BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
************

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
TẠO DÒNG VÀ BIỂU HIỆN ENZYME β -1,3-GLUCANASE
TỪ VI KHUẨN BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS

Ngành học

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện

: ĐẶNG DUY LINH

Niên khóa

: 2007 – 2011

Tháng 7/2011


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
************

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

TẠO DÒNG VÀ BIỂU HIỆN ENZYME β -1,3-GLUCANASE
TỪ VI KHUẨN BACILLUS AMYLOLIQUEFACIENS

Hướng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

ThS. CAO THÀNH TRUNG

ĐẶNG DUY LINH

ThS. NGUYỄN VIẾT DŨNG

Tháng 7/2011


LỜI CẢM ƠN
Để khoá luận này được hoàn thành, tôi đã nhận rất nhiều sự giúp đỡ, động viên
của rất nhiều người.
Đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến thầy giáo hướng dẫn là ThS.
Cao Thành Trung cùng ThS. Nguyễn Viết Dũng đã cho tôi cơ hội được làm đề tài này
và đã tận tình hướng dẫn, chỉ dạy và tạo mọi điều kiện thuận lợi để luận văn này được
hoàn thành.
Xin được gửi lời cảm ơn đến các anh chị trong Viện Nghiên Cứu Nuôi Trồng
Thủy Sản II đã giúp đỡ, đóng góp nhiều ý kiến quý báu trong suốt thời gian tôi thực
hiện đề tài.
Xin chân thành cảm ơn quý Thầy Cô khoa Công Nghệ Sinh học, Trường Đại
Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh đã tận tình dạy dỗ, cung cấp kiến thức cho
tôi trong suốt thời gian học tập tại trường.
Xin cảm ơn các bạn Sinh Viên lớp DH07SH đã động viên, giúp đỡ tôi trong

suốt thời gian qua.
Cuối cùng luôn ghi nhớ công lao dưỡng dục và lòng biết ơn sâu sắc đến gia
đình nơi đã động viên, giúp đỡ, chia sẽ những khó khăn và vui buồn cùng tôi trong
suốt thời gian học tập vừa qua.
Đặng Duy Linh

i


TÓM TẮT
Bacillus amyloliquefaciens là vi khuẩn Garm dương có khả năng tiết enzyme β1,3-glucanase ngoại bào giúp thủy phân β-glucan. Từ đó, chúng tôi đã tiến hành tạo
dòng và biểu hiện enzyme tái tổ hợp β-1,3-glucanase từ vi khuẩn Bacillus
amyloliquefaciens bằng cách sử dụng phương pháp PCR để khuếch đại một trình tự
gen dài 729 bp mã hóa cho tiền enzyme β-1,3-glucanase (precursor enzyme) có chứa
trình tự mã hóa cho chuỗi peptide tín hiệu (signal-peptide) gồm 29 amino acid ở đầu N
của chuỗi polypeptide của tiền phân tử enzyme β-1,3-glucanase. Đồng thời một trình
tự gen có độ dài 642 bp mã hóa cho phân tử enzyme β-1,3-glucanase không có chuỗi
peptide tín hiệu cũng được khuếch đại nhờ phản ứng PCR. Các trình tự này sau đó
được chuyển vào trong vector pQE-Ec và được biểu hiện trong tế bào E. coli WK6.
Kết quả nghiên cứu cho thấy sự biểu hiện cùng khả năng tinh chế enzyme tái tổ
hợp β-1,3-glucanase cao, bằng hệ thống tinh chế ái lực His-tag. Kết quả nghiên cứu
cũng cho thấy khả năng hoạt động của chuỗi peptide tín hiệu của chủng vi khuẩn
Bacillus amyloliquefaciens có khả năng hoạt động trong tế bào vi khẩn E. coli.

ii


SUMMARY
Thesis title “Molecular cloning and expression of enzyme β-1,3-glucanase
from Bacillus amyloliquefaciens”

Bacillus amyloliquefaciens is Gram-positive bacteria that are able to excrete
enzyme β-1,3-glucanase extracellular hydrolytic β-1,3-glucan. We cloned and overexpressed recombinant enzyme β-1,3-glucanase from Bacillus amyloliquefaciens by a
PCR-based strategy using DNA template from Bacillus amyloliquefaciens. PCR
amplify a sequences of 729 bp gene coding for the enzyme pre-β-1,3-glucanase
containing the sequence coding for the signal peptide sequence consists 29 amino acid
polypeptide at the N-terminal of enzyme pre-β-1,3-glucanase. At the same time a
sequence should be longer 642 bp gene coding for the enzyme β-1,3-glucanase without
signal peptide sequence and amplified by PCR reaction. The sequences were then
transferred into the vector pQE-Ec and were expressed in cell E. coli WK6.
Research results suggest that the expression and the ability to purify the
recombinant enzyme β-1,3-glucanase high by system purification affinity his-tagged.
Research results suggested that various signal peptides of Bacillus amyloliquefaciens
can be recognized by the E. coli.

iii


MỤC LỤC
Trang
Lời cảm ơn ................................................................................................................... i
Tóm tắt ......................................................................................................................... ii
Summary ...................................................................................................................... iii
Mục lục ........................................................................................................................ iv
Danh sách các chữ viết tắt ............................................................................................. vi
Danh sách các bảng ....................................................................................................... vii
Danh sách các hình ........................................................................................................viii
Chương 1 MỞ ĐẦU..................................................................................................... 1
1.1. Đặt vấn đề............................................................................................................... 1
1.2. Mục tiêu đề tài ........................................................................................................ 1
1.3. Nội dung thực hiện.................................................................................................. 1

Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU........................................................................... 2
2.1. Sơ lược về β-glucan ............................................................................................... 2
2.1.1. Cấu trúc của β-glucan .......................................................................................... 2
2.1.2. Tính chất của β-glucan ......................................................................................... 2
2.2. Sơ lược về enzyme β-glucanase .............................................................................. 2
2.2.1. Nguồn gốc enzyme β-glucanase ........................................................................... 3
2.2.2. Ứng dụng của enzyme β-glucanase ...................................................................... 4
2.3. Tình hình nghiên cứu về enzyme β-glucanase ......................................................... 7
2.3.1. Nghiên cứu nước ngoài ........................................................................................ 7
2.3.2. Nghiên cứu trong nước......................................................................................... 8
2.4. Kỹ thuật tạo dòng và biểu hiện gen ngoại lai........................................................... 8
2.4.1. Tạo dòng.............................................................................................................. 8
2.4.2. Tế bào E. coli dùng trong biểu hiện...................................................................... 8
2.4.3. Các kỹ thuật và vật liệu sử dụng trong tạo dòng ................................................... 9
Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.................................... 14
3.1. Vật liệu và hóa chất................................................................................................. 14
3.1.1. Dụng cụ và thiết bị ............................................................................................... 14

iv


3.1.2. Hóa chất và môi trường........................................................................................ 14
3.1.2.1. Hóa chất............................................................................................................ 14
3.1.2.2. Môi trường........................................................................................................ 16
3.1.3.3. Vật liệu sinh học ............................................................................................... 17
3.2. Phương pháp tạo dòng và biểu hiện gen .................................................................. 18
3.2.1. Tạo dòng gen signal-glu và gen glu...................................................................... 18
3.2.1.1. Chuẩn bị gen ..................................................................................................... 18
3.2.1.2. Chuẩn bị vector pQE-Ec mở vòng bằng enzyme BamHI ................................... 20
3.2.1.3. Tạo vector tái tổ hợp ......................................................................................... 22

