thức ảnh hưởng của các chất ĐHST đến khả năng tạo callus………...20
Bảng 3.2 Nghiệm thức ảnh hưởng các chất ĐHST lên hệ số nhân PLB ………..........… 21
Bảng 3.3 Nghiệm thức ảnh hưởng của các chất ĐHST lên hệ số nhân chồi ………...… 22
Bảng 3.4 Khảo sát môi trường tái sinh cây lan Hài in vitro ……………………………. 23
Bảng 4.1. Tình trạng mẫu đỉnh sinh trưởng lan Hài sau khử trùng 6 tuần …………..…. 26
Bảng 4.2 Tình trạng mẫu trái lan Hài sau khử trùng và gieo hạt 10 tuần ……….…...… 26
Bảng 4.3 Ảnh hưởng của chất ĐHST đến khả năng tạo callus từ PLB …………...…… 28
Bảng 4.4 Ảnh hưởng các chất ĐHST lên hệ số nhân PLB ………………………..…… 29
Bảng 4.5 Ảnh hưởng của các chất ĐHST lên hệ số nhân chồi của lan Hài ………….… 31
Bảng 4.6 Khả năng tái sinh hoàn chỉnh của cây lan Hài …………………………..…… 32

Bảng 4.7 Giá trị LD50 của các mẫu lan Hài Hồng ……………………………………… 34
Bảng 4.8 Khả năng biến dị in vitro của cây lan Hài sau khi chiếu xạ Gamma ………… 37
Bảng 4.9 Các dạng biến dị in vitro của cây lan Hài Hồng ở thế hệ M1V1 bởi tia ion …..37

xviii


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Trang
Hình 1.1 Lan Hài Hồng (Paphiopedilum delenatii)………..……………………….……. 5
Hình 2.1 Quy trình thực hiện thí nghiệm …………….…………………………...……. 24
Hình 4.1 Mẫu callus lan Hài ……………………………………………………...…… 28
Hình 4.2 Mẫu PLB cây lan Hài …………………………………………………..…….. 31
Hình 4.3 Mẫu chồi cây lan Hài ……………………………….…………………...…….31
Hình 4.4 Cây lan Hài tái sinh in vitro……………………………….……………...……34
Hình 4.5 Ảnh hưởng của bức xạ Gamma Co-60 lên sự sống sót của mẫu in vitro ....…..35
Hình 4.6 Mẫu PBL và chồi lan Hài bị chết sau chiếu xạ……………………..………... 36

xi
ix


Chương 1 MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Đã từ lâu, hoa lan được cả thế giới ca ngợi là “nữ hoàng của các loài hoa”. Hoa lan
đã chinh phục con người bởi cấu trúc kỳ diệu của đóa hoa cũng như bởi sự đa dạng về
màu sắc, hình dạng và hương thơm quyến rũ của nó. Nhu cầu trồng và thưởng thức hoa
lan của con người ngày càng tăng bởi vẻ đẹp và độ bền của hoa.
Lan Hài Vệ Nữ (Paphiopedilum) với hình dạng độc đáo như chiếc hài của phụ nữ
và vẻ đẹp quý phái được coi là nhóm đặc sắc nhất trong họ lan. Đây là một trong những

loài thực vật kiểng được yêu thích và có giá trị thương mại cao nhất trên thế giới. Không
chỉ quý vì vẻ đẹp, lan Hài còn là một trong những loài thực vật hiếm nhất trên thế giới
hiện nay.
Là một nước nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa, Việt Nam được các nhà khoa
học xác định là một trong những cái nôi của loài lan Hài Vệ nữ với khoảng hơn 20 loài,
trong đó có nhiều loài có tính đặc hữu hẹp. Tuy nhiên, do sự khai thác ồ ạt thiếu kiểm
soát và nạn phá rừng tràn lan, các loài lan Hài quý hiếm của Việt Nam đang có nguy cơ
tuyệt chủng ngoài tự nhiên. Để bảo vệ nguồn gen quý này, Công ước quốc tế về buôn bán
các loài động, thực vật hoang dã có nguy cơ tuyệt chủng (CITES) đã cấm xuất khẩu các
loài lan Hài của Việt Nam dưới mọi hình thức.
Là loài lan Hài có tính đặc hữu rất hẹp, lan Hài Hồng (Paphiopedilum delenatii) là
một trong các loài lan quý hiếm nhất của Việt Nam cũng như của thế giới. Được người
Pháp phát hiện và được công bố từ đầu thế kỷ 20, lan Hài Hồng đã nhanh chóng được ưa
thích trên toàn thế giới bởi vẻ đẹp quý phái nhưng thanh nhã của nó. Do có giá trị thương
mại cao và tính đặc hữu rất hẹp, độ mẫn cảm với môi trường cao mà lan Hài Hồng ngoài
tự nhiên đang trong tình trạng có nguy cơ tuyệt chủng trầm trọng.
Sử dụng bức xạ gây đột biến trong tạo giống cây trồng mới là một nội dung quan
trọng trong chủ trương “Ứng dụng kỹ thuật bức xạ trong nông nghiệp” của Thủ Tướng
chính phủ (Quyết định số 775/QĐ-TTg, ngày 2 tháng 6 năm 2010). Hiện nay, Việt Nam

