HỘI THI KHOA HỌC KỸ THUẬT VISEF 2015
**************

ĐỀ TÀI DỰ THI KHOA HỌC, KỸ THUẬT
DÀNH CHO HỌC SINH TRUNG HỌC CẤP QUỐC GIA
LẦN THỨ TƯ (NĂM HỌC 2014 – 2015)

Tên đề tài: Nghiên cứu biện pháp tăng sinh khối rễ tơ cây đan sâm (Salvia

miltiorrhiza Bunge) phục vụ ngành công nghiệp dược

NGƯỜI HƯỚNG DẪN
- PGS.TS Nguyễn Thị Phương Thảo
Học viện Nông nghiệp Việt Nam
- GV Trần Thu Hương
Giáo viên Trường THPT
Chuyên Hà Nội – Amsterdam

TÁC GIẢ:
1. Đinh Thục Anh
2. Nguyễn Minh Châu

Hà Nội, tháng 1 năm 2015

Lớp: 11 Sinh
Lớp: 11 Sinh


Nghiên cứu biện pháp tăng sinh khối rễ tơ cây đan sâm phục vụ ngành công nghiệp
dược.
MỤC LỤC

MỤC LỤC................................................................................................
Nghiên cứu biện pháp tăng sinh khối rễ tơ cây đan sâm
(Salvia miltiorrhiza Bunge) phục vụ ngành công nghiệp
dược...........................................................................................................
.....................................................................................................................
TÓM TẮT................................................................................................
Phần I. MỞ ĐẦU..................................................................................
1.ĐẶT VẤN ĐỀ..........................................................................................................................................5
Với những lý do trên, các tác giả đã tiến hành đề tài: “Nghiên cứu biện pháp tăng sinh khối rễ tơ
cây đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge) phục vụ ngành công nghiệp dược.”.......................................6
2. MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU.....................................................................................................................6
3.YÊU CẦU................................................................................................................................................6
4. ĐIỂM MỚI CỦA ĐỀ TÀI.........................................................................................................................6
5. Ý NGHĨA CỦA ĐỀ TÀI............................................................................................................................6

Phần II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU....................................................
Phần III. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP
NGHIÊN CỨU...................................................................................... 18
Thí nghiệm 1. Ảnh hưởng của thành phần môi trường đến sinh khối rễ tơ đan sâm dòng A5.14....19
Thí nghiệm 4. Ảnh hưởng của dạng bình nuôi cấy đến sự tăng sinh khối rễ tơ..................................21

Phần IV. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN.............................................22
1.Ảnh hưởng của thành phần môi trường đến sinh khối rễ tơ đan sâm dòng A5.14........................22
22
2. Ảnh hưởng của trạng thái môi trường đến sự tăng sinh khối rễ tơ đan sâm.................................22
3. Ảnh hưởng của một số yếu tố elicitor đến sự tăng sinh khối rễ tơ và sự tổng hợp hoạt chất mục
tiêu.........................................................................................................................................................23
4. Ảnh hưởng của dạng bình nuôi cấy đến sự tăng sinh khối rễ tơ.....................................................25


Phần V. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...........................................27
I. Kết luận...............................................................................................................................................27

Tài Liệu Tham Khảo..........................................................................28


Nghiên cứu biện pháp tăng sinh khối rễ tơ cây đan sâm phục vụ ngành công nghiệp
dược.
Nghiên cứu biện pháp tăng sinh khối rễ tơ cây đan sâm (Salvia miltiorrhiza
Bunge) phục vụ ngành công nghiệp dược.
Nhóm tác giả:
1.

Đinh Thục Anh (nhóm trưởng) – Lớp 11 Sinh

2.

Nguyễn Minh Châu – Lớp 11 Sinh
Trường THPT Hà Nội - Amsterdam


Nghiên cứu biện pháp tăng sinh khối rễ tơ cây đan sâm phục vụ ngành công nghiệp
dược.

TÓM TẮT
Đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge) là một cây thuốc quý trong y học cổ
truyền. Các nhà khoa học đã tìm ra trong rễ cây đan sâm có hoạt chất
(Crytotanshinone, Tanshinone I, Tanshinone IIA) đáp ứng được nhu cầu điều trị các
bệnh về tim mạch. Tuy nhiên việc trồng và thu hoạch đan sâm cũng như thu nhận hoạt
chất từ rễ cây còn gặp nhiều khó khăn. Bộ môn Công nghệ sinh học thực vật – Học

viện Nông nghiệp Việt Nam đã tạo hệ thống rễ tơ để dễ dàng nhân trồng, tách chiết
hợp chất từ đan sâm. Đề tài này được thực hiện nhằm xác định một số yếu tố môi
trường ảnh hưởng đến việc nhân nuôi rễ tơ cây đan sâm.
Đề tài sử dụng dòng rễ tơ đan sâm chuyển gen A5.14 do Bộ môn Công nghệ
sinh học thực vật – Học viện Nông nghiệp Việt Nam cung cấp, phát triển trên các nền
môi trường nuôi cấy cơ bản (MS, B5) với các trạng thái khác nhau có bổ sung các yếu
tố elicitor khác nhau để khảo sát khả năng tăng trưởng và sự tích lũy hoạt chất mục
tiêu trong rễ tơ đan sâm. Đề tài đã thu được kết quả bước đầu như sau: điều kiện thích
hợp cho việc nhân nuôi sinh khối rễ tơ đan sâm là môi trường B5 bổ sung 3% sucrose
với phương thức nuôi cấy trên môi trường đặc có dịch chiết nấm men (YE) và ABA
thu được nhiều sinh khối nhất; môi trường có bổ sung dịch chiết nấm men (YE) và
methyl jasmonate thu được nhiều hoạt chất nhất; dùng túi nilon để nuôi cấy là thích
hợp và hiệu quả trong điều kiện thực tế. Đã tìm ra quy trình nuôi cấy rễ tơ đan sâm đạt
hiệu quả cao.
Từ khóa: cây đan sâm, Cryptotanshinone, Tanshinone I, Tanshinone IIA,
nuôi cấy sinh khối rễ, rễ tơ.

1


Nghiên cứu biện pháp tăng sinh khối rễ tơ cây đan sâm phục vụ ngành công nghiệp
dược.

