i 
 

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA NÔNG HỌC



KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

ẢNH HƯỞNG NỒNG ĐỘ BA VÀ NAA ĐẾN KHẢ NĂNG
TÁI SINH CHỒI CỦA LAN HOÀNG THẢO KIM ĐIỆP
(DENDROBIUM CHRYSOTOXUM LINDL)
TRONG GIÂM CÀNH IN VITRO

SINH VIÊN THỰC HIỆN: NGUYỄN PHÚC THÀNH
NGÀNH: NÔNG HỌC
KHÓA: 2007 – 2011

Tháng 08/2011
 


ii 
 

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NƠNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA NƠNG HỌC

ẢNH HƯỞNG NỒNG ĐỘ BA VÀ NAA ĐẾN KHẢ NĂNG
TÁI SINH CHỒI CỦA LAN HỒNG THẢO KIM ĐIỆP
(DENDROBIUM CHRYSOTOXUM LINDL)
TRONG GIÂM CÀNH IN VITRO

NGUYỄN PHÚC THÀNH

Luận văn được đệ trình để hoàn thành yêu cầu cấp bằng kỹ sư nông nghiệp ngành Nông học

Giảng viên hướng dẫn
TS. PHẠM THỊ MINH TÂM
ThS. HÀ THỊ LOAN

TP. Hồ Chí Minh
Tháng 08 năm 2011
 


ii 
 

LỜI CẢM ƠN
Tôi - Nguyễn Phúc Thành xin chân thành cảm ơn!
Ban giám hiệu Trường Đại Học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh.
Ban chủ nhiệm khoa Nông Học.
Cùng tất cả quý thầy cô đã truyền đạt kiến thức trong suốt quá trình tôi học tập
tại trường.
Cô Phạm Thị Minh Tâm đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình

thực hiện đề tài.
Chân thành cảm ơn chị Hà Thị Loan cùng các anh chị tại Trung tâm công nghệ
sinh TP. HCM đã giúp đỡ tôi trong suốt thời gian làm việc và thực hiện đề tài.
Cảm ơn gia đình và bạn bè đã động viên, tạo nhiều điều kiện và giúp đỡ tôi trong
suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài.

Sinh viên thực hiện

Nguyễn Phúc Thành


iii 
 

TÓM TẮT

NGUYỄN PHÚC THÀNH, Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh. Tháng 08/2011.
ẢNH HƯỞNG NỒNG ĐỘ BA VÀ NAA ĐẾN KHẢ NĂNG TÁI SINH CHỒI
CỦA LAN HOÀNG THẢO KIM ĐIỆP (DENDROBIUM CHRYSOTOXUM
LINDL) TRONG GIÂM CÀNH IN VITRO.
Giảng viên hướng dẫn: TS. Phạm Thị Minh Tâm

Thí nghiệm được lấy mẫu trên lan Hoàng thảo kim điệp (Dendrobium
chrysotoxum Lindl) một năm tuổi. Đề tài gồm 2 thí nghệm: Thí nghiệm 1: Khảo sát
ảnh hưởng nồng độ chất khử trùng Javel và thời gian xử lý đến sự vô trùng mẫu, với
mục đích tìm thời gian xử lý và nồng độ Javel hợp lý đạt hiệu quả cao trong quá trình
khử trùng. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ BA và NAA đến khả năng tái
sinh chồi của lan Hoàng thảo kim điệp (Dendrobium chrysotoxum Lindl) trong nuôi
cấy in vitro, với mục đích tìm ra môi trường MS cơ bản (nền) có bổ sung chất điều hòa
sinh trưởng thích hợp để tái sinh nhanh chồi từ đoạn thân.

Kết quả đạt được như sau:
Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng các nồng độ chất khử trùng Javel và thời
gian khử trùng đến sự vô trùng mẫu.
Những đoạn thân mang chồi ngủ được khử trùng có hiệu quả nhất bằng Javel ở
nồng độ 30 %, thời gian xử lý 15 phút có trung bình số mẫu sạch cao nhất là 6,3 mẫu.
Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ BA và NAA đến khả năng tái sinh
chồi của đốt thân lan Hoàng thảo kim điệp.
Môi trường MS cơ bản (nền) có bổ sung BA (1,0 mg/lít môi trường nền) và
NAA (1,0 mg/lít môi trường nền) tốt nhất cho việc tái sinh chồi và hệ số nhân chồi
theo thứ tự tương ứng với số chồi cao nhất là 1,0 chồi/nghiệm thức và hệ số nhân chồi
là 0,5 mẫu.
Môi trường MS cơ bản có bổ sung BA (3,0 mg/lít môi trường nền) thích hợp
cho kết quả tốt nhất về chiều cao chồi là 1,8 cm.
 
