BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
****************

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH MỘT SỐ GIỐNG VI KHUẨN
LACTIC CÓ TRONG TUNG LỌ MỌ

Họ và tên: Đoàn Thị Kim Phúc
Ngành: Bảo Quản và Chế Biến Nông Sản Thực Phẩm
Niên khóa: 2007 - 2011

Tháng 08/2011


PHÂN LẬP VÀ ĐỊNH DANH MỘT SỐ GIỐNG VI KHUẨN LACTIC CÓ
TRONG TUNG LỌ MỌ

Tác giả

Đoàn Thị Kim Phúc

Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp bằng Kỹ sư ngành
Bảo quản và chế biến nông sản thực phẩm

Giáo viên hướng dẫn: TS. VŨ THỊ LÂM AN và TS. TRƯƠNG THANH LONG

Tháng 08/2011
i

LỜI CẢM TẠ
Với tấm lòng biết ơn của một người con, xin gởi đến Cha Mẹ những gì tốt đẹp
nhất – Người đã sinh thành và nuôi dạy con từ thuở ấu thơ cho đến con có được ngày
hôm nay.
Với tấm lòng kính trọng của một người học trò, em xin chân thành cảm ơn Quý
Thầy Cô Trường Đại học Nông Lâm, đặc biệt là Quý Thầy Cô Khoa Công Nghệ Thực
Phẩm đã tận tâm dạy bảo em trong những năm qua, truyền đạt những kiến thức quý
báu làm hành trang cho em bước vào đời.
Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc và chân thành nhất đến Cô Vũ Thị Lâm An và
Thầy Trương Thanh Long đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ và truyền đạt kinh nghiệm
quý báu cho em trong suốt quá trình thực hiện đề tài.
Em xin chân thành cám ơn Quý Thầy Cô phòng Thí Nghiệm Vi Sinh, Hóa Sinh
và Xưởng Chế Biến Thịt Cá, khoa Công Nghệ Thực Phẩm đã tạo điều kiện thuận lợi
và quan tâm giúp đỡ để em hoàn thành đề tài này.
Xin gửi đến những người thân yêu và các bạn lớp DH07BQ, DH07VT,
DH07DD lời cảm ơn sâu sắc.
Xin chân thành cảm ơn!

Đoàn Thị Kim Phúc

ii


TÓM TẮT
Đề tài “Phân lập và định danh một số giống vi khuẩn lactic có trong Tung lọ
mọ” được thực hiện từ ngày 07/03/2010 đến 01/07/2010 tại phòng Thí Nghiệm Vi
Sinh, Hóa Sinh và Xưởng Chế Biến Thịt Cá thuộc khoa Công Nghệ Thực Phẩm
trường Đại học Nông Lâm, thành phố Hồ Chí Minh. Nghiên cứu này nhằm mục đích
định ra chủng vi khuẩn lactic có lợi rồi bổ sung lại vào Tung lọ mọ. Qua đó hi vọng sẽ

chủ động quá trình lên men, cải thiện chất lượng sản phẩm.
Việc phân lập vi khuẩn lactic (LAB) từ Tung lọ mọ có 16 mẫu LAB (phân
thành bốn nhóm A, B, C, D) được phân lập từ ba lần sản xuất khác nhau. Các chủng
đại diện được chọn ngẫu nhiên từ mỗi nhóm để định danh. Kết quả định danh bằng kỹ
thuật giải trình tự gen 16S rRNA của 3 chủng LAB được chọn tại Phòng xét nghiệm
NK – BIOTEK, 793/58 Trần Xuân Soạn, phường Tân Hưng, quận 7 là Lactobacillus
fermentum ở hai mẫu và Weissella cibaria ở một mẫu.
Tiến hành khảo sát ảnh hưởng của việc cấy riêng lẻ hai chủng W. cibaria và Lb.
fermentum phân lập được và tổ hợp của chúng đến pH và thời gian lên men Tung lọ
mọ. Kết quả cho thấy pH Tung lọ mọ giảm dần tới ngày thứ ba và sau đó có sự tăng
trở lại vào ngày thứ tư. Trong đó pH của mẫu bổ sung Lb. fermentum hoặc tổ hợp W.
ciabaria và Lb. fermentum lên men ở ngày thứ ba là thấp nhất.
Chúng tôi cũng tiến hành khảo sát ảnh hưởng của việc cấy riêng lẻ hai chủng
W. cibaria và Lb. fermentum phân lập được và tổ hợp của chúng đến cảm quan Tung
lọ mọ sau 3 ngày lên men. Tung lọ mọ bổ sung tổ hợp W. cibaria và Lb. fermentum là
được người thử ưa thích nhất.

iii


MỤC LỤC
Trang
Trang tựa........................................................................................................................ i
Lời cảm ơn .................................................................................................................... ii
Tóm tắt ......................................................................................................................... iii
Mục lục ........................................................................................................................ iv
Danh sách các bảng .................................................................................................... vii
Danh sách các hình .................................................................................................... viii
Bảng viết tắt ................................................................................................................. ix
CHƯƠNG 1: MỞ ĐẦU ...............................................................................................1

1.1 Đặt vấn đề ...............................................................................................................1
1.2 Mục đích và nội dung ............................................................................................2
CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN .......................................................................................3
2.1 Giới thiệu các sản phẩm thịt cổ truyền ...............................................................3
2.2 Hệ vi sinh vật trong thịt lên men ..........................................................................3
2.2.1 Trong nem chua .................................................................................................3
2.2.2 Trong lạp xưởng lên men ...................................................................................4
2.3 Khái quát về vi khuẩn lactic và lên men lactic ...................................................4
2.3.1 Vi khuẩn lactic ...................................................................................................4
2.3.2 Lên men lactic ....................................................................................................8
2.4 Khái quát về các phương pháp phân lập LAB ...................................................9
2.4.1 Phương pháp phân lập LAB truyền thống .........................................................9
2.4.2 Phương pháp phân lập LAB hiện đại...............................................................10
CHƯƠNG 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .........................13
3.1 Thời gian và địa điểm nghiên cứu ......................................................................13
3.2 Vật liệu và phương pháp nghiên cứu .................................................................13
3.2.1 Nguyên vật liệu thí nghiệm..............................................................................13
3.2.2 Môi trường và thiết bị phân tích ......................................................................13
3.2.2.1 Môi trường và thuốc thử ...........................................................................13
3.2.2.2 Dụng cụ.....................................................................................................13
iv


