BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
**************

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
PHÂN LẬP, NUÔI CẤY VÀ BẢO QUẢN TẾ BÀO GỐC
THẦN KINH TỪ THAI CHUỘT NHẮT TRẮNG
(Mus musculus var. albino)

Ngành học

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện

: TÔN LONG TUẤN

Niên khóa

: 2008 - 2012

Tháng 7/2012


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
**************

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP, NUÔI CẤY VÀ BẢO QUẢN TẾ BÀO GỐC
THẦN KINH TỪ THAI CHUỘT NHẮT TRẮNG
(Mus musculus var. albino)

Hướng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

ThS. Phạm Văn Phúc

Tôn Long Tuấn

Tháng 7/2012


LỜI CẢM ƠN
Khóa luận tốt nghiệp là thành quả của sáu tháng nghiên cứu tại phòng Thí nghiệm
và Ứng dụng Tế bào gốc trường Đại học Khoa học Tự Nhiên Tp.HCM và là tâm huyết
của tôi sau 4 năm đại học không ngừng nỗ lực, phấn đấu vươn lên khi còn học tập tại
trường Đại học Nông Lâm Tp.HCM.
Xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu trường Đại Học Nông Lâm Tp.HCM, Ban
Chủ nhiệm bộ môn Công nghệ Sinh học đã hỗ trợ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho
chúng tôi trong quá trình học tập.
Trân trọng biết ơn quý thầy cô bộ môn Công nghệ Sinh học đã tận tình truyền đạt
những kiến thức quý báo cho tôi trong suốt thời gian học tập.
Xin bày tỏ lòng kính trọng và lời biết ơn sâu sắc đến ThS. Phan Kim Ngọc và ThS.
Phạm Văn Phúc, những người đã giúp đỡ tận tình, hướng dẫn và tạo mọi điều kiện tốt
nhất để tôi hoàn thành luận văn này.
Xin gửi lời biết ơn sâu sắc tới anh Vương Gia Tuệ, chị Đinh Thị Hồng Nhung đã
tận tình chỉ bảo, chia sẻ kinh nghiệm làm việc ở phòng thí nghiệm.

Xin gửi lời cảm ơn chân thành tới các bạn Yên, Dũng, Triết, Long, những người
bạn đồng nghiệp đã giúp tôi hoàn thành luận văn này.
Cảm ơn các bạn bè thân yêu của lớp DH08SH đã chia sẻ cùng tôi vui buồn trong
thời gian học tập trên ghế giảng đường đại học, cũng như hết lòng hỗ trợ, giúp đỡ tôi
trong quá trình thực hiện khóa luận.
Thành kính ghi ơn ba mẹ cùng những người thân trong gia đình luôn tạo điều kiện và
động viên con trong suốt quá trình học tập tại trường.
Tp.HCM, ngày 27 tháng 7 năm 2012
Tôn Long Tuấn

i


TÓM TẮT
Các bệnh thoái hóa thần kinh là một vấn đề nghiêm trọng đối với người lớn tuổi
trên toàn thế giới, trong đó bệnh Parkinson và Alzheimer hầu như được thu hút nhiều
nhất. Việc hạn chế các liệu pháp chữa trị cho các bệnh này hiện nay dẫn đến tỉ lệ người
chết hàng năm cao. Cho đến đầu thế kỉ 20, các nhà khoa học chấp nhận giả định rằng
sự tổn thương trong não không thể chữa trị vì thiếu khả năng tạo ra tế bào mới. Gần
đây, nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng có sự hiện diện ổ tế bào gốc trong não
trưởng thành. Các tế bào gốc này có khả năng biệt hóa thành các tế bào thần kinh và có
thể thay thế các tế bào bị mất trong não. Do đó, việc thiết lập các dòng tế bào gốc thần
kinh là cần thiết cho việc khám phá vai trò của chúng trong các liệu pháp phục hồi não
bị tổn thương.
Thực hiện phân lập tế bào gốc từ chuột mang thai 2 tuần tuổi. Tế bào được nuôi
cấy trong môi trường không huyết thanh có bổ sung các nhân tố B27, N2, EGF, bFGF,
heparin, insulin và transferrin. Đặc tính gốc thần kinh của các tế bào ứng viên được
chứng minh thông qua thí nghiệm tạo sphere, sự biệt hóa thành astrocyte và phương
pháp nhuộm hóa mô miễn dịch. Sau đó, đem tế bào đông lạnh trong môi trường không
huyết thanh.

Thành công của thử nghiệm đạt được trong việc thiết lập môi trường cho nuôi cấy
tế bào tạo sphere. Khi nuôi cấy trong môi trường không huyết thanh, các sphere có thể
hình thành nên các sphere thứ cấp. Các sphere có thể đạt được kích thướt tới 1 mm và
có thể duy trì trong vòng 2 tháng. Các tế bào ứng viên được chứng minh là có đặc tính
của tế bào gốc thông qua khả năng tự làm mới, biệt hóa thành astrocyte, và biểu hiện
nestin- marker phổ biến cho tế bào gốc thần kinh và tế bào tiền thân thần kinh. Ngoài
ta, các tế bào đông lạnh có tỷ lệ sống sau khi giải đông cao.

ii


SUMMARY
Neurodegenerative diseases, Parkinson and Alzheimer, are the most serious
problems in elder people all over the world. Limited therapies for these diseases leads
to high rate of annual death. Until the beginning of 20th century, almost scientists
accepted the theory that damage in brain could not be cured due to lack of proliferative
ability of neural cells. Recently, many researches indicated that there are niches of
stem cells in adult brains. Therefore, these stem cells have the ability to differentiate to
every line of neural cells and replace lost cells in brain. They are so-called neural stem
cells (NSC).
Neural stem cells can be isolated from fetal, adult brains, differentiate from
embryonic stem cells or induced-pluripotent stem cells. The establishment of neural
stem cell lines are crucial for discovering the roles of them in recovery of damaged
brains. We isolated neural stem cells from 2-week mouse fetus. These cells are
cultivated in serum-free medium supplemented with B27, N2, EGF, bFGF, heparin,
insulin and transferrin. Cells are propagated as floating spheres. Charactiristics of
neural stem cells are demonstrated on candidate cells through by sphere-formation
assay, differentiation to astrocyte assay and immunocytochemistry. Cells are cryoreserved in serum-free condition.
We are in establishing the medium in future of floating spheres when
cultivating in serum-free medium. These spheres can give rise to secondary and

tertiary spheres. These spheres would reach the diameter of 1 mm and can be
maintained in 2 months. Candidate cells are proved to have neural stem cells
characteristics such as ability to self-renew, differentiate into astrocyte and express
nestin – a popular marker for neural stem and progenitor cells. Cryoreservation of
neural stem cells also gives high rate of active cells after thawing.

