BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
PHÂN LẬP TAXOID TỪ LÁ CÂY THÔNG ĐỎ LÂM ĐỒNG
TAXUS WALLICHIANA ZUCC

Ngành học

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện

: PHẠM VĂN MẠNH

Niên khóa

: 2008 - 2012

Tháng 07/2012


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

PHÂN LẬP TAXOID TỪ LÁ CÂY THÔNG ĐỎ LÂM ĐỒNG
TAXUS WALLICHIANA ZUCC

Hướng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

PGS.TS. TRẦN CÔNG LUẬN

PHẠM VĂN MẠNH

ThS. BÙI THẾ VINH

Tháng 07 / 2012


LỜI CẢM ƠN
Cảm ơn gia đình tôi, đã tạo điều kiện và là động lực to lớn cho tôi trong suốt thời
gian học đại học và quá trình làm nghiên cứu của tôi.
Cảm ơn PGS. TS. Lê Đình Đôn, TS. Trần Thị Lê Minh và toàn thể các Thầy, Cô
trong Bộ môn công nghệ sinh học đã tận tình hướng dẫn, truyền đạt kiến thức và có
những lời khuyên quý báu cho tôi trong thời gian làm khoá luận tốt nghiệp.
Tôi xin chân thành cảm ơn PGS. TS. Trần Công Luận đã tận tình giúp đỡ, chia sẻ
kinh nghiệm và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi để hoàn thành tốt khoá luận tốt nghiệp.
Tôi xin chân thành cảm ơn ThS. Bùi Thế Vinh đã truyền đạt cho tôi những kinh
nghiệm quý báu, sự tận tình quan tâm, hướng dẫn, giúp đỡ và có những lời khuyên bổ ích
để tôi hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp.
Cảm ơn Anh, Chị công tác và làm việc tại Trung Tâm Sâm và Dược Liệu TP.HCM
đã giúp đỡ và có những lời khuyên chân thành để tôi bước đi trong suốt thời gian nghiên
cứu.
Đặc biệt, tôi xin cảm ơn những anh, chị và các bạn đang thực hiện khoá luận tốt
nghiệp cao học, đại học đã đồng hành, chia sẻ kinh nghiệm và giúp đỡ tôi tận tình trong

những bước đi bỡ ngỡ của buổi đầu thực hiện đề tài cho đến ngày hoàn thành khoá luận.

Người thực hiện
PHẠM VĂN MẠNH

i


TÓM TẮT
Thông đỏ là nguồn dược liệu quý giá, chứa nhóm hợp chất taxoid có giá trị trong
nghiên cứu điều trị ung thư. Nổi bật lên là taxol một loại taxoid có khả năng điều trị ung
thư vú và ung thư buồng trứng được phân lập từ vỏ và lá của những loài taxus khác nhau.
Tuy nhiên, hàm lượng của nó khá thấp, khó đáp ứng được nhu cầu xã hội. May mắn thay,
quá trình bán tổng hợp taxol từ 10-DAB và một số taxoid khác thành công đã mở ra triển
vọng mới cho nhu cầu điều trị bệnh. Phân lập và xác định cấu trúc taxoid từ lá thông đỏ
Lâm Đồng Taxus wallichiana Zucc mở ra hướng mới cho nghiên cứu điều trị ung thư và
một số căn bệnh nguy hiểm khác.
Lá thông đỏ được sử dụng là nguồn nguyên liệu cho quá trình phân lập taxoid. Lá
được làm khô và chiết ngấm kiệt với MeOH theo tỉ lệ 1:6, sau đó được lắc phân đoạn với
diclomethan thu cao diclomethan. Qua sắc ký cột silica gel pha thuận với các hệ dung môi
giải ly khác nhau để phân lập taxoid tinh khiết. Cấu trúc taxoid được xác định dựa vào
phương pháp phổ hiện đại NMR 1D, 2D và so sánh với tài liệu tham khảo.
Hai taxoid được phân lập là: taxuspine F, taxchin A và một hợp chất phytosterol là
β-sitosterol được phân lập. Trong đó, taxchin A được ghi nhận lần đầu ở lá Taxus
wallichiana Zucc.

