Giảng viên: HOÀNG VĨNH PHÚ
Đại học Vinh


Nội dung chính
Chương 1: Nhập môn CNSH
Chương 2: Công nghệ gene
Chương 3. Công nghệ enzyme và protein
Chương 4. Công nghệ tế bào động vật
Chương 5. Công nghệ tế bào thực vật
Chương 6. Công nghệ vi sinh và môi trường
Chương 7. Công nghiệp sinh học


I. NHẬP MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
1. Khái niệm chung
2. Phân loại CNSH
3. Các lĩnh vực ứng dụng của CNSH
4. Một số kỹ thuật cơ bản trong nghiên cứu CNSH


1. Công nghệ sinh học là gì?

Biotechnology:
- Bio: Biology – sinh học
- Technology: Giải quyết các vấn đề hoặc
tạo sản phẩm hữu dụng
CNSH là quá trình nghiên cứu, khai thác, sử
dụng các nguyên lý và quá trình sinh học để giải
quyết các vấn đề thực tiễn sản xuất phục vụ đời
sống con người ở quy mô công nghiệp.

2. Phân loại CNSH
Công nghệ sinh học cổ truyền
Khai thác các nguyên lý và quá trình sinh học dựa trên cơ sở
những hiểu biết sơ đẳng và kinh nghiệm sống của con người.

Công nghệ sinh học hiện đại
Quá trình nghiên cứu, khai thác các nguyên lý sinh học trên
cơ sở những kiến thức khoa học tiên tiến và bằng những
phương pháp nghiên cứu hiện đại. Kết quả và sản phẩm
của CNSH hiện đại có thể mang lại những cuộc cách mạng,
thúc đẩy phát triển sản xuất, đáp ứng nhu cầu cuộc sống
của loài người.


-Công nghệ vi sinh
-Công nghệ enzyme
-Công nghệ lên men
-Công nghệ nuôi cấy tế bào động vật và miễn dịch học
-Công nghệ nuôi cấy tế bào thực vật
- Kỹ thuật gen di truyền


3. Các lĩnh vực ứng dụng CNSH
- Lương thực, thực phẩm: Sản phẩm cá, thịt, tinh bột, đường,
thực phẩm bổ trợ, chất màu, hương vị, các loại vitamin và acid amin
- Nông nghiệp: Thức ăn gia súc, thuốc trừ sâu, vi khuẩn, vi rút,
chế phẩm vi sinh, nhân giống vô tính, cấy hợp tử, sản xuất phôi, vaccin
- Hoá học: acid hữu cơ, rượu, men, chất cao phân tử, metal

extraction, bioaccumulation
- Dược học: các chất kháng sinh, các chất chẩn đoán bệnh, men
ức chế, vaccin, steroids, alcaloids
- Lên men: bia rượu, chất kích thích, lương thực, thực phẩm,
bánh mì, bơ, protein tế bào, cồn công nghiệp, men, chất kháng sinh,
thuốc, vitamin, vaccin.
- Năng lượng: sinh chất, ethanol, methane
- Môi trường: xử lí rác thải, làm sạch nước, tinh chế, phân giải
dầu gây ô nhiễm.


4. Một số kỹ thuật cơ bản trong nghiên cứu CNSH
 Tách chiết DNA
 Điện di
 Kỹ thuật PCR
 Kỹ thuật đọc trình tự DNA
 Phương pháp lai phân tử

 Các phương pháp chuyển gen vào tế bào vật chủ
 Kỹ thuật hóa mô miễn dịch
 Biến đổi vật chất di truyền


4.1. Tách chiết DNA
4.1.1. Tách chiết DNA thực vật
- Nghiền mẫu bằng biện pháp cơ học hoặc bằng sóng siêu âm
- Sử dụng đệm có chất tẩy rửa để phá vỡ màng NSC
- Bảo vệ DNA bằng đệm (phổ biến là EDTA: Etylen diamin tetra
Acetic acid)
- Loại bỏ protein và các tạp chất bằng hóa chất: thường dùng là

tách chiết phân đoạn nhờ phenol và isoamyl alcohol,
Chloroform…
- Kết tủa DNA và hòa tan trong đệm để lưu giữ


Protocol tách chiết DNA từ mô lá
Bước 1: Ủ 5ml đệm chiết CTAB ở 60°C trong bình ổn nhiệt (30p)
Bước 2: Nghiền 0,7-1g mô lá thực vật trong nitơ lỏng bằng cối chày sứ
cho đến khi thành bột mịn
Bước 3: Hòa tan mẫu đang nghiền trong đệm chiết, nghiền thêm 1 chút
nữa để đệm đồng nhất.
Bước 4: Ủ mẫu ở 65°C trong 30p, lắc đều 3-5 lần trong quá trình ủ
Bước 5: Thêm 5ml hỗn hợp chloroform: isoamyl alcohol=24:1
Bước 6: Ly tâm 13000 vòng/phút trong 5p
Bước 7: Lấy dịch lỏng, thêm vào 1 thể tích phức hợp 24:1 và ly tâm
Bước 8: Lấy dịch lỏng, thêm 1 thể tích cồn tuyệt đối có bổ sung NaOAc
3M, pH=5,2. Ủ mẫu ở -20°C trong 20p
Bước 9: Ly tâm ở 13000 vòng/p và thu kết tủa. Hòa tan kết tủa bằng
nước hoặc đệm TE