iii


MỤC LỤC
Trang
Lời cảm ơn ........................................................................................................................ i
Tóm tắt .............................................................................................................................ii
Summary ........................................................................................................................ iii
Mục lục ........................................................................................................................... iv
Danh sách các chữ viết tắt ........................................................................................... viii
Danh sách các hình, sơ đồ .............................................................................................. ix
Chương 1 MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 1
1.1. Đặt vấn đề ................................................................................................................. 1
1.2. Yêu cầu đề tài ........................................................................................................... 3
1.3. Nội dung thực hiện .................................................................................................. 3
Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU ............................................................................... 4
2.1. Tế bào gốc ................................................................................................................ 4
2.1.1. Định nghĩa ............................................................................................................. 4
2.1.2. Ổ tế bào gốc ........................................................................................................... 4
2.1.3. Phân loại và gọi tên tế bào gốc .............................................................................. 5
2.1.3.1. Theo tiềm năng biệt hóa ..................................................................................... 5
2.1.3.2. Theo vị trí thu nhận ............................................................................................ 5
2.1.3.3. Theo kiểu tế bào biệt hóa.................................................................................... 5
2.1.4. Tình hình nghiên cứu tế bào gốc ở Việt Nam ....................................................... 6

2.2. Tế bào gốc thần kinh (neural stem cell_NSC) ......................................................... 6
2.2.1. Lịch sử nghiên cứu tế bào gốc thần kinh ............................................................... 6
2.2.2. Định nghĩa ............................................................................................................. 6
2.2.3. Ổ tế bào gốc thần kinh ........................................................................................... 7
2.2.4. NSC trong quá trình phát triển của hệ thần kinh trung ương ................................ 8
2.2.5. Sự hình thành và phát triển tế bào thần kinh trong não trưởng thành ................... 9
2.2.6. Phương pháp để chứng minh một tế bào ứng viên là NSC ................................. 11
2.2.6.1. Phân tích tính gốc thông qua việc phân tích sự tạo tập đoàn ........................... 11
iv


2.2.6.2. Khả năng biệt hóa tạo thành các loại tế bào trong hệ thần kinh ....................... 12
2.2.6.3. Sự biểu hiện marker của NSC .......................................................................... 12
2.3. Nuôi cấy tế bào gốc thần kinh trong in vitro .......................................................... 12
2.3.1. Đặc điểm của NSC khi nuôi cấy.......................................................................... 12
2.3.2. Các phương pháp nuôi cấy tế bào gốc thần kinh................................................. 13
2.3.2.1. Nuôi cấy lớp đơn .............................................................................................. 13
2.3.2.2. Nuôi cấy neurosphere ....................................................................................... 13
2.3.2.3. Nuôi cấy neurosphere cải tiến .......................................................................... 14
2.4. Marker của tế bào gốc thần kinh và các tế bào thần kinh trưởng thành ................. 14
2.4.1. Các marker tế bào gốc thần kinh ......................................................................... 14
2.4.1.1. Nestin ................................................................................................................ 14
2.4.1.2. Msi1 (homolog of drosophila musashi/Nrp-1) ................................................. 14
2.4.1.3. Sox1/2 (SRY-related HMG-box gene) ............................................................. 15
2.4.2. Marker cho tế bào gốc tiền thân .......................................................................... 15
2.4.2.1. Marker A2B5 .................................................................................................... 15
2.4.2.2. PSA-NCAM (polysialylayed neural cell adhesion molecule).......................... 15
2.4.2.3. Beta tubulin III ................................................................................................. 15
2.4.3. Marker tế bào thần kinh trưởng thành ................................................................ 16
2.4.3.1. Oligodendrocyte ............................................................................................... 16

2.4.3.2. Astrocyte.......................................................................................................... 16
2.4.3.3. Neuron .............................................................................................................. 16
2.5. Ứng dụng tế bào gốc thần kinh............................................................................... 16
2.5.1. Bệnh Parkinson .................................................................................................... 17
2.5.2. Bệnh Alzheimer ................................................................................................... 18
2.6. Đông lạnh tế bào gốc thần kinh .............................................................................. 19
2.6.1. Nguyên lý chung về đông lạnh tế bào ................................................................. 19
2.6.2. Chất bảo quản lạnh cho tế bào gốc thần kinh ...................................................... 20
2.6.3. Dung dịch đệm và các đại phân tử bảo vệ tế bào gốc thần kinh ......................... 20
2.6.4. Các phương pháp đông lạnh tế bào gốc thần kinh .............................................. 20
2.6.4.1. Phương pháp đông lạnh nhanh ......................................................................... 20
2.6.4.2. Phương pháp thủy tinh hóa (vitrification) ........................................................ 21
v


2.6.5. Những yếu tố ảnh hưởng đến chất lượng NSC sau đông lạnh và giải đông ....... 21
2.6.5.1. Chất lượng tế bào trước đông lạnh ................................................................... 21
2.6.5.2. Tốc độ làm lạnh ................................................................................................ 21
6.5.3. Tốc độ giải đông .................................................................................................. 21
6.5.4. Sự hình thành tinh thể đá ..................................................................................... 21
2.7. Đánh giá tế bào gốc thần kinh sau giải đông .......................................................... 22
Chương 3 VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................................... 23
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu .......................................................................... 23
3.2. Vật liệu ................................................................................................................... 23
3.2.1. Mẫu vật ................................................................................................................ 23
3.2.2. Dụng cụ................................................................................................................ 23
3.2.3. Thiết bị................................................................................................................. 24
3.2.4. Hóa chất ............................................................................................................... 24
3.2.4.1. Dung dịch đệm rửa tế bào PBS (-) (không có ion Ca2+ và Mg2+) ..................... 24
3.2.4.2. Dung dịch tách tế bào - trypsin/EDTA 0,25 % ................................................ 25

3.2.4.3. Môi trường nuôi tế bào gốc thần kinh .............................................................. 25
3.2.4.4. Dung dịch hyaluronidase (1,0 mg/ml) .............................................................. 25
3.2.4.5. Dung dịch PBS/agarose 1,5%........................................................................... 26
3.3. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................................ 26
3.3.1. Quy trình phân lập, nuôi cấy và bảo quản tế bào gốc thần kinh ......................... 26
3.3.1.1. Phương pháp tráng gel bình Roux .................................................................... 26
3.3.1.2. Phương pháp tráng poly-L-lysine bình Roux ................................................... 27
3.3.1.3. Phương pháp phân lập và thu nhận tế bào gốc thần kinh chuột từ não chuột .. 27
3.3.1.4. Phương pháp cấy chuyền tế bào gốc thần kinh ................................................ 28
3.3.2. Phương pháp chứng minh tế bào ứng viên là tế bào gốc thần kinh .................... 29
3.3.2.1. Phương pháp đánh giá khả năng tự làm mới của tế bào gốc ứng viên ............. 29
3.3.2.2. Phương pháp biệt hóa tế bào gốc thần kinh thành astrocyte ............................ 30
3.3.2.3. Phương pháp chứng minh tế bào ứng viên có biểu hiện marker nestin ........... 30
3.3.2.4. Phương pháp chứng minh tế bào astrocyte bằng marker GFAP ...................... 32
3.3.3. Phương pháp đông lạnh tế bào ............................................................................ 32
vi