ii


SUMMARY

Isolation of taxoids from the needles of the Taxus wallichiana Zucc.
in Lam Dong province
Taxus were considered one of many important medicine sources, which contain taxoid
groups being valuable in treating cancers. The highlight of taxoid was taxol which used in
treating breast and ovarian cancers which isolated from needles and barks of different taxus
species. However, its field was rather slow and difficult to supply for the treatment. Fortunately,
the semi-synthetic process produced taxol successfully from 10-Deacetylbaccatin III and some
other taxoids which have been opened new ways for anticancer. The isolation and structural
identification of taxoid from needles of the Taxus wallichiana Zucc in Lam Dong provides and
introduces new ways for investing medicine of Vietnam.
The needles of the Taxus Wallichiana Zucc were used for isolating taxoids. It was dried
and extracted completely with methanol ratio 1:6. After it has being shaken with diclomethane
solvent to produce diclomethane glue. The tranditional chromatography approach using silica gel
was used for isolating the purity of taxoids with various solvent systems. Structures of taxoids
were identified by NMR spectroscopy approach 1D, 2D and compared with reference literature.
Two taxoids were taxchin A, taxuspine F and phytosterol compound was β-sitosterol
isolated. Taxchin A was isolated first time in the needles of the Taxus wallichiana Zucc.

Key words : Taxus wallichiana Zucc, taxoid.

iii


MỤC LỤC
Trang
Lời cảm ơn ................................................................................................................... i
Tóm tắt ......................................................................................................................... ii
Summary ...................................................................................................................... iii
Mục lục ........................................................................................................................ iv
Danh sách các chữ viết tắt............................................................................................. vii

Danh sách các bảng ...................................................................................................... viii
Danh sách các hình ....................................................................................................... ix
Chương 1 Mở Đầu ........................................................................................................ 1
1.1. Đặt vấn đề .............................................................................................................. 1
1.2. Yêu cầu của đề tài .................................................................................................. 2
1.3. Nội dung thực hiện................................................................................................. 2
Chương 2 Tổng Quan ................................................................................................... 3
2.1. Giới thiệu về cây Thông Đỏ ................................................................................... 3
2.1.1. Phân loại ............................................................................................................. 3
2.1.2. Đặc điểm sinh học............................................................................................... 3
2.1.3. Phân bố ............................................................................................................... 4
2.1.4. Sinh thái .............................................................................................................. 5
2.2. Đặc tính và phân loại taxoid ................................................................................... 6
2.2.1. Đặc tính của taxoid ............................................................................................. 6
2.2.2. Phân loại cấu trúc taxoid ..................................................................................... 6
2.3. Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ...................................................................... 7
2.3.1. Sắc ký hấp thụ ..................................................................................................... 7
2.3.1.1. Sắc ký cột cổ điển ............................................................................................ 7
2.3.1.2. Sắc ký lớp mỏng .............................................................................................. 8
2.3.1.3. Sắc ký nhanh – cột khô .................................................................................... 8
2.3.2. Phương pháp phổ nghiên cứu cấu trúc của hợp chất hữu cơ ................................ 8
2.4. Các công trình nghiên cứu trên thế giới về loài
Taxus wallichiana Zucc ........................................................................................ 9
iv


2.4.1. Các công trình nghiên cứu trên thế giới về loài Taxus wallichiana Zucc ............. 9
2.4.1.1. Nghiên cứu từ giai đoạn 1970-1999 ................................................................. 9
2.4.1.2. Giai đoạn từ 2000 – 2004 ................................................................................. 20
2.4.2. Các công trình nghiên cứu trong nước về loài Taxus wallichiana Zucc ............... 20

Chương 3 Vật Liệu Và Phương Pháp Nghiên Cứu ........................................................ 22
3.1. Thời gian và địa điểm làm nghiên cứu ................................................................... 22
3.2. Vật liệu .................................................................................................................. 22
3.2.1. Hoá chất .............................................................................................................. 22
3.2.2. Trang thiết bị....................................................................................................... 22
3.3. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................................ 23
3.3.1. Chiết xuất cao ..................................................................................................... 23
3.3.2. Lắc phân đoạn ..................................................................................................... 23
3.3.3. Sắc ký cột phân đoạn và tách các hợp chất tinh khiết .......................................... 23
3.3.3.1. Sắc ký cột phân đoạn (cột A)............................................................................ 23
3.3.3.2. Sắc ký cột phân lập taxoid ................................................................................ 24
3.3.3.3. Phân lập chất tinh khiết từ phân đoạn A2 ......................................................... 26
Chương 4 Kết Quả Và Thảo Luận................................................................................. 27
4.1. Kết quả quá trình chiết ........................................................................................... 27
4.2. Kết quả lắc phân đoạn ............................................................................................ 27
4.3. Kết quả sắc ký phân đoạn và phân lập hợp chất tinh khiết ...................................... 28
4.3.1. Kết quả sắc ký phân đoạn cột A .......................................................................... 28
4.3.2. Kết quả sắc ký cột phân lập taxoid ...................................................................... 29
4.3.3. Kết quả phân lập chất tinh khiết từ phân đoạn A2 ............................................... 30
4.4. Thảo luận ............................................................................................................... 31
4.4.1. Chất M3 được phân lập từ phân đoạn A4-2 ......................................................... 31
4.4.2. Chất M4 được phân lập từ phân đoạn A2 ............................................................ 32
4.4.3. Chất M2 được phân lập từ phân đoạn A4-4-2 ...................................................... 34
Chương 5 Kết Luận Và Đề Nghị ................................................................................... 41