3.2.1.4. Biến nạp sản phẩm nối vào tế bào E. coli JM109............................................... 22
3.2.1.5. Tuyển lựa dòng tế bào E. coli JM109 mang vector tái tổ hợp ............................ 22
3.2.1.6. Phân tích và giải trình tự ................................................................................... 24
3.2.2. Biểu hiện enzyme tái tổ hợp. ............................................................................... 24
3.2.2.1. Tạo dòng biểu hiện E. coli WK6 mang vector tái tổ hợp ................................... 24
3.2.2.2. Cảm ứng và biểu hiện enzyme tái tổ hợp trong E. coli WK6 ............................. 25
3.2.3. Tinh chế enzyme tái tổ hợp. ................................................................................ 27
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................... 28
4.1.Kết quả .................................................................................................................... 28
4.1.1. Nhân dòng và thiết kết vector biểu hiện ............................................................... 28
4.1.1.1. Nhân dòng trình tự gen signal-glu và thiết kế vector biểu hiện .......................... 28
4.1.1.2. Nhân dòng tự gen glu và thiết kế vector biểu hiện ............................................. 33
4.1.2. Biểu hiện và tinh chế protein tái tổ hợp ................................................................ 35
4.1.2.1. Tạo dòng biểu hiện............................................................................................ 35
4.1.2.2. Khảo sát cảm ứng biểu hiện enzyme tái tổ hợp.................................................. 36
4.1.2.3. Tinh chế enzyme tái tổ hợp ............................................................................... 39
4.2. Thảo luận................................................................................................................ 39
Chương 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ....................................................................... 41
5.1. Kết luận .................................................................................................................. 41
5.2. Đề nghị ................................................................................................................... 41
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................... 43
PHỤ LỤC

v


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Ampr

Gen kháng ampicilline


APS

Amonium persulfate

dATP

3’-deoxyadenine-5’-triphosphate

dCTP

3’-deoxycytosine-5’-triphosphate

ddNTP

Dideoxynucleotide

dGTP

3’-deoxyguanine-5’-triphosphate.

DNA

Deoxyribonucleic acid

dNTP

3’-deoxynucleotide-5’-triphosphate

dTTP


3’-deoxythyamine-5’-triphosphate

E. coli

Escherichia coli

EDTA

Ethylene diamin tetracetic acid

IPTG

Isopropyl-β-D-thiogalactoside

Kp

Kilobase pair

KDa

Kilo Dalton

LB

Luria-Bertani

MCS

Multiple cloning site


OD

Optical density

ORF

Open reading frame

PCR

Polymerase chain reaction

PBS

Phosphate buffer saline

SDS

Sodium dodecyl sulfat

SDS-PAGE

Sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel

TAE

Tricacetic ethylene diamine tetra acetate

Taq


Thermus aquaticus

TE

Tris ethylene diamine tetra acetate

TEMED

N,N,N`,N`-tetramethylethylene diamine

vi


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 3.1 Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu........................................................... 15
Bảng 3.2 Thành phần phản ứng PCR khuếch đại gen .................................................... 18
Bảng 3.3 Thành phần phản ứng cắt gen với enzyme BamHI.......................................... 19
Bảng 3.4 Thành phần phản ứng mở vòng vector với enzyme BamHI............................. 20
Bảng 3.5 Thành phần phản ứng xử lý vector sau khi cắt với BamHI.............................. 20
Bảng 3.6 Thành phần phản nối gen vào vector .............................................................. 21
Bảng 3.7 Thành phần phản ứng PCR kiểm tra dòng ...................................................... 22
Bảng 3.8 Thành phần phản ứng cắt kiểm tra vector tái tổ hợp........................................ 22

vii


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 2.1 Cấu trúc glucan............................................................................................... 2
Hình 2.2 Mô hình plasmid sử dụng cho cloning ........................................................... 10

Hinh 3.1 Tổng quan vector pQE-16............................................................................... 17
Hình 3.2 Biến tính protein bằng SDS và β-mercaptethanol............................................ 26
Hình 4.1 Gen signal-glu được khuếch đại bằng phản ứng PCR ..................................... 29
Hình 4.2 Kiểm tra E. coli JM109-pQE-EC-signal-glu bằng kỹ thuật PCR..................... 30
Hình 4.3 Kết quả vector pQE_Ec-signal-glu được cắt bằng BamHI .............................. 30
Hinh 4.4 Phân tích trình tự gen signal-glu trên ngân hàng gen ...................................... 31
Hinh 4.5 Phân tích trình amino acid mã hóa bởi gen signal-glu..................................... 32
Hình 4.6 Phân tích chuỗi peptide tín hiệu (signal peptide) ............................................. 32
Hình 4.7 Kết quả sau khi gen glu khuếch đại bằng phản ứng PCR ................................ 33
Hình 4.8 Kết quả kiểm tra dòng E. coli JM109-pQE-Ec-glu.......................................... 34
Hình 4.9 Kết quả vector pQE-Ec-glu được cắt với enzym BamHI ................................. 34
Hình 4.10 Phân tích trình tự gen glu trong nghiên cứu .................................................. 35
Hình 4.11 Kiểm tra dòng dòng biểu hiện bằng phản ứng PCR....................................... 36
Hình 4.12 Khảo sát cảm ứng biểu hiện theo thời gian ................................................... 37
Hình 4.13 Khảo sát cảm ứng biểu hiên theo nồng độ IPTG ........................................... 37
Hình 4.14 Kết quả tinh sạch enzyme tái tổ hợp ............................................................. 39
Biểu đồ 4.1 Sự phát triển của E. coli WK6-pQE-Ec-signal-glu ..................................... 38
Biểu đồ 4.2 Sự phát triển của E. coli WK6-pQE-Ec-glu ................................................ 38

viii


Chương 1 MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Trong các nguồn cung cấp lương thực cho con người và động vật hiện nay thì
thực vật vẫn là nguồn cung cấp lương thực chủ yếu. Theo thống kê nông nghiệp của
FAO (2010), các loại lương thực truyền thống chủ yếu được sản xuất và tiêu thụ trên
thế giới bao gồm 5 loại cụ thể: lúa gạo, lúa mì, ngô, kê, lúa mạch. Trong số các loại kể
trên, lúa mì và lúa gạo là hai loại lương thực cơ bản dùng cho con người. Tuy nhiên βglucan có nhiều trong vách tế của thực vật, nấm men và vi khuẩn trong đó β-glucan
được tìm thấy nhiều trong ngũ cốc, đặc biệt trong nội nhũ bột ngũ cốc. Ở lúa mạch, lúa