 


 

iv

MỤC LỤC
Nội dung

Trang

Trang tựa.......................................................................................................................... i
Lời cảm ơn.......................................................................................................................ii
Tóm tắt........................................................................................................................... iii
Mục lục ........................................................................................................................... iv

Danh sách các bảng ..................................................................................................... viii
CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU.................................................................................................... 1
1.1 Đặt vấn đề ..................................................................................................................... 1
1.2 Mục đích, yêu cầu và giới hạn của đề tài ............................................................................. 2
1.2.1 Mục đích..................................................................................................................... 2
1.2.2 Yêu cầu ...................................................................................................................... 2
1.2.3 Giới hạn đề tài ............................................................................................................. 2

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................................... 3
2.1 Tình hình sản xuất hoa lan ................................................................................................ 3
2.1.1 Nguồn gốc phân bố, phân loại lan Dendrobium chrysotoxum Lindl ....................................... 3
2.2.1 Đặc điểm thực vật học ................................................................................................... 3
2.2.2 Điều kiện ngoại cảnh..................................................................................................... 4
2.3 Nhân giống lan rừng ........................................................................................................ 4
2.3.1 Gieo hạt lan ................................................................................................................. 4
2.3.2 Tách chiết lan .............................................................................................................. 5
2.3.3 Nuôi cấy in vitro .......................................................................................................... 5
2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến nhân giống in vitro ...................................................................... 7

 
 


 

v

2.4.1 Mẫu cấy ...................................................................................................................... 7
2.4.2 Sự vô trùng mẫu trong nuôi cấy ...................................................................................... 8
2.5 Vai trò của các chất điều hòa tăng trưởng ............................................................................ 9

2.5.1 Auxin ......................................................................................................................... 9
2.5.2 Gibberelline .............................................................................................................. 11
2.5.3 Cytokinine ................................................................................................................ 12
2.6 Các nghiên cứu về nuôi cấy mô lan Dendrobium ................................................................13
2.6.1 Trên thế giới .............................................................................................................. 13
2.6.2 Ở Việt Nam ............................................................................................................... 14

CHƯƠNG 3 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................. 15
3.1 Điều kiện nghiên cứu .....................................................................................................15
3.1.1 Địa điểm ................................................................................................................... 15
3.1.2 Thời gian .................................................................................................................. 15
3.2 Vật liệu thí nghiệm ........................................................................................................15
3.2.1 Mẫu nuôi cấy ............................................................................................................. 15
3.2.2 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm...................................................................................... 15
3.3 Nội dung nghiên cứu .....................................................................................................17
3.3.1 Thí nghiệm 1 ............................................................................................................. 18

3.4 Xử lý số liệu ............................................................................................................ 22
Chương 4 KẾT QUẢ THẢO LUẬN ............................................................................ 23
4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng các nồng độ của chất khử trùng và thời gian khử trùng đến sự
vô trùng ............................................................................................................................23
4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng nồng độ BA và NAA đến khả năng tái sinh chồi của đốt thân
lan hoàng thảo kim điệp ......................................................................................................28

Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .......................................................................... 33
 
 


 


vi

5.1 Kết luận.......................................................................................................................33
5.2 Đề nghị .......................................................................................................................33

Tài liệu tham khảo ......................................................................................................... 34
Phụ lục ........................................................................................................................... 36

 
 


 

vii

DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT

BA

:

6 - Benzyl Adenyl

CC

:

Chiều cao chồi


CV

:

Hệ số biến thiên (Coefficient of Variation)

Fe - EDTA :

Sắt - Ethylene Diamine Tetra Acetate

Hsnc

:

Hệ số nhân chồi

MS

:

Môi trường Murashige và Skoog

NAA

:

α - napthylacetic acid

NSC


:

Ngày sau cấy

NT

:

Nghiệm thức

SAS 9.1

:

Phầm mềm xử lý thống kê (Statistical Analysis Systems 9.1)

TB

:

Trung bình

TP. HCM :

Thành phố Hồ Chí Minh

 
 



 

viii

DANH SÁCH CÁC BẢNG

Bảng

Trang

Bảng 2.1 Nồng độ và thời gian khử trùng của một số chất khử trùng ............................................. 8

Bảng 4.1. Ảnh hưởng nồng độ chất khử trùng Javel và thời gian xử lý đến số mẫu sạch
....................................................................................................................................... 23
Bảng 4.2 Ảnh hưởng nồng độ chất khử trùng Javel và thời gian xử lý đến số lượng mẫu nhiễm ....... 25
Bảng 4.3 Ảnh hưởng nồng độ BA và NAA đến số chồi của lan Hoàng thảo kim điệp. ................. 289
Bảng 4.4 Ảnh hưởng nồng độ BA và NAA đến chiều cao chồi và hệ số nhân chồi sau

135 NSC của lan Hoàng thảo kim điệp. ........................................................................ 31
 

 
 


 

