BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN VIRUS
GÂY HỘI CHỨNG CÒI CỌC TRÊN HEO SAU CAI SỮA Porcine circovirus type 2 BẰNG KỸ THUẬT LAMP

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Sinh viên thực hiện: LÊ THỊ NGỌC BÍCH
Niên khoá: 2007 – 2011

Tháng 7/2011


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
XÂY DỰNG QUY TRÌNH CHẨN ĐOÁN VIRUS GÂY HỘI
CHỨNG CÒI CỌC TRÊN HEO SAU CAI SỮA - Porcine
circovirus type 2 BẰNG KỸ THUẬT LAMP

Hướng dẫn khoa học:

`

Sinh viên thực hiện:
LÊ THỊ NGỌC BÍCH

PGS.TS NGUYỄN NGỌC HẢI
KS. VÕ KHÁNH HƯNG

Tháng 07/2011


LỜI CẢM ƠN
Trước hết, con xin được cám ơn những người thân trong gia đình đã luôn tạo
điều kiện, động viên và giúp đỡ trong thời gian con học tại trường.
Xin chân thành cám ơn:
Ban Giám hiệu Trường đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh, Ban Chủ
nhiệm Bộ môn Công nghệ sinh học cùng các quý thầy cô đã tận tình giúp đỡ, truyền
đạt và dạy bảo cho em trong suốt thời gian học tập tại trường.
Các Thầy Cô và anh chị tại Viện Nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi
trường - Trường Đại Học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh giúp đỡ và tạo mọi điều
kiện tốt nhất cho em trong suốt quá trình thực tập .
PGS.TS. Nguyễn Ngọc Hải đã tận tình dạy bảo, hướng dẫn, giúp đỡ và động
viên em trong suốt quá trình nghiên cứu và thực hiện khóa luận.
Kỹ sư Võ Khánh Hưng và Nguyễn Phan Thành đã tận tình chỉ bảo hướng dẫn
em trong quá trình thực hiện đề tài.
Tập thể lớp Công nghệ Sinh học khóa 2007 và bạn bè đã động viên và giúp đỡ
tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện khoá luận.

Tp.HCM, ngày 07 tháng 07 năm 2011
Lê Thị Ngọc Bích

i


TÓM TẮT

Đề tài được thực hiện với mục đích xây dựng được một quy trình chẩn đoán virút gây hội chứng còi cọc trên heo sau cai sữa (PMWS) - Porcine circovirus type 2
bằng kỹ thuật LAMP .
LAMP là kỹ thuật mới ra đời vào năm 2000 nhưng có nhiều ưu điểm như độ
nhạy cao, nhanh và ít tốn kém nên được đánh giá là có nhiều triển vọng trong chẩn
đoán các loại vi-rút.
Mẫu máu thu thập từ những heo nghi ngờ mắc chứng PMWS tại các trại heo
công nghiệp được ly trích để thu nhận DNA. Phản ứng RealTime PCR được thực hiện
để xác định các mẫu dương tính với PCV2. Các mẫu này cùng với plasmid DNA được
sử dụng làm nguồn vật liệu cho việc thực hiện phản ứng LAMP. Plasmid DNA được
tách chiết từ plasmid pGEM – T Easy (3015 bp) đã được chèn đoạn trình tự (492 bp)
chứa vùng gene ORF1 của PCV2.
Việc xây dựng primer cho phản ứng LAMP được thiết kế trên Internet
PrimerExplorer V4. Bộ primer được thiết kế dựa trên vùng gene ORF1 của PCV2 và
đảm bảo các yêu cầu về nhiệt độ nóng chảy (Tm), %GC, khoảng cách giữa các primer,
cấu trúc bậc hai và tính ổn định tại các đầu 3’, 5’ (∆G).
Kết quả sau khi tiến hành phản ứng LAMP với bộ primer trên để chẩn đoán
PCV2 có sản phẩm đặc trưng nhưng chưa xác định được độ đặc hiệu của phương pháp.
Vì vậy cần phải thực hiện thêm một số kỹ thuật khác để kiểm tra độ đặc hiệu và xác
định đọ nhạy của phương pháp.

ii


SUMMARY
Thesis title: “Construct the procedure for diagnosing the virus causes PMWS Porcine circovirus type 2 by LAMP”.
The purpose of this thesis is constructing a procedure for diagnosing the virus
causes PMWS - Porcine circovirus type 2 by LAMP.
LAMP was developed in 2000, highly sensitive, rapid, inexpensive technique.
This technique has great potential in diagnising the viruses.
Blood samples which collected from suspected of PMWS pigs in the farms were

extracted to obtain DNA of PCV2. RealTime PCR reaction was performed to
determine the samples positive for PCV2. They and plasmid DNA were the materials
for the LAMP reactions. Plasmid DNA was extracted from pGEM – T Easy (3015 bp)
which was inserted ORF1 region of PCV2.
Primers for the LAMP reactions were designed on the Internet PrimerExplorer
V4. Primers were designed that based on the ORF1 region of PCV2. Primers must
meet requirements of the melting temperature (Tm), %GC, the distance between the
primers and ∆G.
There were products of the LAMP method but can not determine the specificity
of the products. Therefore, some other techniques need to do to determine the
specificity and the sensitive of this method.