1


là một trong những nước tạo nhiều giống thực vật đột biến nhất trên thế giới, trong đó
chủ yếu là lúa gạo và đậu tương, bên cạnh đó còn có nhiều giống hoa, cây cảnh.
Chiếu xạ kết hợp với nuôi cấy in vitro đã được chứng minh bằng thực nghiệm là
phương pháp có giá trị để tạo ra các đột biến mong muốn và nhân giống nhanh, đặc biệt
là ở thực vật (Lê Xuân Đắc, 2008, Trương Thị Bích Phượng, 2004, Từ Bích Thủy, 1994).
Các nghiên cứu về gây tạo đột biến trên thực vật cho thấy các cơ quan sinh dưỡng mẫn
cảm hơn hạt khô hay hạt đang ngủ nghỉ. Tế bào thực vật có khả năng phân hóa thành cơ

thể mới nên những đột biến gây tạo trong nuôi cấy in vitro có thể được nhân lên bằng
sinh sản sinh dưỡng (Trương Thị Bích Phượng, 2004).
Với mong muốn góp phần bảo tồn đồng thời tạo nguồn biến dị in vitro làm nguyên
liệu cho công tác tạo giống hai loài lan Hài quý hiếm này, đề tài “Nghiên cứu tạo dòng
biến dị in vitro bằng phương pháp chiếu xạ cây lan Hài Hồng (Paphiopedilum delenatii)
đặc hữu quý hiếm của Việt Nam” được thực hiện.
1.2. Yêu cầu của đề tài
- Xây dựng quy trình nhân giống in vitro cây lan Hài Hồng (Paphiopedilum
delenatii).
- Tạo ra các dòng biến dị in vitro cây lan Hài Hồng bằng phương pháp chiếu xạ.
- Theo dõi và lựa chọn các dòng biến dị in vitro cây lan Hài Hồng.
1.3. Nội dung thực hiện
- Nghiên cứu điều kiện khử trùng mẫu.
- Nghiên cứu quy trình nuôi cấy in vitro lan Hài.
- Chiếu xạ mẫu.
- Chọn lọc sau chiếu xạ.

2


Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu chung
2.1.1. Lan Hài (Paphiopedilum)
2.1.1.1. Phân loại
Lan Hài (Paphiopedilum) là một nhánh của họ Lan (Orchidaceae), thuộc bộ Lan
(Orchidales), phân lớp Hành (Liliidae), lớp một lá mầm (Monocotyledoneae), ngành hạt
kín (Angiospermatophyta) (Hoàng Thị Sản, 2002).
Lan Hài có 5 chi gồm:
- Chi Cypripedium có khoảng 50 loài, thường được gọi là Hài Vệ Nữ, chủ yếu
phân bố ở vùng núi và vùng ôn đới của bắc bán cầu.

- Chi Mexipedium, Phragmipedium và Selenipedium có khoảng 25 loài phân bố ở
vùng nhiệt đới châu Mĩ.
- Chi Paphiopedilum gồm khoảng 75 loài phân bố ở vùng nhiệt đới châu Á từ nam
Ấn Độ và đông Hymalaya đến Philippine, New Guinea và Quần đảo Solomon.
Các loài lan Hài ở Việt Nam đều thuộc chi Paphiopedilum. Tuy lan Hài là nhóm
rất hiếm, tính đa dạng của lan Hài tại Việt Nam cao hơn bất cứ nơi nào trên thế giới.
Nhiều loài của Việt Nam không chỉ rất hiếm mà còn là loài đặc hữu hẹp, có tầm quan
trọng quốc tế (Leonid Averyanov và ctv, 2004).
2.1.1.2. Sinh thái
Chi Paphiopedilum chắc chắn có nguồn gốc từ vùng lục địa Đông Nam Á, trong
đó có Việt Nam. Các loài nguyên thủy nhất của chi này được tìm thấy ở Đông Nam Á,
chủ yếu ở nam Trung Quốc và bắc Việt Nam, mỗi loài đều có khu phân bố rất hạn chế
(Leonid Averyanov và ctv, 2004).
Tính đặc hữu hẹp có lẽ là đặc điểm nổi bật của các loài thuộc chi này. Có đến 72%
số loài đã biết là loài đặc hữu rất hẹp, một số có khu phân bố ít hơn 100 km2. Rất nhiều
loài mới được phát hiện ở một hoặc một vài địa điểm. Hầu hết các loài đều có đặc tính
phân bố hẹp và rải rác, không tập trung vào một vùng riêng biệt. Chỉ có chưa đến 12% các
loài của chi này là có khu phân bố tương đối rộng. Các loài lan Hài là một cấu phần

3


không thể thiếu của rừng nguyên sinh và chúng có thể bị tuyệt chủng một cách nhanh
chóng và không thể phục hồi khi các quần xã tự nhiên bị con người phá hủy (Leonid
Averyanov và ctv, 2004). Trong rừng núi của Việt Nam, nơi còn sót lại những mảnh rừng
nguyên sinh đa dạng nhất, các loài lan Hài rất phong phú.
Về mặt sinh thái, các loài lan Hài ở Việt Nam có thể chia thành hai nhóm. Một
nhóm sống ở vùng núi đá vôi phía bắc Việt Nam và nhóm còn lại sống ở khu vực có đá
mẹ là silicat, đá phiến và cát kết. Trong rừng, lan Hài có thể mọc trên đất, đá và phụ sinh.
Mỗi loài thường có loại môi trường sống ưa thích mặc dù sự thay đổi cũng đã được ghi