mạch đen , và yến mạch có thể chứa đến 70% β-glucan trên trọng lượng của thành tế
bào (Fincher và Stone, 2004). Khi sử dụng thức ăn có chứa nhiều β-glucan sẽ làm tăng
độ nhớt trong đường ruột dẫn đến việc làm giảm khả năng hấp thu chất dinh dưỡng
của ruột gây lãng phí thức ăn. Enzyme β-glucanase phân giải β-glucan trên thành tế
bào thực vật thành đường và các chuỗi polysaccharide ngắn hơn từ đó làm giảm độ
nhớt, giải phóng chất dinh dưỡng trong tế bào giúp tăng khả năng tiêu hóa và hấp thu
dinh dưỡng trong thức ăn (Đỗ Hữu Phương, 2004). Tầm quan trọng enzyme phân giải
β-glucan ngày càng được quan tâm nghiên cứu và ứng dụng trong đời sống như sử
dụng trong công nghiệp thực phẩm, thức ăn chăn nuôi, công nghiệp sản xuất bột
giấy….Vì vậy, việc nghiên sản xuất enzyme β-1,3-glucanase tái tổ hợp để đáp ứng nhu
cầu sử dụng cũng ngày càng được quan tâm.
1.2. Mục tiêu đề tài
Tạo dòng vi khuẩn biểu hiện gen mã hóa enzyme β-1,3-glucanase từ Bacillus
amyloliquefaciens để tạo ra nguồn enzyme β-1,3-glucanase với số lượng lớn và chất
lượng cao để đáp ứng đủ nhu cầu sử dụng.
1.3. Nội dung thực hiện
-Tạo dòng và biểu hiện gen mã hóa cho tiền enzyme β-1,3-glucanase từ vi khuẩn
Bacillus amyloliquefaciens.
-Tạo dòng và biểu hiện gen mã hóa cho enzyme β-1,3-glucanase từ vi khuẩn Bacillus
amyloliquefaciens.
-Thu nhận và tinh sạch enzyme tái tổ hợp β-1,3-glucanase.
1


Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Sơ lược về β-glucan
2.1.1. Cấu trúc β-glucan
β-glucan là một biopolymer của 1,3-D-glucose (hoặc 1,6-D-glucose). β-glucan
bao gồm những liên kết không phân nhánh của liên kết -1,3 và liên kết -1,4glucopyranose tạo nên các chuỗi polysaccharide, chứa khoảng 250.000 phân tử
glucose.


(b)

(a)

Hình 2.1 Cấu trúc glucan. (a) Cấu trúc hóa học; (b) Cấu trúc không gian của phân tử
β-glucan (Åman, 2004).

2.1.2. Tính chất của β–glucan
β–glucan là các polysaccharides bao gồm tỷ lệ khác nhau của (1-3) và (1-4)-Dliên kết glucopyranosyl (Wood, 1989). Các mối liên kết β (1-3) của glucan linh hoạt
cao làm cho β-glucan tan trong nước (Woodward và ctv,1983). β-glucan là loại chất xơ
khó tiêu hóa, tạo thành dung dịch có độ nhớt cao trong nước (Woodward và ctv,
1989). Tăng độ nhớt trong ruột làm nhu động chậm (đường ruột co bóp), có thể giảm
thủy phân tinh bột và cản trở việc hấp thụ các sản phẩm thủy phân thông qua thành
ruột do tăng độ nhớt của nước (Zheng và ctv, 2000).
2.2. Sơ lược về enzyme β-glucanase
Đó là một phức hệ gồm nhiều loại enzyme khác nhau và được xếp thành 3
nhóm cơ bản: endo-β-glucanase, exo-β-glucanase và β-glucosidase (Adney và ctv,
1995). Mỗi loại enzyme tham gia thủy phân cơ chất theo một cơ chế nhất định và nhờ
có sự phối hợp hoạt động của các enzyme đó mà phân tử cơ chất được thủy phân hoàn
toàn tạo thành các sản phẩm đơn giản nhất.
β-1,3-glucanase là loại enzyme tham gia xúc tác phản ứng thủy phân các liên
kết β-1,3-glucoside của các phân tử β-glucan và một số cơ chất tương tự khác thành
các sản phẩm đơn giản hơn (các oligosaccharide).
2


2.2.1. Nguồn gốc β-glucanase
Glucanase có thể được tổng hợp từ rất nhiều nguồn khác nhau trong tự nhiên,
trong đó chủ yếu có nguồn gốc từ vi sinh vật. Trong tự nhiên có rất nhiều chủng vi

khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc và một số loại nấm men có khả năng sinh tổng hợp
β-glucanase.
Nấm mốc là một trong những đối tượng vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp
β-glucanase mạnh. Nhiều chủng nấm mốc thuộc các chi Aspergillus, Trichoderma,
Penicillium, Phanerochaete đã được nghiên cứu là có khả năng sinh tổng hợp βglucanase mạnh như Aspergillus niger (Coral và ctv, 2002), A. flavus, A. fumigatus
(Das và ctv, 1997), A. terreus (Gao và ctv, 2008), Trichoderma reesei (Palonen và ctv,
1999), Penicillium persicinum, P. brasilianum (Henning và ctv, 2005), Penicillium sp.
(Trịnh Đình Khá, 2006), Phanerochaet chrysosporium (Henriksson và ctv, 1999).
Bên cạnh nấm mốc, vi khuẩn cũng được xem là một trong những đối tượng có khả
năng sinh tổng hợp β-glucanase khá phong phú. Nhiều loài vi khuẩn hiếu khí đã được
nghiên cứu là có khả năng sinh tổng hợp β-glucanase mạnh như Acidothemus
cellulobuticus (Bergquist và ctv, 1999), Bacillus pumilis (Gordon và ctv, 1973),
Cellulomonas lavigena (Bagnara và ctv, 1989), Pseudomonas fluoressens (Kim,
1987). Không chỉ có các vi khuẩn hiếu khí mà một số vi khuẩn kỵ khí cũng có khả
năng sinh tổng hợp β-glucanase mạnh như Clostridium (Gordon và ctv, 1973). Nhiều
chủng xạ khuẩn thuộc chi Actinomyces, Streptomyces cũng có khả năng sinh tổng hợp
β-glucanase mạnh như: Actinomyces griseus (Nguyễn Đức Lượng và Đặng Vũ Bích
Hạnh, 1999), Streptomyces reticuli (Wachinger và ctv, 1989).
Ngoài ra, β-glucanase còn được sinh tổng hợp ở thực vật Arabidopsis
(Campillo, 1999), ở động vật nguyên sinh và một số động vật không xương sống khác
như mối (Watanabe và Tokuda, 2001), ở động vật thân mềm như Mytilus edulis (Xu
và ctv, 2001).
Trong số các nguồn sinh enzyme trên thì vi sinh vật được xem là nguồn cung
cấp enzyme với nhiều ưu điểm nổi bật và có tính chất độc đáo vượt xa so với enzyme
có nguồn gốc từ động vật, thực vật. Vì thế, chúng được sử dụng rộng rãi trong quá
trình sản xuất các chế phẩm enzyme. Trước hết, vi sinh vật là nguồn nguyên liệu vô
tận để sản xuất enzyme với số lượng lớn. Đây cũng là nguồn nguyên liệu mà con
3