1


Chương 1
MỞ ĐẦU

1.1 Đặt vấn đề
Hoa đóng vai trò quan trọng trong cuộc sống của con người, là sản phẩm không
những mang giá trị tinh thần mà còn mang lại giá trị kinh tế. Ở nước ta hiện nay, hàng
năm có nhiều giống hoa được lai tạo và nhập nội, nhiều tiến bộ kỹ thuật mới được
nghiên cứu và áp dụng trong sản xuất nên diện tích trồng hoa ngày càng được nâng
cao.
Ngày nay, nhu cầu về hoa lan trên thị trường rất lớn. Các nước có truyền thống
sản xuất hoa lan như: Anh, Pháp, Mỹ, Thái Lan, Đài Loan,...hàng năm thu về hàng
chục triệu USD từ nguồn xuất khẩu hoa lan (Trần Văn Bảo, 2002).
Tuy nhiên, vấn đề mà chúng ta gặp phải là làm thế nào để cung ứng được nguồn
giống đảm bảo yêu cầu đủ về số lượng và đồng đều về chất lượng, đồng thời bảo tồn
các giống hoa vốn dĩ đã và đang mất dần về nguồn gốc và chủng loại. Cùng với sự đa
dạng về các loài hoa nói chung và phong lan nói riêng, đối với lan Hoàng thảo kim
điệp (Dendrobium chrysotoxum Lindl) không những có sự đa dạng về chủng loại và
màu sắc mà hoa còn có những tác dụng dược lý rất lớn. Cánh hoa phong lan vàng này
được phơi để ướp trà. Nó có mùi hương ngọt ngào, dễ chịu. Chỉ cần bỏ một bông
phong lan vàng khô vào có thể tạo một ly trà có hương vị hoàn toàn khác biệt. Chỉ với
10 hoa loại này có thể tạo một tách trà đậm đặc có tác dụng dưỡng âm, bổ khí (Liên
Thùy, 2010).
Chính vì điều đó, công việc nhân giống càng trở nên cấp thiết để bảo tồn nguồn
giống vốn đã sẵn có trong tự nhiên. Trong các phương pháp nhân giống, phương pháp
nuôi nuôi cấy in vitro, ngoài việc tạo một môi trường MS (Murashige và Skoog) cơ
 
 


 


2

bản mà hầu như chúng ta đều bổ sung các chất điều hòa sinh trưởng như BA, NAA,
IBA thích hợp vào môi trường. Điều đó giúp tăng nhanh quá trình tái sinh và nhân
nhanh chồi của lan nuôi cấy. Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn đó, đề tài “Ảnh hưởng
nồng độ của một số chất điều hòa sinh trưởng đến khả năng tái sinh chồi của lan
Hoàng thảo kim điệp (Dendrobium chrysotoxum Lindl) trong giâm cành in vitro”
đã được thực hiện.
1.2 Mục đích, yêu cầu và giới hạn của đề tài
1.2.1 Mục đích
Xác định công thức khử trùng mẫu tương ứng với thời gian xử lý và nồng độ
Javel hợp lý để đạt hiệu quả cao trong quá trình xử lý mẫu.
Xác định môi trường MS cơ bản có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng thích hợp
để tái sinh nhanh chồi.
1.2.2 Yêu cầu
Ghi nhận các chỉ tiêu về số mẫu sạch, số mẫu nhiễm để xác định công thức khử
trùng hiệu quả.
Theo dõi và ghi nhận các chỉ tiêu về số chồi, hệ số nhân chồi cũng như chiều
cao chồi trong tiến trình thí nghiệm.
1.2.3 Giới hạn đề tài
Đề tài được thực hiện từ tháng 02/2011 đến tháng 06/2011 nên tôi chưa thực
hiện được thí nghiệm tạo cây hoàn chỉnh.

 
 


 


3

Chương 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Tình hình sản xuất hoa lan
2.1.1 Nguồn gốc phân bố, phân loại lan Dendrobium chrysotoxum Lindl
Hoa lan là một loài hoa đông đảo vào bậc thứ nhì sau hoa cúc với khoảng 750
loài, 30.000 giống nguyên thủy và khoảng một triệu giống đã được lai giống nhân tạo
(Bùi Xuân Đáng, 2009).
Trong đó, Dendrobium là một giống lan có nhiều loài trong họ Orchidaceae, có
khoảng hơn 1.600 loài. Giống chiếm vị trí lớn nhất là Bulbopllyllum. Phân bố trên các
vùng thuộc Châu Á nhiệt đới, tập trung nhiều nhất ở Đông Nam Á và Úc châu. Nếu
như các nước Nam Mỹ tự hào về các loài thuộc giống Cattleya tuyệt đẹp thì các nước
Đông Nam Á cũng hãnh diện vì có giống Dendrobium vô cùng phong phú. Tuy nhiên,
không có một dạng chung nhất về hoa, cây, cũng như cách trồng của giống
Dendrobium với sự đa dạng về số loài quá lớn này (Lê Trung Tín, 2007).
Lan Dendrobium chrysotoxum Lindl được mô tả như một đàn bướm vàng. Hầu
như chúng phân bố ở Lào, Ấn Độ, Mianma, Thái Lan, Trung Quốc. Tại Việt Nam, cây
mọc chủ yếu ở Tây Nguyên, Kontum, Daklak, Lâm Đồng (Trần Hợp, 1998).
2.2 Sơ lược về lan Dendrobium chrysotoxum Lindl
2.2.1 Đặc điểm thực vật học
Lan Hoàng thảo kim điệp có hoa ngang từ 4 - 5 cm, màu vàng tươi, với cánh
môi có màu vàng cam đậm và cây Dendrobium chrysotoxum var.suavissimum có màu
nâu đen (Natalea Võ, 2009).