nhận nhưng rất ít. Khoảng 22% là địa lan (mọc trên đất), 8% mọc trên đá, còn lại là phụ
sinh. Tại Việt Nam, lan Hài thường phân bố ở vùng có lượng mưa lớn, độ ẩm cao. Tuy
nhiên do đặc trưng là vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa nên thường chúng phải trải qua một
thời kỳ khô hạn và nhanh chóng phục hồi khi mùa mưa trở lại. Độ ẩm xung quanh rễ, kiểu
đất và độ pH, sự có mặt của các nấm rễ, tác nhân thụ phấn và cường độ ánh sáng là các
nhân tố quan trọng trong sự hình thành và phát triển của các quần thể lan Hài (Leonid
Averyanov và ctv, 2004).
2.1.1.3. Hiện trạng cây lan Hài Việt Nam
Với sự hiện hữu của hơn 20 loài thuộc chi Paphiopedilum, Việt Nam là một trong
các quốc gia có nguồn lan Hài tự nhiên phong phú nhất, trong dó có nhiều loài lan Hài
đặc hữu có giá trị thẩm mĩ cao, được thế giới ưa chuộng. Điều này đã tạo nên tình trạng
thu thập và xuất khẩu lan Hài một cách ồ ạt, không kiểm soát, dẫn đến việc lan Hài ngày
càng hiếm trong tự nhiên. Được coi là một trong các thực vật chỉ thị tình trạng môi
trường, lan Hài rất nhạy cảm với các thay đổi của môi trường sống. Với tình trạng môi
trường tự nhiên bị khai thác cạn kiệt như hiện nay, lan Hài đang biến mất nhanh chóng.
Trước tình hình lan Hài cạn kiệt ngoài thiên nhiên trong khi việc nhân giống in
vitro dòng lan này vẫn được cho là rất khó, nhiều chương trình quốc gia về bảo tồn loài
hoa quý này đã được triển khai, chủ yếu là thu thập, phân loại, nghiên cứu về các loài lan
Hài và bảo tồn môi trường sống tự nhiên của chúng. Một công trình hợp tác quốc tế về
lĩnh vực này là mô tả các giống lan Hài của Việt Nam của nhóm tác giả Leonid
Averyanov, Phillip Cribb, Phan Kế Lộc và Nguyễn Tiến Hiệp (2004).

4


Cho đến nay, việc nhân giống loài lan quý này hầu như vẫn được tiến hành bằng
cách gieo hạt hoặc tách các mầm cây từ cây mẹ. Phương pháp này vừa không hiệu quả
vừa cho hệ số nhân rất thấp, không đủ đáp ứng nhu cầu thị trường. Là nhóm hoa kiểng
được nhiều người yêu thích, các loài lan Hài được nhiều nhà khoa học trong và ngoài
nước nghiên cứu nhằm mục đích nhân giống vô tính như: Nuôi cấy chồi và chóp lá

(Allenberge, 1976); Kích thích tạo chồi bên và cây con (Nieman, 1980; Sampolinski,
1983; Stewart và Button, 1977); Phân lập tế bào trần của các loài lan Hài (Price và Earl,
1984); Nuôi cấy mô sẹo (Lin, 2000); Tạo dòng lan Hài in vitro (Huang, 2001); Tái sinh
cây lan Hài từ nuôi cấy lá (Cheng và ctv, 2004); Nhân giống vô tính bằng kỹ thuật gây tạo
vết thương, sử dụng phương pháp nuôi cấy lỏng và kéo dài đốt thân (Dương Tấn Nhựt,
2007); Nhân giống in vitro và tạo đột biến (Lê Quang Luân, 2007); Nhân giống lan Hài
Hằng (Paphiopedilum hangianum) và Hài Tam Đảo (Paphiopedium gratrixianum) (Viện
Ứng dụng Công nghệ, 2009); Lai tạo giống lan Hài (Trần Phạm Anh Tuấn, 2009).
2.1.2. Lan Hài Hồng
2.1.2.1. Giới thiệu
Lan Hài Hồng (Paphiopedilum delenatii Guillaum) là một trong những loài đặc
hữu hẹp nhất của Việt Nam (. Với vẻ đẹp đặc sắc của
hoa và cả lá cây, lan Hài Hồng hiện nay là một trong
các loài hoa được ưa chuộng và có giá trị kinh tế cao
trên thị trường cây cảnh thế giới.
Lan Hài Hồng được phát hiện lần đầu từ
khoảng năm 1922 do một nhà điều tra người Pháp
tên là Poilane ở gần thành phố Nha Trang (Leonid
Averyanov và ctv, 2004). Những cây này sau đó
được các nhà làm vườn Pháp trồng thành công ở
Pháp. Sau một thời gian lai giống, các thế hệ con
cháu của chúng hiện nay đã thích nghi với điều kiện
sinh trưởng ở Pháp và trở nên dễ trồng.
Hình 2.1 Cây lan Hài Hồng
(VNOrchids.net)