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1. Các thành phần hòa tan trong lipid
Bảng 2: Các thành phần hòa tan trong nước
Bảng 3. Thành phần môi trường MS và B5
Bảng 4. Ảnh hưởng của thành phần môi trường nuôi cấy đến sinh khối rễ tơ đan sâm
dòng A5.14 sau 4 tuần nuôi cấy
Bảng 5. Ảnh hưởng của trạng thái môi trường đến sinh khối rễ tơ đan sâm dòng A5.14

sau 4 tuần nuôi cấy
Bảng 6. Ảnh hưởng của yếu tố elicitor đến sinh khối của rễ tơ đan sâm
Bảng 7. Ảnh hưởng của yếu tố elicitor đến sự tích lũy hoạt chất mục tiêu trong rễ tơ
đan sâm
Bảng 8. Ảnh hưởng của dạng bình nuôi đến sự tăng sinh khối rễ tơ

2


Nghiên cứu biện pháp tăng sinh khối rễ tơ cây đan sâm phục vụ ngành công nghiệp
dược.

DANH MỤC HÌNH ẢNH
Hình 1. Hoa Đan sâm
Hình 2. Rễ Đan Sâm
Hình 3. Cây Đan Sâm
Hình 4. Cấu trúc hóa học của Tanshinone I, Tanshinone IIA và Cryptotanshinone
Hình 5. Rễ tơ đan sâm sau 4 tuần nuôi cấy trên môi trường MS, B5
Hình 6. Rễ tơ đan sâm sau 4 tuần nuôi cấy trên môi trường B5 đặc, B5 bán lỏng, B5
lỏng, B5 phân lớp.
Hình 7. Rễ tơ đan sâm sau 5 tuần nuôi cấy và 4 ngày bổ sung các yếu tố elicitor : B5,
B5 + 100 mg/l YE + 50 g/l sorbitol; B5 + 100 mg/l YE + 0.1 mM axit salicylic; B5 +
100 mg/l YE + 0.1 mM methyl jasmonate; B5 + 100 mg/l YE + 0.1 mM ABA
Hình 8. Rễ tơ đan sâm sau 10 tuần nuôi cấy trong bình trụ, bình tam giác, bình chữ
A
B

nhật, và túi nilon.

3



Nghiên cứu biện pháp tăng sinh khối rễ tơ cây đan sâm phục vụ ngành công nghiệp
dược.

DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
ABA: Acid abscisic
Atm: Atmosphere
B5: Gamborg’sB5 (Môi trường dinh dưỡng trung bình)
Cttn: Công thức thí nghiệm

LDL: low – density lipoprotein
MS: Murashige and Skoog
HPCL: Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
YE: Yeast extract (Dịch chiết nấm men)

4


Nghiên cứu biện pháp tăng sinh khối rễ tơ cây đan sâm phục vụ ngành công nghiệp
dược.

Phần I. MỞ ĐẦU
1. ĐẶT VẤN ĐỀ
Sự phát triển của đời sống hiện đại cùng với quá trình công nghiệp hóa – hiện
đại hóa dẫn đến sự xói mòn và ô nhiễm môi trường mà con người gây ra, đi kèm theo
là sự xuất hiện của nhiều loại bệnh, trong đó sự gia tăng các bệnh liên quan đến tim
mạch rất đáng quan ngại.
Chính vì thế việc tìm kiếm các hoạt chất phục vụ cho việc chữa bệnh tim mạch
được các nhà khoa học nhiều quốc gia trên thế giới quan tâm tìm kiếm. Ngày xưa có

câu “Nhất vị đan sâm, cộng đồng tứ vật thang”; nghĩa là một vị đan bằng bốn vị: đơn
quy, địa hoàng, xuyên khung, bạc thược – vốn là bài thuốc huyết kinh điển của Đông
y. Đan sâm được sử dụng trong nhiều thế kỷ để điều trị các bệnh tim mạch như đau
thắt ngực, nhồi máu cơ tim và đột quỵ (Ủy ban dược điển Trung Quốc, 2005).
Ở Việt Nam, cây đan sâm vẫn còn phải nhập gần như 100% nguồn từ Trung
Quốc nên giá trị gia tăng của loài cây này trở nên lớn hơn và lại kèm theo rủi ro hay
sai phạm trong quá trình sản xuất và vận chuyển như không kiểm soát được chất lượng
sản phẩm, sự nhiễm kim loại nặng, dư lượng thuốc trừ sâu, bị thay thế bằng các loại
thuốc thảo dược khác, đã được thông báo rộng rãi (Drew và Myers 1997) . Nếu nuôi
trồng bằng phương pháp hữu tính và khai thác trong điều kiện tự nhiên tại Việt Nam
thì phải mất ít nhất hai năm, đồng thời lại chịu ảnh hưởng của thời tiết, các loại dịch
bệnh và sự ô nhiễm môi trường. Bên cạnh đó, quỹ đất dành cho việc phát triển cây
dược liệu ngày càng bị thu hẹp, sự cạnh tranh từ các ngành cây trồng khác dẫn đến số
lượng thành phẩm thu được không đáp ứng đủ nhu cầu.
Việc phát triển và áp dụng kĩ thuật công nghệ sinh học như nuôi cấy rễ bất định,
rễ tơ… vào sản xuất, thu nhận các hợp chất có hoạt tính sinh học đã và đang được
nghiên cứu, thử nghiệm rộng rãi trên thế giới như một trong những giải pháp tiềm
năng để đáp ứng nhu cầu thảo dược, khắc phục các khó khăn khi nhân nuôi bằng
phương pháp truyền thống. Các nhà khoa học Việt Nam đã nghiên cứu và hoàn thiện
quy trình nhân giống vô tính cây sâm Ngọc Linh, rút ngắn thời gian trồng mà vẫn có
đầy đủ lượng hoạt chất saponin ở thân, củ, rễ… như cây thu hoạch trong tự nhiên. Vậy
tại sao chúng ta không thay cho các phương pháp truyền thống nhiều rủi ro bằng cách
áp dụng kỹ thuật công nghệ sinh học vào sản xuất các hợp chất thứ cấp chất lượng
cao? Dù đòi hỏi chi phí ban đầu và đội ngũ kỹ thuật viên trình độ cao nhưng đây chính
là một trong những chìa khóa mở ra cánh cửa của nền công nghiệp dược liệu sạch
trong tương lai. Phương pháp nuôi cấy rễ tơ với những ưu điểm vượt bậc hứa hẹn là
một hướng đi đầy triển vọng.
5



Nghiên cứu biện pháp tăng sinh khối rễ tơ cây đan sâm phục vụ ngành công nghiệp
dược.
Với những lý do trên, các tác giả đã tiến hành đề tài: “Nghiên cứu biện pháp
tăng sinh khối rễ tơ cây đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge) phục vụ ngành công
nghiệp dược.”
2.

MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU

Tìm biện pháp tăng sinh khối rễ tơ cây đan sâm qua việc nghiên cứu các nhân
tố ảnh hưởng đến việc nhân nuôi rễ tơ đan sâm.
3. YÊU CẦU
-

Đánh giá ảnh hưởng của một số yếu tố trong môi trường nuôi cấy đến sự
tăng sinh khối từ đó xác định hoạt chất mục tiêu của dòng rễ tơ tạo được.
- Bước đầu thiết lập được mô hình nuôi cấy sinh khối rễ tơ in vitro qui mô nhỏ
đạt hiệu quả cao.
4. ĐIỂM MỚI CỦA ĐỀ TÀI
- Phát hiện các nhân tố ảnh hưởng đến sự tăng sinh khối rễ tơ cây đan sâm nuôi
cấy tại Việt Nam.
- Lần đầu tiên nuôi cấy rễ tơ đan sâm tại Việt Nam.
5. Ý NGHĨA CỦA ĐỀ TÀI
• Về sức khỏe con người: Tạo cơ sở khoa học để phát triển nguồn dược liệu
sạch, chất lượng cao phục vụ cho việc phòng và điều trị một số bệnh tim mạch
hoặc bệnh ung thư.
• Về mặt kinh tế: Giảm chi phí sản xuất bằng cách khắc phục khó khăn khi nhân
nuôi bằng phương pháp truyền thống; biện pháp này cho năng suất cao, thu
nhận sản phẩm dễ dàng, rút ngắn thời gian nuôi trồng…
• Về môi trường: Chủ động tạo ra nguồn đan sâm sạch, chất lượng cao, qua đó

làm giảm nguy cơ khai thác quá mức nguồn đan sâm trong tự nhiên
• Về mặt nghiên cứu khoa học: Làm tiền đề cho quy trình sản xuất các hoạt
chất có hoạt tính sinh học từ cây đan sâm, góp phần phát triển ngành công
nghiệp dược liệu Việt Nam.

6


Nghiên cứu biện pháp tăng sinh khối rễ tơ cây đan sâm phục vụ ngành công nghiệp
dược.

Phần II. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.

Sơ lược về cây đan sâm

Đan sâm (Salvia miltiorrhiza Bunge) hay còn gọi là huyết sâm, xích sâm, huyết
căn, cứu thảo... là một loài thực vật sống lâu năm, là loài bản địa của cả Trung Quốc
và Nhật Bản. Sinh sống tại các khu vực có độ cao từ 90 tới 1.200 m so với mực nước
biển, ưa các môi trường nhiều cỏ trong rừng, sườn núi, dọc các bờ suối. Vỏ ngoài của
rễ cái có màu đỏ, là phần được sử dụng trong y học. Phần tên gọi cho loài
miltiorrhiza có nghĩa là "nước màu đỏ chiết ra từ rễ". Tên Trung Quốc của Danshen
chứa nhiều ý nghĩa. Dan là thuật ngữ dùng để mô tả cinnabarit (khoáng chất của thủy
ngân trong tự nhiên), chẳng hạn như dansha tức là cát đỏ. Nó cũng giống màu đỏ của
rễ đan sâm. Hơn nữa dan có thể đã được sử dụng để chỉ giá trị cao của đan sâm, như
vtthường được coi là nguyên liệu chính của loại thuốc Trung Quốc. Mặt khác, Shen đề
cập đến nhân sâm hoặc Renshen được coi là loại thảo dược quý giá ở Trung Quốc từ
lâu. Đan sâm lần đầu tiên được ghi lại trong thần nông bảo thảo kinh được xếp hạng
cao, được mô tả “ nó là cái lạnh buốt và nhẹ. Nó không độc hại và chủ yếu xử lí ác khí
trong tim và bụng, ruột liên tục ríu rít như chạy nước, nó cũng phá vỡ sự ngưng kết,

loại bỏ những kết dính, làm giảm sự khó chịu, và tăng cường lưu thông khí huyết”.
Tại Trung Quốc, đan sâm được trồng ở tỉnh tứ xuyên khoảng 100 năm về trước và
được trồng phổ biến ở các tỉnh Sơn Đông, Hà Nam, Hà Bắc, Liên Ninh, Giang Tô,
Chiết Giang, Giang Tây, Tứ Xuyên, Hồ Bắc , Quý Châu , Quảng Đông, Sơn Tây.
Huyện Shangluo, nằm ở tỉnh Sơn Tây, Trung Quốc là khu vực sản xuất đan sâm lớn
nhất Trung Quốc. Cây cũng được trồng ở Nhật Bản, Triều Tiên và Đức. Cây đan sâm
trồng ở nước ta có nguồn gốc từ Trung Quốc. Cây trồng ở Trại thuốc Sa Pa (VDL) tỏ
ra thích nghi với điều kiện khí hậu nhiệt đới vùng núi cao. Một số cây đưa xuống Trại
thuốc Tam Đảo (VDL) sinh trưởng kém hơn. Nhưng những cây này chưa được đưa
vào sản xuất, cây còn lưu lại ở Sa Pa chỉ có ý nghĩa để giữ giống nên hiện nay ta vẫn
phải dùng thuốc nhập từ Trung Quốc. Mùa hoa đan sâm kéo dài từ tháng 5-8, mùa quả
rễ tháng 6-9. Rễ đan sâm được thu hoạch vào mùa đông, đào rễ về rửa sạch đất, cắt bỏ
cây và rễ con, phơi hoặc sấy khô.