v


5.1. Kết luận ................................................................................................................. 41
5.2. Đề nghị .................................................................................................................. 41

Tài Liệu Tham Khảo ..................................................................................................... 42

vi


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Từ viết tắt

Chữ đầy đủ của từ viết tắt

Nghĩa của từ viết tắt

s

Singlet

Mũi đơn

d

Doublet

Mũi đôi

dd

Doublet of doublet

Hai mũi đôi


t

Triplet,

Mũi ba

q

Quartet

Mũi bốn

m

Multiplet

Mũi đa
Hằng số ghép spin

J
SKC

Sắc ký cột

SKLM

Sắc ký lớp mỏng

MeOH


Methanol

EtO

Ethanol

PE

Petroleum ether

Pđ

Phân đoạn

Dd

Dung dịch

OAc

O-CO-CH3

OBz

O-CO-C6H5

CH2Cl2

Diclomethane


Ace

Aceton

NMR

Nuclear Magnetic Resonance

DEPT

Distortionless Enhancement by Polarization

Cộng hưởng từ hạt nhân

Transfer
HSQC

Heteronuclear Multiple Quantum Correlation

HMBC

Heteronuclear Multiple Bonds Correlation

COSY

Correlation Spectroscopy

vii



DANH SÁCH CÁC BẢNG
Trang
Bảng 2.1 Các hợp chất phân lập được từ Taxus wallichiana Zucc
trên thế giới từ năm 1979-1999.......................................................................... 9
Bảng 3.1 Phân đoạn cột A ................................................................................................ 24
Bảng 3.2 Phân đoạn cột A4 .............................................................................................. 25
Bảng 3.3 Phân đoạn cột A4-4 ........................................................................................... 26
Bảng 4.1 Dữ liệu phổ H1-NMR của M4 .......................................................................... 33
Bảng 4.2 Dữ liệu phổ M2 ................................................................................................. 34
Bảng 4.3 So sánh dữ liệu phổ của M2 và taxchin A.......................................................... 38

viii


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1 Lá và quả thông đỏ ......................................................................................... 4
Hình 2.2 Cấu trúc khung của 3 nhóm taxoid ................................................................. 7
Hình 2.3 Cấu trúc của taxoid (1-7) ................................................................................ 13
Hình 2.4 Cấu trúc của taxoid (8-12) .............................................................................. 14
Hình 2.5 Cấu trúc của taxoid (13-20) ............................................................................ 15
Hình 2.6 Cấu trúc của taxoid (21-25) ............................................................................ 16
Hình 2.7 Cấu trúc của taxoid (26-38) ............................................................................ 17
Hình 2.8 Cấu trúc của taxoid và hợp chất khác (39-44) ................................................. 18
Hình 2.9 Cấu trúc của flavonoid (45-52) ....................................................................... 19
Hình 2.10 Cấu trúc của các hợp chất khác (53-57) ........................................................ 20
Hình 2.11 Cấu trúc của taxoid (58-61) .......................................................................... 21
Hình 4.1 Sơ đồ tạo cao chiết MeOH thô........................................................................ 27
Hình 4.2 Sơ đồ tạo cao CH2Cl2 ..................................................................................... 27
Hình 4.3 Sơ đồ điều chế các phân đoạn cột A ............................................................... 28

Hình 4.4 SKLM các phân đoạn cao CH2Cl2 .................................................................. 29
Hình 4.5 Sơ đồ phân lập taxoid (M2, M3) từ phân đoạn A4 .......................................... 29
Hình 4.6 Kết tinh M3 .................................................................................................... 30
Hình 4.7 SKLM của M2 và M3 .................................................................................... 30
Hình 4.8 Sơ đồ phân lập M4 từ phân đoạn A2 .............................................................. 30
Hình 4.9 SKLM của M4 ............................................................................................... 31
Hình 4.10 SKLM của M3 trên 3 hệ dung môi khác nhau .............................................. 31
Hình 4.11 Cấu trúc của taxuspine F .............................................................................. 32
Hình 4.12 Cấu trúc của β-sitosterol ............................................................................... 33
Hình 4.13 Tương quan HMBC và COSY của M2 ......................................................... 38
Hình 4.14: Cấu trúc của taxchin A ................................................................................ 40

ix


Chương 1 MỞ ĐẦU
1.1.