iii


MỤC LỤC
Trang
LỜI CẢM ƠN ................................................................................................................ iii
TÓM TẮT....................................................................................................................... ii
SUMMARY................................................................................................................... iii
MỤC LỤC .................................................................................................................... iiv
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ......................................................................... vii
DANH SÁCH CÁC BẢNG ........................................................................................ viii
DANH SÁCH CÁC HÌNH .............................................................................................ix
Chương 1 MỞ ĐẦU ........................................................................................................1
1.1. Đặt vấn đề .................................................................................................................1
1.2. Yêu cầu của đề tài .....................................................................................................1
1.2.1. Mục đích ................................................................................................................ 1
1.2.2. Yêu cầu .................................................................................................................. 2
1.3. Nội dung thực hiện ...................................................................................................2

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...............................................................................3
2.1. Giới thiệu hội chứng còi cọc trên heo sau cai sữa ....................................................3
2.1.1. Dịch tễ học của bệnh còi cọc trên heo sau cai sữa ................................................ 4
2.1.2. Triệu chứng bệnh còi cọc trên heo sau cai sữa ...................................................... 5
2.2. Porcine circovirus ...................................................................................................5
2.2.1. Đặc điểm hình thái và tính chất của Porcine circovirus ....................................... 5
2.2.2. Cấu trúc bộ gen của Porcine circovirus ................................................................ 6
2.3. Một số phương pháp chẩn đoán Porcine circovirus type 2......................................8
2.4. Phương pháp LAMP .................................................................................................9
2.4.1. Khái niệm phương pháp LAMP ............................................................................ 9
2.4.2. Thành phần của phản ứng LAMP ......................................................................... 9
2.4.3. Nguyên tắc hoạt động của phản ứng LAMP ....................................................... 10
2.4.4. Cách đọc kết quả của phản ứng LAMP ............................................................... 13
2.4.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng LAMP ....................................................... 14
iv


2.5. Một số công trình nghiên cứu về PCV2 và LAMP ở trong và ngoài nước ............15
2.5.1. Các nghiên cứu trong nước.................................................................................. 15
2.5.2. Các nghiên cứu ngoài nước ................................................................................. 15
Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................................17
3.1. Thời gian và địa điểm .............................................................................................17
3.2. Nội dung nghiên cứu ..............................................................................................17
3.3. Vật liệu, dụng cụ và hóa chất .................................................................................17
3.3.1. Dụng cụ thu thập mẫu.......................................................................................... 17
3.3.2. Hóa chất dùng trong ly trích DNA từ mẫu máu .................................................. 17
3.3.3. Hóa chất dùng trong ly trích plasmid DNA ........................................................ 17
3.3.4. Hóa chất dùng trong phản ứng PCR với mẫu là plasmid DNA .......................... 18
3.3.5. Dụng cụ và hóa chất dùng trong phản ứng PCR ................................................. 18
3.3.6. Hóa chất dùng trong phản ứng LAMP ................................................................ 18

3.3.7. Hóa chất dùng trong điện di ................................................................................ 18
3.4. Phương pháp tiến hành ...........................................................................................19
3.4.1. Thu nhận mẫu ...................................................................................................... 19
3.4.2. Ly trích DNA từ mẫu máu ................................................................................... 19
3.4.3. Kiểm tra nguồn vật liệu cho phản ứng LAMP .................................................... 21
3.4.3.1. Tách chiết plasmid DNA .................................................................................. 21
3.4.3.2. Điện di plasmid DNA ....................................................................................... 22
3.4.3.3. Thực hiện phản ứng PCR với plasmid DNA .................................................... 22
3.4.3.4. Giải trình tự để xác định plasmid có chứa vùng ORF1 ................................... 23
3.4.4. Thực hiện phản ứng LAMP với primer tự thiết kế .............................................. 24
3.4.4.1. Thiết kế bộ primer cho phản ứng LAMP trên vùng ORF1 của PCV2 ............. 24
3.4.4.2. Khảo sát thời gian và nhiệt độ phản ứng .......................................................... 26
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................................26
4.1. Kết quả thiết kế primer ...........................................................................................27
4.2. Kết quả kiểm tra nguồn vật liệu cho phản ứng LAMP. .........................................30
4.3. Kết quả thực hiện phản ứng LAMP phát hiện PCV2 trên vùng ORF1 ..................32
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..........................................................................34
5.1. Kết luận...................................................................................................................34
v