5


2.1.2.2. Phân loại

Lan Hài Hồng có tên khoa học là Paphiopedilum delenatii Guillaum. hay
Cypripedium delenatii Guillaumin hoặc Paphiopedilum delenatii f. albinum Braem. thuộc
tổ Parvisepalum, dưới chi Parvisepalum, chi Paphiopedilum, họ Lan Orchidaceae, bộ
Lan Orchidales, phân lớp Hành Liliidae, lớp một lá mầm Monocotyledoneae, ngành hạt
kín Angiospermatophyta (Hoàng Thị Sản, 2002, Leonid Averyanov và ctv, 2004).
Lan Hài Hồng được xếp trong nhóm lan Hài nguyên thủy, rất tách biệt và có các
đặc điểm ít nhiều thể hiện sự trung gian giữa các chi (Hoàng Thị Sản, 2002).
2.1.2.3. Hình thái học
Lan Hài Hồng có thân cỏ mọc trên đá hoặc đất với 5 – 7 lá mọc thành 2 hàng. Lá
từ hình bầu dục tới bầu dục thuôn, tù và có 3 răng nhỏ ở chóp, dài tới 11 cm, rộng 3 – 3,9
cm, mép có lông rìa ở gần gốc, các đốm khảm xanh lá cây nhạt và thẫm ở mặt trên, chấm
dày màu tía ở dưới. Cụm hoa 1 – 2 hoa, rất hiếm khi 3; cuống hoa dài tới 22 cm, xanh,
đốm tía, phủ lông trắng cứng; lá hoa hình bầu dục tới hình trứng, dài 1,2 – 1,5 cm, rộng 1
cm, xanh đốm tía, có lông ngắn; cuống hoa và bầu dài tới 5,5 cm, màu xanh, có đốm tía,
phủ lông. Hoa có đường kính 7,5 – 8 cm, màu hồng nhạt với môi hồng hoặc hồng - tía, có
đốm đỏ và vàng trên nhị lép, có lông ở cả mặt trong và ngoài. Lá đài lưng hình trứng,
chóp tù tới gần nhọn, dài 1,7 – 3,5 cm, rộng 1,8 – 2,5 cm. Lá đài hợp tương tự, dài 1,9 – 3
cm. Môi hình bầu dục tới hình gần cầu, dài 2,5 – 3,8 cm. rộng 2,5 – 3 cm, mép cuốn vào
trong, có lông tơ nhỏ. Nhị lép hơi lồi, hình trứng, chóp tù, dài 14 – 17 mm, rộng 13 – 16
mm, có lông ria. Bộ nhiễm sắc thể 2n = 26 (Leonid Averyanov và ctv, 2004).
2.1.2.4. Đặc điểm sinh thái
Khu phân bố của lan Hài Hồng trong tự nhiên chắc chắn ít hơn 100 km2, chủ yếu ở
các tỉnh Đắc Lắc và Khánh Hòa thuộc khu vực Nam Trung Bộ (Leonid Averyanov và ctv,
2004). Không giống như các loài lan có quan hệ thân thuộc thường mọc trên núi đá vôi,
lan Hài Hồng mọc trên đất có đá mẹ là đá granit và gơnai. Chúng mọc phổ biến dưới bóng
râm ở những khe hở có rêu trên những vách đá dốc hoặc trong lổ hổng, chỗ lõm của mặt
thềm các vách đá granit trong rừng cây lá rộng thường xanh ở độ cao từ 750 – 1300 m.
Thời gian ra hoa là khoảng tháng 12 đến sau Tết âm lịch.

6



Nhu cầu thị trường: nằm trong danh mục cấm xuất khẩu dưới mọi hình thức của
Công ước quốc tế về buôn bán các loài động, thực vật hoang dã có nguy cơ tuyệt chủng .
Các nhà trồng lan ở Mỹ, Đài Loan, Nhật Bản và Châu Âu đã nhân giống cây Lan
Hài Hồng và lai với nhiều cây lan Hài khác, nên nó được bán với giá rất rẻ, chỉ cần 10 15 USD người ta có thể mua một cây lan có hoa đẹp và to, lại có hương thơm nhẹ - một
đặc điểm rất hiếm trong giống lan hài. Nhưng những cây lan hài Delenatii biến dạng màu
trắng toát như bạch ngọc, với chút màu vàng trong nhị chỉ có tại Việt Nam được truyền
tụng là Đệ Nhất Mỹ Lan được bán với giá khoảng từ 5.000 – 8.000 USD một cây
(VNOrchids.net).
Tình trạng hiện nay ngoài tự nhiên: đang có nguy cơ tuyệt chủng trầm trọng.
2.2. Nuôi cấy mô tế bào thực vật
2.2.1. Khái quát chung về nuôi cấy mô tế bào thực vật
Haberlandt (1902) là người đầu tiên đã đưa ra quan niệm mỗi tế bào bất kỳ của
một cơ thể sinh vật đa bào đều có khả năng tiềm tàng để phát triển thành một cá thể hoàn
chỉnh. Theo quan điểm của sinh học hiện đại thì mỗi tế bào riêng rẽ đã phân hóa đều
mang toàn bộ lượng thông tin di truyền cần thiết và đủ của cả cơ thể sinh vật đó. Khi gặp
điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có thể tái biệt hóa và phát triển thành một cá thể hoàn
chỉnh. Đó là tính toàn năng của tế bào. Cho đến nay con người đã chứng minh được khả
năng tái sinh một cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một tế bào riêng lẻ. Tính toàn năng của tế
bào chính là cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô và tế bào thực vật.
Nuôi cấy mô thực vật là một thuật ngữ được dùng rộng rãi để mô tả việc nuôi cấy
tất cả các phần của thực vật (tế bào, mô, cơ quan) trong điều kiện vô trùng trên môi
trường dinh dưỡng thích hợp. Tế bào nuôi cấy thường phải là các tế bào có nhân hoàn
chỉnh mang toàn bộ thông tin di truyền của loài đó, trong điều kiện thích hợp có thể phân
hóa và phát triển thành cây hoàn chỉnh. Các hệ thống nuôi cấy mô thực vật thường được
dùng để nghiên cứu các vấn đề liên quan đến thực vật như sinh lý học, sinh hóa, di truyền
học và cấu trúc thực vật. Kỹ thuật này hiện nay cũng được sử dụng nhiều trong nhân
giống thực vật, sản xuất giống sạch bệnh…, nhất là đối với các loài thực vật quý, có giá
trị cao (Bùi Bá Bổng, 1995, Nguyễn Quang Thạch, 2009, Nguyễn Đức Thành, 2000).