 
 



 

4

Lan Hoàng thảo kim điệp (Dendrobium chrysotoxum Lindl) thuộc họ
Orchidaceae. Có các đặc điểm thực vật học như: rễ lan hình trụ, trên bề mặt có cấu
trúc đặc biệt khác với các loài thực vật khác đó là mô xốp. Chúng thường có màu
trắng, khi đầy đủ nước chúng trở nên xanh trong, chất liệu này hết sức quan trọng, có
tác dụng hút nước nhiều nhất (Nguyễn Công Nghiệp, 2010). Lan sống phụ, thân mập,
phình ở giữa, cao 20 - 30 cm, nhiều rãnh dọc. Có khoảng 2 - 8 lá, thuôn hình giáo, dài
8 - 10 cm, rộng 2,5 - 3 cm, mềm và dễ rụng. Cụm hoa mềm, buông xuống, dài 15 - 20
cm, mang 8 - 20 hoa lớn màu vàng tươi. Cánh hoa có đốm vàng cam đậm ở giữa, mép
có lông mịn (Trần Hợp, 1998).
2.2.2 Điều kiện ngoại cảnh
Dendrobium chrysotoxum Lindl là một trong những loài lan có thể sống ở cả
vùng lạnh và vùng nóng. Cây có thời gian sinh trưởng và phát triển liên tục, ưa sáng,
cần có độ ẩm không khí cao nên cần có chế độ tưới nước đều đặn quanh năm. Nhiệt độ
môi trường 15 - 32ºC, ánh sáng 2.500 - 3.500 lux, ẩm độ không khí 50 % trở lên
(Natalea Võ, 2009).
2.3 Nhân giống lan rừng
2.3.1 Gieo hạt lan
Hạt lan có kích thước nhỏ, số lượng hạt rất lớn, lại không chứa chất dự trữ và
chỉ có một phôi chưa phân hóa nên không thể phát triển theo một phương cách bình
thường được. Vì vậy, vấn đề làm cho hạt lan nảy mầm và phát triển thành cây lan trở
nên khó khăn vào những năm đầu của thời kì đầu phát triển ngành lan (Nguyễn Thiện
Tịch, 1997).
Tuy nhiên đã có nhiều nghiên cứu về vấn đề này như: Năm 1844, Neumann đã
làm nảy mầm một số hạt lan bằng cách gieo các hạt lan trên đất quanh gốc của các cây
lan lớn. Năm 1899, nhà thực vật học người Pháp là Bernard đã khảo sát sự nảy mầm tự
nhiên của hạt Neottia nidus - avis trong rừng (Nguyễn Thiện Tịch, 1997).

 
 


 

5

2.3.2 Tách chiết lan
Tách bụi: Đây là phương pháp đơn giản, dễ làm, lại được các nhà vườn sử dụng
phổ biến đối với các loại lan đa thân. Phương pháp này tiến hành khi cây có hiện
tượng mọc ra khỏi chậu. Thường thì công việc này bắt đầu vào lúc cây bắt đầu tăng
trưởng sau thời kì ngủ nghỉ, có nghĩa là tiến hành tách bụi vào cuối mùa khô, đầu mùa
mưa.
Chiết cành: Việc chiết cành hầu như áp dụng cho tất cả các loại lan. Công việc
chiết cành được tiến hành vào đầu thời kì phát triển, thường bắt đầu cuối mùa khô, đầu
mùa mưa (Nguyễn Thiện Tịch, 1997).
2.3.3 Nuôi cấy in vitro
Nhân giống in vitro hay nuôi cấy mô đều là thuật ngữ mô tả các phương thức
nuôi cấy các bộ phận thực vật trong ống nghiệm có chứa môi trường xác định ở điều
kiện vô trùng. Mỗi môi trường có các chất dinh dưỡng thích hợp như muối khoáng,
vitamin, các hormone tăng trưởng và đường. Kỹ thuật nuôi cấy mô cho phép tái sinh
chồi hoặc cơ quan từ các mô như lá, thân, hoa hoặc rễ (Dương Công Kiên, 2002).
Nuôi cấy mô tế bào thực vật được phát triển dựa trên tính toàn năng của tế bào
thực vật. Tính toàn năng của tế bào thực vật là khả năng của tế bào đã được biệt hóa có
khả năng thể hiện toàn bộ hệ thống di truyền và có thể trong điều kiện phù hợp sẽ phát
triển theo chu kỳ giống như sự phát triển phôi dẫn đến hình thành cây mới hoàn chỉnh.
Theo Nguyễn Đức Lượng (2002), việc áp dụng nuôi cấy mô trong sản xuất
nông nghiệp và lâm nghiệp cơ những lợi ích cơ bản sau:
- Kiểm soát được dịch bệnh cây trồng bằng phương pháp nuôi cấy mô hay

nuôi cấy tế bào hoàn toàn có thể loại được những cá thể nhiễm bệnh hay mang mầm
bệnh.

 
 


 