Đặt vấn đề
Thế giới với sự tiến bộ không ngừng của khoa học kĩ thuật, đời sống con người

ngày càng cao kéo theo đó là chất lượng cuộc sống tăng, nhu cầu khám và chữa bệnh
ngày một tăng. Tuy nhiên, chất lượng cuộc sống tăng, khoa học tiến bộ không đồng nghĩa
với việc mọi căn bệnh đều có thể chữa trị. Một trong số những căn bệnh đó là ung thư,
vấn đề mà giới khoa học không ngừng tìm kiếm ra thuốc để để chữa trị. Với nỗ lực đó,
vào năm 1971 Wani và cộng sự đã tìm ra một hợp chất bắt nguồn từ thiên nhiên là
paclitaxel (có tên thương mại là taxol được đăng kí bởi tập đoàn Bristol Myers SquibbMỹ), một diterpenoid được phân lập lần đầu tiên từ cây thông đỏ Thái Bình Dương
(Taxus brevifolia Nutt) (Erik, 1997). Theo ghi nhận của Qing-Wen Shi (2005) hợp chất
này có tiềm năng lớn, được sử dụng trong điều trị: ung thư vú, ung thư buồng trứng, ung
thư phổi, ung thư tuyến tiền liệt. Từ khi phát hiện ra taxol một cuộc chạy đua trong việc

khai thác không ngừng vỏ của các loài Taxus, nhưng vẫn không đáp ứng được nhu cầu sử
dụng mà còn gây nguy cơ tuyệt chủng của quần thể Taxus. Từ đó làm huỷ hoại nguồn gen
thiên nhiên và môi trường sinh thái (Seiki và Furusaki, trích dẫn bởi Bùi Trang Việt,
2006). Bởi vì hàm lượng taxol của các loài taxus từ các vị trí khác nhau chỉ dao động
trong khoảng thấp hơn 0,069% theo Castor và Theodore (1993), Guy và cộng sự (2002)
(trích dẫn bởi Guo1, 2006), để phân lập được 1 kg taxol người ta phải có 10000 kg vỏ khô
từ 3000 cây thông đỏ Taxus brevifolia hiệu suất chỉ đạt 0,01%, trong khi đó phải cần 2 g
để điều trị cho một bệnh nhân (Oliver And Quax, 2007), điều này bắt buộc con người phải
tìm ra những phương pháp khác để thu nhận taxol nhằm cung cấp đủ nhu cầu trị bệnh cho
con người. Những phương pháp tổng hợp hoá học taxol cũng đã được sử dụng nhưng rất
phức tạp, cực kì tốn kém do cấu trúc taxol phức tạp phải trải qua hơn 20 bước và không
đạt được hiệu suất cao chỉ đạt khoảng 0,07% và 2,7%. Theo Hezari và Croteau (1997),
con đường tổng hợp sinh học cũng đã được quan tâm nhiều nhưng cho đến nay các giai
đoạn tổng hợp đó con người vẫn chưa tìm ra hết và được dự đoán có liên quan tới hàng
1


loạt phản ứng với sự tham gia của 19 bước enzym hoá, 8 phản ứng oxy hoá phụ thuộc
chuỗi cytochrome P450, 3 phản ứng acyl hoá từ tiền chất là geranylgeranyl diphosphat
cũng rất phức tạp (trích dẫn bởi Guo1, 2006). Tuy nhiên, trong quá trình phân lập taxol
con người đã tìm ra một số hợp chất có hàm lượng cao được tích luỹ trong lá có khả năng
sử dụng trong bán tổng hợp ra taxol là: 10-deacetylbaccatin III (10-DAB III), 10deacetyltaxol (10-DAC), xylosyl-10-deacetyltaxol (Tomasz Mroczek, 2001). Với nỗ lực
không ngừng tìm ra hợp chất có cấu trúc mới có hoạt tính tương tự taxol hay các hợp chất
có khả năng bán tổng hợp ra taxol mà đề tài “Phân lập taxoid từ lá cây thông đỏ Taxus
wallichiana Zucc ở Lâm Đồng” được thực hiện.
1.2. Yêu cầu của đề tài
Phân lập và xác định được cấu trúc của taxoid, hợp chất thu được bằng phương
pháp phổ hiện đại NMR.
1.3. Nội dung thực hiện
-


Chiết được cao MeOH thô từ lá thông đỏ Taxus wallichiana Zucc .