3.3.3.1. Phương pháp đông lạnh tế bào gốc thần kinh .................................................. 32
3.3.3.2. Phương pháp giải đông tế bào gốc thần kinh ................................................... 33
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................................... 34
4.1. Kết quả phân lập và nuôi cấy sơ cấp tế bào gốc thần kinh từ não chuột thai......... 34
4.1.1. Kết quả nuôi cấy sơ cấp tế bào gốc thần kinh từ não thai chuột ......................... 34
4.1.2. Kết quả cấy chuyền tế bào gốc thần kinh ............................................................ 39
4.2. Chứng minh tế bào ứng viên là tế bào gốc thần kinh từ não thai chuột ................. 41
4.2.1. Kết quả đánh giá khả năng tự làm mới thông qua sự hình thành sphere ............ 41
4.2.2. Đánh giá sự biểu hiện marker của tế bào gốc thần kinh trên tế bào ứng viên..... 43
4.2.3. Kết quả biệt hóa tế bào gốc thần kinh ứng viên thành tế bào astrocyte ............. 45
4.3. Kết quả bảo quản tế bào ......................................................................................... 49
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .......................................................................... 52

5.1. Kết luận................................................................................................................... 52
5.2. Đề nghị ................................................................................................................... 52
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 53
PHỤ LỤC

vii


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
AS
BDNF
BSA
ctv
DMSO
DMEM
EC
EGF
EG
ES
FACS
FBS
FGF
FITC
ICM
GFAP
LV
MS
NSC
PBS
PNS

PSA-NCAM
RMS
SC
SGZ
SVZ

Adult stem cell
Brain-drived neutrophic factor
Bovine serum albumin
Cộng tác viên
Dimethylsulfoxide
Dulbecco’s modified essential medium
Embryonic carcinoma
Epidermal growth factor
Embryonic germ cell
Embryonic stem cell
Fluorescence activated cell sorting
Fetal bovine serum
Fibroblast growth factor
Fluorescein isothiocyanate
Inner cell mass
Gial fibrillary acidic protein
Lateral ventricle
Multiple sclerosis
Neural stem cell
Phosphate buffer saline
Peripheral nervous system
Polysialylayed neural cell adhesion molecule
Rostral migratory stream
Stem cell

Subgranular zone
Subventricular zone

viii


DANH MỤC HÌNH, SƠ ĐỒ
Trang
Hình 2.1 Nguồn tế bào gốc vạn năng phôi người ........................................................... 4
Hình 2.2 Quá trình biệt hóa của tế bào gốc thần kinh .................................................... 7
Hình 2.3 Các vị trí của hệ thần kinh chứa NSC.............................................................. 8
Hình 2.4 Minh họa cho ổ tế bào gốc thần kinh ............................................................... 9
Hình 2.5 Sự di chuyển của nguyên bào thần kinh ........................................................ 11
Hình 2.6 Liệu pháp tế bào gốc điều trị bệnh Parkinson................................................ 18
Hình 2.7 Liệu pháp tế bào gốc điều trị bệnh Alzheimer ............................................... 19
Hình 3.1 Một số dụng cụ trong quá trình thí nghiệm ................................................... 24
Hình 3.2 Một số thiết bị dùng trong quá trình thí nghiệm ............................................ 25
Hình 3.3 Quy trình phân lập tế bào gốc thần kinh ........................................................ 29
Hình 4.1 Quần thể tế bào đơn ban đầu và sau 2 ngày nuôi cấy sơ cấp......................... 36
Hình 4.2 Mẫu nuôi cấy sơ cấp từ não thai chuột 8,5 ngày tuổi .................................... 39
Hình 4.3 Mẫu nuôi cấy sơ cấp từ não thai chuột 18 ngày tuổi ..................................... 39
Hình 4.4 Cấy chuyền tế bào gốc thần kinh ................................................................... 40
Hình 4.5 Sự tạo thành các neuosphere thứ cấp từ các sphere sơ cấp ........................... 41
Hình 4.6 Sự hoại tử của neurosphere ............................................................................ 41
Hình 4.7 Quá trình hình thành sphere sau 24 giờ nuôi cấy .......................................... 42
Hình 4.8 Sự hình thành sphere sau 1 tuần nuôi cấy...................................................... 43
Hình 4.9 Nhuộm hóa miễn dịch neurosphere .............................................................. 45
Hình 4.11 Sự thay đổi hình thái của tế bào khi biệt hóa .............................................. 47
Hình 4.12 Hình thái sphere trong quá trình biệt hóa .................................................... 47
Hình 4.13 Quá trình biệt hóa tế bào ứng viên thành tế bào astrocyte........................... 48

Hình 4.14 Nhuộm tế bào biệt hóa thành astrocyte bằng GFAP và Hoechst 33342...... 49
Hình 4.15 Hình thái tế bào giải đông ............................................................................ 50
Sơ đồ 3.1 Mô tả các nội dung nghiên cứu ..................................................................... 27
ix


Chương 1 MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Các bệnh thoái hóa thần kinh là một vấn đề nghiêm trọng đối với người lớn tuổi
trên toàn thế giới. Trong đó, bệnh Parkinson và Alzheimer hiện nay đang được quan
tâm nhiều nhất. Parkinson là một bệnh rối loạn thoái hóa hệ thần trung ương trong
vùng chất đen của não và làm giảm khả năng tiết dopamin. Nhưng nguyên nhân tại sao
các tế bào não sản sinh ra dopamin lại bị thoái hóa và chết đi thì cho tới tận bây giờ
khoa học vẫn chưa tìm ra được. Y học hiện đại vẫn chưa có cách nào để phòng ngừa
và chữa khỏi hẳn được bệnh. Đây là những bệnh nghiêm trọng, đe dọa đến tính mạng
và ảnh hưởng đến chất lượng cuộc sống của bệnh nhân cũng như thân nhân của họ.
Vào năm 2011, theo thống kê của Parkinson’s Disease Foundation (PDF), có
khoảng 7 đến 10 triệu người trên toàn thế giới mắc bệnh Parkinson. Con số này nhiều
hơn số người mắc bệnh tổn thương cột sống, bệnh Lou Gehrig kết hợp lại. Ước tính
mỗi năm có 60.000 người Mỹ chẩn đoán mắc bệnh Parkinson mỗi năm và con số này
chưa phản ánh hết hàng ngàn trường hợp còn lại được phát hiện. Kết hợp chi phí trực
tiếp và gián tiếp để chữa trị Parkinson từ người bệnh không có khả năng làm việc ước
tính gần 2.500 USD mỗi năm và nếu có phẫu thuật thì có thể lên tới 100.000 USD cho
mỗi bệnh nhân. Ngoài ra, ngày càng có nhiều bằng chứng về mối liên hệ giữa các bệnh
như sức khỏe tâm thần và tiểu đường. Điều này nhấn mạnh sự cần thiết cho việc tìm ra
một phương pháp điều trị bệnh phù hợp.
Hiện nay chưa có thuốc chữa trị khỏi được bệnh Parkinson nói riêng cũng như các
bệnh thoái hóa thần kinh nói chung. Các phương pháp hiện tại chỉ chú trọng làm sao
trì hoãn được sự tiến triển của triệu chứng bệnh mà không trị được nguyên căn. Mặc
dù đã có một số loại thuốc có thể làm giảm triệu chứng của bệnh. Tuy nhiên, bệnh