5.2. Đề nghị ...................................................................................................................34
TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................35
PHỤ LỤC

vi


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
µl: micro liter

AHL: Animal Health Laboratory
dNTP: deoxynucleotide triphosphate
EDTA: Ethylene diamine tetra acetic acid
ELISA: Enzyme linked immunosorbent assay
LAMP: Loop – mediated isothermal amplification
ml: mililiter
ORF: Open reading frame
PCR: Polymerase chain reaction
PCV: Porcine circovirus
PCV1: Porcine circovirus type 1
PCV2: Porcine circovirus type 2
PMWS: Post – Weaning Multisystemic Wasting Syndrome
TBE: Tris borate EDTA

vii


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Trang
Bảng 3.1 Thành phần hóa chất cho PCR sử dụng Master Mix 2X .....................23
Bảng 3.2 Chu trình nhiệt cho PCR sử dụng PCV2-83F, PCV2-83R .................23
Bảng 3.3 Thành phần hóa chất của phản ứng LAMP .............................................26

viii


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1 Tổng số trường hợp bệnh do PCV2 từ 1998 - 2006.. ..................... 4
Hình 2.2 Virion của PCV .............................................................................. 5

Hình 2.3 Cấu trúc steem-loop của Porcine circovirus type 1 và 2.. .............. 6
Hình 2.4 Cấu trúc bộ gen của PCV2 với 6 khung đọc mở. ........................... 6
Hình 2.5 Genome của PCV2.......................................................................... 8
Hình 2.6 Bước 1 trong phản ứng LAMP. .................................................... 11
Hình 2.7 Bước 2 trong phản ứng LAMP. .................................................... 11
Hình 2.8 Bước 3 trong phản ứng LAMP. .................................................... 11
Hình2 .9 Bước 4 trong phản ứng LAMP. .................................................... 11
Hình 2.10 Bước 5 trong phản ứng LAMP. .................................................. 12
Hình 2.11 Bước 6 trong phản ứng LAMP. .................................................. 12
Hình 2.12 Bước 7 trong phản ứng LAMP. .................................................. 12
Hình 2.13 Bước 8 trong phản ứng LAMP. .................................................. 12
Hình 2.14 Bước 9 - 11 trong phản ứng LAMP. .......................................... 13
Hình 2.15 Phát hiện sản phẩm qua độ đục.. ................................................. 13
Hình 2.16 Phát hiện sản phẩm nhờ sự phát huỳnh quang. .......................... 14
Hình 2.17 Phát hiện sản phẩm sau khi ddienj di.......................................... 14
Hình 4.1 Kết quả align bộ primer F3 trên vùng ORF1 của PCV2............... 27
Hình 4.2 Kết quả align F2 trên vùng ORF1 của PCV2. .............................. 28
Hình 4.3 Kết quả align F1 trên vùng ORF1 của PCV2. .............................. 28
Hình 4.4 Kết quả align B1 trên vùng ORF1 của PCV2. .............................. 29
Hình 4.5 Kết quả align B2trên vùng ORF1 của PCV2. ............................... 29
Hình 4.6 Kết quả align B3 trên vùng ORF1 của PCV2. .............................. 30
Hình 4.7 Kết quả điện di plasmid DNA. lad: ladder 1 kbp. ........................ 30
Hình 4.8 Kết quả align primer PCV2 – 83F và PCV2 – 83R. ..................... 31
Hình 4.9 Kết quả PCR với mẫu plasmid...................................................... 31
Hình 4.10 Kết quả của LAMP lần 1. ........................................................... 32
Hình 4.11 Kết quả của LAMP lần 2. ........................................................... 33
ix


Chương 1 MỞ ĐẦU

1.1. Đặt vấn đề
Việt Nam là một trong những nước có số lượng heo được nuôi khá lớn với
khoảng 27,3 triệu con tại thời điểm 04/2010 ().Tình hình dịch
bệnh trên đàn heo ở nước ta và những nước khác trên thế giới hiện đang diễn biến
phức tạp, việc kiểm soát bệnh dịch gặp nhiều khó khăn.
Hội chứng còi cọc trên heo con sau cai sữa (PMWS: Post Weaning
Multisystemic Syndrome) là một trong những bệnh thường gặp ở heo. Nguyên nhân
là do heo bị nhiễm Porcine circovirus type 2 (PCV2). Đây là vi-rút DNA mạch đơn,
không vỏ bọc, được xếp vào họ Circoviridae, giống Circovirus.. Các nước châu Âu
mỗi năm có trên 8 triệu heo mắc hội chứng này và thiệt hại do PMWS ước tính từ 562
- 900 triệu euro. Riêng tại nước Anh, vào năm 2001, PMWS cùng với PDNS (Porcine
Dermatitis and Nephropathy Syndrome) đã gây thiệt hại khoảng 21 triệu bảng.
().
Các phương pháp được sử dụng hiện nay để chẩn đoán PCV2 chủ yếu là PCR,
ELISA,…Tuy nhiên, độ chính xác của ELISA trong chẩn đoán PCV2 không cao, còn
phương pháp PCR thì chi phí cao, do đó, cùng với việc tăng cường phòng dịch bệnh,
công tác chẩn đoán nhanh và chính xác PCV2 là một nhiệm vụ hết sức quan trọng
trong phòng và trị bệnh.
LAMP là một kỹ thuật mới được phát triển trong những năm gần đây, có nhiều
ưu điểm như nhanh, nhạy, dễ thực hiện, không cần máy luân nhiệt, có thể thực hiện tại
các trang trại chỉ với bồn ủ nhiệt và có thể quan sát kết quả bằng mắt thường. Vì vậy,
LAMP đáp ứng được nhu cầu chẩn đoán PCV2 tại các trang trại, thực địa và cục thú y
địa phương.
Từ những vấn đề nêu trên, tôi đã thực hiện đề tài: “Xây dựng quy trình chẩn đoán
vi-rút gây hội chứng còi cọc trên heo sau cai sữa – Porcine circovirus type 2 bằng kỹ
thuật LAMP”.
1.2. Yêu cầu của đề tài
1.2.1. Mục đích
1