3.2.2.3 Thiết bị ......................................................................................................14
3.3 Nội dung nghiên cứu ...........................................................................................14
3.4 Phương pháp nghiên cứu ....................................................................................14
3.4.1 Phân lập chủng LAB thuần ..............................................................................14
3.4.1.1 Phương pháp lấy mẫu ...............................................................................14
3.4.1.2 Đồng nhất mẫu..........................................................................................14
3.4.1.3 Pha loãng mẫu ..........................................................................................14

3.4.1.4 Nuôi cấy dịch mẫu ....................................................................................15
3.4.1.5 Tăng sinh ..................................................................................................15
3.4.1.5 Ria .............................................................................................................15
3.4.2 Tiến hành định danh ........................................................................................16
3.4.2.1 Định danh sơ bộ LAB phân lập được .......................................................16
3.4.2.2 Định danh LAB phân lập được.................................................................16
3.4.3 Thử nghiệm sản xuất Tung lọ mọ sử dụng các chủng LAB phân lập được ....16
3.4.3.1 Chuẩn bị giống khởi động .......................................................................16
3.4.3.2 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của việc cấy riêng lẻ hai chủng
W. cibaria và Lb. fermentum phân lập được và tổ hợp của chúng đến pH và
thời gian lên men Tung lọ mọ .............................................................................17
3.4.3.3 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của việc cấy riêng lẻ hai chủng
Weissella cibaria và Lb. fermentum phân lập được và tổ hợp của chúng đến
cảm quan Tung lọ mọ sau 3 ngày lên men ..........................................................18
3.5 Kỹ thuật đo pH ....................................................................................................18
3.6 Xử lý thống kê số liệu thu được ..........................................................................19
CHƯƠNG 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...........................................................20
4.1 Kết quả gởi mẫu định danh ................................................................................20
4.2 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của việc cấy riêng lẻ hai chủng Weissella cibaria và Lb. fermentum phân lập được và tổ hợp của chúng đến pH và
thời gian lên men Tung lọ mọ .....................................................................................23
4.3 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của việc cấy riêng lẻ hai chủng Weissella cibaria và Lb. fermentum phân lập được và tổ hợp của chúng đến cảm
quan Tung lọ mọ sau 3 ngày lên men ..........................................................................31
v


CHƯƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ................................................................33
5.1 Kết luận ................................................................................................................33
5.2 Đề nghị ..................................................................................................................33
TÀI LIỆU THAM KHẢO.........................................................................................34
PHỤ LỤC ...................................................................................................................40


vi


DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT
aw

Hoạt độ nước

ctv

Cộng sự

DC

Đối chứng

DNA

Deoxyribonucleic Acid

GRAS

Generally Regarded As Safe

LAB

Lactic Acid Bacteria

L1


Weissella cibaria

L2

Lactobacillus fermentum

L1L2

Weissella cibaria và Lactobacillus fermentum

MRS

De Man, Rogosa and Sharpe

PCR

Polymerase Chain Reaction

PE

Polyethylene

PFGE

Pulsed Field Gel Electrophoresis

RAPD

Random Amplified Polymorphic DNA


vii


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Trang
Bảng 2.1: Đặc điểm của một vài loài thuộc giống Lactobacillus .................................. 3
Bảng 3.1: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 1 .............................................................................17
Bảng 4.1: Những tính chất hình thái và sinh hóa của 16 chủng LAB phân lập được
từ Tung lọ mọ ...............................................................................................................21
Bảng 4.2: Sự khác biệt về mức độ ưa thích giữa các mẫu DC, L1, L2 và L1L2 ........ 32

viii


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1: Sơ đồ lên men lactic .....................................................................................8
Hình 3.1: Quy trình sản xuất Tung lọ mọ thử nghiệm ...............................................41
Hình 3.2: Các bước chuẩn bị giống khởi động ...........................................................45
Hình 3.3: Quy trình sản xuất Tung lọ mọ thử nghiệm có bổ sung vi sinh vật ...........46
Hình 4.1: Hình thái tế bào của các nhóm LAB ..........................................................22
Hình 4.2: Thay đổi pH của Tung lọ mọ trong 4 ngày lên men ..................................23
Hình 4.3: Quan hệ giữa pH và thời gian lên men của Tung lọ mọ.............................25
Hình 4.4: Quan hệ giữa pH và các ngày lên men của mẫu L1, L2, L1L2 so với mẫu
DC ................................................................................................................................26
Hình 4.5: So sánh pH Tung lọ mọ thử nghiệm giữa các mẫu DC, L1, L2
và L1L2 lên men ở ngày 0 ...........................................................................................27
Hình 4.6: So sánh pH Tung lọ mọ thử nghiệm giữa các mẫu DC, L1, L2
và L1L2 lên men ở ngày 1 ..........................................................................................28

Hình 4.7: So sánh pH Tung lọ mọ thử nghiệm giữa các mẫu DC, L1, L2
và L1L2 lên men ở ngày 2 ..........................................................................................29
Hình 4.8: So sánh pH Tung lọ mọ thử nghiệm giữa mẫu DC, L1, L2 và
L1L2 lên men ở ngày 3................................................................................................29
Hình 4.9: So sánh pH Tung lọ mọ thử nghiệm giữa mẫu DC, L1, L2 và
L1L2 lên men ở ngày 4................................................................................................30