người chủ động tạo ra được. Chu kỳ sinh trưởng của vi sinh vật ngắn (từ 16 - 100 giờ).
Vi sinh vật sinh trưởng, phát triển với tốc độ cực kỳ nhanh chóng, khối lượng lại nhỏ,
kích thước bé, nhưng tỷ lệ enzyme trong tế bào tương đối lớn nên quy trình sản xuất
chế phẩm enzyme khá dễ dàng, hiệu suất thu hồi cao. Hơn nữa, enzyme từ vi sinh vật
có hoạt tính rất mạnh, vượt xa các sinh vật khác. Đối với một số trường hợp có thể
dùng 100% sinh khối vi sinh vật làm nguồn enzyme (Nguyễn Lân Dũng, 1976).
2.2.2. Ứng dụng của β-glucanase
Glucanase được ứng dụng rộng rãi trong nhiều ngành công nghiệp như: công
nghiệp thực phẩm, công nghiệp sản xuất thức ăn gia súc, công nghiệp sản xuất dung
môi hữu cơ, công nghiệp giấy và bột giấy.
Trong công nghiệp thực phẩm: sử dụng các chế phẩm enzyme có thể coi là một
trong những phương hướng tiến bộ có triển vọng nhất của sản xuất nước quả và nước
uống không cồn. Dịch quả sau khi ép chiết thường chứa các thành phần tế bào thịt quả
và các chất sơ có bản chất polysaccharide làm cho dịch có độ nhớt cao và màu đục.
Glucanase thường được sử dụng để phá vỡ thành tế bào, thủy phân các polysaccharide
làm giảm độ nhớt của dịch quả tạo thuận lợi cho quá trình tách chiết và làm trong.
Glucanase kết hợp với các hemicellulase, pectinase trong chế phẩm enzyme
Viscozyme L của hãng NOVOZYMES (Mỹ) được ứng dụng chủ yếu để xử lý phá vỡ
màng tế bào đậu tương (Đặng Thị Thu và ctv, 2004). Trong công nghệ sản xuất bia,
dịch lên men ngoài các thành phần đường, protein còn có một lượng không nhỏ các
phân tử khối lượng cao như cellulose và β-glucan, làm ảnh hưởng xấu đến quá trình
lọc và chất lượng sản phẩm. Người ta thường sử dụng β-glucanase để loại bỏ những
thành phần này. Các chế phẩm như Finizyme gồm các cellulase từ Aspergillus niger,
β-glucanase từ Bacillus subtillis, Disporotrichum dimorphosporum đã được sử dụng
trong sản xuất bia. Ngoài ra, glucanase còn được sử dụng trong công nghệ sản xuất
bánh mì, bánh bisqui và thực phẩm chức năng. Glucanase từ Humicolainsolens được
ứng dụng trong sản xuất bánh mì, làm tăng độ mềm và xốp cho bánh mỳ. Glucanase từ
Trichoderma reesei, A. niger được ứng dụng trong sản xuất fructooligosaccharide.
Đây là một trong số các oligosaccharide chức năng (prebiotic) được sản xuất để bổ
sung vào khẩu phần ăn. Prebiotic có nhiều lợi ích về mặt dược phẩm cũng như có ảnh

hưởng tốt đến sức khỏe. Khi được bổ sung vào cơ thể người và động vật, prebiotic có
4


nhiều tác động sinh lý quan trọng như: ngăn cản quá trình xâm nhập của các vi sinh
vật gây bệnh, bảo vệ các chức năng của gan, làm giảm lượng cholesterol trong huyết
thanh, tăng khả năng miễn dịch của cơ thể, kháng lại bệnh ung thư, cản trở sự phát
triển của các vi sinh vật trong khoang miệng (Hsu và ctv, 2004). Các phế phụ phẩm
nông nghiệp như lõi ngô, bã mía, bã sắn, vỏ trấu là cơ chất lý tưởng cho việc sản xuất
các oligosaccharide. Các enzyme tốt nhất sử dụng cho quá trình này chủ yếu có nguồn
gốc từ nấm mốc. Hiện nay, nhu cầu sử dụng các oligosaccharide ở các nước trên thế
giới là rất lớn. Tại Nhật Bản, nhu cầu hàng năm về các oligosaccharide vào khoảng
1000 - 2000 tấn/năm (Nakakuki, 2003).
Trong công nghiệp sản xuất thức ăn gia súc: thức ăn gia súc, gia cầm được chế
biến từ các loại ngũ cốc có chứa nhiều cellulose và glucan. Những thành phần này
thường không được tiêu hóa triệt để, làm tăng độ nhớt của dịch dạ dày. Do đó chúng
đã hạn chế sự hấp thu các chất dinh dưỡng, làm giảm khả năng tiêu hóa của động vật.
Bổ sung β-glucanase vào thức ăn sẽ làm tăng khả năng phân giải các hợp chất trên,
giải phóng glucose và các oligosaccharide, làm giảm độ nhớt, tăng khả năng hấp thu
và chuyển hóa thức ăn (Đặng Thị Thu và ctv, 2004). Nhiều nghiên cứu cho thấy, khi
bổ sung glucanase độc lập hoặc kết hợp với các enzyme khác vào thức ăn chăn nuôi
làm tăng đáng kể tốc độ tăng trưởng và giảm thiểu bệnh tật cho vật nuôi.
Omogbenigun và ctv (2004) cho thấy, khi bổ sung tổ hợp chế phẩm β-glucanase và
một số enzyme khác (amylase, invertase, protease, phytase, xylanase) xử lý thức ăn
cho lợn con 25 ngày tuổi có tác dụng nâng cao khả năng tiêu hóa so với đối chứng (là
khẩu phần cơ sở không bổ sung enzyme) như sau: khả năng tiêu hóa tinh bột tăng 8794%, các polysaccharide khác tăng 10 - 18%, phytate tăng 59 - 70%. Tiềm năng ứng
dụng to lớn của glucanase trong chăn nuôi đã thu hút sự quan tâm của nhiều công ty
chế biến thức ăn gia súc, gia cầm. Một số chế phẩm là tổ hợp các enzyme khác nhau
có thể kể đến như: Rovazyme G2 (DSM Nutritional Products Ltd, Thụy Sỹ) là tổ hợp
của 3 loại enzyme (cellulase, β-glucanase và xylanase); Roxazyme G (DSM

