BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC



KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN VI-RÚT ĐỐM TRẮNG (WSSV)
TRÊN TÔM TẠI TỈNH CÀ MAU BẰNG NESTED PCR

Ngành học: CÔNG NGHỆ SINH HỌC
Sinh viên thực hiện: THIÊN THỊ KIM KỶ
Niên khóa: 2008 - 2012

Tháng 7 năm 2012


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC



KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
NGHIÊN CỨU PHÁT HIỆN VI-RÚT ĐỐM TRẮNG (WSSV)
TRÊN TÔM TẠI TỈNH CÀ MAU BẰNG NESTED PCR

Hƣớng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

PGS.TS. LÊ ĐÌNH ĐÔN

THIÊN THỊ KIM KỶ

KS. HUỲNH ĐĂNG SANG

Tháng 7 năm 2012

i


LỜI CẢM ƠN
Tôi xin chân thành cảm ơn:
Ban giám hiệu trƣờng Đại học Nông lâm thành phố Hồ Chí Minh.
Ban chủ nhiệm Bộ môn Công nghệ Sinh học cùng toàn thể thầy cô đã truyền
đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tại trƣờng.
PGS.TS. Lê Đình Đôn đã giúp đỡ tôi trong quá trình làm thực tập tốt nghiệp.
KS. Huỳnh Đăng Sang đã tạo mọi điều kiện thuận lợi, tận tình giúp đỡ tôi trong
quá trình thực tập tại Viện Công nghệ Sinh học và Môi trƣờng - Đại học Nông lâm
Thành phố Hồ Chí Minh.
Chị Lê Tố Trâm (Sở Nông nghiệp và Phát triển nông thôn tỉnh Cà Mau), anh
Phạm Kinh Kha (Phó phòng dịch tễ Chi Cục Thú Y Tỉnh Cà Mau), anh Nguyễn Thanh
Ngoan (Cán bộ Thú y huyện Cái Nƣớc) đã giúp đỡ trong thời gian tôi ở Cà Mau.
Các em Hồ Thị Bích Trâm, Phạm Thị Thu Hƣờng, Huỳnh Thanh Trúc lớp
Công nghệ Sinh học khóa 36 đã giúp tôi trong suốt quá trình thực tập.
Bạn bè thân yêu của lớp Công nghệ Sinh học khóa 34 đã chia sẻ cùng tôi những
vui buồn cũng nhƣ hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ, động viên tôi trong suốt 4 năm qua.
Thành kính ghi nhớ công ơn cha mẹ cùng những ngƣời thân trong gia đình đã
luôn là chỗ dựa vững chắc cho con, động viên, khuyến khích, tạo mọi điều kiện cho
con học tập tốt.

Tp. Hồ Chí Minh, tháng 07 năm 2012.
Sinh viên thực hiện
Thiên Thị Kim Kỷ

ii


TÓM TẮT
Vi-rút gây bệnh đốm trắng (WSSV), là một trong những nhóm tác nhân gây tổn
thất nghiêm trọng cho ngƣời nuôi tôm. Tỷ lệ tôm chết khi nhiễm WSSV có thể lên đến
100% trong vòng 7 – 10 ngày sau khi nhiễm. Cho đến nay, công tác phòng bệnh vẫn
là biện pháp hiệu quả nhất để hạn chế thiệt hại do bệnh đốm trắng. Trong đó việc thả
nuôi tôm giống sạch bệnh là điều cần thiết. Do đó, cần có quy trình chẩn đoán sớm
WSSV trên tôm giống và tôm. Để phát triển công tác sản xuất tôm giống sạch bệnh
cũng nhƣ hỗ trợ cho công tác phòng ngừa dịch bệnh, việc chẩn đoán sớm và chính xác
sự hiện diện của WSSV trên tôm là điều cực kỳ quan trọng.
Trong đề tài này, các mẫu tôm sú nghi ngờ nhiễm WSSV đã đƣợc thu thập tại 2
huyện Cái Nƣớc và Đầm Dơi tỉnh Cà Mau. Quy trình phát hiện WSSV trên các mẫu
tôm thu thập cũng đƣợc tiến hành bằng kỹ thuật nested PCR. Để đánh giá độ nhạy của
quy trình, chuẩn gốc WSSV – DNA đƣợc xây dựng, xác định số bản sao, pha loãng từ
108 đến 1 bản sao và thực hiện PCR. Bên cạnh đó, độ đặc hiệu cũng đƣợc xác định khi
so sánh với tôm bị nhiễm IHHNV. Kết quả giải trình tự cho thấy quy trình nested PCR
đƣợc khảo sát có khả năng phát hiện chính xác WSSV trên mẫu tôm nghi ngờ nhiễm
WSSV thu thập tại 2 huyện Cái Nƣớc và Đầm Dơi. Độ nhạy của quy trình đạt 103 bản
sao và có độ đặc hiệu cao với WSSV. Trong nghiên cứu này quy trình nested PCR
chẩn đoán sự hiện diện của WSSV đã đƣợc xây dựng thành công và có thể ứng dụng
trong công tác sản xuất giống sạch bệnh đốm trắng. Bộ mẫu tôm nhiễm vi-rút đốm
trắng đã đƣợc thành lập phục vụ cho công tác giảng dạy tại bộ môn Công nghệ Sinh
học và là nguồn mẫu cho các nghiên cứu tiếp theo.


iii


SUMMARY
Thesis: “Study to detect white spot syndrome virus on shrimp in Ca Mau
province by nested PCR”
White spot syndrome virus (WSSV) is an important viral pathogen responsible
for severely economic loss to shrimp farmers. Mortality rate when infected with
WSSV can be up to 100% within 7 - 10 days after infection. So far, disease prevention
is still the most effective measure to limit damages caused by white spot disease. In
which the breeding of disease-free shrimp seeds is essential. Therefore, there should be
a procedure for early diagnosing of WSSV on shrimp seed and mature shrimp. For
developing disease-free shrimp seed production as well as supporting the disease
prevention, early and accurate diagnosis of the presence of WSSV on shrimp is
extremely important.
In this study, the shrimp samples suspected of being infected with WSSV were
collected in Cai Nuoc and Dam Doi districts of Ca Mau province. The procedure for
detecting WSSV on collected shrimp samples was carried out by nested PCR. To
evaluate the sensitivity of the procedure, WSSV – DNA standard was built to
determine number of copies, diluted from 108 to 1 copies and performed PCR. In
addition, the specificity was well defined when compared with IHHNV-infected
shrimp. The sequencing results showed that nested PCR procedure surveyed in this
study was able to detect accurately WSSV in shrimp samples suspected of being
infected with WSSV collected in Cai Nuoc and Dam Doi districts. This procedure had
the sensitivity of 103 copies and the high specificity with WSSV. In this study, the
nested PCR procedure for diagnosing the presence of WSSV has been successfully set
up and can be applied for white spot disease-free seed shrimp production. Moreover,
the samples of shrimp infected with WSSV was established to serve for teaching in
Department of Biotechnology and to be the sample source for further studies.
Keywords: diagnosis, detection, nested PCR, white spot syndrome virus.