7


Nghiên cứu biện pháp tăng sinh khối rễ tơ cây đan sâm phục vụ ngành công nghiệp
dược.
2. Phân loại cây đan sâm
Giới (regnum)

Plantae

Ngành

Angiospermae

Lớp


Dicotyledones

Phân lớp

Asteridae

Bộ (ordo)

Lamiales

Họ (familia)

Lamiaceae

Chi (genus)

Salvia

Loài (species)

Salvia miltiorrhiza

3. Đặc điểm thực vật học
Đan sâm là loại cây sống lâu năm có thân phân thành nhiều cành, nhánh nhỏ,
cao 30-70 cm. Thân cây vuông cạnh, có những vệt chạy dọc theo thân. Toàn thân phủ
lớp lông mỏng hơi hanh vàng. Lá thuộc loại kép lông chim lẻ, 3-5 lá chét, mọc đối. Lá
chét giữa thường lớn. Phiến lá có lông mịn , xung quanh cuống lá thường có 5 lá nhỏ ít
khi 3 lá. Lá ở đỉnh thường lớn hơn các lá bên. Phiến lá hình trứng, dài 2-7 cm, rộng
0.8-5 cm. Đầu lá nhọn, mép lá có nhiều răng cưa.
Mặt phải phiến lá màu xanh lục, mặt trái màu nhạt

hơn. Hoa mọc thành chùm ở đầu cành hoặc kẽ lá,
gồm nhiều vòng chỗ dày, chỗ thưa xếp thành tầng
dọc.
Hoa mọc vòng, mỗi vòng 3-10 hoa, thường
là 5 hoa. Hoa màu hồng tím nhạt. Tràng hoa chẻ
đôi, dài 2-3 cm, màu xanh nhạt , pha màu tím phớt.
Môi trên phát triển, cong hình lưỡi liềm. Môi dưới
Hình 1. Hoa Đan sâm
ngắn hơn môi trên, xẻ ra thành 3 thùy, thùy giữa có răng cưa tròn. Hai nhị ở môi dưới,
bầu có vòi dài lòi ra ở môi trên. Quả nhỏ, thuôn dài, dài 3mm, rộng 1.5mm.
Rễ đan sâm được phát triển từ thân rễ chính,
rễ nhỏ hình trụ, dài 10-20cm, đường kính 0.5-1.5cm. Rễ đâm ăn sâu xuống đất, cong
queo, có khi phân nhánh và có rễ con dạng tua nhỏ. Rễ có màu đỏ tối, mặt ngoài nhăn
nheo tạo thành rãnh nhỏ sóng song xuôi theo chiều dài của rễ. Sau lớp vỏ mỏng là lớp
cùi mềm màu nâu sẫm, giữa là những thớ dọc màu vàng ngà xếp theo thớ hướng tâm
như hình nan hoa xe đạp (những thớ từ vỏ ngoài chụm lại lõi đều đặn) xen kẽ là chất
deo dẻo sẫm màu làm cho gân thớ càng nổi bật và rễ thêm mềm. Chất cứng và giòn,
8


Nghiên cứu biện pháp tăng sinh khối rễ tơ cây đan sâm phục vụ ngành công nghiệp
dược.
mặt bẻ gẫy không chắc có vết nứt, hoặc hơi phẳng, phần vỏ màu đỏ nâu và phần gỗ
màu vàng xám hoặc nâu tía vs bó mạch màu trắng vàng, xếp theo hướng xuyên tâm.
Rễ đan sâm có mùi nhẹ, vị hơi đắng.
Về mặt vi phẫu rễ, lớp bần gồm nhiều lớp tế bào có thành dày, bị hẹp. Mô mềm
vỏ dày cấu tạo bởi tế bào hình tròn hay bầu dục, thành mỏng, xếp đều đặn theo hướng
tiếp tuyến. Libe cấp 2 gồm nhiều tế bào nhỏ, thành mỏng xếp đều đặn và liên tục thành
vòng tròn và tập trung dày hơn ở chỗ tương ứng với các nhánh gỗ. Tia ruột rộng, mỗi
tia gồm 6-35 dãy tế bào có thành mỏng, xếp theo hướng xuyên tâm từ gần trung tâm

xuyên qua gỗ đến libe cấp 2 .

Hình 2. Rễ Đan Sâm
4.

Hình 3. Cây Đan Sâm

Giá trị dược liệu

4.1 . Thành phần hóa học
Hơn 80 hợp chất khác nhau đã được xác định trong đan sâm, 50 trong số đó là
hợp chất hòa tan trong nước, 30 hợp chất còn lại tan trong lipit (Zhou và cs, 2005).
Các thành phần tan trong lipit là các hợp chất diterpene khung naphthoquinone (nhóm
tanshinones), trong đó hai hợp chất quan trọng là tanshinone IIA và cryptotanshinone.
Các thành phần hòa tan trong nước gồm nhiều (lên đến 15) axit polyphenolic bao gồm
axit salvianolic, aldehyde và protocatechuic acid, và axit salvianic A (danshensu). Hợp
chất đáng chú ý khác là beta- sitosterol, axit ursolic, Vitamin E. Trong số các hợp chất
này , những hợp chất có giá trị dược lý cao là axit salvinoic và tanshinones.
4.1.1 Thành phần hòa tan trong lipid
Thành phần chính là các quinon diterpenoit của tashinones. Tashinones I (C0
18H12O3 ) có nhiệt độ nóng chảy 231 C, tashinones II (C19H20O3) có nhiệt độ nóng chảy
216oC, tashinones III (C19H20O3 ) có nhiệt độ nóng chảy 182oC là chất tạo ra màu nâu
đỏ của rễ được Nakao và Fukushima lần đầu tiên chiết xuất từ năm 1934 (Nakao và
Fukushima, 1934). Hiện nay, hoạt tính sinh học của các thành phần hòa tan trong lipid
đã và đang được tiến hành nghiên cứu và thử nghiệm lâm sàng, các thành phần này có
9


Nghiên cứu biện pháp tăng sinh khối rễ tơ cây đan sâm phục vụ ngành công nghiệp
dược.

nhiều hoạt tính sinh học như: chống thiếu máu cục bộ, chống oxy hóa kháng khuẩn,
chống đông máu, hạ huyết áp và đặc tính kháng u .