Nutritional Products Ltd, Thụy Sỹ) là tổ hợp của 7 loại enzyme (cellulase, glucanase,
protease, amylase, pectinase, xylanase, hemicellulase); Natugrain (tập đoàn BASF,
Đức) là hỗn hợp của endoxylanase và endo-glucanase; Rhodizyme-CF (RampartPower Bangladesh Ltd) là tổ hợp của 5 loại enzyme (cellulase, amylase, protease,

5


lipase, pectinase). Chế phẩm SSF của Mỹ hiện đang bán tại thị trường Việt Nam là tổ
hợp của 6 loại enzyme: β-glucanase, phytase, α-amylase, pectinase, protease và
xylanase (Bộ Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, 2006).
Trong công nghiệp sản xuất dung môi hữu cơ: sử dụng glucanase xử lý nguyên
liệu giàu cellulose, glucan trước khi lên men đã làm tăng hiệu suất thu hồi dung môi
lên trung bình là 1,5%. Nhiều chế phẩm enzyme đã được sử dụng trong ngành công
nghiệp này như Neutrase có chứa β-glucanase sử dụng trong công nghiệp sản xuất
ethanol. Đồng thời, nhiều chủng vi sinh vật kỵ khí trong chi Clostridium sinh tổng hợp
glucanase được sử dụng trong công nghệ lên men sản xuất dung môi hữu cơ, acetic
acid (Cheryan MS và ctv, 1997), sản xuất acetone, butanol và isopropanol
(Dürre P, 1998).
Trong công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy: trong công nghiệp sản xuất giấy
và bột giấy, nguyên liệu ban đầu được nghiền cơ học và xử lý hóa học để các sợi gỗ
được tách riêng khỏi nhau chuyển thành bột giấy chứa các sợi và bột mịn. Trong quy
trình sản xuất giấy cần loại bỏ lignin khỏi bột giấy, còn cellulose thì được giữ lại.
Phương pháp thông thường là bổ sung dung dịch chlor hoặc chlor diocide. Đây là một
phương pháp tốn kém và thường gây ô nhiễm môi trường do thành phần chlor tồn dư
trong nước thải. Vì thế, trong những năm gần đây một giải pháp mới được đưa ra để
thay thế phương pháp truyền thống, đó là sử dụng các chế phẩm enzyme trong đó có
glucanase để xử lý bột giấy. Glucanase thường được bổ sung vào công đoạn nghiền
bột giấy để làm thay đổi nhẹ cấu hình của sợi cellulose, tăng khả năng nghiền và tiết
kiệm khoảng 20% năng lượng cho quá trình nghiền cơ học. Đồng thời xử lý glucanase
trước khi xử lý hóa chất nghiền bột hóa học sẽ làm phá vỡ lớp vỏ ngoài của gỗ, làm

tăng khả năng khuếch tán của hóa chất vào phía trong gỗ, tăng hiệu quả khử lignin
(Hồ Sỹ Tráng, 2006). Đặc biệt trong công nghệ tái chế giấy, glucanase được sử dụng
để tẩy mực in bám trên giấy. Kỹ thuật này đã mở ra triển vọng đầy hứa hẹn cho ngành
công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy tái sinh (Howard và ctv, 2003).

6


2.3. Tình hình nghiên cứu enzyme β-glucanase
2.3.1. Một số nghiên cứu nước ngoài
Việc dòng hóa và biều hiện protein β-glucanase đã được nghiên cứu từ rất lâu.
Năm 1983 Cantwell và McConnell đã có nghiên cứu về tạo dòng và biểu hiện
gen β-glucanase trong tế bào Escherichia coli. Một trình tự gen của Bacillus subtilis
mã hóa cho trình tự enzyme β-1,3-glucanase được chuyển vào trong tế bào
Escherichia coli bằng cách sử dụng thực khuẩn thể λL47.1 và plasmid vectors. Gen
được gắn với vector pBR325 và pAT153 và đã được biểu hiện trong E. coli NK5772.
Hoạt tính của enzyme được kiểm tra bằng cách nuôi cấy vi khuẩn trên đĩa LB (10g
Bacto tryptone, 5 g yeast extractagar, 5 g NaCl, 12 g agar trong 1 lít chuẩn pH về 7,2 )
có bổ sung 0,1% (w/v) congo cho thấy sự biểu hiện hoạt tính của enzyme.
Năm 2001 Jiong Hong và các đồng sự đã tạo dòng gen β-glucanase từ
Aspergillu niger và biểu hiện trong nấm men. Một gen mã hóa cho enzyme
endon-1,4-glucanse có nguồn gốc từ Aspergillus niger được chuyển vào plasmid
YEGAp và biểu hiện trong tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae. Nghiên cứu
cho thấy enzyme tái tổ hợp được tạo ra có khả năng hoạt động tốt và được khảo sát
bằng cách thủy phân cơ chất CMC (carboxy methyl cellulor).
Năm 2005 Zhiwei Xu và các đồng sự đã tạo dòng và biểu hiện chức năng endoβ-glucanase ngoại bào từ Pichia pastoris. Trong nghiên cứu này trình tự gen mã hóa
cho β-1,3-glucanase từ chủng Pichia pastoris được chuyển vào vector pPICZ và được
biểu hiện trong tế bào nấm men Saccharomyces cerevisiae. Bằng cách sử dụng một
trình tự gen từ Pichia pastoris mã hóa cho cả đoạn protein chứa 414 amino acid trong
đó bao gồm chuỗi peptide tín hiệu (signal-peptide) ở đầu N (N-terminal) và họ mong

đợi sau khi protein trưởng thành sẽ cho ra một protein chứa 392 amino acid. Kết quả
nghiên cứu bước đầu cho thấy sự biểu hiện của của enzyme tái tổ hợp. Tiếp đó, chuỗi
peptide tín hiệu cũng được nghiên cứu bởi Montarop Yamabhai và các ctv năm 2007
về sự biểu hiện của enzyme chức năng của Bacillus spp. trong tế bào Escherichia coli.
Trong nghiên cứu này họ đã biểu hiện gen mã hóa cho enyme α-amylase từ vi khuẩn
Bacillus spp. gram dương có mang đoạn peptide tín hiệu và biểu hiên trong tế bào E.
coli. Kết quả của họ cho thấy khả năng tạo vòng thủy phân trên môi trường đĩa thạch
7