iv


MỤC LỤC
LỜI CẢM ƠN…………………………………………………………………………..i
TÓM TẮT……………………………………………………………………………...ii
SUMMARY…………………………………………………………………………...iii
MỤC LỤC……………………………………………………………………………..iv
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT………………………………………………...vi
DANH SÁCH CÁC BẢNG…………………………………………………………..vii
DANH SÁCH CÁC HÌNH…………………………………………………...……....vii
Chƣơng 1 MỞ ĐẦU ........................................................................................................9
1.1. Đặt vấn đề .................................................................................................................9
1.2. Yêu cầu đề tài .........................................................................................................10
1.3. Nội dung thực hiện .................................................................................................10
Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU .............................................................................11
2.1. Tình hình dịch bệnh đốm trắng trên tôm tại Việt Nam ..........................................11
2.2. Tình hình dịch bệnh đốm trắng trên tôm ở tỉnh Cà Mau………………………..…4
2.3. Bệnh đốm trắng trên tôm ..........................................................................................5
2.3.1.Vi-rút gây bệnh đốm trắng (White spot syndromes virus – WSSV) ......................5
2.3.1.1. Đặc điểm hình thái..............................................................................................5
2.3.1.2. Đặt tính sinh học .................................................................................................6
2.3.2. Vật chủ mang mầm bệnh .......................................................................................6
2.3.3. Các con đƣờng lây truyền ......................................................................................6
2.3.4. Cơ chế xâm nhập ...................................................................................................6
2.3.5. Triệu chứng của bệnh ............................................................................................6
2.3.6. Phƣơng pháp chẩn đoán ........................................................................................7
2.3.7. Phòng bệnh ............................................................................................................8
2.4. Tình hình nghiên cứu phát hiện bệnh đốm trắng trên tôm .......................................8

2.5. Phƣơng pháp Polymerase Chain Reaction (PCR) ....................................................9
2.6. Kỹ thuật nested PCR ..............................................................................................10
2.7. Phƣơng pháp phân tích định tính và định lƣợng thô nucleic acid ..........................11
2.7.1. Phƣơng pháp điện di DNA trên gel .....................................................................11
v


2.7.2. Phƣơng pháp định lƣợng bằng quang phổ kế ......................................................20
2.8. Xác định số bản sao của một mẫu ..........................................................................20
2.9. Giải trình tự DNA tự động .....................................................................................20
Chƣơng 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................................22
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ..........................................................................22
3.2. Vật liệu và hóa chất ................................................................................................22
3.2.1. Dụng cụ và thiết bị .............................................................................................13
3.2.2. Hóa chất và vật liệu . ...........................................................................................13
3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu ........................................................................................23
3.3.1. Phƣơng pháp thu mẫu và bảo quản mẫu..............................................................23
3.3.2. Phƣơng pháp tách chiết DNA ..............................................................................23
3.3.3. Phƣơng pháp nested PCR xác định tôm nhiễm WSSV .......................................24
3.3.4. Phƣơng pháp tạo chuẩn WSSV - DNA ...............................................................25
3.3.5. Phƣơng pháp xác định độ nhạy của quy trình nested PCR ................................26
3.3.6. Phƣơng pháp xác định độ đặc hiệu của quy trình nested PCR ............................27
3.3.7.Giải trình tự sản phẩm PCR của WSSV đƣợc khuếch đại ...................................27
Chƣơng 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................................19
4.1. Thành lập bộ mẫu bệnh đốm trắng .........................................................................19
4.2. Đánh giá quy trình trên các mẫu DNA dƣơng tính với WSSV ..............................20
4.3. Thiết lập quy trình nested PCR có khả năng phát hiện WSSV thu từ Cà Mau ......21
4.4. Xác định độ nhạy của quy trình nested PCR ..........................................................34
4.5. Độ đặc hiệu của quy trình nested PCR ...................................................................35
Chƣơng 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ..........................................................................36

5.1. Kết luận...................................................................................................................36
5.2.Đề nghị ....................................................................................................................36
TÀI LIỆU THAM KHẢO .............................................................................................37
PHỤ LỤC

vi


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
bp

base pair

Ctv

Cộng tác viên

DNA

Deoxyribonucleic acid

dNTP

Deoxyribonucleotide triphosphate

ddNTP

Dideoxynucleoside triphosphate

EDTA


Ethylene Diamine Tetra acetic Acid

HPV

Hepatopanceatic parvovirus

IMNV

Infectiuos meonecrosis virus

IHHNV

Infectious hypodermal and haematopoietic necrosis virus

OD

Opitical density

PCR

Polymerase Chain Reaction

SDS

Sodium Dodecyl Sulfate

Taq

Thermus aquaticus


TBE

Tris Borate EDTA

TE

Tris - EDTA

TSV

Taura syndrome virus

UV

Ultraviolet radiation

V

Volt (đơn vị hiệu điện thế)

YHV

Yellow head virus

WSSV

White Spot Syndrome Virus

rpm


revolutions per minute (số vòng quay trong một phút)

vii


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Trang
Bảng 3.1. Trình tự đoạn mồi xác định WSSV………………………………………..14
Bàng 3.2. Thành phần phản ứng nested PCR bƣớc 1………………………………...15
Bảng 3.3. Thành phần phản ứng nested PCR bƣớc 2……………………………… ..15
Bảng 3.4. Chƣơng trình nhiệt PCR …………………………………………………..15

DANH SÁCH CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1 Triệu chứng bên ngoài tôm bị bệnh đốm trắng……………………………...7
Hình 2.2 Nguyên tắc nested PCR……………………………….................................10
Hình 3.1 Cách pha loãng mẫu theo hệ số pha loãng mẫu bậc 10…………………….18
Hình 4.1 Tôm nghi ngờ nhiễm WSSV……………………………………………….19
Hình 4.2 Bộ mẫu tôm nghi ngờ nhiễm WSSV ………………………………………19
Hình 4.3 Kiểm tra quy trình nested PCR với các mẫu DNA dƣơng tính WSSV……20
Hình 4.4 Kết quả PCR mẫu tôm thu tại huyện Đầm Dơi…………………………….21
Hình 4.5 Kết quả PCR mẫu tôm thu tại huyện Cái Nƣớc…………………………….22
Hình 4.6 Độ nhạy của nested PCR phát hiện WSSV với chuẩn gốc WSSV - DNA…24
Hình 4.7 Kết quả độ đặc hiệu của quy trình nested PCR……………….…………….25