Xây dựng quy trình chẩn đoán PCV2 bằng kỹ thuật LAMP phục vụ chẩn đoán
các mẫu bệnh phẩm thực địa thay thế các phương pháp chẩn đoán khác.
1.2.2. Yêu cầu
-

Ly trích DNA từ mẫu nghi nhiễm vi-rút PCV2 thu thập từ trại chăn nuôi heo.

-

Xây dựng quy trình chẩn đoán PCV2 bằng kỹ thuật LAMP dựa trên vùng ORF1.

1.3. Nội dung thực hiện
-

Ly trích DNA từ mẫu nghi nhiễm vi-rút PCV2 thu thập từ các trại chăn nuôi heo
công nghiệp tại tỉnh Đồng Nai.

-

Sử dụng kĩ thuật RealTime PCR phát hiện mẫu dương tính để làm vật liệu cho việc
xây dựng quy trình phản ứng LAMP phát hiện PCV2.

-

Xây dựng quy trình chẩn đoán PCV2 bằng kỹ thuật LAMP trên vùng ORF1.

2



Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Giới thiệu hội chứng còi cọc trên heo sau cai sữa
PMWS (Post Weaning Multisystemic Wasting Syndrome) đang là vấn đề nhận
được nhiều sự quan tâm của nhiều quốc gia trên thế giới, đặc biệt là tại Canada, Mỹ,
châu Âu và châu Á. Hội chứng còi cọc trên heo sau cai sữa được phát hiện tại Canada
vào năm 1991. Trên đàn heo này, một số heo sau khi cai sữa khoảng hai tuần bắt đầu
có dấu hiệu còi cọc và không có đáp ứng tốt với việc điều trị. Cho đến nay, bệnh đã
gây thiệt hại rất lớn cho ngành chăn nuôi heo công nghiệp ở Bắc Mỹ, nhiều nước ở
châu Âu và một số nước ở châu Á. Hội chứng PMWS thường xuất hiện ở heo từ 6 -14
tuần tuổi, cũng xảy ra ở lợn 3 tuần tuổi. Tỉ lệ chết có thể lên đến 30% ở một số đàn
heo. Bệnh xuất hiện với những triệu chứng điển hình như gầy còm nhanh, thở khó, tiêu
chảy, thỉnh thoảng có một số heo bị vàng da, nhạt màu…
Nguyên nhân gây bệnh là do Porcine circovirus type 2, gọi tắt là PCV2. PCV2
được phân lập vào năm 1997. Đây là một loại DNA vi–rút DNA mạch đơn, vòng,
không vỏ bọc, thuộc họ Circoviridae, giống Circovirus, có khả năng tồn tại cao trong
môi trường. PCV2 được xem là yếu tố tiền phát gây suy yếu hệ miễn dịch làm heo dễ
bị nhiễm kế phát một số mầm bệnh khác (viêm phổi, hội chứng viêm da và thận ở heo
- PDNS, viêm ruột - Enteritis, thai khô, rối loạn hô hấp và sinh sản – Porcine
Reprodutive and Respiratory Syndrome, suyển lợn - Mycoplasma hyopneumonia) và
làm triệu chứng trầm trọng hơn (). PMWS đã gây
thiệt hại kinh tế đáng kể và ảnh hưởng xấu đến sức khỏe đàn heo trong ngành chăn
nuôi heo công nghiệp của nhiều quốc gia. Trong một báo cáo của Susy Carman năm
2007 về ảnh hưởng của PCV2 gây bệnh PMWS trên heo cho thấy tốc độ lây lan của
bệnh tăng lên đáng kể từ năm 2004 - 2006. Gần đây, tại một số quốc gia cũng đã xuất
hiện những chủng PCV2 mới.
PMWS có chiều hướng lây lan rộng trên khắp thế giới nhưng những hiểu biết về
bệnh vẫn còn hạn chế. Vì thế, các nhà khoa học vẫn đang nỗ lực nghiên cứu và tìm
cách khống chế loại bệnh này.
3



Hình 2.1 Tổng số trường hợp bệnh do PCV2 và tỉ lệ phần trăm tương ứng trong tổng
số các trường hợp heo bệnh được gởi về AHL từ 1998 - 2006. (Susy Carman, 2007).