Hình 4 : Cấu trúc hóa học của Tanshinone I, Tanshinone IIA và
Cryptotanshinone

Bảng 1. Các thành phần hòa tan trong lipid
Nhóm

Hoạt chất

Tài liệu tham khảo
10


Nghiên cứu biện pháp tăng sinh khối rễ tơ cây đan sâm phục vụ ngành công nghiệp
dược.
Ortho-quinones

Para- quinones

Các deterpenes
khác

Tanshinone I

Nakao và
Fukushima,1934 ;
Wessele và Wang,1940


Tanshinone IIA

Takiura 1941; Okumura
và cộng sự 1961

Tanshinone IIB

Takiura 1941; Bailie và
Thomson, 1968

Cryptotanshinote

Takiura 1941

Methyltanshinonate

Kakisawa và cộng sự ,
1968

Isotanshinone I và IIA

Kakisawa và cộng sự
1969

Isotanshinone IIB

Lee và cộng sự , 1987

Isocryptotanshinone


Kakisawa và cộng sự ,
1969

Danshenxinkun A,B,C

Fang và cộng sự 1976

Danshenxinkun D

Luo và cộng sự 1985

Dihydroisotanshinone I

Kong và cộng sự 1987

Neocryptotanshinone

Lee và cộng sự 1987

Neocryptotanshinone II

Lin và Chang , 2000

Các thành phần diterpene của đan sâm được phân thành ba nhóm, bao gồm
orthoquinones, paraquinone và các thành phần diterpene khác. Các thành phần chính
diterpene của đan sâm được tóm tắt trong bảng 1. Tanshinone IIA, Tanshinone I và
Cryptotanshinone là những thành phần chính trong nhóm orthoquinon. Hợp chất
paraquinone, ví dụ như isotanshinone I, isotanshinone II và isocryptotanshinone, có
lượng rất thấp trong đan sâm. Các hợp chất diterpene khác như neocryptotanshinone
có hàm lượng ít. Cho tới nay, từ rễ đan sâm hơn 40 hợp chất nhóm diterpene đã được

phân lập và xác định cấu trúc hóa học.

4.1.2. Thành phần hòa tan trong nước
Axit caffeic và các dẫn xuất của nó là thành phần chính trong nhóm hợp chất
hòa tan trong nước của đan sâm. Axit caffeic là bộ khung tạo các dẫn xuất từ nhiều
monomer đơn giản đến sự kết tụ của nhiều oliogomer. 25 dẫn suất của axit caffeic đã
11


Nghiên cứu biện pháp tăng sinh khối rễ tơ cây đan sâm phục vụ ngành công nghiệp
dược.
được phân lập và xác định từ đan sâm (Lu và Foo, 2002; Jiang và cộng sự, 2005a).
Theo số lượng đơn vị axit caffeic, có thể chia các dẫn xuất của axit caffeic thành 4
nhóm: monomer, dimer, trimer và tetramer.

Bảng 2: Các thành phần hòa tan trong nước
Nhóm

Hoạt chất

Tài liệu tham khảo

Axit caffeic và các dẫn

Axit caffeic

Jiang và cộng sự , 2005
12



Nghiên cứu biện pháp tăng sinh khối rễ tơ cây đan sâm phục vụ ngành công nghiệp
dược.
xuất monomer

3-(3,4-dyhydrophenyI) axit
lactic

Yang và Zhang , 1981

3-(3,4-dyhydrophenyI)
lactamide

Jiang và cộng sự ,2005

Isoferulic
Dẫn xuất dimer của
axit caffeic

Axit rosmarinic

Scarpati, 1958; Zou và
cộng sự 1993

Methyl rosmarinate

Kohda và cộng sự 1989, Li
và cộng sự ,1993

Axit salvianolic C,D,F và G


Jiang và cộng sự 2005

Axit prolithospermic
Dẫn xuất trimer của
axit caffeic

Axit salvianolic A

Lin và cộng sự 2006; Liu
và cộng sự 2006

Axit salvianolic B

Jiang và cộng sự 2005

Axit lithospermic

Kohda và cộng sự 1989,
Kim và cộng sự 2005, Liu
và cộng sự 2006

Axit lithospermic
monomethyl ester

Kohda và cộng sự ,1989

Axit lithospermic dimethyl
ester
Dẫn xuất tetramer


Axit salvianolic E và axit
salvianolic B

Li và cộng sự ,2004; Liu và
cộng sự ,2006

Methyl lithospermate B
Magnesium lithospermate B
Amonium postassium
lithospermate B

Tanaka và cộng sự ,1989

13


Nghiên cứu biện pháp tăng sinh khối rễ tơ cây đan sâm phục vụ ngành công nghiệp
dược.
4.1 Hoạt tính dược lý

Axit caffeic

Salvianic axit A
(Danshensu)

Salvionolic axit B

Được tìm thấy nhiều trong nhiều loại thực vật và thực
phẩm. Nó có tác dụng chống oxy hóa và chống viêm,
ảnh hưởng đến hệ miễn dịch trong cơ thể. Các nghiên

cứu trong phòng thí nghiệm cho thấy nó có thể làm
giảm sự tăng trưởng của tế bào ung thư và virus.

Có thể làm giãn động mạch vành , ức chế sự kết tập
tiểu cầu , cải thiện vi tuần hoàn và bảo vệ cơ tim sau
chấn thương. Nó cũng có thể ức chế quá trình gây
chết tế bào cơ tim trong khi bảo vệ các tế bào khỏi các
gốc tự do và làm giảm Homocysteine..
Góp phần bảo vệ tim bằng cách ức chế quá trình oxy
hóa của các protein LDL (ngăn chặn sự hấp thu của
các đại thực bào) và ức chế kết tụ tiểu cầu. Nó cũng
có thể ức chế angiotension –II gồm hyperplasmia,
hoạt động của kinase của protein kích hoạt stress
(SAP). Nó cũng có tác dụng bảo vệ chống lại các tổn
thương não thiếu máu cục bộ, tái cung cấp máu

Có thể làm giảm nguy cơ nhồi máu cơ tim và phì đại
tế bào tim (thông qua sự ức chế angiotension II). Nó
cũng là một chất chống oxy hóa trong màng ty thể cơ
tim và chống lại quá trình oxy hóa của các protein
LDL. Làm chậm quá trình truyền các xung thần kinh
trong tim, làm chậm nhịp đập trong khi tăng phân suất
Tanshinone IIA
tống máu của tim, hoặc làm giảm lượng máu tim
bơm vào các mạch máu. Nó ngăn cản sự hình thành
các cục máu đông trong mạch máu và làm giảm
cholesterol trong máu, chỉ số triglycerid. Nó được sử
dụng để nâng cao hiệu quả sức khỏe tim mạch từ tác
động của các axit béo không bão hòa và bảo vệ các tế
bào tim và thần kinh khỏi các gốc tự do