ix


Chương 1
MỞ ĐẦU
1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ
Tung lọ mọ là lạp xưởng bò lên men truyền thống của người Chăm ở tỉnh An
Giang được làm từ thịt bò, mỡ bò và ruột bò (người Chăm theo Hồi Giáo không ăn thịt
heo nên làm lạp xưởng bằng thịt bò). Phần lớn Tung lọ mọ được sản xuất ở qui mô hộ
gia đình theo phương thức lên men tự nhiên nên chất lượng sản phẩm không ổn định
và không kiểm soát được quá trình lên men.
Việc thêm giống khởi động đã được giới thiệu và trở nên phổ biến trong sản
xuất nhiều loại lạp xưởng lên men (Andrighetto và ctv., 2001). Trong việc sản xuất thủ
công của lạp xưởng lên men truyền thống, có tầm quan trọng của việc sử dụng giống
khởi động gồm lactobacilli được phân lập từ sản phẩm và bổ sung trở lại vào sản
phẩm, do đó thật sự phù hợp với sản phẩm và công nghệ sản xuất (Papa và Grazia,
1990).
Việc sử dụng giống khởi động giúp định hướng quá trình lên men nhờ ức chế
những chủng không cần thiết, chất lượng sản phẩm ổn định và mùi vị phù hợp với thị
hiếu người tiêu dùng. Mặt khác, với những lượng vi sinh vật bổ sung khác nhau có thể
rút ngắn thời gian lên men.
Tung lọ mọ là sản phẩm truyền thống chủ yếu dựa vào quá trình lên men tự
nhiên và sản phẩm chỉ cung cấp cho một bộ phận nhỏ người dân xã Châu Phong,

huyện Tân Châu, tỉnh An Giang. Hiện nay, tỉnh An Giang đang được nhà nước kêu gọi
đầu tư “Dự án chăn nuôi và chế biến thịt bò (VN - 02 - 141)” tại hai huyện miền núi
Tri Ôn và Tịnh Biên với qui mô dự kiến là trại chăn nuôi tập trung lên đến 10.000 15.000 con bò và đầu tư xây dựng nhà máy chế biến thịt bò có công suất 1.500 - 2.000
tấn/năm (do Sở Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn Tỉnh An giang lập dự án). Dựa
vào nguồn nguyên liệu dồi dào và mong muốn giới thiệu một nét văn hóa ẩm thực đặc
trưng của người Chăm, chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: “Phân lập và định danh
một số giống vi khuẩn lactic có trong Tung lọ mọ”.

1


1.2 MỤC ĐÍCH VÀ NỘI DUNG
Đề tài này được thực hiện nhằm mục đích định ra chủng vi khuẩn lactic có lợi
rồi bổ sung lại vào Tung lọ mọ. Qua đó hi vọng sẽ chủ động quá trình lên men, cải
thiện chất lượng sản phẩm với các mục tiêu:
 Phân lập ra chủng vi khuẩn lactic thuần.
 Tiến hành định danh.
 Thử nghiệm sản xuất Tung lọ mọ sử dụng những chủng vi khuẩn lactic phân
lập được.

2


Chương 2
TỔNG QUAN
2.1 GIỚI THIỆU CÁC SẢN PHẨM THỊT CỔ TRUYỀN
Công nghệ chế biến thịt ở Châu Âu và Châu Mỹ đã bắt đầu từ hàng thế kỷ trước
với các sản phẩm thịt lên men. Các thí dụ là các jambon tươi lên men như Parma hams
(Italy), jamon serrano (Tây Ban Nha). Xúc xích khô lên men như là salami Ý và
Hungary hay chorizo Tây Ban Nha chỉ làm bằng thịt heo hoặc hỗn hợp thịt heo, bò và

mỡ heo. Argentina cũng có salame là xúc xích tươi lên men được làm từ mỡ heo, thịt
bò và ruột heo, quá trình làm chín và lên men trong phòng lạnh.
Ở Trung Quốc có chế biến thịt đùi tươi lên men (Jinhua hams) là sản phẩm cổ
truyền được lên men để gia tăng độ bền và đạt được hương vị mong muốn.
Nhiều quốc gia Đông Nam Á chế biến nem, là hỗn hợp thịt nạc heo xay với da
heo nấu cắt sợi, phối trộn muối, tiêu đen và tỏi, gói trong lá chuối với một lượng nhỏ
và lên men ở nhiệt độ phòng.
Ở tỉnh An giang (Việt Nam) có sản phẩm truyền thống là Tung lọ mọ được làm
hoàn toàn từ thịt bò, mỡ bò và ruột bò. Thịt đùi được lóc bỏ hết gân với mỡ bò được
rửa sạch, cắt hạt lựu phối trộn với muối, đường và bột ngọt rồi nhồi vào ruột bò sạch.
Sau 3 ngày lên men, sản phẩm bảo quản trong ngăn mát tủ lạnh được một tuần. Tung
lọ mọ có vị chua, hăng mùi bò đặc trưng, có thể chiên hoặc nướng trước khi ăn.
2.2 HỆ VI SINH VẬT TRONG THỊT LÊN MEN
2.2.1 Trong nem chua
Kết quả định danh vi sinh vật có lợi hiện diện trong nem chua bằng bộ kít API
50 CH của BioMérieux (Pháp) là Lb. acidophilus, Lb. plantarum, Lb. coprophilus, Lb.
delbrueckii, Lb. cellobiosus, Lb. leichmanic và Leuconostoc mesenteroides (Nguyễn
Thanh Khương, 2004; Trịnh Phương Nam, 2005).

3


Lý Ngọc Quí (2006) cũng đã định danh Lactobacillus trên nem chua Lai Vung
nhờ vào bộ kít API 50 CH của BioMérieux (Pháp) cho kết quả là Lb. fermentum, Lb.
paracasei spp paracasei, Lb. plantarum, Lb. cellobiosus, Lb. collinoides và Lb. brevis.
2.2.2 Trong lạp xưởng lên men
Kết quả nghiên cứu về đặc tính của lactobacilli bằng RAPD – PCR được phân
lập từ lạp xưởng lên men truyền thống ở vùng Veneto (Italy), cho thấy có sự hiện diện
của Lb. curvatus, Lb. paracasei subsp tolerans, Lb. paracasei subsp paracasei, Lb.
lantarum và Lb. sakei (Andrighetto và ctv., 2001).