viii


Chƣơng 1 MỞ ĐẦU

1.1. Đặt vấn đề
Sự phát triển nhanh của nghề nuôi tôm đã đem lại lợi ích đáng kể về mặt kinh tế;
với sản lƣợng năm 2011 là 482,2 nghìn tấn, chiếm 11,6% tổng sản lƣợng thủy sản toàn
quốc (Theo thông tin từ Tổng Cục Thống kê năm 2011). Tuy nhiên khi nghề nuôi tôm
đƣợc thâm canh hóa thì dịch bệnh xảy ra ngày càng nhiều nhất là bệnh do vi-rút gây ra
nhƣ bệnh đốm trắng (WSSV), hội chứng Taura (TSV), bệnh đầu vàng (YHV), bệnh hoại
tử cơ quan tạo máu và cơ quan biểu mô (IHHNV), bệnh gan tụy (HPV), bệnh còi (MBV),
bệnh hoại tử cơ/đục cơ (IMNV). Theo cơ quan Quốc tế về Dịch bệnh Động vật (năm
1995), WSSV là vi-rút gây bệnh cực kì nghiêm trọng cho nghề nuôi tôm, vì tác nhân này
có khả năng lây rất nhanh, có hệ ký chủ rộng (Bonilla, 2008), tỉ lệ tôm chết khi bị nhiễm
bệnh có thể lên đến 80 – 100% sau 7 – 10 ngày nhiễm (Lightner, 1996). Theo thống kê
của Chi cục Thú y tỉnh Cà Mau năm 2011, diện tích nuôi tôm đạt hơn 296.592 ha (tôm
công nghiệp trên 3.398 ha, tôm quảng canh cải tiến 10.015 ha), chiếm 1/4 sản lƣợng tôm
nuôi của cả nƣớc. Diện tích tôm nuôi công nghiệp bị bệnh 538,85 ha (đốm trắng 86,33 ha,
hoại tử gan tụy 452,53 ha). Năm nay, tình hình không khả quan hơn, tính đến tháng 03
năm 2012, đã đem khoảng 200 mẫu tôm đã đƣợc xét nghiệm và kết quả có trên 60% mẫu
nhiễm vi-rút gây bệnh đốm trắng, còn lại là bệnh gan tụy và một số bệnh khác
(www.vietlinh.com.vn).
Hiện tại chƣa có thuốc đặc trị bệnh WSSV trên tôm nên công tác phòng ngừa tổng
hợp bao gồm tẩy trùng ao nuôi, ngăn cản sự xâm nhập của các sinh vật mang mầm bệnh
vào ao nuôi và sử dụng tôm giống sạch bệnh đƣợc khuyến cáo nhƣ một biện pháp an toàn
sinh học (Bonilla, 2008). Do đó cần có phƣơng pháp phát hiện sớm sự hiện diện vi-rút
gây bệnh trên đàn tôm giống trƣớc khi thả nuôi và trên ao nuôi tôm công nghiệp nhằm
hạn chế nguy cơ bùng phát dịch bệnh. Các phƣơng pháp chẩn đoán truyền thống nhƣ quan
sát dấu hiệu bệnh hay phƣơng pháp mô bệnh học không cho phép phát hiện sớm và chính
xác tác nhân gây bệnh. Nhiều phƣơng pháp phân tử nhƣ lai in situ, western blot, PCR,
nested PCR đƣợc phát triển nhằm khắc phục những nhƣợc điểm trên (Trần Việt Tiên và
9



ctv, 2008). Phƣơng pháp PCR hiện đang đƣợc sử dụng rất rộng rải và hiệu quả trong việc
xét nghiệm tôm giống và nested PCR là một trong những cải tiến mới, có tính đặc hiệu và
độ nhạy cao. Đề tài: “Nghiên cứu phát hiện vi-rút đốm trắng (WSSV) trên tôm tại tỉnh Cà
Mau bằng nested PCR” đƣợc thực hiện nhằm mục tiêu phát triển qui trình PCR có thể
ứng dụng trong điều kiện phòng thí nghiệm đơn giản và đặc biệt phƣơng pháp cần đáp
ứng đƣợc yêu cầu về độ chính xác cao, thời gian thực hiện nhanh, giúp giải quyết kịp thời
các nhu cầu của vụ nuôi. Qua đó ngƣời nuôi tôm có biện pháp xử lí kịp thời để hạn chế
thiệt hại, nâng cao chất lƣợng và sản lƣợng tôm nuôi.
1.2. Yêu cầu đề tài
Thành lập đƣợc bộ mẫu tôm bệnh đốm trắng thu thập tại huyện Cái Nƣớc và huyện
Đầm Dơi tỉnh Cà Mau.
Xây dựng quy trình phát hiện WSSV tại Cà Mau bằng nested PCR.
Đánh giá mức độ tƣơng đồng của WSSV tại Cà Mau với ngân hàng gen.
Đánh giá độ nhạy và độ đặc hiệu của quy trình.
1.3. Nội dung thực hiện
Thu thập mẫu tôm nghi ngờ bệnh tại vùng dịch ở Cà Mau.
Đánh giá quy trình nested PCR của Lo và ctv (1996) trên các mẫu DNA đã đƣợc
xác định dƣơng tính với WSSV.
Thiết lập quy trình nested PCR có khả năng phát hiện WSSV trên các mẫu tôm
nghi ngờ nhiễm WSSV đƣợc thu thập tại các huyện Cái Nƣớc và Đầm Dơi tỉnh Cà Mau.
Khẳng định sự chính xác của quy trình bằng giải trình tự và so sánh mức độ tƣơng đồng
của trình tự WSSV tại Cà Mau (chủng thực địa) với các trình tự đã công bố trên ngân
hàng gen.
Xác định độ nhạy và độ đặc hiệu của quy trình nested PCR.

10


Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Tình hình dịch bệnh đốm trắng trên tôm tại Viêt Nam

Sau khi xuất hiện và gây thiệt hại hàng trăm ha tôm tại Cà Mau và Quảng Nam,
dịch đốm trắng ở tôm lại tiếp tục bùng phát tại một số địa phƣơng trên cả nƣớc, làm ngƣời
nuôi tôm thiệt hại hàng trăm triệu đồng. Tại huyện Cẩm Xuyên và thành phố Hà Tĩnh,
tỉnh Hà Tĩnh, đến nay đã có trên 11 ha tôm bị bệnh đốm trắng, làm thiệt hại khoảng 4,5 7 triệu con tôm giống. Tỉnh Long An có 1.250 ha tôm sú bị chết do bệnh đốm trắng và sốc
nhiệt, chiếm khoảng 50% diện tích nuôi thả. Nguyên nhân ban đầu cho thấy, các ao nuôi
tôm bị dịch đốm trắng đều không tuân thủ theo lịch thời vụ, có hộ mới thả giống đƣợc
hơn 15 ngày, có hộ gần đến thời kỳ thu hoạch. Tất cả các hộ có tôm bị bệnh khi mua
giống đều không có giấy phép kiểm dịch và không tuân thủ các kỹ thuật chăm sóc bảo vệ
môi trƣờng ao nuôi. Theo các chuyên gia về thủy sản, một nguyên nhân quan trọng khác
dẫn đến tình trạng lây lan dịch đốm trắng ở tôm là do thời tiết nắng nóng kéo dài làm các
chỉ số sinh lý, hóa lý của môi trƣờng nuôi tôm dao động bất thƣờng, biên độ dao động
thời tiết ngày và đêm cao, dẫn đến tôm bị sốc nhiệt và giảm sức đề kháng, khiến vi- rút
bệnh đốm trắng dễ dàng xâm nhập vào tôm và lây lan. Với tình hình thời tiết nắng nóng
gay gắt còn tiếp tục trong thời gian tới, độ mặn trong các ao đầm nuôi tăng lên, tình trạng
xả nƣớc thải không đƣợc xử lý, chất lƣợng con giống chƣa tốt, ngƣời nuôi tôm sẽ tiếp tục
phải gánh chịu thiệt hại nếu không tuân thủ các quy định về phòng bệnh cho tôm
(baomoi.com).
Trƣớc tình hình dịch bệnh trên tôm đang xuất hiện ở nhiều tỉnh Đồng bằng sông
Cửu Long trong vụ tôm 2012, một cuộc họp về dịch bệnh tôm đã đƣợc tổ chức ở Bến Tre
vào chiều ngày 29/2. Theo ông Nguyễn Huy Điền, Vụ trƣởng Vụ Nuôi trồng Thủy sản
(Tổng cục Thủy sản), thông tin ban đầu từ các địa phƣơng cho thấy, tôm bệnh chủ yếu
trên diện tích nuôi theo kiểu quảng canh, do ngƣời nuôi cố tình xuống giống trƣớc lịch
thời vụ. Gặp khi thời tiết lạnh kéo dài, độ mặn trên sông chƣa có, môi trƣờng chƣa ổn
định, dẫn tới việc tôm phát bệnh và chết. Bệnh trên tôm chủ yếu hiện nay là đốm trắng,
các bệnh khác cũng có nhƣng ít. Một số địa phƣơng, diện tích thiệt hại đã lên tới hàng
11