có bổ sung chitin. Từ những kết quả thu được từ thí nghiệm trong nghiên cứu, họ nhận
thấy khả năng peptide tín hiệu (signal peptide) ở Bacillus spp. có khả năng hoạt động
trong tế bào E. coli giúp cho enzyme tái tổ hợp α-amylase được vận chuyển ra ngoài
màng tế bào.
2.3.2. Những nghiên cứu trong nước
Tại Việt Nam việc nghiên cứu về β-glucanse đã được nghiên cứu nhiều nhưng
vẫn tập trung vào vấn đề phân lập và tinh chế các sản phẩm β-glucanase từ các chủng
sinh vật được phân lập từ tự nhiên. Trong khi đó việc nghiên cứu và sản suất enzyme
tái tổ hợp β-glucanase vẫn là một lĩnh vực khá mới chưa được quan tâm nghiên cứu và
ứng dụng nhiều.
2.4. Kỹ thuật tạo dòng và biểu hiện gen ngoại lai
2.4.1. Tạo dòng
Đây là quá trình hình thành một dòng tế bào chứa một hay nhiều bản sao của
DNA mục tiêu ở dạng tái tổ hợp với một vector. Mục đích của tạo dòng nhằm thu
nhận lượng lớn và tinh sạch DNA mục tiêu, thu nhận dòng tế bào biểu hiện gen mục
tiêu…Các bước cơ bản trong tạo dòng là: Đầu tên thu nhận và xử lý DNA mục tiêu.
Tiếp theo chọn và xử lý vector phù hợp. Sau đó tạo vector tái tổ hợp bằng các nối gen
mục tiêu vào vector nhận. Đưa vector tái tổ hợp vào dòng tế bào chủ và sau đó tiến
hành sàng lọc dòng tế bào mang vector tái tổ hợp.
2.4.2. Tế bào vi khuẩn E. coli dùng trong biểu hiện

E. coli là vi khuẩn được sử dụng phổ biến nhất để biểu hiện protein ngoại lai do
đặc tính di truyền, sinh học phân tử, sinh hóa và sinh lý của vi khuẩn đã được nghiên
cứ rất nhiều. Các hệ thống biểu hiện ở E. coli cũng rất phong phú. Việc lựa chọn hệ
thống biểu hiện gen ngoại lai ở E. coli lại phù hợp nhiều vào bản chất protein mục tiêu.
Và vector biểu hiện được thiết kế nhằm mục đích kiểm soát chặt chẽ sự biểu hiện của
gen được dòng hóa sao cho những gen này chỉ được biểu hiện vào một thời kỳ nhất
định trong chu kỳ tăng trưởng của tế bào. Vector biểu hiện được biến đổi một số đặc
điểm di truyền nhằm kiểm soát sự phiên mã dịch mã, độ biểu hiện của protein,… Biểu
hiện protein dung hợp với đuôi ái lực được sử dụng phổ biến cho nhiều mục đích mà
trong đó quan trọng nhất là làm tăng tính tan, dễ dàng phát hiện và tinh chế của protein
8


đích. Một trong những trình tự ái lực thường gặp là protein GST, protein His-Tag. Khi
biểu hiện trong tế bào chất của E. coli protein này vẫn giữ nguyên được các đặc tính
enzyme của nó.
2.4.3. Các kỹ thuật và vật liệu sử dụng trong tạo dòng
Kỹ thuật PCR: được mô tả bởi Mulis và ctv (1985) là kỹ thuật cho phép làm
tăng bội một đoạn DNA cần được nghiên cứu. Khác với sự tăng bội DNA qua sự tạo
dòng nhờ vi khuẩn, PCR được thực hiện in vitro (McPherson và Moller, 2000).
Nguyên tắc phản ứng PCR dùng để khuếch đại một trình tự DNA dựa trên phản ứng
tổng hợp dây chuyền nhờ hoạt động của enzyme DNA polymerase. Thành phần phản
ứng bao gồm: DNA khuôn mẫu, mồi, DNA polymerase, dNTP (dATP, dCTP, dGTP,
dTTP), dung dịch đệm cho phản ứng PCR. Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lặp đi lặp
lại nhiều lần. Mỗi chu kỳ gồm ba bước là biến tính, bắt cặp và kéo dài. Một trong
những DNA polymerase thông dụng cho PCR là Taq DNA polymerase, có nguồn gốc
từ loài Thermus aquatcus. Taq DNA polymerase có nhược điểm là thường gắn thêm
đuôi adenin và tỉ lệ sai sót tương đối cao. Vì thế để thu nhận gen người ta sử dụng
những DNA polymerase như Pfu DNA polymerase có nguồn gốc từ Pyrococcs
furiosus có khả năng sửa sai và sản phẩm khuếch đại được tạo ra có đầu bằng. Trong

một số trường hợp mồi của phản ứng PCR được gắn trình tự nhận biết của enzyme cắt
giới hạn (RE) ở đầu 5’ của mỗi mồi, sản phẩm PCR được tạo ra sau đó sẽ được xử lý
với enzyme cắt giới hạn để sử dụng trong việc tạo dòng.
Plasmid: được dùng phổ biến và thực hiện trong các phòng thí nghiệm về sinh
học phân tử. Trong tự nhiên plasmid có nhiều dạng có kích thước khác nhau từ vài
ngàn cặp base tới vài trăm kilobase. Thường các plasmid dùng trong cloning có kích
thước từ 2 – 5 kb. Plasmid là phân tử DNA vòng, xoắn đôi độc lập với tế bào vi khuẩn.
Chúng có khả năng mang một hoặc nhiều gen, thường là gen có ích cho vi khuẩn như
ampicillin giúp cho vi khuẩn tồn tại trên môi trường có kháng sinh này. Và đây cũng
được xem như một dấu hiệu để chọn lọc hay đặc điểm xác nhận sự hiện diện của gen
ngoại lai.

9


Hình 2.2. Mô hình plasmid sử dụng cho cloning (Brown, 1997)
Cấu trúc của plasmid bao gồm vùng ori giúp quá trình nhân nhanh về số lượng nhưng
không phụ thuộc vào nhiễm sắc thể của vi khuẩn chủ. Những plasmid nhỏ có thể sử
dụng genome của tế bào kí chủ cho việc nhân bản của nó, nhưng đối với plasmid lớn
chúng mang những gen mã hóa chuyên biệt giúp cho quá trình tái bản của chính nó.
Tuy nhiên một vài plasmid gắn vào nhiễm sắc thể của vi khuẩn vì vậy số lượng
plasmid được nhân lên cùng với sự phân chia tế bào vi khuẩn. Những plasmid hợp
nhất gọi là episome thường ổn định qua nhiều chu kỳ phân chia tế bào, nhưng trong
một giai đoạn nào đó plasmid cũng có thể ở dạng tự do. Phân loại plasmid dựa vào đặc
tính cơ bản mã hóa bởi gen của nó. Được chia làm 5 loại: thứ nhất là Fertility plasmid
chỉ mang gen tra có khả năng chuyển vị và tiếp hợp, Thứ hai là R plasmid (resistance)
mang gen mã hóa các hợp chất kháng lại chất kháng sinh giúp tế bào chủ tồn tại trong
môi trường sống. Thứ ba là Col plasmid tạo ra colycin gây chết vi khuẩn khác. Thứ tư
là Degradative plasmid giúp kí chủ tạo các chất sinh học có tính chất đặc biệt trong
điều nào đó như toluen, acid salycylyc. Thứ năm là Virulence plasmid xác định khả