Phân lập và định danh vi khuẩn lactic từ hai loại lạp xưởng khô lên men tự
nhiên ở Hy Lạp cho thấy 90% là lactobacilli, 4% enterococci, 3% Pediococcus spp và
còn lại là các chủng Weissella viridescens, Leuconostoc pseudomesenteroids và
Leuconostoc spp (Papanomali và ctv., 2003).
2.3 KHÁI QUÁT VỀ VI KHUẨN LACTIC VÀ LÊN MEN LACTIC
2.3.1 Vi khuẩn lactic
Vi khuẩn lactic (LAB) là nhóm vi khuẩn Gram dương, không di động, không
sinh bào tử, dạng cầu hoặc trực, sản xuất acid lactic là sản phẩm chính cuối cùng trong
suốt quá trình lên men carbohydrate, gồm khoảng 20 giống. Các giống được coi là
LAB

chính

là:

Aerococcus,

Carnobacterium,

Enterococcus,

Lactobacillus,

Lactococcus, Leuconostoc, Oenococcus, Pediococcus, Streptococcus, Vagococcus,
Tetragenococcus và Weissella (Axelsson, 2004). Đặc điểm của một vài loài thuộc
giống Lactobacillus được trình bày ở Bảng 2.1.

4



5

Ho
FH
FH
FH
FH
He
He
He
He
He

CP
CP
CP
CP
CP
CP
CP
CP
Ln

FH

D
CP

Ho


D

Ho

Ho

D
D

biến dưỡng

kiểu hình

+

+

-

V

+

+

+

+

+


+

-

-

-

-

15 oC

-

-

+

V

-

-

-

-

V


-

-

+

+

+

45 oC

triển

Nhiệt độ phát

-

-

+

V

V

+

+


+

+

+

-

+

-

+

Galactose

-

+

+

V

V

+

+


V

-

+

-

+

+

+

Lactose

-

+

+

+

+

+

+


+

V

+

V

V

-

+

Maltose

-

+

+

+

+

+

+


+

-

-

V

-

-

-

Ribose

Khả năng lên men

-

-

+

V

V

+


+

-

-

+

-

-

-

+

Sucrose

-

+

+

+

+

+


+

+

+

-

-

-

-

-

Gluconate

(Nguồn: Dellaglio, 1994 ; Stiles và Holzapfel, 1997 trích dẫn bởi Limsowtin và ctv., 2002).

Dạng lên men: Ho (đồng hình), FH (dị hình tùy nghi), He (dị hình bắt buộc).

Nhóm kiểu hình: D (Lb. brueckii); CP (Lb. casei-Pediococcus); Ln (Leuconostoc); Khả năng sử dụng đương: + (dương tính), - (âm tính), V (thay đổi nhiều).

Lb. fructosus

Lb. kefir

Lb. fermmentum


Lb. buchneri

Lb. brevis

Lb. sake

Lb. plantarum

Lb. curvatus

Lb. casei

Lb. farcimnis

Lb. acetotolerans

Lb. helveticus

subsp . bulgaricus

Lb. delbrueckii

Lb. acidophilus

Nhóm

Nhóm

Bảng 2.1: Đặc điểm của một vài loài thuộc giống Lactobacillus



Các vi khuẩn lactic đóng vai trò chủ yếu trong việc sản xuất sản phẩm thịt lên
men và là một trong các vi sinh vật được nghiên cứu nhiều nhất. Lactobacillus là
giống chính được sử dụng trong sản phẩm lên men. Để đảm bảo chất lượng cảm quan
và màu sắc tốt, chỉ LAB là không đủ và sự đóng góp của Staphylococcus carnosus là
cần thiết. Một vài lactobacilli có khả năng sản xuất chất kháng khuẩn bacteriocin. Các
ứng dụng của vi khuẩn sinh chất kháng khuẩn bacteriocin như là một giống khởi động
trong lên men sản phẩm có thể cung cấp thêm một công cụ để ngăn chặn sự phát triển
của vi khuẩn gây bệnh trong lạp xưởng, cũng như nâng cao khả năng cạnh tranh của
giống khởi động có lợi. Phổ ứng dụng của LAB là rất rộng, lactobacilli là ứng viên tốt
như là chủng probiotic nhờ tình trạng “generally regarded as safe” (GRAS) của chúng.
Trong tương lai gần, lactobacilli probiotic được bổ sung vào nhiều sản phẩm mới và
sản phẩm thịt lên men là một ví dụ (Hugas và Monfort, 1996).
LAB sản sinh acid lactic làm giảm pH trong thực phẩm lên men chứa
carbohydrate, có thể ngăn chặn hoặc giết chết những vi khuẩn gây hư hại và gây bệnh
(Limsowtin và ctv., 2002; Heinz và Hautzinger, 2007; Vương Thị Việt Hoa, 2009).
Các vi khuẩn lactic được phân lập từ lạp xưởng khô lên men như Lb. sakei, Lb.
curvatus và Lb. plantarum là thường được sử dụng để chế biến lạp xưởng với các công
nghệ khác nhau (Hammes và ctv., 1990; Morishia và Shiromizu, 1986; Schillinger và
Lücke, 1987). Do đó, việc chọn những chủng vi khuẩn lactic từ sản phẩm truyền thống
dựa trên tiêu chuẩn kỹ thuật quan trọng như là đặc tính probiotic để có được các giống
thích nghi tốt hơn những vi sinh vật khác có trong sản phẩm thịt lên men đó là rất cần
thiết (Papanomali và ctv., 2003).
Vai trò vi khuẩn lactic trong thịt lên men:
Lạp xưởng lên men gồm thịt và mỡ cắt nhỏ trộn với muối nitrite (nitrate) và gia
vị, được nhồi vào vỏ bọc lên men một thời gian và tiến hành sấy. Sản phẩm cuối cùng
bảo quản tốt và tăng thời hạn sử dụng nhờ hiệu quả ngăn chặn vi khuẩn gây bệnh và
hư hỏng phát triển. Trong sản phẩm thịt lên men tự nhiên, LAB nhiễm vào từ nguyên
liệu và môi trường sinh acid làm giảm pH và tiến gần điểm đẳng điện của protein làm

sản phẩm có độ liên kết chặt và quá trình chín cũng xảy ra. Sự phát triển màu sắc của
sản phẩm cũng diễn ra trong điều kiện acid khi nitric oxide phản ứng với myoglobin.
Cuối cùng, hiệu quả ức chế vi khuẩn gây bệnh và hư hỏng là nhờ sự tích tụ acid lactic
6