6

- Kiểm soát được chất lượng giống thông qua kiểm soát kiểu gene của giống
đưa vào sản xuất.
- Kiểm soát được toàn bộ kỹ thuật từ khâu nhân giống đến khâu thu hoạch.
- Tạo ra sự đồng loạt về giống, từ đó tạo ra sự đồng loạt đến sản phẩm cuối
cùng. Sự đồng loạt này giúp cơ giới hóa được khâu trồng trọt và khâu thu hoạch. Do
đó, năng suất lao động sẽ tăng lên, chất lượng sản phẩm đồng nhất, tạo điều kiện thuận
lợi cho khâu thu hoạch và chế biến.
Các phương pháp tách chiết thông thường không thể cung cấp đủ cây giống để
đáp ứng nhu cầu phát triển của ngành lan. Vì vậy, việc áp dụng thành công phương
pháp nuôi cấy mô (in vitro) ở cây lan đã đóng góp rất lớn trong việc tạo lập ngành hoa
cắt cành tại Việt Nam.
Phương pháp này đã tạo được một số lượng cây giống rất lớn đồng nhất về chất
lượng trong cùng một lúc với thời gian ngắn. So với phương pháp gieo hạt, phương
pháp nuôi cấy mô thuận tiện hơn vì mẫu luôn có sẵn, không mất thời gian phải chờ đợi
trái chín (Nguyễn Thiện Tịch, 1997).
Trong nuôi cấy lan in vitro, sử dụng mẫu cấy là chồi ngọn hoặc chồi bên có
mang một đoạn thân ngắn. Theo Murashige (1974), tiến trình nhân giống in vitro bao
gồm các giai đoạn sau:
- Giai đoạn 1: Thiết lập sự nuôi cấy vô trùng. Giai đoạn này thường kéo dài 4 6 tuần, mẫu cấy hình thành cây con cao khoảng 1 cm với vài cành bên.

- Giai đoạn 2: Nhân giống vô tính in vitro. Mẫu cấy được cắt chia ra và cây
mầm được cấy chuyền vào môi trường mới. Sự nhân giống này tùy thuộc vào việc tiếp
tục sản xuất chồi nách hoặc khởi phát chồi bất định từ những khối giống như callus ở
gốc chồi.

 
 


 

7

- Giai đoạn 3: Chuyển cây in vitro ra vườn ươm. Cây con được tái sinh hoàn
chỉnh chuẩn bị cho việc cấy trồng và môi trường bên ngoài được thiết lập để thuần hóa
cây in vitro.
- Giai đoạn 4: Trồng cây in vitro ngoài đồng ruộng. Cây con được tiếp tục
nhân giống trên luống ươm và được cấy vào bầu đất rồi chuyển ra trồng trên đồng
ruộng (Trần Thị Dung, 2003).
Sự hiện diện của các hormone tăng trưởng đã được khám phá ở cuối thế kỷ 20.
Trong đó, chất Auxin là chất được khám phá đầu tiên vào năm 1934, kế đến là các chất
Gibberelline và Cytoknines. Các hormone này có tác dụng kích thích lên sự chuyển
hóa tế bào. Các chất này có nguồn gốc “nội sinh”, có nghĩa là nó được tổng hợp bởi
thực vật, ngoài ra, còn có những chất tổng hợp khác do con người tạo nên. Tuy nhiên,
chúng có công thức hóa học gần giống nhau hoặc khác với các chất trong thiên nhiên,
nhưng chúng biểu hiện một hoạt động về một sinh lý tương tự nhau (Dương Công
Kiên, 2002).
2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến nhân giống in vitro
2.4.1 Mẫu cấy
Theo Nguyễn Đức Lượng (2002), các tế bào còn sống đã phân hóa đều có khả

năng phản phân hóa để trở lại trạng thái trẻ hóa và tái lập khả năng phân chia.
Các mô thực vật thường được sử dụng để nuôi cấy là đỉnh sinh trưởng thân, rễ;
chồi bên; tượng tầng; vảy củ (Tulip, Iris,...); chồi ngọn; nhu mô lá, nhu mô vỏ thân;
chồi nảy từ củ (Khoai tây,...).
Mẫu cấy sau khi chọn lựa phải được rửa bằng xà phòng bột rồi mới ngâm vào
trong dung dịch khử trùng. Một vài loài thực vật thân thảo không cần phải thông qua
bước này.

 
 


 

8

2.4.2 Sự vô trùng mẫu trong nuôi cấy
Môi trường nuôi cấy và tế bào thực vật đều chứa đường, muối khoáng,
vitamin,... rất thích hợp cho các loại nấm và vi khuẩn phát triển. Trong môi trường
nuôi cấy, tốc độ phân bào của vi khuẩn, nấm lớn hơn nhiều so với tốc độ phân hóa của
các tế bào thực vật. Vì vậy, nếu môi trường bị nhiễm (nấm, khuẩn) thì quá trình vô
trùng mẫu không được đảm bảo.
Có 3 nguồn nhiễm tạp chính là:
- Dụng cụ thủy tinh, môi trường nuôi cấy và nút đậy không được vô trùng
tuyệt đối.
- Trên bề mặt và bên trong mẫu nuôi cấy còn tồn tại các bào tử nấm, vi khuẩn.
- Trong quá trình thao tác làm rơi nấm hoặc vi khuẩn ảnh hưởng đến mẫu nuôi
cấy.
Bảng 2.1 Nồng độ và thời gian khử trùng của một số chất khử trùng (Lê Văn Hoàng,
2008)

STT

Chất khử trùng

Nồng độ (%)

Thời gian (phút)

Hiệu quả

1

Calcium hypochorite

9 - 10

5 - 30

Rất tốt

2

Sodim hypochorite

0,5 - 5

5 - 50

Rất tốt


3

Nước bromine

1-2

2 - 10

Rất tốt

4

Oxy già

3 - 12

5 -15

Tốt

5

Thủy ngân chlorua

0,1 - 1

2 - 10

Tốt


6

Nitrate bạc

1

5 - 30

Tốt

7

Kháng sinh

4 - 50 mg/l

30 - 60

Khá
 
 