7


2.2.2. Môi trường nuôi cấy mô tế bào thực vật
2.2.2.1. Các loại muối khoáng.
Các chất vô cơ bao gồm các thành phần đa lượng (hàm lượng trên 0,5 mM) và vi
lượng (hàm lượng dưới 0,05 mM) trong môi trường nuôi cấy được thực vật sử dụng như
là thành phần cơ bản để tổng hợp chất hữu cơ (Bùi Bá Bổng, 1995, Nguyễn Quang Thạch,
2009). Các dạng ion của muối đóng vai trò quan trọng trong quá trình vận chuyển xuyên
màng, điều hòa áp suất thẩm thấu và điện thế màng (Bùi Trang Việt, 2002). Các loại muối
khoáng được bổ sung vào môi trường với nồng độ trên 0,5 mM được xếp vào nhóm đa
lượng. Các muối khoáng được xếp vào nhóm đa lượng chứa các nguyên tố như: nitrogen
(N), phosphorus (P), sulfur (S), potassium (K), calcium (Ca) và magnesium (Mg) thường
được bổ sung vào môi trường ở dạng muối mà thực vật dễ hấp thu. Các loại muối khoáng
vi lượng vẫn thường được bổ sung vào trong môi trường nuôi cấy để bảo đảm cho sự phát
triển của mô như: boron (B), chlorine (Cl), copper (Cu), manganese (Mn)… với nồng độ
dưới 0,05 mM.
2.2.2.2. Vitamin
Vitamin thường giữ vai trò co-enzyme trong các phản ứng sinh hóa. Vitamin được
bổ sung vào môi trường nuôi cấy dưới nhiều dạng và nhiều nồng độ khác nhau, nhưng tất
cả các môi trường đều có thiamin (vitamin B1). Các vitamin thường dùng là: myoinositol, nicotinic acid (vitamin PP), pyridoxine HCl (vitamin B6)…
2.2.2.3. Chất điều hòa sinh trưởng
Chất điều hòa sinh trưởng thực vật còn được gọi là Phytohormone, là các chất hữu
cơ có bản chất hóa học khác nhau nhưng đều có vai trò điều hòa các hoạt động sinh lý,
các quá trình sinh trưởng, sinh sản và phát triển của thực vật, được tổng hợp với một
lượng rất nhỏ trong các cơ quan khác nhau của thực vật (Bùi Trang Việt, 2002). Chất điều
hòa sinh trưởng có vai trò trong quá trình phân chia tế bào, phân hóa mô, phát sinh phôi,
ảnh hưởng đến những hoạt động sống chủ yếu của thực vật như quang hợp, hô hấp…
(Nguyễn Quang Thạch, 2009). Chính vì vậy, chúng có tác dụng điều hòa sinh trưởng và

phát triển ở thực vật. Các nhóm chất điều hòa sinh trưởng thực vật thường gặp trong nuôi
cấy mô là: Auxins, Cytokinins, Gibberellins.

8


2.2.2.4. Các chất bổ sung
Mô cấy trong môi trường nuôi cấy in vitro không có khả năng tự dưỡng do không
tiến hành quang hợp đầy đủ vì điều kiện trao đổi khí trong bình nuôi cấy mô và bên ngoài
không thuận lợi. Vì vậy cần phải cung cấp thêm cacbon cho mô từ môi trường nuôi cấy.
Nguồn cacbon cung cấp cho môi trường nuôi cấy thường là các loại đường, phổ biến nhất
là sucrose với hàm lượng từ 20 – 30 g/l.
Agar là hợp chất hữu cơ có thành phần không xác định thường được sử dụng để
làm đặc môi trường nuôi cấy. Độ cứng của môi trường thay đổi tùy theo mỗi loại mô thực
vật khác nhau, lượng agar dùng thường trong khoảng từ 8-15 g/l môi trường.
Than hoạt tính thường được sử dụng với lượng 2 g/l môi trường trong nuôi cấy mô
các loài lan, có vai trò khử độc, hút ẩm, hạn chế hiện tượng hóa nâu mẫu.
Ngoài ra, người ta cũng thường bổ sung một số chất hữu cơ nhằm cung cấp thêm
một số chất cần thiết cho sự phát triển của mô như: nước dừa, dịch chiết nấm men, dịch
chiết khoai tây… với thành phần không xác định và hàm lượng tùy thuộc vào loài thực
vật và giai đoạn phát triển của mô.
2.2.3. Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô trong nghiên cứu và sản xuất
Dưới các điều kiện nuôi cấy thích hợp, tế bào thực vật có thể nhân lên, hình thành
cơ quan và thậm chí có thể tái sinh thành một cây hoàn chỉnh. Sự tái sinh cây nguyên vẹn
từ một nhóm tế bào cây bằng phương pháp nuôi cấy mô thể hiện một bước quan trọng
trong nông nghiệp hiện đại. Một số ứng dụng quan trọng của phương pháp nuôi cấy mô
trong nghiên cứu và sản xuất:
- Tế bào thực vật có thể được dùng như các nhà máy sinh học. Việc nuôi cấy huyền
dịch trên quy mô lớn có thể dùng để sản xuất các chất kháng khuẩn, ancaloide kháng khối
u, các loại vitamine, thuốc diệt côn trùng và các đồ gia vị dùng trong thực phẩm… với số

lượng lớn và giá thành rẻ.
- Bằng phương pháp này người ta có thể tạo ra nguồn cung cấp một lượng lớn
giống cây thương phẩm trong thời gian ngắn và có các đặc tính giống hệt cây mẹ. Đồng
thời có thể nhân giống nhanh chóng với số lượng lớn các dòng thực vật vô tính có các đặc
tính di truyền có giá trị.
- Rút ngắn thời gian sinh trưởng ở một số cây có thời gian sinh trưởng dài, khó
nhân giống có giá trị cao hoặc đang có nguy cơ tuyệt chủng…