Tóm lại hoạt tính dược lý của đan sâm là :
- Hoạt động chống vi khuẩn
14


Nghiên cứu biện pháp tăng sinh khối rễ tơ cây đan sâm phục vụ ngành công nghiệp
dược.
- Hoạt động hỗ trợ, bảo vệ tim mạch
- Hoạt tính kháng viêm
- Cảm ứng quá trình tự chết của tế bào, dẫn đến khả năng tiêu diệt khối u
- Hoạt tính bảo vệ thần kinh
- Hoạt động chống oxi hóa
- Bảo vệ chống lại chứng thiếu máu cục bộ ở não và tim và sự tái cung cấp máu
5. Tình hình sản xuất và tiêu thụ đan sâm
Dược điển Trung Quốc cho biết rễ đan sâm đã được sử dụng trong y học cổ
truyền từ nhiều thế kỉ. Trong hai thập kỉ gần đây, việc sử dụng rộng rãi các sản phẩm
hòa tan trong nước của đan sâm làm gia tăng nhanh chóng nhu cầu dược liệu đan sâm.
Nếu như năm 1998, nhu cầu đan sâm trên thế giới ở mức 4500 tấn/năm thì nay con số
đã lên tới 15000 tấn/năm. Có tới 80% công ty dược và bệnh viện y học Trung Quốc có
nhu cầu về dược liệu đan sâm (Qin, 2006). Từ đan sâm đã tạo ra gần 100 chủng loại
thuốc Đông y đặc biệt trong đó có thuốc tiêm nước đan sâm, viên xông van tim, viên
xông dãn tim... và nhiều loại thực phẩm chức năng.
Năm 2002, nhu cầu của nguyên liệu đan sâm là 10000 tấn trên toàn thế giới,
trong đó 8000 tấn tiêu thụ ở Trung Quốc (Wei, 2002). Theo số liệu thống kê của Hải
quan Trung Quốc, tổng xuất khẩu của các loại thuốc thảo dược của Trung Quốc trong
năm 2005 là hơn 8 tỷ USD trong số đó 3,38 tỷ USD đối với nguyên liệu thảo dược thô.
6. Các nghiên cứu về cây Đan Sâm ở Việt Nam
Nghiên cứu nhân giống và trồng di thực cây đan sâm (Salvia miltiorrhiza
Bunge) có nguồn gốc Tứ Xuyên Trung Quốc tại Việt Nam. Cấp Bộ Y tế Nghiên cứu
nhân giống và trồng thử trên các vùng trồng khác nhau.

Định tính và định lượng tanshinon IIA trong cao đặc hỗn hợp hoàng kỳ và đan
sâm bằng sắc ký lớp mỏng và sắc ký lỏng cao áp: phân tích Tanshinon IIA trong hỗn
hợp chiết xuất từ Radix Salvia miltiorrhizae và Radix Astragali bởi TLC và HPLC.
Tanshinon IIA trong hỗn hợp chiết xuất từ Radix Salviae miltiorrhizae và Radix
Astragali được xác định theo các điều kiện phân tích 0,559 % trong hỗn hợp với nồng
độ cồn 80%
Nghiên cứu tác dụng của hỗn hợp cao chiết từ các dược liệu bạch quả, hoàng
kỳ, đan sâm và đương quy lên một số chỉ tiêu tim mạch, huyết áp và đông máu trên
chuột thực nghiêm: Nghiên cứu để tìm ra các loại thuốc truyền thống có hiệu quả điều
trị suy tuần hoàn não. Kết quả cho thấy chất chiết xuất từ dầu thô hỗn hợp (Ginkgo
biloba Lin, Radix Astragali, Radix Salviae miltiorhiza, Radix Angelicae sinensis) đã
15


Nghiên cứu biện pháp tăng sinh khối rễ tơ cây đan sâm phục vụ ngành công nghiệp
dược.
cải thiện suy tuần hoàn não; tăng co tim; tăng thời gian prothrombia nhưng không có
thay đổi trong huyết áp động mạch.
5. Rễ tơ
Rễ tơ được tạo ra do sự chuyển gen sử dụng hệ thống vector tự nhiên từ tác
nhân bệnh - Agrobacterium rhizogenes, vi khuẩn đất gram âm vào tế bào thực vật. Rễ
tơ đặc trưng bởi sự phát triển nhanh, không hướng đất, không phụ thuộc vào chất điều
hòa tăng trưởng ngoại sinh, và bền vững về mặt di truyền. Các yếu tố ảnh hưởng đến
quá trình tạo rễ tơ: độ tuổi cây, loại mô, loại cây, chủng vi sinh vật, thời gian nuôi cấy,
thời gian ngâm mẫu.
Nuôi cấy rễ tơ được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như sản xuất hợp chất thứ
cấp, tạo giống cây trồng mới, mô hình nghiên cứu phytoremediation, tìm hiểu con
đường sinh tổng hợp hợp chất có hoạt tính sinh học, nghiên cứu sinh lý của rễ và sản
xuất protein tái tổ hợp. Trong đó, sản xuất hợp chất thứ cấp từ rễ tơ được tập trung
nghiên cứu nhiều nhất.