 

9

Quá trình khử mẫu nuôi cấy là công việc rất quan trọng vì mẫu nuôi cấy không
thể khử bằng nhiệt độ cao mà mẫu phải giữ được bản chất sinh học. Do đó, các mẫu
cấy (mô/cơ quan) thực vật phải được khử trùng bằng các dung dịch khử trùng. Các

dung dịch khử trùng thường được sử dụng là calcium hypochlorite, sodium
hypochlorite, thủy ngân chlorua, javel,... Tỷ lệ mẫu vô trùng thành công phụ thuộc vào
thời gian và nồng độ các chất khử trùng. Các dung dịch dùng để khử trùng mẫu phải
bảo vệ được mô thực vật nhưng thời gian khử trùng mẫu phải đủ để tiêu diệt nguồn
gây nhiễm là nấm và vi khuẩn. Tuy nhiên, việc xử lý thành công nguồn gây nhiễm
cũng phụ thuộc rất lớn vào kỹ thuật xử lý trong nuôi cấy vô trùng (Nguyễn Đức
Lượng, 2002).
2.5 Vai trò của các chất điều hòa tăng trưởng
2.5.1 Auxin
Đây là một chất có nhân indole, có công thức phân tử là C10H9O2N. Tên gọi đầy
đủ là Acid indole β-acetique hoặc β-indolylacetique.
Hoạt động của auxin phụ thuộc vào nồng độ và có sự tương hổ qua lại của
chúng với các chất điều hòa khác. Các tác dụng của auxin được thể hiện sau:
- Kéo dài tế bào làm gia tăng tính đàn hồi của thành tế bào và cho sự xâm nhập
của nước vào bên trong tế bào. Lúc đó, sự đề kháng của thành tế bào giảm đi và tế bào
tự kéo dài ra.
- Sự thay đổi về tính thẩm thấu của màng tế bào, sự thay đổi này thể hiện bằng
một sự phóng thích ion H+, ion này gây ra một hoạt tính acid có tác dụng làm giảm
tính đề kháng của thành tế bào và bởi sự hấp thu ion K+.
- Một hoạt động tổng quát trên sự chuyển hóa và đặc biệt là trên sự tổng hợp
ARN - robosomique.

 
 


 

10


- Sự thích ứng về sự phân chia tế bào đối với các tế bào nguồn gốc cambium.
Hiệu quả này do chất “histogene” bởi vì nó dẫn đến nhiều tế bào giống nhau hoàn
toàn, các tế bào này tạo nên một “mô sẹo”.
- Hoạt động lên sự tổng hợp ethylen bắt đầu từ một vài nồng độ; chất ethylen
tham giai đoạn trở về để điều chỉnh tỷ lệ chất auxin, ít nhất ở mức độ chuyên chở.
- Hoạt động trong các phản ứng về tăng trưởng và trong các sự hỗ tương giữa
các cơ quan với nhau, đặc biệt là tính ưu thế của chồi non.
- Có tác dụng làm giảm sự rụng lá và trái, đồng thời kích thích tạo rễ (Dương
Công Kiên, 2002).
2.5.1.1 Auxin trong cây trồng
Tất cả cây trồng đều tổng hợp được auxin dạng tổng hợp tùy theo giai đoạn phát
triển của chúng. Auxin sinh ra được hiện diện trong lá non, trong các chồi đang hoạt
động, ở mức độ phát hoa và ở trên các quả còn non.
Auxin lưu thông từ đỉnh xuống dưới các cơ quan với một sự phân cực rõ ràng,
được thấy rõ trên các cơ quan thực vật còn non, nhưng trong quá trình chuyển vận này
chúng bị thoái hóa bởi sự có mặt của enzyme auxin - oxydases. Điều này cho thấy
nồng độ auxin thì luôn luôn cao hơn gần với những nơi tổng hợp chúng. Như vậy,
auxin hiện diện với nồng độ vừa đủ ở các điểm tăng trưởng hoặc ở phát hoa để đảm
bảo sự nhân giống và kéo dài tế bào (Dương Công Kiên, 2002).
2.5.1.2 Các chất auxin tổng hợp
Gồm các chất chính sau:
- Acid indolybutylbutyrique (AIB)
- Acid naphytylacetique (ANA) hoặc các dẫn xuất của chúng như:
+ Acid naphytyloxyacetique (ANAOA)
 
 


 