Parkinson biểu hiện ở mỗi người khác nhau, vì vậy không có một cách dùng thuốc duy
nhất cho tất cả bệnh nhân.
Trong vài thập kỷ gần đây, chúng ta đã được chứng kiến nhiều thành tựu quan
trọng trong nghiên cứu và ứng dụng tế bào gốc. Sự ra đời của tế bào gốc đã mở ra
niềm hy vọng to lớn về khả năng chữa trị bệnh cho con người, đặc biệt các bệnh liên
1


quan đến suy thoái chức năng tế bào. Hệ thần kinh là cơ quan phức tạp được cấu thành
các tế bào thần kinh, và các tế bào thần kinh đệm có vai trò bao quanh và hỗ trợ các
neuron. Các neuron sẽ dẫn truyền tính hiệu tác động đến các chức năng, như các quá
trình xử lí nhận thức và vận động của cơ thể. Một kiểu tế bào thần kinh đệm (tế bào
glia) là tế bào oligodendrocyte (tế bào thần kinh đệm ít nhánh), hoạt hóa giúp làm tăng
tốc truyền tính hiệu của tế bào thần kinh cho một khoảng cách xa. Nếu mất đi tế bào
nào trong các kiểu này sẽ gây các bất thường trong chức năng của não.
Nhiều nghiên cứu hiện tại đã hướng đến điều trị bệnh Parkinson bằng tế bào gốc
được xem như là mô hình tiêu biểu cho việc điều trị theo liệu pháp này đối với các
bệnh thần kinh. Tế bào gốc được cấy vào vị trí tổn thương của não và biệt hóa thành
các tế bào neuron tiết dopamin, điều này mang lại hy vọng trong việc điều trị bệnh này
(Perrier và ctv, 2004). Các nghiên cứu gần đây cho thấy rằng, trong não trưởng thành
có thể sản sinh ra tế bào thần kinh mới để hồi phục lại chức năng của não (Zhao và ctv,
2008). Tuy nhiên, tế bào gốc trưởng thành rất ít ở mô hay cơ quan trưởng thành, do đó
để phân lập được các tế bào này là một thách thức, và các phương pháp giúp tăng sinh
tế bào trong nuôi cấy vẫn chưa được tối ưu. Tế bào gốc có nguồn gốc từ não thai do
tính đa năng cao hơn tế bào gốc trưởng thành nên khả năng tăng sinh mạnh trong in
vitro. Nhìn chung, các tế bào gốc từ não thai phát triển tương đối dễ dàng trong quá
trình nuôi cấy nhân tạo và biệt hóa thành nhiều dạng tế bào khác nhau nên có tiềm
năng ứng dụng lớn trong cấy ghép và điều trị bệnh mãn tính và nan giải mà hiện nay
chưa có biện pháp điều trị hiệu quả.
Vì vậy, trong phạm vi đề tài này tìm hiểu phương pháp thu nhận, nuôi cấy và bảo

quản tế bào gốc thần kinh từ não thai chuột hiệu quả nhất, nhằm thu nhận tế bào gốc
thần kinh với số lượng nhiều và sức sống tốt để ứng dụng cho những nghiên cứu trên
mô hình động vật bị bệnh lí thần kinh hay những nghiên cứu lâm sàng trên người.

2


1.2. Yêu cầu đề tài
Xây dựng quy trình phân lập, nuôi cấy tăng sinh và bảo quản tế bào gốc thần kinh
từ não thai chuột nhắt trắng (Mus musculus var. albino). Từ đó, tạo ra dòng tế bào gốc
thần kinh ổn định để phục vụ cho các nghiên cứu và ứng dụng trong việc hỗ trợ, điều
trị nhiều bệnh thần kinh.
1.3. Nội dung thực hiện
Phân lập và nuôi cấy tế bào gốc thần kinh từ não thai chuột nhắt trắng (Mus
musculus var. albino) trong môi trường không huyết thanh DMEM/F12 có bổ sung các
thành phần dinh dưỡng B27, N2, heparin, insulin và các yếu tố tăng trưởng EGF, FGF.
Chứng minh tính gốc của tế bào ứng viên sau khoảng 3 đến 4 lần cấy chuyền tăng
sinh thông qua khả năng tạo sphere, biệt hóa thành tế bào astrocyte và sự biểu hiện
marker nestin.
Thiết lập quy trình bảo quản tế bào gốc thần kinh. Đánh giá tế bào trước đông
lạnh và sau khi giải đông theo hình thái, khả năng tăng sinh tiếp tục của tế bào sau giải
đông.

3


Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Tế bào gốc
2.1.1. Định nghĩa
Tế bào gốc (Stem Cell_SC) là những tế bào không (hoặc chưa) chuyên hóa

trong mô sống, chúng có khả năng trở thành các tế bào chuyên hóa với các chức năng
sinh lí. Trong điều kiện in vivo hay in vitro, một tế bào gốc có thể tiến hành một số
lượng lớn chu kỳ phân bào nguyên nhiễm thông qua sự tự làm mới (self-renewal) và
có khả năng biệt hóa (differentiation) thành bất kỳ kiểu tế bào trưởng thành nào (Phan
Kim Ngọc, 2009). Về cơ bản, mọi tế bào trong cơ thể người đều có nguồn gốc từ trứng
đã thụ tinh (còn được gọi là hợp tử), là sự kết hợp giữa trứng và tinh trùng.

Hình 2.1 Nguồn tế bào gốc vạn năng phôi người
/>2.1.2. Ổ tế bào gốc
Ổ tế bào gốc (stem cell niche) là vi môi trường (microenviroment) mà ở đó chứa
quần thể tế bào gốc. Cấu trúc ổ tế bào gốc bao gồm tế bào xung quanh ổ, chất nền
ngoại bào, các yếu tố có thể hòa tan được (Alvarez-Buylla và Lim, 2004). Nhờ đó, tế
bào gốc tránh được các yếu tố kích thích biệt hóa và hiện tượng apoptosis để giữ trạng
thái cân bằng với sự tăng sinh của tế bào gốc (Moore và Lemischka, 2006).