9


- Thuận tiện cho các nghiên cứu chọn tạo giống cây trồng bằng các phương pháp
sinh học hiện đại như: xử lý bằng phóng xạ, hóa chất để gây đột biến, chuyển
gene…Bằng cách sử dụng quy trình nuôi cấy mô, các yếu tố ngoại cảnh có thể được kiểm
soát tốt hơn trong môi trường chọn lọc. Việc gây biến đổi di truyền và chọn lọc có thể tiến
hành ở mức tế bào. Cây tái sinh mang tính trạng di truyền mới, ít xuất hiện thể khảm.
Điều này đã rút ngắn đáng kể thời gian chọn lọc và hạn chế các biến dị soma trên thực vật
khi tiến hành tạo giống (Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang, 2007). Đồng thời, các nghiên
cứu cũng cho thấy xử lý đột biến các mô nuôi cấy cho tần suất biến dị cao hơn, vì tế bào
được tiếp xúc trực tiếp với các tác nhân gây đột biến.
2.3. Chọn tạo giống cây trồng mới bằng phương pháp chiếu xạ
2.3.1. Thành tựu chọn tạo giống đột biến bằng phương pháp chiếu xạ
Phương pháp tạo giống bằng thực nghiệm được coi là một trong các thành tựu to
lớn của thế kỷ 20, có vai trò quyết định đối với cuộc Cách mạng xanh vào thập niên 1960.
Đến đầu thập niên 1990 đã có 1364 giống đột biến được tạo ra trên thế giới, trong đó
khoảng 90% là do xử lý bức xạ (Lê Xuân Đắc, 2008). Hầu hết các giống cây trồng phổ
biến hiện nay như: ngũ cốc (lúa, lúa mì, lúa mạch, ngô…), chuối, đậu (đặc biệt là đậu
tương), bông, lê, nho, cam, quýt…, các giống hoa như: cẩm chướng, cúc, hồng, lan…đều
có các dòng đột biến; một số trường hợp dòng đột biến được ưa thích hơn trong trồng trọt
như lúa, ngô, đậu tương, hầu hết các giống hoa vì các ưu điểm nổi bật của chúng.

Theo thống kê của Cơ quan Năng lượng Nguyên tử quốc tế (IAEA) đến nay đã có
hơn 3100 giống mới của 170 loài được tạo ra bằng phương pháp gây đột biến được công
bố bởi hơn 60 quốc gia khác nhau (Zaiton và ctv, 2006). Trong đó Việt Nam đóng góp
hơn 50 giống chủ yếu là lúa gạo và đậu tương. Là một quốc gia nông nghiệp, Việt Nam
rất chú trọng công tác nghiên cứu, cải tạo và chọn lọc giống cây trồng. Hiện nay, Việt
Nam là một trong 10 quốc gia tạo ra nhiều giống thực vật đột biến nhất.
2.3.2. Khái quát chung về đột biến
Đột biến là những biến đổi bất thường, đột ngột, riêng biệt trong vật liệu di truyền
mà kết quả là làm biến đổi vĩnh viễn cấu trúc di truyền do đó làm biến đổi sự biểu hiện
tính trạng ở sinh vật. Đột biến thường được phân chia dựa trên nguyên nhân gây đột biến,
loại tế bào bị đột biến, kiểu thay đổi trong phân tử DNA, đột biến tự nhiên hay nhân tạo
(Lê Xuân Đắc, 2008, Nguyễn Hữu Đống và ctv, 1997, Trương Thị Bích Phượng , 2004).

10


Đột biến làm tăng cường các biến dị, do cấu trúc gen bị biến đổi, có thể tạo ra các
tổ hợp gene mới, từ đó tạo nguồn nguyên liệu cho chọn lọc giống cây trồng. Bằng cách
tạo đột biến một cách chủ động, người ta có thể làm tăng tốc độ chọn lọc, tạo ra nhiều
giống mới trong khoảng thời gian ngắn, phạm vi thực nghiệm hẹp (Trương Thị Bích
Phượng, 2004, Lê Xuân Đắc, 2008).
Đột biến ở mức độ nhiễm sắc thể là biến dị từ những điều kiện bình thường làm
thay đổi số lượng nhiễm sắc thể hoặc cấu trúc của nhiễm sắc thể, những thay đổi như vậy
gây ảnh hưởng đến nhiều tính trạng khác nhau trong cơ thể (Bùi Bá Bổng, 1995).
Đột biến ở mức độ phân tử là đột biến trong chuỗi trình tự của gene ở mức độ từng
cặp base. Do đó, nó còn được gọi là đột biến gene hoặc đột biến điểm (Bùi Bá Bổng,
1995, Lê Xuân Đắc, 2008). Nó chỉ ảnh hưởng đến một hoặc một vài tính trạng mà không
làm gây ảnh hưởng nhiều đến kiểu hình của cơ thể. Đột biến điểm làm đổi chức năng
gene nên đã thu hút được sự quan tâm của các nhà chọn giống thực vật muốn biến đổi
một hoặc một vài đặc điểm của giống gốc.