năng gây bệnh của vi khuẩn chủ (Nguyễn Thị Lang và Bùi Chí Bửu, 2005).
Enzyme giới hạn (Restriction Enzyme-RE). Hiện tượng giới hạn và enzyme
giới hạn do Hamilton Smith phát hiện đầu tiên (1970) ở vi khuẩn Hemophilus
influenzae đặt tên là Hind II. Enzyme giới hạn thuộc nhóm enzyme endonuclease, cắt
các liên kết trong phân tử DNA. Các RE có đặc tính cắt DNA không đặc hiệu loài,
nghĩa là RE tách chiết từ vi khuẩn có thể cắt DNA của tế bào động vật, thực vật và vi
khuẩn khác ở cùng vị trí giới hạn hay điểm giới hạn. Số lượng và kích thước đoạn cắt
dài hay ngắn tuỳ thuộc vào số lượng điểm giới hạn trên phân tử DNA. Bản đồ trình tự
các vị trí cắt bởi enzyme giới hạn gọi là bản đồ giới hạn. Mỗi loại enzyme giới hạn chỉ
hoạt động tốt trong những điều kiện nhất định về nhiệt độ và dung dịch đệm thích hợp.

10


Tiến hành phản ứng của các enzyme giới hạn cần thực hiện trong một thể tích càng
nhỏ càng tốt để RE tiếp xúc tốt với cơ chất. Hiện nay phát hiện có hàng nghìn enzyme
giới hạn được ly trích từ vi khuẩn. Dựa vào khả năng nhận biết và cắt các trình tự đặc
hiệu khoảng 4 – 7 cặp nucleotide, người ta chia enzyme giới hạn làm ba loại. Loại thứ
nhất gồm các enzyme giới hạn nhận biết được trình tự đặc hiệu (vị trí giới hạn) di
chuyển dọc theo DNA, đến cách vị trí giới hạn khoảng 1000 – 5000 nucleotide cắt tại
đó và giải phóng độ vài chục nucleotide. Loại thứ hai gồm các enzyme giới hạn nhận
biết vị trí giới hạn cắt ngay tại đó. Loại này thường sử dụng nhiều trong kỹ thuật gen
và công nghệ DNA tái tổ hợp. Loại thứ ba gồm các enzyme giới hạn nhận biết vị trí
giới hạn và cắt ở vị trí cách đó khoảng 20 nucleotide về phía trước.
Các enzyme khử phosphoril hoá. Đó là các phosphatase kiềm, có vai trò loại
một nhóm phosphate ở đầu 5’ của chuỗi DNA. Người ta thường khử phosphoril hoá
vector vừa được mở bởi enzym giới hạn để tránh sự tự đóng lại của vector. Enzym loại
này thường được sử dụng là CIP (Calf intestinal alkalyne phosphatase), cấu trúc là một
dimer glycoprotein- xúc tác phản ứng cắt bỏ gốc phosphate từ phân tử DNA mạch
thẳng. Trong phản ứng của enzyme này cần có sự hiện diện của ion Zn2+ như là yếu tố

hoạt hoá. Sau khi phản ứng xảy ra bất hoạt enzym bằng cách thêm vào một lượng nhỏ
proteinase K và EDTA, sản phẩm khử phosphoril được tinh sạch lại bằng cách sử dụng
phenol:chloroform (Simsek và ctv, 1973).
Enzyme nối: Phản ứng nối giữa một đoạn phân tử DNA và vector đã mở vòng
bằng enzyme cắt giới hạn liên quan đến sự hình thành liên kết cộng hóa trị giữa gốc
phosphate và gốc hydroxyl của hai phân tử DNA mạch đôi liền kề. Sự hình thành liên
kết này có thể được xúc tác bởi enzyme T4 DNA ligase.
Tế bào khả nạp: Hiện tượng biến nạp đã được chứng minh lần đầu tiên năm
1928 trên vi khuẩn Streptococcus pneumoniae bởi Fred Griffiths và đến năm 1944 đã
được kiểm chứng lại bởi Avery và ctv. Chủng vi khuẩn mà Griffiths và Avery sử dụng
ở trạng thái khả nạp tự nhiên nên có khả năng hấp thu DNA có sẵn trong môi trường
sống. Đó là các DNA có nguồn gốc từ các tế bào chết hay các tế bào bị phân hủy. Kết
quả thu được là vi khuẩn thể hiện một vài tính trạng mới, ổn định và có khả năng di
truyền. Trạng thái khả nạp tự nhiên xuất hiện ở một vài loài vi khuẩn khi mà nồng độ
chất dinh dưỡng và hàm lượng oxy trong môi trường giảm xuống thấp. Thực tế khi
11


nghiên cứu biến nạp phải tiến hành xử lý tế bào để chúng ở trạng thái khả nạp, có khả
năng hấp thu DNA. Để tăng khả năng khả nạp của tế bào có hai phương pháp. Phương
pháp vật lý: Phương pháp này sử dụng xung điện tác động lên tế bào chủ từ đó gây nên
sự thay đổi trong cấu trúc tế bào và tính thấm ở màng. Ưu điểm của phương pháp này
là tiến hành nhanh chóng, tế bào sau xử lý có hiệu suất biến nạp cao. Phương pháp hóa
học. Là phương pháp sử dụng hoá chất xử lý tế bào (có thể kết hợp với nhiệt độ).
Phương pháp này thực hiện lâu, hệ số biến nạp của tế bào sau xử lý thấp hơn phương
pháp vật lý nhưng đơn giản và dễ thực hiện. Hiện nay để tạo tế bào E. coli khả nạp
theo các phương pháp hóa học, người ta có thể tiến hành theo 3 cách khác nhau. Thứ
nhất, phương pháp Hanahan, cho phép tạo những tế bào E. coli khả nạp có hiệu quả
biến nạp cao (5 x 108 khuẩn lạc/μg plasmid DNA). Thứ hai, phương pháp Inoue,
phưng pháp Inoue dễ lặp lại hơn phương pháp Hanahan và tạo ra các tế bào khả nạp có