4


2.1.3. Phân loại và gọi tên tế bào gốc
2.1.3.1. Theo tiềm năng biệt hóa
Tế bào toàn năng hay toàn thế (totipotent): có tiềm năng cao nhất và có thể trở
thành tất cả các tế bào của cơ thể. Ở động vật có vú kể cả người, có hơn 200 loại tế
bào thuộc các nhóm tế bào thần kinh, tế bào cơ, tế bào biểu mô, tế bào máu,…
Tế bào đa năng hay vạn năng (pluripotent): mô tả tế bào gốc có khả năng biệt hóa
thành các tế bào xuất xứ từ ba lớp phôi: ngoại bì, trung bì, nội bì. Một trong ba lớp này
sẽ tạo ra tất cả các loại tế bào chuyên biệt trong cơ thể.
Tế bào đa năng (multipotent): dùng để chỉ những tế bào có khả năng biệt hóa
thành nhiều tế bào khác. Một số tác giả cho rằng thuật ngữ pluripotent và multipotent
là hoàn toàn giống nhau, chúng đều mô tả những tế bào có khả năng biệt hóa thành
nhiều kiểu tế bào khác nhau.

2.1.3.2. Theo vị trí thu nhận
Tế bào gốc phôi (embryonic stem cell_ES) được thu nhận đầu tiên từ phôi chuột
vào năm 1981, ở người vào năm 1998 từ lớp sinh khối bên trong (inner cell mass_
ICM) của phôi giai đoạn phôi nang. Tế bào gốc phôi có khả năng phân chia vô hạn và
biệt hóa thành các tế bào khác nhau từ ba lớp phôi.
Tế bào mầm (tế bào gốc sinh dục; embryonic germ cell_EG) thu nhận từ rãnh sinh
dục, có tính vạn năng và có một số khác biệt so với tế bào ES. Tế bào mầm được gọi
theo kiểu tế bào biệt hóa, nghĩa là chúng biệt hóa thành các tế bào sinh dục.
Tế bào gốc biểu mô ung thư phôi (embryonic carcinoma_EC) thu nhận đầu tiên từ
khối u trong tinh hoàn và buồng trứng ở một số chủng chuột. EC có bản chất giống
như các tế bào gốc phôi, có thể biệt hóa thành nhiều kiểu tế bào khác.
Tế bào gốc trưởng thành (adult stem cell_AS) được tìm thấy hầu hết ở các mô
chuyên biệt trong cơ thể trưởng thành là loại tế bào chưa chuyên hóa như trong tủy
xương, máu, giác mạc, gan… (Paspala và ctv, 2011). Các tế bào này có thể tự đổi mới
và biệt hóa thành nhiều kiểu tế bào chuyên biệt.
2.1.3.3. Theo kiểu tế bào biệt hóa
Tế bào gốc cơ tim là tế bào sẽ biệt hoá thành tế bào cơ tim, tế bào gốc xương là
những tế bào biệt hoá thành những tế bào xương… Nhưng có một số tác giả cho rằng
5


cách gọi tên này không thật hợp lí vì các tế bào trên là những tế bào tiền thân
(progenitor cell) hay cơ chất (precursor cell) không phải là những tế bào gốc thực thụ.
2.1.4. Tình hình nghiên cứu tế bào gốc ở Việt Nam
Ở Việt Nam, công nghệ tế bào gốc vẫn còn khá mới mẻ, đặc biệt là tế bào gốc
phôi. Chỉ trong vài năm tiếp cận và nghiên cứu ứng dụng đến nay đã thu được những
thành công bước đầu. Năm 2005, một công trình xuất sắc của GS Phan Toàn Thắng
phát hiện từ màng lót dây cuốn rốn đã hứa hẹn nhiều ứng dụng trong trị liệu. Vào đầu
năm 2009, các nhà khoa học Viện Bỏng Quốc Gia nghiên cứu và ứng dụng thành công
công nghệ tế bào gốc trong cơ chế tái tạo da, qua đó điều trị bệnh loét khó lành. Ngày

15/02/2009, Ngân hàng Tế bào gốc MekoStem được khai trương tại Tp. Hồ Chí Minh,
là ngân hàng chính quy và hiện đại theo tiêu chuẩn quốc tế (Phan Kim Ngọc, 2009).
Hiện nay, tế bào gốc đã thu hút sự quan tâm của nhiều quốc gia trên thế giới, góp phần
tìm ra giải pháp và nhân rộng hoạt động cấy ghép tế bào gốc cho các nước có nguồn
lực hạn chế nói chung và Việt Nam nói riêng.
2.2. Tế bào gốc thần kinh (neural stem cell_NSC)
2.2.1. Lịch sử nghiên cứu tế bào gốc thần kinh
Vào giữa thế kỉ XX, người ta cho rằng các tế bào thần kinh mới có thể được hình
thành não động vật có vú trưởng thành. Đến năm 1960, Joseph và Gopal đã đưa ra các
bằng chứng về sự phát triển những tế bào thần kinh mới ở người trưởng thành. Vào
những năm 1980, các nhà khoa học cấy các tế bào tiết dopamin từ tuyến thượng thận
của chính bệnh nhân vào não, tuy nhiên chỉ cải thiện tạm thời.
Đến thập niên 1990, đã có nhiều nghiên cứu hướng đến việc xác định NSC
(Paspala và ctv, 2011). Năm 1992, các tế bào gốc thần kinh người được nuôi cấy in
vitro thành công (Ayuso-Sacido và ctv, 2008).
Ngày 3/12/2007, Arenas và đồng nghiệp tại viện Karolinska (Thụy Điển) xác định
nguồn tế bào gốc thần kinh/tiền thân não giữa, mang lại hiệu quả đáng kể khi cấy ghép
vào chuột mang bệnh Parkinson (Phan Kim Ngọc, 2009).
2.2.2. Định nghĩa
Tế bào gốc thần kinh là các tế bào có khả năng tăng sinh và tự làm mới, được phân
lập từ não và tủy sống mà không liên quan đến giai đoạn phát triển, có thể là ở thời kỳ
phôi thai, bào thai, hoặc thời kỳ trưởng thành. Sau đó các tế bào này biệt hóa thành các
6


loại tế bào của não, bao gồm tế bào thần kinh (neuron), tế bào hình sao (astrocyte) và
tế bào thần kinh đệm ít gai (oligodendrocyte) (Martin và Kuschinsky W., 2006).