Protocol tách chiết DNA từ hạt
Bước 1: Nghiền hạt cho mịn, cho vào ống ly tâm 1,5ml
Bước 2: Thêm 250µl đệm chiết (350mM NaCl, 500mM Tris, 0.5% SDS),
lắc đều bằng vortex. Ủ 15p ở nhiệt độ phòng.
Bước 3: Ly tâm 13000 vòng/p và thu dịch nổi.
Bước 4: Bổ sung 10 lần thể tích kali axetat, ủ trong đá lạnh 20p
Bước 5: Ly tâm 9000 vòng/phút trong 10p. Thu dịch nổi
Bước 6: Kết tủa DNA băng isopropanol với thể tích 1:1. Giữ trong đá
lạnh 2-5p

Bước 7: Ly tâm 13000v/p và hút bỏ dịch nổi và làm khô phần kết tủa
Bước 8: Hòa tan kết tủa bằng nước hoặc đệm TE


4.1.2.Tách chiết DNA động vật
 Nguyên lí: Có thể tách chiết DNA từ các nguyên liệu khác nhau

như: máu, nước bọt, mô cơ, lông, tóc (còn nguyên chân tóc, chân
lông) và các loại mô khác.
 Các bước chung
 Tách tế bào có nhân ra khỏi vật mang
 Phá vỡ màng tế bào
 Xử lí bằng nhiệt để phá vỡ hoàn toàn protein. Giải phóng DNA ra

khỏi nhân
 Tách DNA ra khỏi đệm tách và bảo quản DNA ở -20°C


Protocol tách chiết DNA từ mô ĐV
Bước 1: Cắt mô và nghiền trong nitơ lỏng. Cho mẫu vào ống nghiệm và
chờ nitơ bay hơi hết.
Bước 2: Cho khoảng 100g mẫu nghiền vào ống nghiệm 1,5ml và thêm
500µl đệm STE. Trộn đều bằng vortex và thêm vào 12µl protease K
(10mg/l) và 37µl SDS 10%.
Bước 3: Trộn đều hỗn hợp và ủ ở 55°C trong 2h có lắc nhẹ. Sau đó thêm
1 thể tích hỗn hợp phenol: chloroform: isoamylalkohol=25:24:1, trộn
đều và lắc nhẹ và để ở nhiệt độ phòng trong 5p
Bước 4:Ly tâm 9000v/p trong 5p. Lấy phần dịch nổi và lặp lại bước 3 và
bước 4 thêm 1 lần nữa
Bước 5: Thêm một thể tích hỗn hợp chloroform:isoamylalcohol=24:1 ,

trộn đều, ủ ở nhiệt độ phòng 5p. Ly tâm 9000v/p và thu dịch nổi
Bước 6: Thêm 1/10 thể tích NaOAc 3M và 2,5 thể tích EtOH 96%, ủ ở
-20°C trong ít nhất 2h, ly tâm và hòa tan cặn bằng nước hoặc TE.


4.1.3.Tách chiết DNA của vi khuẩn


Protocol tách chiết DNA tổng số
Bước 1: Dịch nuôi cấy vi khuẩn được li tâm ở 5000 vòng/phút, thu
cặn, loại bỏ dịch nổi.
Bước 2: Hòa tan cặn bằng dịch thủy giải, thông thường người ta
dùng TE hoặc GET. Sau đó thêm vào 1,5 thể tích SDS 1% và ủ
hỗn hợp 5p ở 80 C
Bước 3: Làm lạnh tuýp và thêm RN-aza (3ul). Đảo ngược tuýp 2-3
lần cho trộn đều và ủ ở nhiệt độ 30 C.
Bước 4: Kết tủa protein bằng hỗn hợp chloroform và phenol.
Bước 5: Kết tủa DNA
Bước 6: Hòa tan DNA trong dịch đệm, kiểm tra và cất giữ.


4.1.4. Định lượng và xác định nồng độ DNA
1. Phương pháp quang phổ:
A260 = 1  50µg/ml DNA mạch kép
 33µg/ml DNA mạch đơn
 40µg/ml RNA
Thông thường người ta tính độ sạch của DNA bằng tỷ số
A260/A280. Độ sạch cho phép khi tỷ số A260/A280=1,8-2

2. Phương pháp điện di

Dùng điện di để phân tách các đoạn DNA trên gel
agarose hoặc acrylamid. Dựa vào vị trí, độ đậm của band
trên gel mà người ta định lượng nồng độ DNA


4.2. Điện di
 Electrophoresis: Là sự di
chuyển các phần tử mang
điện thông qua dung dịch
(hoặc gel) dựa vào điện
trường
 Đoạn DNA mang điện tích

âm và sẽ di chuyển về phía
điện cực dương



Các thành phần cơ bản
 Gel điện di: agarose hoặc acrylamid, chúng có chức năng

tách các phân tử DNA.
 Bộ nguồn điện di
 Ngăn điện di.


/>n




 Bản gel được ráp vào bể điện di.
 Gel hoạt động như là cầu nối để các phân tử đi từ cực âm

sang cực dương.


 Gel thường chứa đựng một vài
mẫu khác nhau dùng cho nghiên

cứu.
 Người nghiên cứu sử dụng pipet để
lấy mẫu cho vào các giếng trên gel.


The electrophoresis:
After all the DNA samples have been loaded into the wells, the electrodes are
connected to the power supply. When the power is turned on, the negatively
charged molecules move through the gel toward the positive pole (Remember:
Opposites do Attract!!). Both the DNA fragments and the dye molecules
have a negative charge.


/>n