trăm ha. Chẳng hạn, ở Trà Vinh, đến nay đã có 9.039 ha đƣợc thả giống tôm sú và tôm thẻ
chân trắng, với tổng số giống đã thả là 645 triệu con. Trong đó, đã có 399 hộ có tôm bị

thiệt hại do dịch bệnh, diện tích bệnh là 545 ha, tổng số tôm giống đã thả trên diện tích
bệnh này là 26 triệu con. Ông Nguyễn Văn Khởi, Phó Giám Đốc Sở Nông Nghiệp và
Phát Triển Nông Thôn tỉnh Sóc Trăng cho biết, kết quả khảo sát mới nhất cho thấy, tỉnh
Sóc Trăng đã có 1.510 ha đƣợc thả giống, trong đó khoảng 260 ha tôm bị thiệt hại.
Nguyên nhân thiệt hại chủ yếu do bệnh đốm trắng. Theo bà Phan Thị Thu Oanh, Phó
Giám Đốc Sở Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn tỉnh Bạc Liêu, đến cuối tháng
5/2012, tỉnh này có 1.256 ha đƣợc thả giống tôm, trong đó, diện tích thiệt hại các huyện
báo cáo lên mới là 49 ha. Tỉnh Long An, tính đến cuối tháng 2 năm 2012, trong tổng số
1.018 ha đã thả giống,có 268,5 ha đã bị thiệt hại (nongnghiep.vn).
2.2. Tình hình dịch bệnh đốm trắng trên tôm ở tỉnh Cà Mau
Tỉnh Cà Mau nhờ địa thế ba mặt giáp biển nên có tiềm năng, lợi thế để phát triển
ngành thủy sản, đặc biệt là nghề nuôi tôm. Cà Mau là tỉnh có diện tích nuôi tôm lớn nhất
cả nƣớc. Theo thống kê của Chi cục Thú y tỉnh Cà Mau, năm 2011, diện tích nuôi tôm đạt
hơn 296.592 ha (tôm công nghiệp trên 3.398 ha, tôm quảng canh cải tiến 10.015 ha),
chiếm 1/4 sản lƣợng tôm nuôi của cả nƣớc. Diện tích tôm nuôi công nghiệp bị bệnh
538,85 ha (đốm trắng 86,33 ha, hoại tử gan tụy 452,53 ha) (sonnptnt.camau.gov.vn). Năm
2012 tình hình không khả quan hơn, đến cuối tháng 02 năm 2012 các cơ quan chức năng
của Cà Mau đang tiến hành khảo sát lại tình hình thả nuôi và diễn biến dịch bệnh, nên
chƣa có con số cập nhật về diện tích thả nuôi và diện tích nhiễm bệnh. Tuy nhiên, một số
thông tin cho thấy trong tháng 1 và tháng 2, ở tỉnh này có nhiều cơn mƣa lớn trái vụ làm
tỷ lệ tôm chết ở Cà Mau tăng rất nhanh đã có khoảng 20% diện tích tôm bị bệnh trên tổng
số diện tích đã thả giống là 2.500 ha. Tôm chết chủ yếu bởi các bệnh đốm trắng, hoại tử
gan (nongnghiep.vn). Dịch bệnh đốm trắng đã xuất hiện và có dấu hiệu lây lan trên diện
tích nuôi tôm công nghiệp ở Cà Mau. Theo thống kê bƣớc đầu tại các huyện Đầm Dơi,
Cái Nƣớc, Phú Tân và thành phố Cà Mau, đã có hàng chục hộ bị thiệt hại trắng với diện
tích lên đến gần 50 ha, chủ yếu là diện tích tôm nuôi công nghiệp (www.vietlinh.com.vn).
Theo báo cáo của Sở Nông Nghiệp và Phát Triển Nông Thôn tỉnh Cà Mau, trong 4 tháng
12



đầu năm 2012, toàn tỉnh đã có 555 ha (cả tôm sú và tôm thẻ chân trắng) bị chết, tập trung
nhiều ở các huyện nhƣ Đầm Dơi (với 234 ha tôm chết), Phú Tân (215 ha), Cái Nƣớc (67
ha) và thành phố Cà Mau (38 ha) (nongnghiep.vn). Theo ngành nông nghiệp, trong những
ngày qua trên địa bàn toàn tỉnh Cà Mau có 110 ha diện tích tôm nuôi công nghiệp bị chết
trắng do dịch bệnh hoại tử gan tụy và đốm trắng. Trƣớc mắt, ngành nông nghiệp đã xuất
và hỗ trợ cho các địa phƣơng 42 tấn Chlorine để xử lý ao đầm. Tuy nhiên, dịch bệnh trên
tôm nuôi đang diễn biến khá phức tạp, có dấu hiệu lây lan trên diện rộng. Theo ngành
nông nghiệp, ngoài yếu tố thời tiết, môi trƣờng chung quanh tiềm ẩn, phát sinh dịch bệnh
nhƣ tôm bị đốm trắng, đỏ thân, hoại tử gan tụy thì nguồn giống không bảo đảm chất
lƣợng cũng là nguyên nhân làm tôm nuôi chết trên diện rộng. (khoahocthuysan.org).
2.3. Bệnh đốm trắng trên tôm
2.3.1. Vi-rút gây bệnh đốm trắng (White spot syndromes virus – WSSV)
2.3.1.1 Đặc điểm hình thái
WSSV có DNA bộ gen mạch vòng. Bộ gen WSSV đã đƣợc giải trình tự năm 2001.
Bộ gen của WSSV có nguồn gốc từ Thái Lan có kích thƣớc 202.967 bp, chứa 184 khung
đọc mở (ofen reading frame, ORF). Tỷ lệ của hai loại acid nucleic A và T là 58,9%. DNA
bộ gen của WSSV có nguồn gốc từ Trung Quốc có kích thƣớc là 305.107 bp chứa 181
khung đọc mở, tỷ lệ của hai loại acid nucleic G và C là 41%. Tại Việt Nam, chƣa có tài
liệu nghiên cứu công bố về vấn đề này.
Dựa trên những phân tích các trình tự đặc biệt của WSSV, ngƣời ta thấy rằng giữa
những WSSV có nguồn gốc khác nhau có những sai khác về gen. Điều này dẫn đến sự sai
khác về cấu trúc protein của WSSV ở các vùng khác nhau.
Protein cấu trúc của WSSV đang đƣợc nghiên cứu. Năm 2000, bốn loại protein cấu
trúc của WSSV đã đƣợc xác định và đƣợc gọi tên theo trọng lƣợng khi điện di trên SDSPAGE là protein VP24 (có trọng lƣợng phân tử 24 kDa), Protein VP26 (26 kDa), protein
VP19 và protein VP28. Trong đó, VP19 và VP28 đƣợc xác định là hiện diện tại vỏ của
virus, còn VP24 và VP26 thì hiện diện ở nucleocapsid.
Năm 2001, một protein cấu trúc khác của WSSV đã đƣợc xác định là VP15 có
trọng lƣợng phân tử 15 kDa hiện diện trong nucleocapsid. Trong năm 2002, một số
13