cũng như acid acetic, acid formic, ethanol, ammonium, acid béo, hydrogen peroxide,
acetaldehyde, antibiotics và bacteriocins (Hugas và Monfort, 1996).
Việc ổn định thịt trong xúc xích lên men có thể được thực hiện bằng cách thêm
muối để ngăn ngừa vi sinh vật hiếu khí ưa lạnh gây hư hỏng như loài Pseudomonas
spp phát triển do sự giảm hoạt độ nước (Vương Thị Việt Hoa, 2009). Trong điều kiện
hoạt độ nước giảm vi khuẩn lactic vẫn chịu được và sinh nhiều acid lactic, làm giảm
pH (Vương Thị Việt Hoa, 2009; Andrighetto và ctv., 2001). Môi trường có pH thấp sẽ
ngăn ngừa vi khuẩn đường ruột, Clostridium spp và Bacillus spp phát triển (Vương
Thị Việt Hoa, 2009).
Lactobacillus fermentum là vi khuẩn Gram dương, không sinh bào tử, không di
động, catalase âm, liên quan đến hoạt động tổn thương răng nhưng được sử dụng rộng
rãi trong công nghiệp lên men như là một giống khởi động trong công nghiệp sữa
(Dickson và ctv., 2005). Lb. fermentum là vi khuẩn lên men lactic dị hình bắt buộc,
phát triển ở nhiệt độ khoảng 45 oC, sử dụng các đường galactose, lactose, maltose,
ribose, sucrose và gluconate và sinh acid lactic dạng DL. Lb. fermentum còn liên quan
tới quá trình chín pho mát và lên men rau quả (Limsowtin và ctv., 2002).
Sự phân loại kiểu hình của vi khuẩn trong giống Weissella đã được làm rõ trong
năm 1990 (Martinez và Collins, 1990 trích dẫn bởi Dickson và ctv., 2005) và sự phân
loại của Weissella đã được đánh giá thêm trong năm 1993 (Collins và ctv., 1993 trích
dẫn bởi Dickson và ctv., 2005). Weissella là vi khuẩn Gram dương, dạng cầu trực, lên
men dị hình, catalase âm, sản xuất acid lactic dạng D hoặc đồng phân dạng DL là sản
phẩm chính cuối cùng của quá trình lên men (Jang và ctv., 2002).
Weissella đã được phân lập từ nhiều nguồn khác nhau và một số đóng vai trò
quan trọng trong quá trình lên men như kết quả phân lập và định danh vi khuẩn lactic

từ dâu tằm ở Đài Loan của Chen và ctv (2010): Weissella cibaria là loại LAB được
tìm thấy nhiều nhất trong bốn trang trại dâu tằm, trong khi Lactobacillus plantarum
chiếm đa số trong các trang trại còn lại. Trong nghiên cứu này, Chen và ctv (2010)
không chỉ tập trung vào sự phân bố của LAB trong các trang trại dâu, mà còn tập trung
vào khả năng sản xuất bacteriocin của các chủng phân lập được. Tổng cộng có 11
chủng, trong đó có 10 chủng W. cibaria và 1 chủng L. lactis subsp. lactis cho thấy khả
năng ức chế chủng L. sakei JCM 1157.
7


Weissella cibaria 110 được phân lập từ cá lên men ở Thái Lan cũng được
chứng minh là sinh Weissellicin 110. Weissellicin 110 là bacteriocin mới, trình tự các
peptide không giống với các bacteriocin khác được biết đến nên được gọi là
Weissellicin 110 (Srionnual S. và ctv., 2007).
Ngoài ra, Weissella cũng đã được phân lập từ nhiều loại thực phẩm và mẫu thịt
như từ bột ngô lên men, bột mì nhào lên men truyền thống ở Hy Lạp (Ampe và ctv.,
1999; Corsetti và ctv., 2001) hay thịt lên men (Samelis và ctv., 1998).
2.3.2 Lên men lactic
“Lên men lactic là quá trình chuyển hóa đường thành acid lactic nhờ vi sinh
vật” (Lương Đức Phẩm, 2000). Theo Erickson và ctv (2004) lên men là quá trình
chuyển hóa sinh học kỵ khí mà vi khuẩn lactic sử dụng đường tạo thành acid lactic
(được trình bày qua Hình 2.1). Năm 1780, nhà bác học Thụy Điển Schaele lần đầu tiên
đã tách được acid lactic từ sữa bò lên men. Năm 1857, Pasteur đã chứng minh rằng sữa
chua là kết quả hoạt động của một nhóm vi sinh vật đặc biệt gọi là vi khuẩn lactic.
Năm 1878, Lister đã phân lập thành công vi khuẩn lactic và đặt tên là Bacterium lactis,
nay gọi là Streptococcus lactis.

Hình 2.1: Sơ đồ lên men lactic

8



Theo Limsowtin và ctv (2002) có 3 dạng lên men lactic như sau:
Vi khuẩn lên men lactic đồng hình: những loài này chuyển hóa hexose qua con
đường Embden – Meyerhof, và chỉ tạo thành acid lactic hoặc acid lactic là sản phẩm
cuối cùng chiếm ưu thế lớn trong điều kiện lên men đặc thù. Chúng không sử dụng
pentose hoặc gluconate. Một số loài có tầm quan trọng lớn trong pho mát, sữa chua và
thức uống probiotic như Lb. delbrueckii, Lb. helveticus, Lb. acidophilus,…
Vi khuẩn lên men lactic dị hình tùy nghi: những loài này cũng chuyển hóa
hexose qua con đường Embden – Meyerhof, nhưng pentose và một vài chất nền khác
được chuyển hóa theo con đường phosphoketolase, tạo ra acid lactic và các sản phẩm
khác thường là acid acetic, ethanol. Một số loài liên quan tới thực phẩm lên men và ủ
chua như Lb. casei, Lb. paracasei, Lb. plantarum, Lb. rhamnosus, …
Vi khuẩn lên men lactic bắt buộc: những loài này chỉ sử dụng đường qua con
đường phosphoketolase và acid lactic không phải là sản phẩm duy nhất cuối cùng mà
có một lượng đáng kể acid acetic và ethanol với CO 2 . Chúng được tìm thấy trong dạ
dày và thực phẩm, đặc biệt trong pho mát, như Lb. fermentum (liên quan tới quá trình
chín pho mát và lên men rau quả), Lb. kefiri (lên men sữa), Lb. sanfranciscensisi (lên
men bột bánh mì), Lb. hilgardii (rượu vang có độ cồn cao), …
2.4 KHÁI QUÁT VỀ CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP LAB
2.4.1 Phương pháp phân lập LAB truyền thống
Mẫu được tiến hành đồng nhất, pha loãng và cấy lên môi trường MRS thạch.
Chọn khuẩn lạc trên đĩa cấy, tăng sinh trên MRS lỏng và khuẩn lạc thuần sau khi ria
nhiều lần trên MRS thạch. Sau đó tiến hành định danh sơ bộ (cơ chế và dấu hiệu nhận
biết phản ứng của phương pháp phân lập LAB truyền thống được trình bày ở Phụ lục
1):
Nhuộm Gram
Phản ứng catalase
Thử nghiệm tính di động
Thử nghiệm khả năng lên men