Hình 2.2 Quá trình biệt hóa của tế bào gốc thần kinh
(Martin và Kuschinsky W., 2006)

2.2.3. Ổ tế bào gốc thần kinh
NSC có thể được phân lập từ nhiều vùng khác nhau trong não trưởng thành và hệ
thần kinh ngoại vi. Tuy nhiên, vùng SVZ của não thất bên và vùng SGZ của vùng hồi
hải mã là hai vùng đặc biệt mà trong đó tập trung và nuôi dưỡng cho sự hình thành và
phát triển NSC (Doetsch, 2003; Landgren và Curtis, 2011).
Bằng chứng cho sự tồn tại ổ tế bào gốc thần kinh được thực hiện bằng cách cấy tế
bào gốc thần kinh vào vùng không chứa tế bào thần kinh của não động vật thì thấy
vùng được cấy tế bào gốc thần kinh này tăng sinh, di cư và biệt hóa thành các tế bào
chuyên hóa (Paspala và ctv, 2011). Ngoài ra, tế bào gốc thần kinh được cấy vào có khả
năng cung cấp cytokine và các yếu tố dinh dưỡng thần kinh, giúp hỗ trợ trong việc xây
dựng hệ thống thần kinh. (Yun và ctv, 2011).
Trong não của động vật có vú trưởng thành (in vivo), tế bào gốc thần kinh tham
gia vào quá trình phát triển hệ thần kinh dưới các điều kiện sinh lí tại một số vị trí đặc
biệt: vùng SVZ của não thất bên, vùng SGZ của vùng hồi hải mã. Các tế bào gốc thần
kinh cũng có khả năng sửa chữa hư hại cho hệ thần kinh trung ương.

7


Hình 2.3 Các vị trí của hệ thần kinh chứa NSC
(www.nature.com/nature/journal/v414/n6859/fig_tab/414112a0_F1.html#figure)
2.2.4. NSC trong quá trình phát triển của hệ thần kinh trung ương
Trong suốt quá trình phát triển của não, các chương trình thiết lập từ trước tạo ra
quần thể NSC biệt hóa theo không gian và thời gian (Alvarez-Buylla và ctv, 2001).
Trong quá trình phát triển của phôi, sự biệt hóa là sự kiện trung tâm. Sự phát sinh hình
thái, quá trình tổ chức các tế bào và mô là yếu tố đầu tiên cần cho sự biệt hóa tế bào.
Sự kiện trung tâm của phôi vị là sắp xếp lại các phôi bào để tạo thành ba lá phôi bao
gồm ngoại bì, trung bì và nội bì. Một phần ngoại bì vùng lưng được biệt hóa thành tế
bào thần kinh, vùng này của phôi được gọi là tấm thần kinh. Quá trình hình thành phôi
thần kinh sẽ tạo ra ống thần kinh và phôi ở giai đoạn này được gọi là phôi thần kinh.

Ống thần kinh sẽ tạo thành não và tủy sống.
Sự phát sinh thần kinh trong não thai bắt đầu với sự cảm ứng từ tế bào biểu mô
thần kinh, mà sẽ hình thành nên các tấm thần kinh ở phôi chuột 7 ngày rưỡi và sau đó
gấp lại hình thành nên các ống thần kinh (Gotz và Huttner, 2005). Hai đầu ống thần
kinh sẽ tiếp xúc với mặt trên cùng của não thất. Ban đầu, các tế bào biểu mô thần kinh
phân chia đồng đều tại bề mặt của não thất để tăng sinh quần thể tế bào gốc. Tuy
nhiên, tại một thời điểm nhất định, chúng bắt đầu phân chia không đồng đều tạo ra một
tế bào gốc mà nó vẫn giữ nguyên trên vùng não thất và một tế bào khác di chuyển tỏa
tia hướng ra ngoài (Haubensak và ctv, 2004). Các tế bào này chịu trách nhiệm cho sự
phát sinh thần kinh trong ống thần kinh và sau đó chúng hình thành nên các tế bào thần
kinh đệm tỏa tia. Tế bào thần kinh đệm tỏa tia được hình thành ở chuột khoảng 9 ngày
8


rưỡi. Các tế bào này có nguồn gốc từ các tế bào biểu mô thần kinh tại thời điểm bắt
đầu sự phát sinh thần kinh và sự hiện diện các loại tế bào chính trong quá trình phát
triển của não, nơi mà chúng hoạt động như là các tế bào tiền thân thần kinh cũng như
là giá thể cho sự di cư của các tế bào thần kinh mới sinh (Conti và Cattaneo, 2010).
2.2.5. Sự hình thành và phát triển tế bào thần kinh trong não trưởng thành
Theo suy nghĩ trước đây thì sự phát sinh thần kinh chỉ xảy ra ở giai đoạn phát triển
phôi trong CNS động vật có vú. Tuy nhiên, nghiên cứu đầu tiên bởi Altman và Das
vào năm 1965 đã khẳng định rằng điều này vẫn xảy ra trong não trưởng thành. Ở động
vật có vú kể cả người, neuron tăng lên tại các vùng não giới hạn nhất định như hành
khứu giác và vùng hồi hải mã (Zhao và ctv, 2008).

Hình 2.4 Minh họa cho ổ tế bào gốc thần kinh (Doetsch, 2003)
Trong hai cấu trúc SVZ và SGZ, các tế bào nội mô hình thành nên các mạch máu
và màng nền đáy, là thành phần thiết yếu của ổ tế bào gốc. Các tế bào nội mô này dính
tế bào gốc kiểu B của SVZ và SGZ để tạo ra tín hiệu khác nhau điều khiển sự tự làm
mới của tế bào gốc và quy định số phận của các dòng tế bào (Shen và ctv, 2004).

Trong vùng SVZ của não thất bên (lateral ventricle_LV) (hình 2.4 a), tế bào kiểu
B (neuroblast tăng sinh chậm) lót dưới lớp tế bào lông rung màng não thất E chức
9


năng như là NSC. Chúng hình thành nên các tế bào kiểu C (tế bào tiền thân thần kinh),
sau đó tạo ra nguyên bào thần kinh A (neuroblast). Lớp tế bào lót khoang não - tủy
sống từ phần lót ngoài của não thất, phân cách vùng não thất bên với SVZ. Tế bào kiểu
B định vị kề bên các tế bào lót khoang não-tủy sống và kéo dài xuyên qua lớp tế bào
lót khoang não - tủy sống để tiếp xúc với vùng não thất bên, hình thành một ống tế bào
thần kinh đệm và bao quanh một nhóm nguyên bào thần kinh A.
Các tế bào chưa trưởng thành có nguồn gốc từ các tế bào kiểu B là tế bào tiền thân
của nguyên bào thần kinh A. Một lớp màng đáy kéo dài từ các mạch máu đến các tế
bào lót khoang não - tủy sống tiếp xúc với các loại tế bào trong vùng SVZ. Các tế bào
kiểu B biểu hiện marker GFAP, chúng có khả năng tự làm mới, hình thành nên các tế
bào kiểu C tiền thân khuếch đại chuyển và rồi tiến đến các nguyên bào thần kinh A.
Các nguyên bào thần kinh A biệt hóa thành các tế bào thần kinh sau đó di cư hướng
đến hành khứu giác và các vùng cần thiết khác. Ngoài ra, tế bào kiểu B có thể tạo ra tế
bào thần kinh đệm ít gai (Temple 2001; Mirescu và Gould, 2003).
Trong vùng SGZ (hình 2.4 b), tế bào kiểu B đính vào mạch máu (blood vessel) và
nhận tín hiệu từ tế bào biểu mô để NSC trải qua quá trình tự làm mới D và biệt hóa G
(Doetsch, 2003). Ngoài ra, các tế bào kiểu B biểu hiện GFAP và có chức năng như tế
bào gốc, thông qua quá trình tự làm mới để tạo ra các tế bào chị em và các tế bào thần
kinh có hạt (Temple, 2001; Doetsch, 2003). Hơn 30.000 nguyên bào thần kinh thoát
khỏi SVZ tới RMS của động vật gặm nhấm mỗi ngày (Alvarez-Buylla và ctv, 2001).
Một điều đặc biệt là khả năng biệt hóa của các tế bào tiền thân vùng SVZ bị giới hạn,
số phận của các tế bào con cháu được xác định bởi thông tin về vị trí được thiết lập
trong suốt sự phát triển của hệ thần kinh trung ương (Merkle và ctv, 2007).
Tế bào thần kinh mới liên tục được bổ sung vào các mạch thần trong não trưởng
thành (Doetsch, 2003). Xác định tế bào gốc, sự phát sinh thần kinh trong não trưởng