protein vỏ khác của WSSV đã đƣợc tiếp tục xác định là VP466, VP292 và VP281, các
protein này đƣợc phân biệt và đặt tên dựa trên số lƣợng amino acid của protein đó.
(Martínez và ctv, 2007).
2.3.1.2 Đặc tính sinh học
Vi-rút đốm trắng ký sinh ở tổ chức ngoại bì, trung bì, mang, cơ quan lymphoid và
biểu bì dƣới vỏ kitin. Vi-rút xâm nhập vào nhân tế bào gây hoại tử và sƣng to. Vi-rút sống
và tồn tại trong nƣớc có độ mặn từ 5 – 40%, độ mặn pH từ 4 – 10, có khả năng chịu đựng
đƣợc nhiệt từ 0 – 80 oC (Trần Thị Việt Ngân, 2002).
2.3.2. Vật chủ mang mầm bệnh
Một trong những nguyên nhân dẫn đến việc lây lan nhanh của WSSV là do phổ
loài cảm nhiễm rộng. WSSV đã đƣợc phát hiện cảm nhiễm nhiều loài vật chủ khác nhau
Penaeus monodon, P. japonicus, P. indicus, P. chinensis, P. merguensis, P. aztecus, P.
stylirostris, P. vannami, P. duorarum và P. setiferus (Lightner, 1996); tôm càng xanh Macrobrachium rosenbergii (Peng và ctv, 1998), cua - Calappa lophos, Portunus
sanguinolentus, Charybdis granulata và C. feriata (Lo và ctv, 1996).
2.3.3. Các con đƣờng lây truyền
Bệnh đốm trắng do WSSV lây lan rất nhanh qua 2 con đƣờng chính: lây lan theo
chiều dọc (vertical transmission) từ bố mẹ nhiễm lây cho con. Lây lan theo chiều ngang
(horizontal transmission) là đƣờng lan truyền chủ yếu, nhiễm vi-rút từ nguồn nƣớc nuôi,
từ cua, còng mang vi-rút từ ao này sang ao kia, từ dụng cụ sản xuất mang mầm bệnh, từ
tôm chết, chim, cò vô tình đƣa vào ao (Trần Thị Việt Ngân, 2002).
2.3.4. Cơ chế xâm nhập
Vi-rút gây hội chứng đốm trắng khi xâm nhập vào tôm sẽ cƣ trú ở nhiều bộ phận
của tôm nhƣ mô nội bì, mô dạ dày, mang, buồng trứng, hệ thống thần kinh, mắt, chân bơi
và các bộ phận khác. Sau khi xâm nhập vào tế bào chủ, vi-rút này tiến hành tự nhân bản
dựa trên cơ sở vật chất và năng lƣợng tế bào. Thông qua quá trình này, số lƣợng thể vi-rút
tăng rất nhanh, đồng thời làm thay đổi hoạt động bình thƣờng của tế bào. Khi quan sát
dƣới kính hiển vi, các tế bào bị nhiễm vi-rút thƣờng có nhân phình to. Vi-rút phát triển

14



đến giai đoạn phá vỡ nhân và giết chết tế bào, vi-rút lan truyền ra môi trƣờng nƣớc, đi tìm
ký chủ khác và tiếp tục xâm nhập (Trần Thị Việt Ngân, 2002).
2.3.5. Triệu chứng của bệnh
Dấu hiệu đặc trƣng: tôm bị bệnh giảm ăn rõ rệt, vỏ bì chùng lỏng với những đốm
trắng từ 0,2 – 2 mm đƣờng kính, biểu hiện bề mặt bên trong của vỏ. Nhiều trƣờng hợp,
tôm bị bệnh WSSV chuyển sang màu hồng đến màu nâu đỏ gọi là bệnh đỏ thân. Bệnh này
dẫn đến tỷ lệ chết cao, có thể tới 100% (Trần Thị Minh Tâm và ctv, 1999).
Những dấu hiệu khác: tôm ở tầng mặt dạt vào bờ, các phần phụ bị tổn thƣơng, nắp
mang phồng lên và vỏ có nhiều vi sinh vật bám. Khi có dấu hiệu sức khỏe tôm yếu, đồng
thời các đốm trắng xuất hiện, tỷ lệ tôm phát bệnh trong vòng từ 3 – 10 ngày lên đến 100%
(Bùi Quang Tề, 2003).
Tuy nhiên, không phải tôm có đốm trắng nào cũng do vi-rút gây ra mà có thể tôm
bị đốm trắng do lƣợng vôi trong ao quá lớn hay do vi khuẩn gây ra. Cách phân biệt đối
với đốm trắng do lƣợng vôi trong ao quá lớn, ngƣời nuôi lƣu ý là tôm có đốm trắng ở vỏ
đầu ngực, không có tôm tấp bờ, đàn tôm vẫn ăn đều ở mức bình thƣờng, pH nƣớc cao
nhiều ngày, buổi sáng có thể trên 8,3. Đối với đốm trắng do vi khuẩn thì tôm vào bờ rất
nhiều, một số bị chết, hầu hết bị đóng rong, mang bị bẩn. Có đốm trắng trên vỏ đầu ngực,
tôm trong nhá ăn bình thƣờng. Nhìn chung tôm có ăn chậm hơn nhƣng không đáng kể
(www.agroviet.gov.vn).

Hình 2.1 Triệu chứng bên ngoài tôm bị bệnh đốm trắng. (a)Tôm sú bị bệnh đốm trắng
dạt vào bờ và chết, (b)Vỏ đầu ngực tôm bị bệnh đốm trắng (Bùi Quang Tề, 2003).