2.1.1. Dịch tễ học của bệnh còi cọc trên heo sau cai sữa
Hội chứng PMWS do PCV2 gây ra thường tác động trên heo hơn 3 tuần tuổi và
hiện rõ từ 4 - 6 tuần tuổi. Heo con có hàm lượng kháng thể mẹ truyền cao thường
không nhiễm bệnh (Lâm Thị Thu Hương và cs, 2005).
PCV2 phân bố nhiều trên các cơ quan nội tạng đặc biệt là hạch bạch huyết. Ngoài
ra, virus còn được tìm thấy trong xoang mũi, phân, nước tiểu, mẫu máu của heo con
cũng như trong tinh dịch của heo đực.
Bệnh chủ yếu lây truyền từ heo nhiễm bệnh sang heo khỏe theo phân, qua tiếp
xúc trực tiếp, gián tiếp qua các phương tiện chăn nuôi hoặc thức ăn, nước uống, do mật
độ chăn nuôi cao, heo bị stress…PCV2 có thể lan truyền giữa các đàn khi chuyển heo
từ đàn này sang đàn khác hoặc thông qua những động vật trung gian mang mầm bệnh
như chuột, chim… Ngoài ra, PCV2 có trong tinh dịch của những nọc bị nhiễm bệnh có
thể lây truyền qua quá trình giao phối. Bệnh lây truyền qua nhau thai có thể làm cho
heo nái bị sẩy thai.
4


2.1.2. Triệu chứng bệnh còi cọc trên heo sau cai sữa
Heo kém vận động, ốm, sụt cân, lông khô, da tái nhợt đôi khi bị vàng da, chậm
phát triển và tai bị đổi màu, sốt 41 - 420C. Quanh hạch bạch huyết sưng, đặc biệt ở
giữa hai chân sau, có thể xuất hiện tiêu chảy và loét dạ dày (30%), hoặc khó thở do
viêm phổi. Có thể có triệu chứng thần kinh. Tỷ lệ heo bệnh trong đàn từ 3 - 50%, và tỷ
lệ heo cai sữa chết khoảng 6 - 10%. Ở dạng mãn tính xảy ra ở lợn tơ vỗ béo, tỷ lệ chết
ít hơn nhưng lợn tăng trọng kém (trọng lượng chỉ đạt 30kg trong khi những heo bình
thường có thể đạt 100kg).
PMWS nếu kết hợp với hội chứng viêm da và thận ở heo (Porcine Dermatitis and

Nephropathy Syndrome – PDNS) sẽ tăng tỷ lệ gây chết trên đàn heo bệnh. Bệnh biểu
hiện qua viêm vành tai, viêm da phía sau đùi, viêm da toàn thân (giống triệu chứng
viêm da tiết dịch do nhiễm Staphylococcus), bệnh có thể kéo dài nhiều tháng trong đàn
và lây lan. Hiệu quả điều trị không cao do chưa có thuốc đặc trị.
2.2. Porcine circovirus
2.2.1. Đặc điểm hình thái và tính chất của Porcine circovirus
PCV được xác định vào năm 1972, là một vi-rút không gây bệnh tích tế bào khi
gây nhiễm trên môi trường tế bào thận heo PK15 - pig kidney cell line 15 (Tischer và
ctv, 1974). Cùng với vi-rút gây bệnh thiếu máu gà, vi-rút gây bệnh trên mỏ và lông
chim mỏ vẹt, PCV đã được phân loại vào họ vi-rút mới gọi là Circoviridae (Ellis và
ctv, 1999).
Circovirus là những vi-rút nhỏ nhất lây nhiễm sang động vật có vú được công
nhận. Vi-rút này không có vỏ bọc, hình khối 20 mặt, đường kính khoảng 17 - 22nm,.
Bộ máy di truyền là một vòng DNA chuỗi đơn (Ellis và ctv, 1999).

Hình 2.2 Virion của PCV (Allan, 2000).
5


Chủng PCV gốc không gây bệnh được gọi là Porcine circovirus type 1 (PCV1).
Ngược lại, Porcine circovirus type 2 (PCV2) có độc tính cao và là nguyên nhân gây
bệnh PMWS trên heo.
PCV1 được phát hiện lần đầu tiên năm 1972, nhiễm phổ biến trên các đàn heo
trên thế giới. Một lượng kháng thể huyết thanh chống PCV1 được phát hiện từ những
heo bị còi. Tuy nhiên, khi tiến hành thử nghiệm lây nhiễm trên heo mới sinh thì không
gây triệu chứng bệnh lâm sàng và PCV1 được kết luận là yếu tố không gây bệnh .
PCV2 được ghi nhận lần đầu tiên năm 1991, trên đàn heo ở Tây Canada. Kháng
thể chống PCV2 đã được phát hiện trong huyết thanh trên đàn heo nuôi tại Bỉ năm
1985. Từ những nghiên cứu ban đầu cho thấy khi gây nhiễm trên heo, heo có một số
biểu hiện tổn thương đặc trưng của bệnh PMWS. Tuy nhiên, nguyên nhân gây bệnh