thành đã được làm rõ trong vùng SVZ của chuột trưởng thành.
Ở hình 2.5 minh họa cho các nguyên bào thần kinh sinh ra tại vùng SVZ và di cư
thông qua một con đường đặc biệt được tìm thấy ở não một số động vật gọi là rostral
migratory stream (RMS) và đi đến hành khứu giác (Nakaguchi và ctv, 2010). Ở đây
chúng biệt hóa thành hai loại tế bào thần kinh trung gian khứu giác là tế bào hạt và tế
bào periglomerular (Doetsch và Scharff, 2001).
10


Hình 2.5 Sự di chuyển của nguyên bào thần kinh
(Martin và Kuschinsky W., 2006)
2.2.6. Phương pháp để chứng minh một tế bào ứng viên là NSC
Với sự tiến bộ trong công nghệ nuôi cấy tế bào đã cho phép các nhà nghiên cứu
thu nhận tế bào gốc thần kinh từ lớp ICM giai đoạn phôi nang (Conti và Cattaneo,
2010), từ tế bào gốc vạn năng cảm ứng, các ổ tế bào gốc của não thai và trưởng thành
trong in vitro (Conti và Cattaneo, 2010). Các quy trình nuôi cấy NSC trong điều kiện
bám dính và không bán dính dựa trên các yếu tố tăng trưởng đã được phát triển rộng
rãi (Kokovay và ctv, 2008). Sau đây là một số chiến lược cho thu nhận NSC hiện nay:
2.2.6.1. Phân tích tính gốc thông qua việc phân tích sự tạo tập đoàn
Phương pháp này có tính tiêu chuẩn cho việc xác định tính gốc của tế bào gốc nói
chung và tế bào gốc thần kinh nói riêng. Nguyên tắc chung là tế bào gốc có khả năng
phát triển thành tập đoàn, trong khi đó các tế bào biệt hóa không có khả năng này. Cụ
thể là một nhóm các tế bào, trong đó có chứa tế bào gốc thần kinh được nuôi trong môi
trường lỏng không huyết thanh, bổ sung yếu tố sinh trưởng EGF hay FGF-2, B27, N2,
insulin, transferrin, serin, progesteron. Các tế bào không phải là các tế bào gốc thần
kinh sẽ chết trong môi trường chọn lọc, trong khi các tế bào gốc thần kinh vẫn phát
triển tốt và hình thành các cụm tế bào từ các tế bào đơn gọi là neurosphere và có thể
phát triển trong thời gian dài.Trong một điều kiện và một thời gian nuôi cấy nhất định,
một tế bào đơn sẽ hình thành một tập đoàn, tập đoàn có kích thước càng lớn thì tế bào
ban đầu của nó có tính gốc càng cao, do vậy có thể tách tế bào gốc ra khỏi quần thể

ban đầu. Kĩ thuật này được tiến hành đầu tiên bởi Temple (1989), nhằm phân tích sự
tạo tập đoàn các tế bào gốc thần kinh mà ngày nay còn được sử dụng.
11


2.2.6.2. Khả năng biệt hóa tạo thành các loại tế bào trong hệ thần kinh
Tiến hành biệt hóa tế bào đơn từ các sphere sau khi thu nhận, được đem nuôi trong
môi trường DMEM/F12 bổ sung các thành phần thiết yếu như B27, N2, heparin,
insulin, 10% huyết thanh bào thai bò (fetal bovin serum_FBS) và loại bỏ các yếu tố
tăng trưởng EGF và FGF. Để tăng khả năng biệt hóa, các tế bào được nuôi trên bình
Roux có tráng poly-L-lysine trước đó thì chúng sẽ bám và biệt hóa thành tất cả các tế
bào của hệ thần kinh như neuron, astrocyte và oligodendrocyte.
2.2.6.3. Sự biểu hiện marker của tế bào gốc thần kinh
Các gốc thần kinh biểu hiện dương tính với marker nestin. Sau một thời gian nuôi
cấy, tiến hành biệt hóa thành các tế bào trong hệ thần kinh. Đối với tế bào astrocyte thì
biểu hiện dương tính với GFAP, còn đối với neuron biểu hiện dương tính với MAP2.
Hầu hết phương pháp này đòi hỏi phải tạo ra huyền phù tế bào đơn (chứa tế bào NSC),
rồi sàng lọc bằng kháng thể đơn dòng với marker kháng nguyên bề mặt.
2.3. Nuôi cấy tế bào gốc thần kinh trong in vitro
2.3.1. Đặc điểm của tế bào gốc thần kinh khi nuôi cấy
Các nghiên cứu trước đây có thể khái quát rằng yếu tố điều khiển sự tăng sinh và
biệt hóa của tế bào gốc phôi thần kinh được xếp vào hai nhóm chính, các yếu tố bên
ngoài và các yếu tố bên trong từ cơ chất nuôi cấy, thành phần môi trường và một số
tương tác phức tạp giữa các tế bào (Tsai và ctv, 2000).
Môi trường DMEM/F12 thì tế bào neuron sống lâu hơn DMEM. Môi trường căn
bản DMEM/F12 được phát triển ở nồng độ tối ưu các thành phần nhưng thiếu trong
DMEM như alanine, asparagine, cysteine, glutamate, proline và vitamin B12. Do tế
bào gốc thần kinh phát triển ở nồng độ đường cao, cần có thêm một số chất cho quá
trình chuyển hóa như putrescin, progesterone, transferrin, insulin, selenium salt gọi tắt
là yếu tố bổ sung N2. Trong môi trường DMEM/F12 kết hợp với FGF, EGF, B27 và