Định danh bằng bộ kít API 50 CH: API 50 CH là một hệ thống tiêu chuẩn, liên
quan đến 50 phản ứng hóa học cho nghiên cứu khả năng thủy phân carbohydrate của
vi sinh vật. Trong suốt quá trình ủ, sự lên men được phát hiện bởi sự thay đổi màu sắc
9


trong ống do sự sản sinh acid và phát hiện bởi chất chỉ thị pH có mặt trong ống đó
(Biomerieux, 2002).
Các đặc tính hình thái, sinh lý và sinh hóa trên bộc lộ hạn chế do các đặc tính
được dùng cho nhóm vi sinh vật này nhưng lại không có ý nghĩa đối với nhóm khác,
và có thể gen quyết định phản ứng sinh hóa nằm trong plasmid lại bị mất do nhiều
nguyên nhân khác nhau như tuổi tế bào, lượng giống cấy hay những thay đổi trong quy
trình nuôi cấy dẫn đến sai khác và làm sai kết quả. Mặt khác, mỗi bộ kit chỉ cho phép
định danh được một số vi sinh vật, chi phí thử nghiệm đắt tiền hơn,… như API 50
CHL được dùng để nhận dạng Lactobacillus và API 50 CHB/E nhận dạng Bacillus,
Enterbacteriaceae và Vibrionaceae (Biomerieux, 2002). Tuy nhiên, thao tác tiến hành
đơn giản, tiết kiệm thời gian và công suất (Trần Linh Thước, 2009).
Bộ kit API 50 CHL đã được dùng để định danh Lactobacillus trong nem chua
được thực hiện bởi Nguyễn Thanh Khương (2004), Mai Huỳnh Cang (2005) và Lý
Ngọc Quí (2006).
Những phương pháp truyền thống xác định giống Lactobacillus dựa trên các xét
nghiệm sinh hóa là không đáng tin cậy (Dickson và ctv., 2005). Những kỹ thuật hiện
đại đã được phát triển để nhận dạng và phân tích hoạt động của vi khuẩn, dựa trên
đoạn acid nucleic và những kỹ thuật này đã giúp cho việc phân tích các hoạt động của
các tế bào hoàn chỉnh (Amor và ctv., 2007).
2.4.2 Phương pháp phân lập LAB hiện đại
Những năm gần đây sự phát triển và ứng dụng các kỹ thuật phân tử để xác định
vi khuẩn và phân tích hoạt động của chúng ngày càng phát triển nhanh chóng. Những
kỹ thuật này đang ngày càng được áp dụng để nhận dạng và phân tích hoạt động các
chủng LAB, bao gồm những chủng sử dụng cho lên men và probiotic. Đa số các kỹ

thuật này dựa vào trình tự 16S ribosome DNA và sự lai DNA hoặc kỹ thuật PCR
(Amor và ctv., 2007).
Những kỹ thuật hiện đại đã được sử dụng để đánh giá hiệu quả trong việc nhận
dạng vi sinh vật bổ sung vào thực phẩm. Trong số đó phương pháp dựa trên kỹ thuật
PCR đã cho phép nhận dạng tới mức giống và loài, trong khi PFGE cho thấy sự khác
biệt tới mức độ chủng (Bernardeau và ctv., 2008). Mặc dù ngày nay có nhiều công cụ
phân tử, các kỹ thuật phù hợp cho việc xác định đặc tính lactobacilli lại thiếu các nhân
10


tố thiết yếu như tốc độ và khả năng lặp lại đồng đều. Hơn thế nữa, những kỹ thuật như
là PFGE có độ tin cậy cao nhưng có thể tốn nhiều thời gian và không phù hợp cho việc
sử dụng thường xuyên trong nhiều phòng thí nghiệm (Ventura and Zink, 2002). Một số
công cụ phân tử nhận dạng LAB hiện nay là:
PFGE là một kỹ thuật hiệu quả cho việc xác định đặc tính nhiều chủng khác
nhau ở cấp độ ADN, thu thập thông tin liên quan tới kích thước bộ gen và xây dựng
bản đồ vật lý và di truyền nhiễm sắc thể của vi khuẩn vốn chưa được hiểu rõ ở mức độ
di truyền (Esin and Huseyin, 2001).
Ribotyping là một biến thể của việc phân tích RFLP thông thường, kết hợp lai
Southern của dấu vân tay DNA được tạo ra từ việc phân tích điện di các đoạn DNA
bởi các đoạn dò rDNA. Tuy nhiên, PFGE có khả năng phân biệt các chủng có quan hệ
gần như Lb. casei, Lb. rhamnosus và Lb. johsonii hơn là ribotyping hoặc RAPD
(Amor và ctv., 2007).
RAPD là phương pháp khuếch đại ngẫu nhiên nhanh, nhạy cảm và không tốn
kém cho di truyền những chủng khác nhau của LAB và bifidobacteria. Tuy nhiên,
RAPD dễ bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ ủ, độ tinh khiết và sự tập trung của DNA và sự kết
hợp của đoạn mồi (Amor và ctv., 2007).
Các kỹ thuật dựa trên trình tự 16S rRNA (PCR hoặc sử dụng đoạn dò nucleic
acid) cung cấp một lựa chọn khả thi cho việc xác định nhanh chóng và đáng tin cậy
các LAB và các chủng probiotic trong các quần thể hỗn hợp (Amor và ctv., 2007).