còn là do sự nhiễm thứ cấp của một số vi-rút và vi khuẩn như PPV hay PRRS cùng với
yếu tố môi trường và kĩ thuật chăm sóc (Allan và ctv, 2000).
PCV không có tính chất gây ngưng kết hồng cầu của một số động vật và có khả
năng đề kháng cao với một số chất sát trùng mạnh như ethanol, chloroform,
formaldehyde…Nó có thể tồn tại trong môi trường nhiều tháng, không bị bất hoạt ở
pH=3,0; nhiệt độ 700C trong 15 phút (Ellis và cs, 1999). PCV2 có thể bị bất hoạt bởi
sodium hydroxide với độ pha loãng 1% (Royer và ctv, 2001).
2.2.2. Cấu trúc bộ gen của Porcine circovirus
Kích thước bộ gene của PCV1 khoảng 1759 bp và PCV2 khoảng 1767 – 1768 bp.
PCV sao chép thông qua khuôn sao chép sợi đôi (Double strand replicate form – RF),
cả hai sợi PCV - RF đều phiên mã và mã hóa thành protein (Ellis và ctv, 1999).
Bộ gene của PCV1 và PCV2 có cấu trúc steem - loop (tương tự như kẹp tóc và
vòng kẹp tóc) và các trình tự nonanucleotide motif gần giống nhau. Đây được xem là
vùng cần thiết cho sự nhân lên của vi-rút.
PCV1 có 7 khung đọc mở (Open reading frames - ORFs) có khả năng mã hóa các
protein có kích thước lớn hơn 5 kDa, PCV2 có 6 khung đọc mở.

6


Hình 2.3 Cấu trúc steem - loop của Porcine circovirus type 1 và 2. (a) cấu trúc steemloop dạng thẳng của PCV1 và PCV2; (b) cấu trúc steem - loop dạng vòng mô phỏng từ hình
a; Dấu sao chỉ các trình tự Nu tương đồng. (Andre, 1998).

Hình 2.4 Cấu trúc bộ gen của Porcine
circovirus type 2 với 6 khung đọc mở
(Andre, 1998).

PCV1 và PCV2 có khoảng 68 - 76% trình tự nucleotide tương đồng, trong đó
tương đồng 90 - 94% protein capsid và 95,7 - 99,4% Reps. Các phân lập PCV2 có
nhiều kiểu gene khác nhau và được xếp vào 2 nhóm chính: PCV2a và PCV2b. Các

nghiên cứu gần đây đã phát hiện thêm các nhóm PCV2c, PCV2d và PCV2e. Khu vực
địa lý và tình trạng bệnh không liên quan đến các nhóm PCV. Phân tích bộ gene của
PCV2 phân lập từ Bắc Mỹ và châu Âu cho thấy 96% trình tự nucleotide tương đồng.
7


ORF1 của PCV1 có kích thước 936 nucleotide và của PCV2 có kích thước 942
nucleotide, tương đồng khoảng 83% về trình tự nucleotide (Nguyễn Ngọc Hải, 2007).
ORF1 mã hoá protein liên quan đến sự nhân lên của virus, sản phẩm protein. ORF1
được gọi là Rep gene.
ORF2 mã hóa protein vỏ capsid. ORF2 của PCV1 và PCV2 có kích thước 699
nucleotide chỉ tương đồng 67% về trình tự nucleotide và 65% axit amin. Sản phẩm
protein mã hóa có kích thước 27,8 kDa. ORF2 được gọi là Cap gene. Khi giải mã
trình tự gene khung đọc mở ORF2 của vỏ capsid virus, những phân lập PCV2 ở châu
Mỹ có tính tương đồng rất cao với các phân lập PCV khác trên thế giới. Mặc dù có
một số khác biệt về gene của ORF2 nhưng vùng mã hóa đầu N cuối (N-terminal
region) của ORF2 gần như không thay đổi ở tất cả các phân lập vi-rút được nghiên cứu
(Nguyễn Ngọc Hải, 2007).

Hình 2.5 Genome của PCV2. (Faurez, 2009).
Gần đây, gene ORF3 của PCV2 cũng được nghiên cứu. ORF3 có kích thước 315
bp. ORF3 có vai trò cảm ứng virus gây ra hiện tượng apoptosis. Tuy nhiên, ORF3
không cần thiết cho việc nhân rộng của virus và các nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng
apoptosis chưa phải là đặc tính đáng lưu ý trong việc phát triển thương tổn lympho do
PMWS. Ý nghĩa của các ORF còn lại vẫn chưa được hiểu biết nhiều.
2.3. Một số phương pháp chẩn đoán Porcine circovirus type 2
- Phương pháp huyết thanh học: Sử dụng các phương pháp Indirect
immunoperoxidase (IIP), Indirect immunoflourescence assay (IFA), ELISA cạnh
8