N2 được sử dụng cho sự phát triển và tăng sinh cho các tế bào thần kinh sau nguyên
phân. Có thể sử dụng cho hầu hết các tế bào hệ thần kinh trung ương, đặc biệt giúp các
tế bào gốc phôi phát triển tối ưu và sống trong khoảng thời gian dài.
Tuy nhiên, sự kết hợp B27 với DMEM/F12 còn tồn tại nhiều vấn đề như làm giảm
đáng kể dưỡng chất từ môi trường để cung cấp cho neuron và sinh ra nhóm chất gây
12


tổn thương tới thần kinh (excitotoxin) trong môi trường. Excitotoxin này là các acid
amin phản ứng với các thụ thể chuyên biệt trong não, hoặc gây kích thích quá mức sự
dẫn truyền thần kinh trong não dẫn đến chết tế bào thần kinh.
Ngoài ra, việc bổ sung yếu tố tăng trưởng thì khác nhau ở các loài khác nhau. NSC
ở chuột nuôi cấy thì cần FGF, EGF và heparin, còn ở chuột rat thì chỉ cần có FGF để
hình thành neurosphere. Hơn thế nữa, dưới các điều kiện thích hợp, các neurosphere
tương tác với EGF hoặc FGF có thể bám vào cơ chất và cảm ứng để biệt hóa thành
neuron, astrocyte và oligodendrocyte (Young và ctv, 2005).
Để tế bào bám tốt, bề mặt dụng cụ nuôi cần phải phủ các protein ngoại bào cần
thiết như poly-L-lysine, fibronectin, laminin, polyornithine, collagen, thylene-co-vinyl
alcohol. Tuy nhiên, hệ thống nuôi cấy tế bào in vitro, nhiều cơ chất được sử dụng như
yếu tố hòa tan hoặc cơ chất dùng bao phủ, có thể gây ảnh hưởng khác nhau lên tế bào
nuôi cấy. Ví dụ, poly-D-lysine, hầu như là cơ chất dùng để bao phủ bề mặt trong nuôi
cấy neuron hệ thần kinh trung ương, được chứng minh cải thiện khả năng sống của tế
bào tốt hơn (Young và ctv, 2003). Nhưng khi poly-D-lysine được huyền phù trong môi
trường, nó tạo ra chất độc gây chết tế bào (Liu và Hong, 2003).
2.3.2. Các phương pháp nuôi cấy tế bào gốc thần kinh
2.3.2.1. Nuôi cấy lớp đơn
Các cơ chất thường sử dụng để phủ dụng cụ nuôi là poly-L-lysine hoặc kết hợp
với laminin, fibronectin, hoặc polyornithine, được ủ với dụng cụ nuôi để chúng bám
vào bề mặt đĩa trước. Thực chất, đây là phương pháp nhằm tạo ra một vi môi trường
giống như trong não nơi mà chúng hiện diện. Các protein dùng để bao phủ đĩa là

chuyên biệt cho sự bám dính của tế bào tại vi môi trường não. Trong trạng thái bám
dính, với sự hiện diện của các mitogen như EGF, FGF thì các NSC tăng sinh không
biệt hóa. Tuy nhiên, nhiều tác giả cho rằng phương pháp này khó giữ được trạng thái
không biệt hóa của tế bào, khi nuôi cấy trong thời gian dài.
2.3.2.2. Nuôi cấy neurosphere
Một trong những tiến bộ trong nghiên cứu NSC là sự phát triển phương pháp
neurosphere. Neurosphere là các khối cầu gồm nhiều tế bào lơ lửng có nguồn gốc từ
một tế bào NSC đơn (Reynolds và ctv, 2005). Trong phương này, các NSC không bám
vào dụng cụ nuôi. Chiến lược này nhằm tránh sự biệt hóa của các tế bào NSC khi bám
13


dính. Nếu chuyển các neurosphere này sang môi trường có huyết thanh, loại bỏ các
mitogen thì chúng nhanh chóng biệt hóa thành các loại tế bào của hệ thần kinh. Tuy
nhiên, nuôi cấy một thời gian dài, các neurosphere to dần lên và chạm với bề mặt,
chúng sẽ bám, khi ấy các tế bào bề ngoài của neurosphere sẽ biệt hóa.
2.3.2.3. Nuôi cấy neurosphere cải tiến
Thấy được hạn chế của phương pháp nuôi cấy trước, Zheng và cộng tác viên vào
năm 2007 đã sử dụng gel agarose bao phủ bề mặt bình nuôi. Gel agarose giúp ngăn
chặn sự bám dính của neurosphere vào dụng cụ nuôi. Theo kết quả công bố, việc sử
dụng hệ thống nuôi chống bám bằng gel agarose có thể nuôi tế bào gốc thần kinh ít
nhất suốt 3 tháng liền mà chúng không biệt hóa, không có hiện tượng bám dính xảy ra.
Kết quả còn cho biết thêm gel agarose không gây ảnh hưởng đến sự tăng sinh và khả
năng biệt hóa của tế bào gốc thần kinh sau này (Zheng và ctv, 2007).
Mặc dù đã có nhiều nỗ lực được thực hiện để hiểu rõ hơn ở cấp độ tế bào và phân
tử liên quan đến sự biệt hóa, tuy vậy để xác định được nguồn thu nhận NSC tốt nhất
trong in vitro, quy trình tối ưu hóa và sự tăng sinh nhanh vẫn còn là mục tiêu trung tâm
của nghiên cứu tế bào gốc. Sự khác nhau về các kết quả trong nghiên cứu có lẽ được
giải thích bởi các quy trình nuôi cấy in vitro khác nhau cũng như là sử dụng các dòng
tế bào phôi, thai chuột khác nhau (Klein và Fishell, 2004).

2.4. Marker của tế bào gốc thần kinh và các tế bào thần kinh trưởng thành
2.4.1. Các marker tế bào gốc thần kinh
2.4.1.1. Nestin
Nestin là một sợi filament trung gian với domain xoắn alpha, có trong các khung
sườn tế bào. Nestin biểu hiện trội trong các quần thể tế bào gốc hay tiền thân của hệ
thống thần kinh trung ương, khi các tế bào thần kinh đã biệt hóa dần, gen này được
điều hòa giảm và có thể được thay thế bởi các protein khác. Dường như tất cả các tế
bào gốc thần kinh tăng sinh sẽ biểu hiện nestin. Trong điều kiện in vitro và in vivo, có
thể sử dụng kháng thể đơn dòng và đa dòng để đánh dấu nestin rất hiệu quả. Kháng thể
được sử dụng nhiều nhất là Rat401.
2.4.1.2. Msi1 (homolog of drosophila musashi/Nrp-1)
Musashi 1 (Msi 1) là protein gắn RNA ở thần kinh, chứa hai motif nhận diện RNA.
Cả RNA và protein này định vị nhiều trong não thai và thai trưởng thành, chủ yếu
14