15


2.3.6. Phƣơng pháp chẩn đoán
Kết hợp với dấu hiệu lâm sàng của bệnh đốm trắng đã đƣợc mô tả ở trên, để phát

hiện mầm bệnh WSSV có trên tôm bằng nhiều phƣơng pháp khác nhau nhƣ: phƣơng pháp
mô học xác định bệnh dựa trên các thể vùi hiện diện trong tế bào biểu mô của các cơ quan
có nguồn gốc trung bì; phƣơng pháp lai tại chỗ (In situ hybridization) dấu hiệu xác định
bệnh là kết quả lai giữa đoạn gen dùng làm mẫu dò và đoạn gen của tác nhân gây bệnh
trong điều kiện nghiêm ngặt; phƣơng pháp PCR xác định bệnh dựa trên là sản phẩm
khuếch đại của một đoạn gen đặc trƣng của tác nhân gây bệnh; phƣơng pháp Dot blot và
Southern blot đƣợc thực hiện với sản phẩm của PCR; phƣơng pháp miễn dịch huỳnh
quang dấu hiệu định bệnh là kết quả kết hợp đặc hiệu giữa kháng nguyên và kháng thể.
Trong đó kỹ thuật PCR là kỹ thuật chẩn đoán nhanh, nhạy, có tính đặc hiệu cao và đƣợc
nhiều nhà nghiên cứu quan tâm và phát triển, đồng thời đƣa ra các cải tiến mới nhƣ:
nested PCR, Semi - nested PCR, Real time PCR (Trần Thị Minh Tâm, 1999).
2.3.7. Phòng bệnh
Cho đến nay, công tác phòng bệnh vẫn là biện pháp hiệu quả nhất để hạn chế thiệt
hại do bệnh đốm trắng. Phòng bệnh tức là sử dụng biện pháp phòng trừ tổng hợp nhằm
ngăn chặn mầm bệnh từ bên ngoài vào ao nuôi, duy trì các yếu tố môi trƣờng thích hợp
cũng nhƣ chất lƣợng thức ăn tốt, khẩu phần ăn hợp lý để khống chế dịch bệnh xảy ra
trong khi nuôi. Sự phòng ngừa gồm có các biện pháp sau: chọn tôm bố mẹ có chất lƣợng
tốt, không nhiễm WSSV, không vận chuyển tôm giống mật độ cao. Thức ăn tƣơi sống
không hƣ thối và dùng nhiệt nấu chín, hàng tháng cho tôm ăn Vitamin C từ 1-2 đợt với
liều 2-3 g/1 kg tức ăn cơ bản, mỗi đợt cho tôm ăn 1 tuần liên tục. Nguồn nƣớc cấp cho ao
nuôi tôm phải lắng lọc và khử trùng, vớt tôm chết ra khỏi ao, ngăn chặn không cho tôm và
giáp xác khác vào ao nuôi. Nƣớc nuôi tôm bị bệnh WSSV phải xử lý bằng Cholorua vôi
nồng độ (30 - 50 g/m3), không đƣợc xả ra ngoài. Khi phát hiện bệnh tốt nhất là thu hoạch
ngay (Bùi Quang Tề, 2003).
2.4. Tình hình nghiên cứu phát hiện bệnh đốm trắng trên tôm
Nghiên cứu của Lo và ctv (1996), tiến hành ly trích DNA tôm nhiễm WSSV, pha
loãng DNA theo hệ số pha loãng bậc 10 phát hiện tôm bị nhiễm WSSV bằng cách thực
16



hiện PCR một bƣớc. Trong nỗ lực để thiết lập một quy trình có độ nhạy cao, Lo và ctv
năm 1996 đã phát triển quy trình nested PCR hai bƣớc (thực hiện phản ứng PCR với cặp
mồi 146F1/ 146R1 và cặp mồi 146F2/ 146R2). Theo nghiên cứu này, độ nhạy của quy
trình nested PCR hai bƣớc là 103 – 104 lần so với PCR một bƣớc. Các DNA đƣợc ly trích
và sản phẩm khuếch đại có kích thƣớc lần lƣợt 1447 bp và 941 bp.
Nghiên cứu cũng phát hiện độ nhạy của quy trình với 1000 bản sao khi thực hiện PCR với
cặp mồi ngoài 146F1/146R1 và 10 bản sao với cặp mồi trong 146F2/ 146 R2.
Theo nghiên cứu của Kiatpathomchai và ctv (2001), tiến hành nghiên cứu kỹ
thuật Non stop-nested PCR, semi- nested PCR đƣợc nghiên cứu sử dụng để phân loại
mức độ nghiêm trọng của WSSV trên tôm sú (Penaeus monodon). Kỹ thuật này có thể
phát hiện ít nhất là 5 fg WSSV - DNA (20 hạt virus) trong các dịch chiết từ mẫu tôm ấu
trùng hoặc chân bơi của tôm lớn hơn.
Năm 2006, Sritunyalucksana và ctv thực hiện nghiên cứu việc xây dựng chuẩn
WSSV – DNA và đánh giá độ nhạy quy trình do Lo và ctv (1996) phát triển để so sánh độ
nhạy của các phƣơng pháp PCR. Kết quả nghiên cứu cho thấy, Real time PCR phát hiện ở
5 bản sao, 103 bản sao cho 1 bƣớc PCR thông thƣờng, 50 bản sao cho nested PCR một
bƣớc (thực hiện trong 1 ống) và nested PCR 2 bƣớc (thực hiện trong 2 ống) lần lƣợt là
103 bản sao và 102 bản sao.
Trần Việt Tiên và Đặng Thị Hoàng Oanh (2009) nghiên cứu, phát triển quy trình
mutiplex PCR phát hiện đồng thời WSSV với cặp mồi 146F1/146R1, IHHNV và gen nội
chuẩn β-actin ở tôm. Kết quả quy trình phát hiện đồng thời WSSV, IHHNV, β-actin với
sản phẩm khuyếch đại cho kết quả 3 băng với kích thƣớc 1447 bp (WSSV), 703 bp
(IHHNV) , 216 bp (β-actin).
Năm 2011, Nguyễn Thị Tuyết Hoa đã nghiên cứu quy trình nested PCR phát hiện
vi-rút gây bệnh đốm trắng và nội giáp xác 10 chân trên nhiều đối tƣợng cảm nhiễm. Trong
nghiên cứu này, quy trình nested PCR đƣợc thiết lập có tính nhạy và tính đặc hiệu cao,
cho phép phát hiện WSSV và đoạn gen của giáp xác 10 chân đƣợc sử dụng nhƣ là nội
chuẩn của phản ứng. Sự kết hợp này là một trong những mục tiêu hàng đầu của nghiên
cứu. Mồi P1, P2, P3 và P4 (Kimura và ctv, 1996) và mồi Deca-20a2 và Deca-20s9
17



(CSIRO, 2008) đƣợc sử dụng cho phản ứng PCR 2 bƣớc. Quy trình có thể ứng dụng để
phát hiện WSSV trên mẫu có cƣờng độ nhiễm thấp.
2.5. Phƣơng pháp Polymerase Chain Reaction (PCR)
PCR là phƣơng pháp nhân nhanh một đoạn phân tử DNA mục tiêu trong ống
nghiệm. Phản ứng PCR đƣợc thực hiện trên cơ sở sinh tổng hợp DNA theo nhiều chu kỳ
nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm 3 trình tự nhƣ sau: biến tính, bắt cặp, kéo dài (Bùi Chí Bửu
và Nguyễn Thị Lang, 1999). Các yếu tố ảnh hƣởng đến kết quả phản ứng PCR: độ dài của
mồi khoảng 17 – 30 nucleotide; tỷ lệ G - C lý tƣởng trong đoạn mồi vào khoảng 50% để
nhiệt độ bắt cặp của đoạn mồi là không quá thấp; các đoạn mồi không nên chứa hơn 3
nucleotide giống nhau xếp liên tiếp; tránh sử dụng các đoạn mồi có thể nhân lên các đoạn
gen phụ; hai đoạn mồi không đƣợc có trình tự nucleotide bổ sung lẫn nhau; nhiệt độ lúc
bắt đầu phản ứng PCR tức là lúc cho enzym tổng hợp DNA vào, không nên thấp hơn
nhiệt độ bắt cặp của đoạn mồi (Nguyễn Ngọc Hải, 2007).
2.6. Kỹ thuật nested PCR
Nested PCR là phƣơng pháp phát hiện các sản phẩm PCR với tốc độ nhanh và độ
chính xác cao. Trong phƣơng pháp này, cặp mồi đƣợc thiết kế nhằm khuếch đại đoạn
DNA đích nằm bên trong sản phẩm PCR lần thứ nhất. Sản phẩm PCR lần thứ nhất làm
khuôn DNA cho sản phẩm PCR lần thứ hai đƣợc khuếch đại qua cặp mồi trong. Do đó
sản phẩm PCR lần hai sẽ ngắn hơn sản phẩm PCR lần nhất. Nested PCR có độ nhạy tăng
gấp 104 lần khi phát hiện chính xác sản phẩm PCR mong đợi (McPherson và ctv, 2001).
Kỹ thuật nested PCR gia tăng độ nhạy của sản phẩm nhờ tổng số chu kỳ đƣợc thực
hiện nhiều hơn. Độ đặc hiệu của nested PCR gia tăng là do sự bắt cặp của cặp mồi thứ 2
chỉ xảy ra chủ yếu với đoạn gen đƣợc nhân lên bởi phản ứng PCR thứ nhất. Nhƣợc điểm
lớn nhất của nested PCR đó là gia tăng mức tạp nhiễm trong quá trình chuyển mẫu giữa 2
lần chạy PCR. Tuy nhiên có thể khắc phục nhƣợc điểm này bằng cách cải tiến chạy nested
PCR trong 1 ống (Nguyễn Ngọc Hải, 2007).
Nguyên tắc: Trƣớc tiên khuếch đại một đoạn DNA trên bộ gen của vi sinh vật đích,
sau đó khuếch đại một đoạn DNA bên trong sản phẩm khuếch đại đầu tiên này để có sản