tranh…để phát hiện kháng thể PCV2. Phương pháp hóa mô miễn dịch
(Immunocytochemistry-ICC) và lai in situ (in situ hybridization-ISH) được dùng để
phát hiện kháng nguyên PCV2 trực tiếp trên mô bệnh. Trong đó kĩ thuật ICC được
đánh giá là nhạy hơn kĩ thuật ISH.
- Phương pháp nuôi cấy tế bào: phương pháp này chủ yếu phục vụ cho việc bào chế
vaccine và định type virus.
- Phương pháp PCR/ Multiplex PCR/ Phương pháp Real Time PCR: là phương
pháp có độ nhạy và độ chính xác cao nên được sử dụng chủ yếu để chẩn đoán PCV2
phân biệt với PCV1.
2.4. Phương pháp LAMP
2.4.1. Khái niệm phương pháp LAMP
Phương pháp LAMP được Tsugunori Notomi và các cộng sự công bố năm 2000
(Notommi và ctv, 2000).
LAMP là kĩ thuật sinh học phân tử có khả năng khuếch đại DNA đích với bộ
primer thiết kế trên 6 vùng đặc trưng cho DNA đích. Dưới tác dụng của DNA
polymerase có hoạt tính thay mạch (DNA polymerase bị bất hoạt hoạt tính exo nên có
khả năng kéo dài một đoạn DNA rất dài), trình tự DNA đích sẽ được khuếch đại lên
109 - 1010 lần trong 30 - 60 phút ở nhiệt độ 60 - 650C.
So với các phương khác, LAMP được xem có nhiều ưu điểm như không cần
thiết bị luân nhiệt, thời gian khuếch đại ngắn hơn, độ nhạy của phản ứng cũng tăng cao
10 -100 lần so với phương pháp PCR truyền thống, do vậy việc áp dụng phương pháp
này trở nên dễ dàng hơn cho nhiều phòng thí nghiệm không trang bị máy luân nhiệt
mà thay vào đó chỉ cần bể ủ nhiệt (water bath) hoặc thiết bị nhiệt khô (heating block).
Mặc dù mới được giới thiệu nhưng số lượng công trình nghiên cứu sử dụng phương
pháp LAMP như một công cụ chẩn đoán tăng lên đáng kể trong vài năm gần đây đã
cho thấy tính hấp dẫn của phương pháp này.
2.4.2. Thành phần của phản ứng LAMP
- H 2 O: là dung môi
- DNA mẫu: làm khuôn mẫu cho phản ứng LAMP.

- Thermopol buffer: giúp enzyme và các thành phần phản ứng khác hoạt động
9


- Betaine: có vai trò trong việc tách mạch đôi DNA ở điều kiện nhiệt độ 60 650C. Betaine làm cho DNA mạch đôi trở nên lỏng lẻo và dễ dàng tách ra ở nhiệt độ
thấp 60 - 650C. Đây chính là yếu tố giúp phản ứng LAMP có thể thực hiện được ở điều
kiện nhiệt độ thấp hơn nhiều so với phản ứng PCR. Ngoải ra, betaine còn giúp tăng
cường hệu quả khuếch đại gen bằng cách làm giảm sự hình thành cấu trúc bậc hai của
các primer và các vùng DNA giàu GC và làm tăng tính chọn lọc trình tự mục tiêu bằng
cách giảm sự khuếch đại các trình tự không mong muốn.
- MgSO 4 : giúp làm ổn định hoạt động tổng hợp của enzyme Bst DNA
polymerase. Khi phản ứng LAMP xảy ra sẽ tạo Mg 2 P 2 O 7 kết tủa làm cho dung dịch
sau phản ứng vẩn đục và giúp nhận diện phản ứng dương tính xảy ra bằng mắt thường.
- dNTPs: là hỗn hợp 4 loại deoxyribonucleotide (dATP, dTTP, dGTP, dCTP) có
vai trò làm nguyên liệu cho quá trình tổng hợp DNA.
- Primer (4 - 6 primer): bao gồm outer primer (B3, F3), inner primer (FIP và
BIP) và loop primer (LF và LB): là thành phần quan trọng giúp phản ứng xảy ra và đặc
trưng cho khuôn mẫu DNA, quyết định độ đặc hiệu của phương pháp.
- Bst polymerase: được ly trích từ chủng vi khuẩn Bacillus stearothermophilus,
có trọng lượng phân tử 67000 Dalton, hoạt tính khoảng 120000 units/mg, có khả năng
thay thế mạch, do đó giúp cho phản ứng xảy ra liên tục, kéo dài một trình tự DNA có
kích thước lớn. Ở nhiệt độ 60 - 650C thì khả năng hoạt động đạt 100%.
- Thuốc nhuộm huỳnh quang: có thể sử dụng hoặc không.
2.4.3. Nguyên tắc hoạt động của phản ứng LAMP
Bước 1: DNA mạch đôi được ủ với các thành phần thích hợp giúp cấu trúc trở
nên lỏng lẻo mà không cần trải qua bước biến tính. Điều này giúp cho các primer trong
(FIP hoặcBIP) có thể bám lên mạch khuôn và khởi động sự tổng hợp kéo dài. Để khái
quát hóa nguyên tắc của phương pháp, ở đây tập trung miêu tả các quá trình diễn ra
trên mạch khuôn 3’- 5’ với sự bắt cặp ban đầu của primer FIP lên mạch khuôn.


10


Hình 2.6 Bước 1 trong phản ứng LAMP.
Bước 2: Thông qua hoạt động tổng hợp kéo dài của Bst DNA Polymerase, một
DNA mạch đơn bổ sung với mạch khuôn được tổng hợp, bắt đầu từ 3’ của vùng F2
của primer FIP.