hiệu quả biến nạp từ 1 x 108 đến 3 x 108 khuẩn lạc/μg plasmid DNA. Thứ ba, phương
pháp Calcium chloride, phương pháp này được phát triển từ hơn 30 năm qua và tạo ra
các tế bào khả nạp có hiệu quả biến nạp từ 5 x 106 đến 2 x 107 khuẩn lạc/μg plasmid
DNA. Thông thường, người ta xử lý tế bào vi khuẩn trong dung dịch muối lạnh của
kim loại hoá trị II như CaCl2, MgCl2, RbCl2. Việc biến nạp DNA plasmid vào E. coli
đạt hiệu quả cao hơn khi có sự hiện diện của ion Ca2+ ở nhiệt độ thấp (0 - 4oC). Ion
Ca2+ có thể gây ra những xáo trộn trên màng tế bào làm cho DNA xâm nhập tế bào E.
coli dễ dàng hơn. Giai đọan sốc nhiệt kế tiếp để kích thích sự chuyển của phân tử
DNA vào trong tế bào, môi trường dưỡng chất được thêm vào sau đó cho phép tế bào
phục hồi và DNA tiến hành sao mã, dịch mã để tạo ra các protein tương ứng.
Phương pháp đọc trình tự nucleotide của Sanger: phương pháp “sequencing” do
Sanger và ctv tìm ra năm 1977, họ dùng một DNA polymerase để tổng hợp một bản
sao có trình tự bổ sung từ dây nền của phân tử DNA. Mỗi dây đơn của DNA được tác
động với một mồi tương ứng trong phẩn ứng polymer. Trong phản ứng tổng hợp sợ bổ
sung, Dideoxynucleotide (ddNTP) là các deoxynukeotide đã được khử nhóm OH ở
3’.khi dideoxynucleotide gia nhập vào chuỗ, sự kéo dài chuỗi sẽ ngừng lại. Các
ddNTP được đánh dấu bằng đồng vị phóng xạ P32. Mỗi chương trình với một loại
ddNTP đều có phần chung đầu 5’ nhưng mỗi đầu có sự thay đổi chiều dài ở vị trí 3’.
Sau khi ủ DNA, trộn lại và làm nóng lên sau đó dùng diện di tách băng DNA với sợi

12


đơn DNA được đánh dấu phóng xạ. Mã trình tự có thể được đọc trực tiếp từ dấu hiệu
phóng xạ.
Giải trình tự bằng hệ thống tự động: Nguyên tắc chung của máy giải trình tự tự
động dựa trên phương pháp dideoxy. Máy đọc trình tự trên cả hai mạch đơn, do vậy có
thể phát hiện và giảm các nhầm lẫn do kỹ thuật. Cả hai loại primer xuôi và ngược đều
đực sử dụng để dọc cả hai mạch đơn DNA. Giải trình tự theo phương pháp tự động
không phải dùng chất phóng xạ mà sử dụng các chất huỳnh quang để đánh dấu DNA,

máy sequencer có thể phát hiện cùng lúc hiện tượng huỳnh quang ở bốn độ dài sóng
khác nhau (Bùi Chính Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999).

13


Chương 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Vật liệu và hóa chất
3.1.1. Dụng cụ và thiết bị
Thiết bị : Máy cất nước 1 lần, 2 lần (Anh); Máy li tâm (Sigma, Hettich); Máy ly
tâm lạnh -4oC (Hettich); Tủ mát (nhiệt độ 2 – 8oC), tủ lạnh -20oC và -80oC (trữ hóa
chất và mẫu) (Reetech, Brandt, Sanyo). Tủ ấm (Memmert, Đức). Bồn ủ nhiệt
(Memmert, Đức). Máy vortex (IKA Works). Máy lắc (Stuart); máy thực hiện phản ứng
PCR iCycler (Bio-Rad). Lò viba (National). Cân phân tích (Shimadzu). Bộ nguồn và
bồn điện di (Biorad). Máy đọc gel–GelDocX (Biorad). Bộ điện di protein (Biorad).
Máy chuyển gen bằng xung điện (Gene Pulser Xcell Total System, Mỹ). Máy đo OD
SmartSpecTM Plus (Bio-Rab). Tủ hút (Esco). Thiết bị làm nóng và ổn nhiệt (Heat
block)…
Dụng cụ: eppendorf thể tích 0,2 ml, 0,5 ml, 1 ml; đầu típ 10 μl, 100 μl, 1000 μl
(Nam khoa); micropipette 10 μl, 100 μl, 1000 μl (BioHit); ống đong 20 ml, 50 ml, 100
ml, 500 ml (Đức); ống nghiệm (Đức); đĩa petri nhựa (Nam Khoa); bình thủy tinh 100
ml, 200 ml, 500 ml (Đức); falcon 15 ml (Nam Khoa); que cấy; đèn cồn…
3.1.2. Hóa chất và môi trường
3.1.2.1. Hóa chất
 Hóa chất tách chiết vector: Sử dụng bộ kít tinh sạch DNA plasmid Wizard®SV
(Promega, Mỹ).
 Hóa chất tinh sạch vector và DNA sau khi điện đi: Sử dụng bộ kít Wizard® SV Gel
and PCR Clean-Up System (Promega, Mỹ).
 Bộ kít tinh sạch protein: MagneHis™ Protein Purification System (Promega, Mỹ).
 Hóa chất điện di agarose

Agarose (Promega, Mỹ).
Ethidium bromide 10 mg/ml (Sigma, Mỹ).

14


Dung dịch đệm TBE (10X): NaOH 1 g; Tris Base(AKA Trizma Base) 108 g;
Boric Acid 55 g; EDTA(disodium salt) 7,4 g. Thêm H2O cho đủ 1 liter.
Dung dịch nạp mẫu DNA (loading dye): 25 mg Bromophenol blue (0.25%);
25 mg xylenecyanol (0.25%); 4 g sucrose(40%). Thêm H2O cho đủ 10 ml.
Thang DNA: thang 1 Kb và thang 100 bp (Promegar, Mỹ).
 Hóa chất cho phản ứng cắt giới hạn và phản ứng nối
Enzyme BamHI, NEBuffer 3 (10X) và BSA (100X) (New England Biolabs,
Mỹ).
Enzyme T4 ligase và buffer ligase (10X) (Promega, Mỹ).
 Hóa chất biến nạp
Dung dịch CaCl2, dung dịch glycerol (Promega, Mỹ).
 Hóa chất PCR
Pfu polymerase, Buffer Pfu polymerase (10X) (Promega, Mỹ).
GoTaq® Flexi DNA polymerase, GoTaq® Flexi Buffer (5X), Magnesium
chloride (MgCl2) (Promega, Mỹ).
Nucleotides (dNTPs): Pha nồng độ gốc 25 mM mỗi loại thành dung dịch hoạt
động ở 10 mM trong mỗi loại (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) (Promega, Mỹ).
Bảng 3.1 Các cặp mồi sử dụng trong nghiên cứu.
Tên Mồi
Trình tự mồi
Signal-glu-F
Glu-F
Glu-R
pQE-Ec-R

pQE-Ec-F

5’-TAC GTG GAT CCA TGT TTT ATC GTA TGA AAC G-3’
5’-CGT GGA TCC CAA ACA GGC GGA TCG T-3’
5’- CGT GGA TCC TTT TTT TGT ATA GCG CA-3’
5’-TGG ATC TAT CAA CAG-3’
5’-CCC GAA AAG TGC CAC CTG-3’

 Hóa chất điện di protein
Dung dịch đệm điện di protein (10X SDS-PAGE): Tris Base 15 g, SDS 5 g,
glicine 72 g, thêm nước vừa đủ 500 ml.

15