18


phẩm khuếch đại cuối cùng phát hiện đƣợc nhỏ hơn sản phẩm khuếch đại ban đầu (Phạm
Hùng Vân, 2002).

Hình 2.2 Nguyên tắc Nested- PCR
(Phạm Hùng Vân, 2009).
2.7. Phƣơng pháp phân tích định tính và định lƣợng thô nucleic acid
Sau khi thu nhận nucleic acid ở dạng sạch, ngƣời ta có thể tiến hành phân tích định tính
và định lƣợng chúng bằng một số phƣơng pháp nhƣ: phƣơng pháp điện di DNA trên gel,
phƣơng pháp định lƣợng bằng quang phổ kế.
2.7.1. Phƣơng pháp điện di DNA trên gel
Điện di là kỹ thuật để tách và định lƣợng acid nucleic với các kích thƣớc và hàm
lƣợng khác nhau. Kỹ thuật này dựa trên một đặc tính cơ bản của acid nucleic là các đại
phân tử tích điện âm do sự có mặt của gốc PO43- trên bề mặt. Do đó, khi acid nucleic trong
điện trƣờng với cƣờng độ dòng điện và hiệu điện thế thích hợp, chúng sẽ di chuyển dần về
phía cực dƣơng. Gel đƣợc sử dụng trong kỹ thuật điện di là gel agarose (với các phân tử
có kích thƣớc lớn) hoặc polyacryamid (các các phân tử có kích thƣớc nhỏ). Trong thí
nghiệm này, sử dụng gel agarose với nồng độ 1,5% với kích thƣớc các đoạn cần phân
tách (0,5 – 7,0 kb) (Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 1997).

19


2.7.2. Phƣơng pháp định lƣợng bằng quang phổ kế
Nguyên tắc của phƣơng pháp dựa vào sự hấp thu mạnh ánh sáng tử ngoại ở bƣớc
sóng 260 nm (OD260nm- Optical Density260nm) của các mẫu đo cho phép xác định nồng độ
nucleic acid trong mẫu dựa vào sự tƣơng quan sau: một đơn vị OD260nm tƣơng ứng với

một nồng độ là 50 µg/ml cho một dung dịch DNA sơi đôi và 40 µg/ml cho một dung dịch
RNA hay DNA sợi đơn. Tuy nhiên cách tính này chỉ đúng với các dung dịch nucleic acid
sạch. Đô kiểm tra độ sạch của dung dịch, ngƣời ta đo thêm giá trị OD ở 280 nm
(OD280nm). Bƣớc sóng 280 nm là bƣớc sóng mà các protein có mức hấp thụ cao nhất,
nhƣng các protein cũng hấp thụ ánh sáng ở bƣớc sóng 260 nm nhƣ các nucleic acid và do
đó làm sai lệch giá trị thật của nồng độ nucleic acid (Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 1997). Một
dung dịch nucleic acid đƣơc xem là sạch khi tỷ số OD260nm/OD280 nằm trong khoảng 1,6 1,8 (Sritunyalucksana, 2006).
2.8. Xác định số bản sao của một mẫu
Tính toán này dựa trên giả định rằng trọng lƣợng trung bình của một cặp base (bp)
là 650 Daltons. Điều này có nghĩa là 1 mol của 1 bp nặng 650 gram và trọng lƣợng phân
tử của bất kỳ mẫu DNA sợi đôi có thể đƣợc ƣớc tính bằng cách lấy sản phẩm của chiều
dài của mẫu DNA (bp) và 650. Sử dụng số Avogadro 6,022x1023 phân tử / mol, số lƣợng
của

các

phân

tử

của

mẫu

cho

mỗi

gram


có

thể

đƣợc

tính:

mol/g x phân tử /mol = phân tử /g. Cuối cùng số lƣợng bản sao của các mẫu trong mẫu có
thể đƣợc ƣớc tính bằng cách nhân 109 để chuyển đổi về ng.
Công thức tính số lƣợng bản sao (Staroscik, 2004):
(số lƣợng DNA x 6,022x1023) / (chiều dài của mẫu x1x109 x650) .
(ng x số / mol) / (bp x ng / g x g / mol bp).
2.9. Giải trình tự DNA tự động
Giải trình tự DNA tự động dựa theo nguyên lý của phƣơng pháp dideoxy đƣợc cải
tiến dựa vào các thiết bị tự động hóa nhanh và chính xác hơn. Máy đọc trình tự trên cả hai
mạch đơn, do vậy có thể phát hiện và giảm các nhầm lẫn do kỹ thuật. Trong kỹ thuật này
không phải đánh dấu bằng chất đồng vị phóng xạ mà bằng chất huỳnh quang
(fluochrome). Mỗi loại dideoxy nucleotide đƣợc đánh dấu bằng một fluochrome có màu
20


khác nhau. Máy giải trình tự có thể phát hiện cùng lúc hiện tƣợng huỳnh quang ở bốn độ
dài sóng khác nhau (Bùi Chí Bửu và Nguyễn Thị Lang, 1999).
Các phƣơng pháp xác định trình tự nucleic acid đều dựa vào 2 nguyên tắc:
Nguyên tắc hóa học: dựa vào các phân tử hóa học thủy giải đặc hiệu phân tử DNA,
tạo thành một tập hợp nhiều phân đoạn có kính thƣớc khác nhau.
Nguyên tắc enzym học: dựa vào sự tổng hợp mạch bổ sung cho trình tự cần xác
định nhờ DNA polymerase. Với việc sử dụng thêm các dideoxynucleotide cùng với các
deoxynucleotide thông thƣờng, kết quả tổng hợp cũng là sự hình thành một tập hợp nhiều

đoạn DNA có kính thƣớc khác nhau.
Các phân đoạn DNA sẽ đƣợc phân tách qua điện di trên gel polyacrylamide có khả
năng phân tách hai trình tự DNA chỉ chênh nhau một nucleotide. Việc sử dụng một đoạn
nucleotide có đánh dấu đồng vị phóng xạ, kết quả trình tự cần xác định đƣợc đọc trên bản
phóng xạ tự ghi từ bản điện di (Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 1997).