6. Nghiên cứu cảm ứng và nuôi cấy rễ tơ đan sâm.
8.1. Cảm ứng tạo rễ tơ nhờ vi khuẩn A.Rhizogenes
Agrobacterium rhizogenes (Tên cũ Phytomonas rhizogenes ) được định danh
lần đầu tiên cách đâu hơn 70 năm (White, 1972), là vi khuẩn đất, hình que Gram âm,
thuộc chi Agrobacterium, tác nhân gây bệnh tạo rễ tơ ở thực vật
Rễ tơ là rễ thực vật chuyển gen nhờ lây nhiễm mô thực vật với vi khuẩn
Agrobacterium rhizogenes, do đặc điểm của rễ tơ là sinh trưởng nhanh mà không cần
bổ sung hormone sinh trưởng và có tính ổn định di truyền cao nên nuôi cấy rễ tơ là là
phương pháp thuận tiện và hiệu quả cho nghiên cứu và phát triển khoa học cũng như
công nghệ sinh học thực vật, đặc biệt nó hứa hẹn mang lại hệ thống sản xuất sinh khối
ưu việt cho các cây dược liệu. Hu và Alfermann (1993) đã tiến hành tạo rễ Salvia
miltiorrhiza chuyển gen bằng cách lây nhiễm các bộ phận của cây được nuôi cấy trong
điều kiện vô trùng với các chủng vi khuẩn Agrobacterium rhizogenes khác nhau.
Nghiên cứu này đã chỉ ra rằng các chủng vi khuẩn khác nhau có ảnh hưởng khác nhau
đến khả năng cảm ứng rễ tơ từ lá cây đan sâm, chủng vi khuẩn LBA 9402 có mang
plasmid pRi 1855 cảm ứng tạo rễ tơ tốt nhất.
8.2 Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nhân nuôi rễ tơ đan sâm
Sự kích kháng bảo vệ thực vật (elicitation): Thực vật sản xuất các hợp chất thứ
cấp trong tự nhiên như một bộ máy bảo vệ chống lại các yếu tố gây bệnh. Chất kích
kháng bảo vệ thực vật (elicitor) báo hiệu việc hình thành các hợp chất thứ cấp. Sử
dụng các elicitor của bộ máy bảo vệ cây, tức sự kích kháng bảo vệ thực vật, là phương
16


Nghiên cứu biện pháp tăng sinh khối rễ tơ cây đan sâm phục vụ ngành công nghiệp
dược.
thức để thu được các sản phẩm hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học một cách hiệu
quả nhất. Sử dụng các elicitor sinh học và phi sinh học (được phân loại dựa trên nguồn
gốc của chúng) để kích thích hình thành các hợp chất thứ cấp trong quá trình nuôi cấy
tế bào, có thể giúp rút ngắn thời gian và đạt hiệu suất cao. Nhằm nâng cao sự tổng hợp

tanshinone và các sản phẩm thứ cấp, Chen và cs (2001) đã tiến hành nghiên cứu sự
ảnh hưởng của dịch chiết nấm men đến sự tăng trưởng và tổng hợp các hợp chất thứ
cấp trong nuôi cây rễ tơ cây đan sâm. Nghiên cứu này cho thấy rằng, khi sử dụng dịch
chiết nấm men (YE), sự tích lũy hai loại axit phenolic và tanshinones được tăng
cường.
Yan và cộng sự (2005) đã sử dụng 3 yếu tố là elicitor (YE), sự hấp thụ tại chỗ
tanshinone (in situ adsorption) sử dụng resin trùng hợp kị nước (X-5) và chế độ điều
khiển bán liên tục. Nghiên cứu cho thấy việc xử lý YE kích thích quá trình sinh tổng
hợp tanshinone, làm tăng hàm lượng tanshinone tổng số (gồm 3 loại tanshinone chính
là cryptotanshinone, tanshinone I và tanshinone IIA) trong rễ lên gấp khoảng hai lần.
Việc bổ sung X-5 resins vào môi trường nuôi cấy chỉ làm tăng một lượng nhỏ
tanshinone nhưng giúp thu lại trên 80% từ rễ.
Hsia và cộng sự (2007) đã nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ đường (sucrose)
tới sự sinh trưởng của rễ tơ đan sâm với dải công thức từ 0-6% sucrose và kết luận sự
phát triển của rễ tơ đan sâm tăng lên theo sự tăng nồng độ của đường. Khối lượng tươi
và khối lượng khô của rễ đan sâm thu được cao nhất ở công thức 6% sucrose sau 6
tuần nuôi cấy.

17


Nghiên cứu biện pháp tăng sinh khối rễ tơ cây đan sâm phục vụ ngành công nghiệp
dược.

Phần III. VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN
CỨU
1.

Vật liệu nghiên cứu


Dòng rễ tơ đan sâm chuyển gen A5.14 do Bộ môn Công nghệ sinh học thực vật
– Học viện Nông nghiệp Việt Nam cung cấp.
2.

Địa điểm và thời gian nghiên cứu:

Địa điểm: Phòng thí nghiệm Bộ môn Công nghệ Sinh học Thực vật – Khoa
Công nghệ Sinh học – Trường Đại Học Nông Nghiệp Hà Nội
-

-

Thời gian: Từ tháng 6 đến tháng 11 năm 2014

3.

Phương pháp và nội dung nghiên cứu

3.1

Phương pháp nghiên cứu
3.1.1 Phương pháp nhân nuôi rễ tơ

Rễ tơ được nuôi cấy trên các môi trường (MS, B5) với các trạng thái môi
trường khác nhau (đặc, lỏng, bán lỏng và phân lớp) có bổ sung chất điều tiết sinh
trưởng hoặc các yếu tố elicitor khác nhau để khảo sát khả năng tăng trưởng và sự tích
lũy hoạt chất mục tiêu (Cryptotanshinone, Tanshinone I, Tanshinone IIA) trong rễ tơ
đan sâm.
Môi trường đặc là môi trường chứa 0,7 % agar, môi trường bán lỏng chứa 0,35
% agar. Môi trường phân lớp là môi trường có pha đặc (25 ml) ở dưới và pha lỏng (25

ml) ở trên.
Môi trường nuôi cấy được điều chỉnh pH = 5,8 trước khi hấp khử trùng ở nhiệt
độ 1210C trong 20 phút, 1,1 atm. Điều kiện nuôi cấy in vitro: 14h sáng, cường độ ánh
sáng 2000-2500 lux, nhiệt độ 25 ± 20C
3.1.2 Phương pháp xác định khối lượng rễ khô
Rễ tơ sau khi thu sinh khối được sấy ở nhiệt độ 45 0C đến khối lượng không đổi
để xác khối lượng rễ khô (Ge và cs., 2005).
3.1.3 Phương pháp phân tích hoạt chất mục tiêu
Các hoạt chất mục tiêu (Cryptotanshinone, Tanshinone I, Tanshinone IIA) được
phân tích bằng phương pháp sắc ký lỏng cao áp (HPLC).