11

+ Acid naphytylacetamide (NAD)
+ Acid 2,4 dichrolophen - oxyacetique (2,4 - D)
2.5.2 Gibberelline
Gibberelline đầu tiên được nhận dạng là acid gibberellique hoặc là GA3, kế đến
là GA4 + GA7 và GA7. Tất cả các gibberelline thể hiện một nhân giống nhau; chúng
khác nhau bởi chất lượng và vị trí các chất gắn trên nhân. Chúng có tác dụng sinh lý
như sau:
- Hoạt động kéo dài các đốt của cây, hoạt động này cũng có thể áp dụng lên
các cuống hoa và điều này cho phép những phát hoa phát triển tốt hơn.
- Trong nuôi cấy in vitro, gibberelline các tác động đối với nhiều đỉnh sinh
trưởng, nếu thiếu gibberelline đỉnh sinh trưởng thể hiện một dạng hình cầu, tạo nên các
mắt cây.
- Hoạt động phức tạp trong sự ra hoa cũng như tác động lên sự đậu trái của các
trái không hạt.
- Tác động gây thức giấc các chồi, mầm ngủ trên các hạt giống làm thuận lợi
cho sự nảy mầm.
- Trong lĩnh vực tạo cơ quan thực vật, gibberelline cho thấy các hoạt động đối
kháng; chúng dường như đối ngược với hiện tượng phân hóa tế bào. Trong nuôi cấy in
vitro, Gibberelline không được sử dụng vào mục đích này, nhưng chúng có công dụng
với các mô đã có tổ chức (đỉnh sinh trưởng, chồi ngọn, chồi thân,…).
Gibberelline được tìm thấy trong tất cả các loại cây và trong các loại nấm. Ở
đây chúng phân bố không đều, một vài loại trong vài loại cây, một vài loại nấm và một
và chất gibberelline có trong cả hai nhóm như GA1, GA3, GA4, GA7, GA9. Trong cây
trồng, một vài loại cây chỉ có một loại gibberelline, các loài cây khác có thể có nhiều
loại gibberelline.
 
 



 

12

2.5.3 Cytokinine
Cytokinine được khám phá qua trung gian của sự nuôi cấy mô. Người ta đã biết
thêm nước dừa vào môi trường nuôi cấy gây ra hiệu quả thuận lợi cho việc phân chia
tế bào và cho việc hình thành chồi. Năm 1956, Skoog đã cô lập được một chất rất hoạt
động mà người ta đặt tên là kinetine, do ADN biến chất. Chúng có các hoạt động sinh
lý như sau:
- Tác động rất rõ lên hiệu quả phân chia tế bào. Trong quá trình này, chúng
cần thiết nhưng sẽ không hiệu quả nếu vắng mặt auxin. Cytokinine là chất bổ sung;
auxin làm thuận lợi cho sự nhân đôi của acid desoxyribonucleique (ADN) và
cytokinine cho phép làm tách rời các chromosome.
- Có vai trò mạnh mẽ trong việc tạo cơ quan thực vật, ở đây chúng sẽ kích
thích mạnh mẽ sự thành lập các chồi non. Trái lại, chúng đối kháng với sự tạo rễ.
- Hoạt động kích thích trên sự chuyển hóa, làm thuận lợi một phần cho việc
tổng hợp protein, mặt khác, trong lúc bảo vệ các chất chuyển hóa chống lại các tác
động của enzym ly giải.
- Hiệu quả đối kháng của tính ưu thế chồi non: Các chồi nách được xử lý
cytokinine sẽ tăng trưởng và cạnh tranh với chồi tận cùng.
- Cytokinine có vai trò quan trọng trong nuôi cấy in vitro, nó thể hiện tính chất
cần thiết để duy trì sự sống của mô, kích thích sự phân chia tế bào và định hướng tế
bào trong con đường phân hóa (Dương Công Kiên, 2002).
2.5.3.1 Cytokinine trong cây trồng
Được tìm thấy đầu tiên vào năm 1963 trong các phôi còn non của cây ngô; chất
thứ hai là IBA tìm thấy trong cây bị nhiễm khuẩn Corynebacterium fascines. Chúng
định vị ở lá non trong chồi và ở các đầu của rễ cây.


 
 


 

13

2.5.3.2 Cytokinine tổng hợp
- Cytokinine là các chất adenine được thay thế, chất này được người ta biết
đến qua 2 nhóm nội sinh:
- Zeatine
- Isopentenyladenine (IBA), cytokinine trong tự nhiên và các chất tổng hợp.
Có 2 loại được sử dụng nhiều nhất:
+ Kinetine (6 furfuryl - aminopurine)
+ Benzyladenine (BAP) (6 benzyl - aminopurine)
(Dương Công Kiên, 2002)
2.6 Các nghiên cứu về nuôi cấy mô lan Dendrobium
2.6.1 Trên thế giới
Trong quá trình nuôi cấy in vitro, người ta thường bổ sung các chất điều hòa
sinh trưởng khác nhau vào môi trường nuôi cấy nhằm đạt được kết quả nhân giống
cao. Việc bổ sung kết hợp vào môi trường nuôi cấy như BA và NAA sẽ ảnh hưởng
đáng kể đến quá trình nhân giống in vitro (Nayak và ctv, 1998; Vij và ctv, 1994;
Sheelavantmath và cvt, 2000; Lee và ctv, 1999). Theo Ed Herman (2000), nuôi cấy
thân giả hành lan Dendrobium moschatum trên môi trường có bổ sung kết hợp BA (0;
0,5; 1,0; 2,0; 3,0 mg/lít môi trường nền) và NAA (0; 0,5; 1,0; 2,0; 3,0 mg/lít môi
trường nền), kết quả tốt nhất thu được ở nghiệm thức BA 3,0 mg/lít môi trường nền và
NAA 2,0 mg/lít môi trường nền) là 8,4 chồi (Nguyễn Thị Hồng Nhật, 2004).
Nasiruddin và ctv (2003) đã thử nghiệm nuôi cấy từ lá lan của giống lan
Dendrobium formosum trên môi trường có bổ sung BA (0; 1,25; 2,5; 5 mg/lít môi

trường nền) và NAA (0; 0,5; 1,0; 2,0 mg/lít môi trường nền). Sau 60 ngày nuôi cấy,
 