21


Chƣơng 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1. Thời gian và địa điểm thực hiện đề tài
Thời gian thực hiện đề tài từ tháng 01 năm 2012 đến tháng 06 năm 2012. Mẫu tôm
đƣợc thu thập tại 2 huyện Cái Nƣớc và Đầm Dơi thuộc tỉnh Cà Mau. Việc nghiên cứu
phát hiện WSSV trên mẫu tôm nghi ngờ nhiễm đƣợc thực hiện tại Phòng thí nghiệm Sinh
học phân tử của Viện nghiên cứu Công nghệ Sinh học và Môi trƣờng - Đại học Nông
Lâm Tp. Hồ Chí Minh.
3.2. Vât liệu và hóa chất
3.2.1. Dụng cụ và thiết bị
Thiết bị: tủ lạnh – 20o C và tủ mát 4oC, tủ hấp, tủ sấy dụng cụ, máy ly tâm, bếp
điện, cân điện tử, lò vi sóng (microwave), máy votex, máy PCR (Eppendorf), máy ảnh, bộ
điện di gồm nguồn và bồn điện di ngang, micropipette các loại: 1 µl – 5 µl; 5 µl – 10 µl;
20 µl – 100 µl và 100 µl - 1000 µl.
Dụng cụ: đầu típ 10 µl, 100 µl, 1000 µl, ống đong, đèn cồn, chày vô trùng, giấy
thắm, giấy bạc, kéo cắt mẫu, eppendorf 1,5 ml và 0,2 ml, giá đựng eppendorf, dụng cụ
gắp mẫu, khẩu trang, găng tay.
3.2.2. Hóa chất và vật liệu
3.2.2.1.Vật liệu
Mẫu DNA ly trích từ tôm bệnh bằng bộ kit của công ty cổ phần Công nghệ Việt Á
đã kiểm tra dƣơng tính tại Trung tâm dịch vụ kỹ thuật và huấn luyện nghiệp vụ quản lý
chất lƣợng nông lâm, thủy sản Cà Mau đƣợc dùng làm đối chứng dƣơng.

Mẫu tôm nghi ngờ nhiễm WSSV đƣợc thu thập tại ao nuôi tôm công nghiệp tại
huyện Cái Nƣớc và huyện Đầm Dơi thuộc tỉnh Cà Mau.
3.2.2.2. Hóa chất
Hóa chất điện di: Agarose (abm, Mỹ), Ethiumbromide 10 mg/ml (Sigma, Mỹ),
loading dye, thang DNA 1000 bp (abm, Mỹ), dung dịch đệm TBE 10X.
Hóa chất ly trích DNA: NaOH, SDS, TE 10X, Ethanol 70 %.
Hóa chất PCR (abm, Mỹ) gồm Taq DNA polymerase, PCR buffer 10X, MgCl2 25
mM , Nucleotides 25 mM (dNTPs), nƣớc cất.
22


Bảng 3.1 Trình tự đoạn mồi sử dụng trong nghiên cứu (Lo và ctv, 1996)
Đoạn mồi

Trình tự

Kích thƣớc sản phẩm

Mồi 146F1

5’-ACT-ACT-AAC-TTC-AGC-CTA-TCTAG-3’

1447 bp

Mồi 146R1 5’-TAA-TGC-GGG-TGT-AAT-GTT-CTT-ACG-A-3’
Mồi 146F2

5’-GTA-ACT-GCC-CCT-TCC-ATC-TCC-A-3’

Mồi 146F2


5’-TAC-GGC-AGC-TGC-TGC-ACC-TTG-T-3’

941 bp

3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
3.3.1. Phƣơng pháp thu mẫu và bảo quản mẫu
Mẫu tôm đƣơc thu thập tại các chủ hộ nuôi tôm có thông báo dịch bệnh. Trƣớc khi
xuống ao lấy mẫu chủ nuôi tôm rửa tay qua cồn và vớt những con có biểu hiện bệnh bệnh
rõ nhất (bơi lờ đờ sát mép bờ). Sau khi vớt tôm lên, mang tôm đƣợc bóc ra khỏi đầu để
quan sát có hay không sự xuất hiện đốm trắng ở bộ phận mang. Lấy khoảng 5 - 6 con có
biểu hiện bên ngoài rõ nhất. Tất cả các mẫu tôm đƣợc bảo quản trong cồn 95% sao cho
cồn ngập hết mẫu. Ghi tên chủ nuôi, nơi lấy mẫu, thời gian lấy mẫu và dán vào hộp đựng
mẫu. Nếu mẫu không đƣợc xét nghiệm ngay thì phải định kỳ thay dung dịch bảo quản
mẫu, mẫu đƣợc bảo quản ở 4oC.
3.3.2. Phƣơng pháp tách chiết DNA
Trong nghiên cứu này, DNA tôm đƣợc tách chiết theo nghiên cứu của
Kiatpathomchai và ctv (2001). Quy trình đƣợc tiến hành nhƣ sau:
Cho mẫu mang tôm vào eppendorf 1,5 ml và thêm 500 µl dung dịch đệm ly trích
thô DNA (0,025 N NaOH và 0,0125% SDS).
Dùng chày vô trùng nghiền cho mẫu đồng nhất.
Thêm 300 µl dung dịch ly trích thô DNA, tiếp tục nghiền.
Đun sôi eppendorf ở 100oC trong 10 phút (thấy dung dịch trong mẫu sôi lên).
Làm lạnh mẫu nhanh: chuyển eppendorf vào nƣớc đá lạnh trong 5 phút.

23


Ly tâm ở12.000 rpm trong 5 phút. Hút dịch nổi vào eppendorf mới. Nên thực hiện
phản ứng PCR ngay sau khi tách chiết. Tuy nhiên có thể giữ mẫu ở - 20oC trong thời gian

ngắn (khoảng 1 - 2 ngày).
3.3.3. Phƣơng pháp nested PCR xác định tôm nhiễm WSSV
Quy trình đƣợc thực hiện dựa theo nghiên cứu của (Lo và ctv, 1996). Các mẫu tôm
sau khi ly trích đƣợc dùng làm khuôn mẫu để chạy PCR. Các thao tác pha hỗn hợp đƣợc
tiến hành trong tủ hút vô trùng. Sử dụng găng tay khi thao tác để giảm tối đa khả năng tạp
nhiễm các enzyme không mong muốn từ bàn tay ngƣời thao tác lên ống phân tích. Mỗi
phản ứng gồm các thành phần sau:
Bảng 3.2 Thành phần phản ứng nested PCR bƣớc 1
Thành phần
Đệm
MgCl2
dNTP
Mồi 146F1
Mồi 146 R1
Taq DNA polymerase
DNA mẫu
Nƣớc cất

Nồng độ đầu

Nồng độ cuối

10X
25 mM
25 mM
10 µM
10 µM
5 U/µ l

2X

1,75 mM
0,2 mM
0,8 µM
0,8 µM
1,5 U
1 µl

Thêm vừa đủ 25 µ1

Bảng 3.3 Thành phần phản ứng nested PCR bƣớc 2
Thành phần
Đệm
MgCl2
dNTP
Mồi 146F2
Mồi 146R2
Taq DNA polymerase
Sản phẩm khuếch đại bƣớc 1
Nƣớc cất

Nồng độ đầu

Nồng độ cuối

10X
25 mM
25 mM
10 µM
10 µM
5 U/ µl


2X
1,75 mM
0,2 mM
0,8 µM
0,8 µM
1,5 U
1 µl

Thêm vừa đủ 25 µl

24