3.1.4 Phương pháp bố trí thí nghiệm và xử lý số liệu
18


Nghiên cứu biện pháp tăng sinh khối rễ tơ cây đan sâm phục vụ ngành công nghiệp
dược.
Các thí nghiệm nhân được bố trí nhắc lại 3 lần mỗi công thức, mồi lần 10-20
mẫu tùy từng thí nghiệm. Các chỉ tiêu được theo dõi và đo đếm sau 5-10 tuần.
Số liệu được xử lý thống kê theo chương trình Excel

3.2

Nội dung nghiên cứu

3.2.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường nuôi cấy đến sự tăng
sinh khối và hàm lượng hoạt chất mục tiêu.
Thí nghiệm 1. Ảnh hưởng của thành phần môi trường đến sinh khối rễ tơ đan sâm
dòng A5.14
CTTN


Môi trường nền

CT1

MS

CT2

B5

Thành phần của môi trường MS và B5 theo như bảng sau:
Bảng 3. Thành phần môi trường MS và B5
Thành phần

Môi trường
Murashige và Skoog (MS)

Gamborg (B5)

Khoáng đa lượng (Mg/l)
NH4NO3

1650

-

NH4SO4

-


134

CaCl2.2H2O

332,2

150

MgSO4.7H2O

370

250

KNO3

1900

2500

KH2PO4

170

-

NaH2PO4

-


130,5
Khoáng vi lượng (Mg/l)

H3PO3

6,2

3,0

CoCl2.6H2O

0,025

0,025

CuSO4.5H2O

0,025

0,025

Na2EDTA

37,3

37,3

FeSO4.7H2O


27,8

27,8

MnSO4.H2O

16,9

10,0

KI

0,83

0,75

Na2MoO4.2H2O

0,25

0,25
19


Nghiên cứu biện pháp tăng sinh khối rễ tơ cây đan sâm phục vụ ngành công nghiệp
dược.
ZnSO4.7H2O

8,6


2,0
Chất hữu cơ (Mg/l)

Myo-inositol

100

100

Glycine

2,0

-

Axit nicotinic

0,5

1,0

Vitamin B1

0,5

0,1

Vitamin B6

0,1


10,0

3.2.2. Nghiên cứu sản xuất sinh khối rễ tơ trong một số hệ thống nuôi cấy khác
nhau
Thí nghiệm 2. Ảnh hưởng của trạng thái môi trường đến sự tăng sinh khối rễ tơ đan
sâm
CTTN

Trạng thái môi trường

CT3

Đặc

CT4

Bán lỏng

CT5

Lỏng, tĩnh

CT6

Phân lớp

Thí nghiệm 3. Ảnh hưởng của một số yếu tố elicitor đến sự tăng sinh khối rễ tơ và sự
tổng hợp hoạt chất mục tiêu
Công thức


Elicitor

CT7

Đối chứng (B5)

CT8

B5 + 100 mg/l YE + 50 g/l sorbitol

CT9

B5 + 100 mg/l YE + 0.1 mM axit salicylic

CT10

B5 + 100 mg/l YE + 0.1 mM methyl jasmonate
20


Nghiên cứu biện pháp tăng sinh khối rễ tơ cây đan sâm phục vụ ngành công nghiệp
dược.
CT11

B5 + 100 mg/l YE + 0.1 mM ABA

Thí nghiệm 4. Ảnh hưởng của dạng bình nuôi cấy đến sự tăng sinh khối rễ tơ
Công thức


Dạng bình nuôi cấy

CT12

Bình trụ

CT13

Bình tam giác

CT14

Bình chữ nhật

CT15

Túi nilon

21


Nghiên cứu biện pháp tăng sinh khối rễ tơ cây đan sâm phục vụ ngành công nghiệp
dược.

Phần IV. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
1.

Ảnh hưởng của thành phần môi trường đến sinh khối rễ tơ đan sâm dòng

A5.14

Trong số các dòng rễ tơ đã được cảm ứng thành công, dòng rễ tơ A5.14 có sự
tăng sinh khối nhanh, ổn định trong môi trường nuôi cấy không bổ sung chất điều tiết
sinh trưởng nên được sử dụng làm vật liệu nuôi cấy trên hai môi trường MS và B5 đặc.
Tốc độ tăng trưởng của rễ tơ trên môi trường B5 cao hơn so với trên môi trường MS.
Từ 0,57 gram rễ nuôi cấy trên môi trường B5, sau 5 tuần, khối lượng rễ tăng 7,67 lần,
đạt 4,34 gram khối lượng rễ tươi và 0,373 gram khối lượng rễ khô. Trong khi đó, khối
lượng rễ tăng trên môi trường MS là 5,96 lần, đạt 3,25 gram khối lượng tươi và 0,297
gram khối lượng khô từ 0,55 gram rễ ban đầu (Bảng 4).
Bảng 4. Ảnh hưởng của thành phần môi trường nuôi cấy đến sinh khối rễ tơ đan
sâm dòng A5.14 sau 4 tuần nuôi cấy
Môi
trường

Khối lượng rễ
Khối lượng rễ ban
tươi sau 4 tuần
đầu (gram)
(gram)

Khối lượng rễ
tăng

Khối lượng rễ
khô

(lần)

(gram)

MS


0,55

3,25

5,96

0,297

B5

0,57

4,34

7,67

0,373

A
B
Hình 5. Rễ tơ đan sâm sau 4 tuần nuôi cấy trên môi trường MS (A), B5 (B)
2. Ảnh hưởng của trạng thái môi trường đến sự tăng sinh khối rễ tơ đan sâm
Trong bốn trạng thái môi trường thử nghiệm gồm đặc; bán lỏng; lỏng và nuôi
cấy phân lớp với 25 ml môi trường đặc ở dưới, 25 ml môi trường lỏng ở trên, rễ tơ trên
môi trường đặc cho tốc độ tăng trưởng cao nhất, theo sau là môi trường bán lỏng; lỏng,
tĩnh và phân lớp với khối lượng rễ tăng lần lượt là 7,67; 3,67; 3,08 và 2,83 lần so với
khối lượng rễ ban đầu sau 4 tuần nuôi cấy (Bảng 5). Về mặt hình thái, rễ đan sâm trên

22