Hình 2.7 Bước 2 trong phản ứng LAMP.
Bước 3: Primer F3 bắt cặp với vùng F3c trên trình tự mục tiêu từ phía ngoài của
primer FIP và bắt đầu khởi động tổng hợp sợi DNA thay thế, giải phóng chuỗi DNA
bổ sung có gắn primer FIP.

Hình 2.8 Bước 3 trong phản ứng LAMP.
Bước 4: DNA mạch đôi được hình thành gồm chuỗi DNA vừa được tổng hợp
bằng primer F3 và chuỗi DNA mạch khuôn.

Hình2 .9 Bước 4 trong phản ứng LAMP.
Bước 5: Sợi DNA mạch đơn gắn primer FIP được giải phóng do sự thay thế bởi
sợi DNA được tổng hợp bằng primer F3. Sau đó, chuỗi DNA mạch đơn vừa được giải
phóng này hình thành nên một cấu trúc vòm tại đầu 5’ do có sự bắt cặp bổ sung giữa
hai vùng F1 và F1c.

11


Hình 2.10 Bước 5 trong phản ứng LAMP.
Bước 6: Primer BIP bắt cặp với sợi DNA sản phẩm được hình thành trong bước 5.
Sự tổng hợp mạch bổ sung diễn ra bắt đầu từ 3’ của primer BIP. Trong suốt quá trình
này, DNA hoàn nguyên từ cấu trúc vòm về cấu trúc sợi thẳng ban đầu. Primer B3 bắt

cặp từ bên ngoài primer BIP và sau đó thông qua hoạt động của Bst DNA Polymerase
bắt đầu từ 3’, sợi DNA được tổng hợp từ primer BIP được thay thế và giải phóng bởi
sợi DNA được tổng hợp từ primer B3.

Hình 2.11 Bước 6 trong phản ứng LAMP.
Bước 7: Chuỗi DNA mạch đôi được tạo ra thông qua quá trình mô tả ở bước 6.

Hình 2.12 Bước 7 trong phản ứng LAMP.
Bước 8: Sợi DNA gắn primer BIP được giải phóng trong bước 6 hình thành nên
cấu trúc vòm ở cả hai đầu. Cấu trúc này được dùng để bắt đầu chu trình khuếch đại
trong phản ứng LAMP.

Hình 2.13 Bước 8 trong phản ứng LAMP.
Bước 9 – 11 (bước khuếch đại): Cấu trúc sợi DNA với hai đầu hình thành cấu
trúc vòm là nguyên liệu chính cho chu trình khuếch đại LAMP. Các primer FIP và BIP
hoạt động song song và thay phiên bắt cặp lên vùng trình tự mạch đơn của cấu trúc
vòm và khởi động sự khuếch đại chuỗi DNA. Sự khuếch đại này diễn ra liên tục, đồng
thời, tạo ra sản phẩm là những sợi DNA kích thước đa dạng với sự hiện diện các
“vòm” (loop) xen kẽ với trình tự mục tiêu được sắp xếp lặp đi lặp lại trên cùng một
sợi. Sau mỗi chu kỳ khuếch đại, cấu trúc DNA ở bước 8 được giải phóng lại tiếp tục
12


trở thành mắt xích cho sự tổng hợp tiếp theo. Quá trình này diễn ra liên tục cho đến khi
nguyên liệu cho phản ứng cạn kiệt hay người làm thí nghiệm chủ động kết thúc phản
ứng bằng cách đun nóng hỗn hợp ở 80oC và ủ vào đá lạnh ngay sau đó.

Hình 2.14 Bước 9 - 11 trong phản ứng LAMP.
2.4.4. Cách đọc kết quả của phản ứng LAMP
Có thể sử dụng nhiều cách khác nhau để phát hiện sản phẩm:

Quan sát bằng mắt – độ đục: Thông qua sự hiện diện của sản phẩm phụ
magnesium pyrophosphate.

(-)

(+)

Hình 2.15 Phát hiện sản
phẩm qua độ đục. (-): âm
tính, (+): dương tính.

Quan sát bằng mắt – huỳnh quang : Thông qua sự phát huỳnh quang của
Calcein. Calcein kết hợp với Mg2+ tạo thành phức hợp Calcein - Mg2+ phát
huỳnh quang màu xanh lá cây.
13


Hình 2.16 Phát hiện sản phẩm nhờ
sự phát huỳnh quang.

Điện di, nhuộm Ethidium Bromide rồi chụp dưới tia UV: phương pháp
này áp dụng đối với các phản ứng không có thuốc thử trong thành phần
phản ứng.

Hình 2.17 Phát hiện sản phẩm nhờ điện di.
2.4.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng LAMP
- Thời gian và nhiệt độ phản ứng có tác động lớn đến độ nhạy và độ đặc hiệu của
phản ứng LAMP. Thời gian phản ứng ngắn sẽ làm giảm độ nhạy, thời gian phản ứng
cao sẽ làm giảm độ đặc hiệu. Nhiệt độ phản ứng nếu thấp sẽ làm giảm độ đặc hiệu, nếu
cao sẽ gây ức chế enzyme.

- Nồng độ của các chất trong thành phần phản ứng sẽ ảnh hưởng đến khả năng hoạt
động của phản ứng.

14