Theo Trần Linh Thước (2009): “Phương pháp PCR là một phương pháp in vitro
để tổng hợp DNA dựa trên khuôn là một trình tự đích DNA ban đầu, khuếch đại, nhân
số lượng bản sao của khuôn này thành hàng triệu bản sao nhờ hoạt động của enzyme
polymerase và một cặp mồi”. Mồi là những đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ
sung với một đầu của mạch khuôn và DNA polymerase sẽ nối dài mồi để hình thành
mạch mới.
Ngày nay, các nhà khoa học đều thừa nhận PCR là một cuộc cách mạng trong
sinh học phân tử, mở ra một thế giới khoa học với rất nhiều triển vọng áp dụng cho
hiện tại và tương lai (Nguyễn Đức Hùng và ctv., 2004).
Nguyên tắc của phương pháp PCR là khi có sự hiện diện của hai mồi chuyên
biệt bắp cặp bổ sung với hai đầu của một trình tự DNA, ở điều kiện đảm bảo hoạt động
11


của DNA polymerase, đoạn DNA nằm giữa hai mồi sẽ được khuếch đại thành số
lượng lớn bản sao đến mức có thể thấy được sau khi nhuộm bằng ethidium bromide và
có thể thu nhận được đoạn DNA cho mục đích tái thao tác trên gen. Do đó, để khuếch
đại một trình tự DNA xác định, cần phải có thông tin tối thiểu về trình tự đó đủ để tạo
các mồi bổ sung chuyên biệt. Các mồi này gồm mồi xuôi và mồi ngược so với chiều
phiên mã của gen (Trần Linh Thước, 2009; Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2005).
Xác định trình tự DNA gồm hai phương pháp chính là phương pháp hóa học
của Maxam và Gilbert (1977) và phương pháp enzyme học qua việc sử dụng các
dideoxynucleotid của Sanger và cộng sự (1977). Trong đó, phương pháp enzyme học
tiện ích và đơn giản hơn phương pháp hóa học (Cao Văn Thu, 2008).
Một số ưu điểm chính của phương pháp PCR dùng trong phát hiện vi sinh vật
gây bệnh là thời gian cho kết quả nhanh, hóa chất cần cho phản ứng dễ tìm và dễ tồn
trữ, có thể phát hiện được những vi sinh vật khó nuôi cấy và ít tốn kém về mặt nhân sự
(Trần Linh Thước, 2009).
Phản ứng khuếch đại tối ưu xảy ra trên DNA thật tinh sạch nhưng nhiều kĩ thuật
chuẩn đoán bằng PCR vẫn đạt kết quả tốt với DNA thu nhận trực tiếp từ dịch tế bào.

Khi sử dụng các polymerase cho hiệu quả cao thì lượng mẫu sử dụng có khuynh
hướng giảm nên hạn chế được các khuếch đại “kí sinh” tạo những sản phẩm không
mong muốn. Một ưu điểm lớn nữa của PCR là cho phép khuếch đại cả những mẫu
DNA không được bảo quản tốt hoặc bị phân hủy từng phần. Mặt khác, enzyme được
sử dụng đầu tiên là đoạn Klenow của DNA polymerase I, là enzyme không chịu nhiệt
nên thao tác phức tạp và hiệu quả thấp. Tuy nhiên, ngày nay nhiều polymerase chịu
nhiệt khác đã được đưa ra thị trường với nhiều chức năng chuyên biệt hay hoàn thiện
hơn như Tth polymerase, Taq polymerase, … (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2005).
Việc phân lập vi khuẩn từ phụ phế phẩm của nhà máy bia DUDA (Huế) đã
được Trần Thị Thu Hồng và ctv (2009) tiến hành bằng giải trình tự gen 16S rDNA với
bộ kít ABI PRISMTM, xác định rằng vi khuẩn lên men lactic chiếm ưu thế. Trong đó,
cụ thể có bốn loài vi khuẩn lên men sinh acid lactic là Lb. fermentum, Lb. mucosae,
Lb. plantarum và Lb. brevis, và Lb. fermentum là chiếm ưu thế. Phương pháp giải trình
tự gen 16S rRNA cũng đã được Dickson và ctv (2005) phát triển để xác định sự hiện
diện của Lb. fermentum trên mẫu bệnh phẩm từ miệng.
12


Chương 3
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU
Đề tài được thực hiện từ 07/03/2010 đến 01/07/2010 tại phòng Thí Nghiệm Vi
Sinh, Hóa Sinh và Xưởng Chế Biến Thịt Cá thuộc khoa Công Nghệ Thực Phẩm
trường Đại học Nông Lâm, thành phố Hồ Chí Minh.
3.2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.2.1 Nguyên vật liệu thí nghiệm
Tung lọ mọ được chế biến dựa theo qui trình truyền thống tham khảo của người
Chăm, An Giang tại Xưởng Chế Biến Thịt Cá, khoa Công Nghệ Thực Phẩm do vị trí
địa lý cách xa không thuận tiện cho việc lấy mẫu tại An Giang. Quy trình sản xuất
Tung lọ mọ thử nghiệm được trình bày ở Phụ lục 2. Sản phẩm sau 3 ngày lên men

được dùng làm mẫu để phân lập LAB.
Thịt bò và mỡ bò dùng để sản xuất Tung lọ mọ thử nghiệm được mua tại chợ
Linh Xuân, phường Linh Trung, quận Thủ Đức.
3.2.2 Môi trường và thiết bị phân tích
3.2.2.1 Môi trường và thuốc thử
Thạch và canh MRS (nguồn gốc Ấn Độ, pH 6,5 ± 0,2 dùng để phân lập, tăng
sinh và giữ giống vi sinh vật).
Môi trường canh Phenol Red Broth Base (pH 7,4) dùng khảo sát khả năng lên
men đường của các chủng vi khuẩn lactic phân lập được.
Dung dịch NaCl 0,85% dùng để pha loãng.
Thuốc thử hydrogen peroxide 10% để thử phản ứng catalase.
Thuốc nhuộm Gram: crytasl violet, lugol và fuschin. Thành phần môi trường và
thuốc thử được trình bày ở Phụ lục 3.
3.2.2.2 Dụng cụ: Đĩa petri, ống nghiệm, pipet, micropipet, đèn cồn, que cấy, …
13