Tác nhân gây đột biến có thể là các nhân tố vật lý, hóa học hay sinh học. Các nhân
tố này có thể làm tăng tần số đột biến lên 10 đến 100.000 lần. Các nhân tố được nghiên
cứu kỹ là các tia bức xạ như UV, gamma, tia X, các chất đồng đẳng của nitơ, các tác nhân
alkyl hóa... Hiện nay, các các tia bức xạ được chứng minh là có hiệu quả cao trong nghiên
cứu đột biến và được sử dụng rộng rãi.
Các tia bức xạ có tác dụng gây ra sự ion hóa ở các phân tử, nguyên tử khi xuyên
qua tế bào như tia X, gamma, apha và beta, proton, neutron... Chính quá trình ion hóa này
tạo ra những biến đổi về mặt hóa học, phá hủy cấu trúc nguyên vẹn của nhiễm sắc thể
trong nhân tế bào, tạo ra các biến đổi về mặt di truyền, là nguyên nhân gây đột biến.
Trong tạo giống đột biến ở thực vật, người ta thường sử dụng tia X quang và tia gamma
(Lê Xuân Đắc, 2008, Forum for Nuclear Cooperation in Asia (FNCA), 2004).
Tia X quang là tia điện tử có bước sóng ngắn được tạo ra từ máy chiếu X quang.
Tia X quang dùng để tạo đột biến thường có độ dài bước sóng ngắn hơn khi dùng trong
chẩn đoán y khoa. Bước sóng của tia X quang quan hệ tuyến tính với hiệu điện thế của
máy phát. Khi sử dụng tia X, người ta thường quan tâm đến các chỉ số hiệu điện thế,

11


cường độ dòng điện, thời gian, khoảng cách từ ống nhắm đến mẫu và đặc biệt là độ dày
mẫu hấp thu làm giảm 1/2 năng lượng của tia. Tia gamma là một loại tia phóng xạ thu
được khi các đồng vị phóng xạ phân rã. Tia gamma có bước sóng ngắn hơn và do đó nó
có năng lượng cao hơn tia X . Tia gamma được sử dụng tương tự tia X quang trong tạo
đột biến ở thực vật. Ưu điểm của tia gamma là nó có thể được sử dụng trong nhà kính
hoặc ở cánh đồng để thực vật tiếp xúc trong thời gian dài. Các đồng vị thường dùng để tạo
tia gamma trong tạo giống đột biến ở thực vật là Cobalt – 60 và Cessium -137. Tia UV là
loại tia bức xạ không gây ion hóa nhưng có khả năng gây ra đột biến với tần số khá cao
do có bước sóng trùng với bước sóng hấp phụ của DNA. Khi các nguyên tử của phân tử
DNA hấp thu năng lượng của tia bức xạ thì các điện tử vòng ngoài bị kích thích sẽ làm
các liên kết yếu trong phân tử bị phá vỡ và trật tự liên kết trong phân tử DNA có thể bị

thay đổi dẫn tạo ra đột biến điểm hay đột biến cấu trúc (FNCA, 2004).
2.3.3. Cơ chế gây đột biến do phóng xạ
2.3.3.1. Tác dụng của bức xạ ion hóa lên cơ thể sống
Tương tác của bức xạ ion hóa với cơ thể sống là kích thích và ion hóa các phân tử
và nguyên tử. Các tổ chức tế bào của cơ thể sau khi bị kích thích bởi năng lượng bức xạ
sẽ biến đổi qua hai giai đoạn:
Giai đoạn hóa lý: Giai đoạn này rất ngắn (10-13 – 10-16 giây), trong giai đoạn này,
các phân tử sinh học chịu tác động trực tiếp và gián tiếp của bức xạ ion hóa. Các tổn
thương này gọi là tổn thường hóa sinh (Lê Xuân Đắc, 2008, Trương Thị Bích Phượng,
2004).
- Tác dụng trực tiếp bức xạ trực tiếp ion hóa và kích thích các phân tử sinh học,
gây biến đổi cấu trúc và làm tổn thương các phân tử đó.
- Tác dụng gián tiếp (theo thuyết gốc tự do): bức xạ ion hóa tác dụng lên các phân
tử nước trong tế bào gây ra quá trình xạ phân (radiolyse) tạo ra các ion H+, OH-, các gốc
tự do OH0, H0 và các sản phẩm oxy hóa mạnh như H2O2 và HO2. Các sản phẩm của quá
trình này rất hoạt động về mặt hóa học, tác động và làm tổn thương các phân tử sinh học.
Giai đoạn sinh học: Nếu các tổn thương hóa sinh xảy ra trong giai đoạn hóa lý
không hồi phục được sẽ gây ra những thay đổi trong chuyển hóa dẫn đến những thay đổi
về hình thái và chức năng. Giai đoạn này có thể kéo dài hay ngắn tùy thuộc vào mức độ tế
bào hay tổ chức bị tổn thương.
12


Bức xạ có thể gây ra những thay đổi hình thái cũng như thay đổi chức năng trong
tế bào và mô. Nhiều nhà nghiên cứu trong và ngoài nước cho rằng bức xạ không tạo ra
chức năng mới trong tế bào và mô mà bức xạ làm thay đổi các chức năng sẵn có hay làm
xuất hiện các chức năng trước đó tiềm tàng.
2.3.3.2. Cơ chế gây đột biến
Sự tương tác của các tia phóng xạ lên hệ thống gây nên sự biến đổi cấu trúc DNA
làm cơ thể bị đột biến (Lê Xuân Đắc, 2008, Vũ Như Ngọc, 2005, Trương Thị Bích