 


 

14

kết quả thu được tại nồng độ BA 2,5 mg/lít môi trường nền và NAA 1,0 mg/lít môi
trường nền) có số chồi cao nhất là 2,68 chồi. Talukder, Nasirudin và ctv (2003) đã
nuôi cấy từ đỉnh sinh trưởng trên môi trường có bổ sung BA (0; 1,0; 2,5; 5,0 mg/lít
môi trường nền) và NAA (0; 0,1; 0,5; 1,0 mg/lít môi trường nền). Sau 40 ngày nuôi
cấy thu được số chồi cao nhất là 1,9 chồi tại nồng độ BA 2,5 mg/lít môi trường nền và
NAA 0,5 mg/lít môi trường nền (Đặng Quốc Tượng, 2008).
2.6.2 Ở Việt Nam
Hiện nay, có nhiều nghiên cứu trong nước đã và đang tiến hành trên loài hoa có
giá trị này. Tuy nhiên, cho đến bây giờ tình hình nghiên cứu khoa học trong nước trên
đối tượng này vẫn chủ yếu tập trung vào các đặc tính nông học với các đề tài xoay
quanh một số các vấn đề bao gồm phát triển các kỹ thuật chọn, tạo, nhân giống và một
số nghiên cứu khảo sát ảnh hưởng của các chất kích thích sinh trưởng như auxin
(NAA, IBA, IAA), cytokinine (BA, BAP, TDZ) có ảnh hưởng đến sự phát triển. Theo
Dương Tấn Nhựt (2007), hạt của loài Dendrobium mild yumi được gieo trên môi
trường khác nhau, sau 8 tuần hạt nảy mầm và hình thành protocrom tốt nhất trên môi
trường MS (Murashige và Skoog) có bổ sung NAA 0,5 mg/lít môi trường nền; 20 %
nước dừa và than hoạt tính 1 g/lít môi trường nền. Quá trình chuyển hóa từ protocrom
thành cây hoàn chỉnh diễn ra từ tuần thứ 9 đến tuần thứ 20 trên môi trường tương tự có
bổ sung thêm BA 2,0 mg/lít môi trường nền, ở giai đoạn này phát hoa đã bắt đầu cảm
ứng. Các cây con này hình thành các chồi hoa trên môi trường có sự thay đổi thích hợp
nồng độ các nguyên tố đa lượng.


 
 


 

15

Chương 3
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

3.1 Điều kiện nghiên cứu
3.1.1 Địa điểm
Đề tài được tiến hành tại phòng Công nghệ sinh thực vật của Trung tâm công
nghệ sinh thành phố Hồ Chí Minh.
3.1.2 Thời gian
Các thí nghiệm được tiến hành từ tháng 02/2011 đến tháng 06/2011.
3.2 Vật liệu thí nghiệm
3.2.1 Mẫu nuôi cấy
Mẫu được chọn từ những cành lan 1 năm tuổi, không được quá già và phải đảm
bảo vô trùng, không được nhiễm nấm, bệnh. Mẫu nuôi cấy được cắt thành từng đoạn
khoảng 2 cm.
3.2.2 Thiết bị và dụng cụ thí nghiệm
Phòng chuẩn bị mẫu:
- Tủ sấy dùng để sấy khô các dụng cụ.
- Nồi hấp để hấp vô trùng dụng cụ nuôi cấy và môi trường.
- Tủ lạnh sử dụng để bảo quản hóa chất và môi trường dự trữ.
- Bể rửa chai và ống nghiệm.


 
 


 

16

- Bếp điện dùng để nấu môi trường và hấp cách thủy hóa chất.
- Cân phân tích sử dụng để cân đường agar và hóa chất.
- Máy đo pH.
Phòng cấy: Phòng cấy lớn được khử trùng, tốt nhất bằng đèn cực tím. Bao gồm:
tủ cấy vô trùng, đèn cực tím, giá, bàn để môi trường và mẫu cấy. Các dụng cụ cấy gồm
dao cấy, pince, đèn cồn, bình phun và bông gòn. Tất cả các dụng cụ trên đã được hấp
vô trùng.
Phòng nuôi cây:
- Kệ đặt chai hoặc ống nghiệm nuôi cấy, trên mỗi kệ đều lắp đèn huỳnh quang
dài 1,2 m.
- Máy điều hòa nhiệt độ, đảm bảo nhiệt độ trong phòng nuôi cây là 25 ± 20C.
- Nhiệt kế để đo nhiệt độ phòng nuôi cây.
- Ẩm độ để đo độ ẩm phòng nuôi cây.
Các thành phần trong môi trường MS cơ bản (nền): Nguyên tố đa lượng,
nguyên tố vi lượng, vitamins, Fe - EDTA, đường 30 g/lít môi trường nền, agar 8,5 g/lít
môi trường nền, bổ sung thêm chất điều hòa sinh trưởng như BA, NAA.
Điều kiện nuôi cấy:
- Thời gian chiếu sáng: 16 giờ/ngày. Cường độ ánh sáng: 2.000 – 3.000 lux.
- Nhiệt độ: 25 ± 20C.
- Độ ẩm: 70 - 80 %.