3.2.2.3 Thiết bị: Cân điện tử (Ac Adapter, Hàn Quốc, ± 0,01 g), Nồi hấp tiệt trùng
(ALP, Nhật), Máy đồng nhất mẫu (Seward, Anh), Máy rung ống nghiệm (Velp
Scientifica, Ý), Tủ ủ (Memmert, Đức), Máy đếm khuẩn lạc (Stuart Scientific, Anh),
Máy ly tâm (Mse, Anh), Máy đo pH (Oakton, Mỹ, ± 0,01), Kính hiển vi, Tủ sấy
(Memmert, Đức), …
3.3 NỘI DUNG NGHIÊN CỨU
Chúng tôi đã thực hiện các nội dung như sau:
 Phân lập ra chủng LAB thuần.
 Tiến hành định danh.
 Thử nghiệm sản xuất Tung lọ mọ sử dụng những chủng vi khuẩn lactic phân
lập được.
3.4 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.4.1 Phân lập chủng thuần

3.4.1.1 Phương pháp lấy mẫu
Chúng tôi tiến hành lấy mẫu lặp ba lần ở những lần sản xuất khác nhau. Các
mẫu Tung lọ mọ sau ba ngày lên men ở Xưởng Chế Biến Thịt Cá được cho vào bao
Polyethylene (PE) vô trùng và mang ngay đến phòng Thí Nghiệm Vi sinh để tiến hành
phân tích trong thời gian sớm nhất.
3.4.1.2 Đồng nhất mẫu
Môi trường làm việc xung quanh, hai tay và dao cắt mẫu phải được tiệt trùng kỹ
bằng cồn 70o. Sau khi cồn bay hơi hết, đốt đèn cồn hơ nóng dao cắt, để nguội và tiến
hành cắt vỏ bao Tung lọ mọ. Dao tiếp tục được tiệt trùng bằng cồn rồi hơ nóng, để
nguội và tiến hành cắt nhỏ mẫu Tung lọ mọ và cho vào bao PE vô trùng. Sau đó, cho
thêm dung dịch NaCl 0,85% vô trùng vào bao theo tỉ lệ 9 NaCl: 1 Tung lọ mọ. Tiến
hành đồng nhất mẫu bằng máy đồng nhất mẫu trong 2 phút, thu được nồng độ pha
loãng 10-1.
3.4.1.3 Pha loãng mẫu
Sau khi môi trường làm việc và hai tay được tiệt trùng kỹ bằng cồn 70o, tiến
hành đốt đèn cồn và chuẩn bị 6 ống nghiệm có ghi ký hiệu từ 10-2 đến 10-7, pipet và
đầu hút vô trùng. Dùng pipet 10 ml vô trùng hút 9 ml NaCl 0,85% vô trùng vào các
ống nghiệm trên. Dùng micropipet 1 ml với đầu hút vô trùng lấy 1 ml từ nồng độ pha
14


loãng 10-1 đưa vào ống nghiệm ký hiệu 10-2, tiến hành rung lắc ống lắc ống nghiệm
bằng máy rung ống nghiệm Votex, thu được nồng độ pha loãng 10-2. Tiến hành làm
tương tự với các nồng độ kế tiếp. Khi pha loãng mẫu phải tiệt trùng kỹ môi trường làm
việc và hai tay bằng cồn, tiến hành thao tác bên cạnh ngọn lửa đèn cồn không quá 10 –
20 cm, các ống nghiệm, pipet phải được vô trùng và sử dụng 1 đầu hút cho 1 nồng độ
pha loãng để tránh hiện tượng sai số.
3.4.1.4 Nuôi cấy dịch mẫu
Chuẩn bị 6 đĩa petri vô trùng, ký hiệu 2 đĩa nồng độ 10-5, 2 đĩa nồng độ 10-6 và
2 đĩa nồng độ 10-7, ghi tên mẫu, tên môi trường MRS và ngày đỗ đĩa. Môi trường MRS

đã tiệt trùng và để nguội khoảng 45 – 50 oC. Môi trường làm việc và hai tay được tiệt
trùng kỹ bằng cồn 70o.
Dùng micropipet 1 ml với đầu hút vô trùng hút 1 ml từ nồng độ mẫu pha loãng
10 , 10-6, 10-7 cho vào các đĩa có ký hiệu tương ứng với mỗi nồng độ pha loãng là một
-5

đầu hút. Sau đó, tay trái mở hé nắp đĩa petri, tay phải cầm bình môi trường đổ khoảng
15 – 20 ml môi trường tiệt trùng 45 – 50 oC trên vào đĩa. Tiến hành xoay nhẹ đĩa petri
cùng chiều và ngược chiều kim đồng hồ vài lần nhằm trộn đều dịch mẫu với môi
trường để thu được những khuẩn lạc tách rời. Tiến hành làm tương tự với các nồng độ
kế tiếp. Để môi trường đông tự nhiên, lật ngược đĩa, gói cẩn thận và ủ trong tủ ấm ở 35
o

C trong 48 giờ.

3.4.1.5 Tăng sinh
Tiệt trùng kỹ môi trường làm việc, hai tay và que cấy tròn bằng cồn 70o. Chuẩn
bị các ống nghiệm chứa 10 ml canh MRS tiệt trùng để nguội.
Chọn khuẩn lạc điển hình trên các đĩa và ghi tên vi sinh vật, tên môi trường cấy
và ngày cấy vào ống nghiệm. Đốt đèn cồn, hơ nóng que cấy tròn để nguội và chọn
khuẩn lạc cho vào ống nghiệm, tiệt trùng kỹ que cấy trước khi tiến hành với mỗi khuẩn
lạc. Sau đó, các ống nghiệm được gói cẩn thận và ủ trong tủ ấm ở 35 oC trong 48 giờ.
3.4.1.6 Ria
Tiệt trùng kỹ môi trường làm việc, hai tay và que cấy tròn bằng cồn 70o. Chuẩn
bị môi trường ria: tay trái hé nắp đĩa petri, tay phải cầm bình môi trường MRS tiệt
trùng, nguội khoảng 45 – 50 oC đổ vào các đĩa và để đông tự nhiên. Sau đó, ghi tên
môi trường, vi sinh vật và ngày cấy vào các đĩa.
15