Phượng, 2004). Có hai giả thuyết chính để giải thích hiện tượng này:
- Thuyết “bia”: Sự xuất hiện các sai lệnh ở DNA xảy ra một cách tức thời với xác
xuất phụ thuộc vào cơ hội bắn trúng “bia” của tia phóng xạ. Dựa vào thuyết này, người ta
giải thích được mối liên quan giữa liều lượng xạ và tần số xuất hiện đột biến. Thuyết này
cũng là nền tảng xây dựng các nguyên tắc của di truyền phóng xạ. Tuy nhiên, các nghiên
cứu sau này đã chứng minh thuyết “bia” chưa đầy đủ do nó chưa giải thích được các yếu
tố của điều kiện môi trường và điều kiện sinh lý của cơ thể có ảnh hưởng rõ rệt đến kết
quả của quá trình xử lý phóng xạ.
- Thuyết “gốc tự do”: Thuyết này cho rằng tác động gây đột biến trên tế bào sống
của tia phóng xạ là tác động gián tiếp. Thoạt đầu, tia phóng xạ ion hóa nước, vốn là thành
phần vật chất chủ yếu trong mọi tế bào sống. Nước bị ion hóa tạo thành các gốc tự do, các
gốc tự do có thể tương tác với nhau tạo thành các chất oxy hóa mạnh đồng thời tương tác
với các phân tử sinh học trong tế bào. Các tương tác này nếu đủ mạnh và số lượng đủ
nhiều thì sẽ gây ra các biến đổi trong thành phần và số lượng của các nucleotide của phân
tử DNA. Tùy theo nguồn năng lượng dự trữ của gốc tự do mà có thể gây ra các biến đổi
lớn trong cấu trúc của phân tử DNA hoặc các đột biến nhỏ trong thành phần nucleotide
của gen (còn gọi là đột biến điểm). Như vậy, tuy chưa đầy đủ nhưng nếu giải thích cơ chế
gây đột biến theo thuyết này có thể giải thích được sự phụ thuộc của tần số đột biến vào
liều lượng chiếu xạ, điều kiện môi trường, điều kiện sinh lý của cơ thể…

13


2.3.4. Gây đột biến bằng bức xạ ion hóa và ứng dụng trong tạo giống
2.3.4.1. Nguyên tắc gây đột biến bằng bức xạ ion hóa
Nguyên tắc cơ bản để gây tạo đột biến thành công là dựa vào đặc điểm sinh
trưởng, phát triển, kiểu gene của từng đối tượng để chọn phương pháp và tác nhân gây đột
biến thích hợp (Lê Xuân Đắc, 2008, Nguyễn Hữu Đống và ctv, 1997, Trương Thị Bích
Phượng, 2004). Trong chọn tạo giống cây trồng bằng cách gây đột biến, người ta thường
sử dụng bức xạ ion hóa (rơnghen, nơtron, gamma và mới đây là ion beam). Nhờ quá trình

ion hóa vật liệu trong tế bào gây ra sự biến đổi tạm thời hay vĩnh viễn trong tế bào khi tế
bào tiếp xúc với tia bức xạ.
Trong quá trình chọn lọc sau khi đột biến có thể một số đột biến không thể hiện ở
thế hệ M1 mà chỉ thể hiện sau đó vài thế hệ nên cần quan sát tỉ mỉ và theo dõi có phương
pháp qua hai đến bốn thế hệ trước khi đưa vào ứng dụng ở quy mô nhỏ. Sau đó, quy mô
có thể được mở rộng dần ở các thế hệ tiếp theo khi giống mới đã có tính ổn định về mặt di
truyền, trước khi tiến hành khảo nghiệm giống để đưa ra sản xuất đại trà (Lê Xuân Đắc,
2008, Chu Thị Thơm và ctv, 2006, Từ Bích Thủy, 1994).
Các nghiên cứu về đột biến do phóng xạ đã chỉ ra: trong một giới hạn liều lượng,
tần số các đột biến phụ thuộc tuyến tính vào liều lượng chiếu xạ (Vũ Như Ngọc, 2005, Từ
Bích Thủy, 1994). Mặt khác, đối với các loài thực vật khác nhau, độ tuổi, bộ phận khác
nhau có độ mẫn cảm khác nhau đối với bức xạ. Do đó, để thu được đột biến mong muốn,
người ta cần chiếu xạ ở liều lượng thích hợp để tạo ra nhiều đột biến cho chọn lọc mà
không làm chết nhiều cây cũng như làm tăng độ bất thụ (Lê Xuân Đắc, 2008, Từ Bích
Thủy, 1994). Đó là liều lượng tới hạn mà ở mức liều này, số lượng đột biến thu được
nhiều nhất, thường được xác định trong khoảng gần giá trị LD50. Giá trị LD50 là liều mà
khi hấp thụ, 50% số cá thể được xử lý bức xạ bị chết (hoặc hạt giống không nảy mầm).
Nhiều nghiên cứu cho thấy không có sự khác biệt đáng kể về bản chất giữa các đột
biến nhân tạo và đột biến tự nhiên. Các dạng đột biến trong tự nhiên đều thấy xuất hiện
trong các phổ đột biến nhân tạo. Điều khác biệt cơ bản giữa hai dạng đột biến này là tần
số đột biến. Các nghiên cứu cũng cho thấy tần số đột biến do xử lý bằng bức xạ cao hơn
14