-

Lắc phân đoạn cao CH2Cl2 từ cao MeOH thô.

-

Phân đoạn cao CH2Cl2 thành những phân đoạn nhỏ thông qua sắc ký cột pha thuận
sử dụng silica gel.

-

Phân lập được hợp chất tinh khiết từ một phân đoạn nhỏ thu được.

-

Xác định hợp chất thu được bằng việc so sánh với chuẩn thông qua SKLM.

-

Xác định cấu trúc hợp chất bằng phương pháp phổ hiện đại NMR và so sánh với tài
liệu tham khảo.

2


Chương 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU


2.1. Giới thiệu về cây thông đỏ
2.1.1. Phân loại
Tên khoa học: Taxus wallichiana Zucc.
Thông đỏ lá dài (Taxus wallichiana Zucc), họ Thanh Tùng (Taxaceae).
Vị trí cây Thông đỏ trong hệ thống phân loại thực vật
Giới (kingdom): Plantae.
Ngành (division): Pinophyta.
Lớp (class): Pinopsida.
Bộ (order): Pinales.
Họ (family): Taxaceae (Võ Văn Chi; Trần Hợp, 1999)
Loài (species): Taxus baccata L. (Thông đỏ châu Âu), Taxus brevifolia Nutt.
(Thông đỏ Thái Bình Dương), Taxus canadensis (Thông đỏ Canada), Taxus celebrica,
Taxus chinensis (Thông đỏ Trung Quốc), Taxus cuspidata Zucc. (Thông đỏ Nhật), Taxus
floridana (Thông đỏ Florida), Taxus globosa (Thông đỏ Mexico), Taxus hunnewelli,
Taxus jortunei, Taxus sumatrana (Thông đỏ Sumatra), Taxus wallichiana Zucc (Thông đỏ
Himalaya), (Anderson, 2003; Chase, 1998; Farjon, 1993).
2.1.2. Đặc điểm sinh học
Thông đỏ lá dài là một loại cây thân gỗ, thường xanh, kích thước trung bình hoặc nhỏ,
chậm lớn (cây sinh trưởng cả trăm năm chỉ có đường kính không quá
35 cm). Cây có chiều cao khoảng 20-30 m, đường kính ngang ngực khoảng 1-1,5 m. Cây
mọc đứng có cành xòe rộng ra 2 bên, cành non màu lục, chuyển sang nâu sau 3 hoặc 4
năm, mọc phân tán tùy theo điều kiện môi trường. Vỏ cây ở phía ngoài có màu nâu đỏ
nhạt, hơi dày, bóc tách thành từng mảng hay từng tấm nhỏ, thịt màu nâu đỏ. Lá cây mềm,
xếp hình xoắn ốc thành 2 dãy, mọc cách, thuôn thành đỉnh nhọn, gốc lá mọc xuống, mép
lá phẳng, mặt trên xanh vàng, mặt dưới xanh nhạt với các dải lỗ khí xanh nhạt hơn ở hai
bên gân giữa. Lá của các chồi chính có thể mọc dựng lên hơn là xếp dãy. Cây có nón phân
3


tính khác gốc. Nón cái đơn độc, có một hạt và được bao quanh nhưng không bao kín bằng

lớp áo hạt màu đỏ, chín trong 1 năm. Nón đực tạo thành hàng ở nách lá, nhỏ, hình trứng,
dài 6 mm và rộng 3 mm, nhưng không có cuống hoặc cuống rất nhỏ (Võ Văn Chi, 1999;
Hội đồng Dược điển, 2002). Sự hình thành hạt với đặc điểm hình trứng, dài 7 mm và rộng
5 mm, màu đen khi chín.

Hình 2.1 Lá và quả Thông đỏ
2.1.3. Phân bố
Tháng 7/2006, tổ chức IUCN đã tìm thấy loài Thông đỏ lá dài tại Afghanistan,
Bhutan, Tây Nam Trung Quốc (Sichuan, Xizang, Yunnan), Ấn Độ (Arunachal Pradesh,
Assam, Himachal Pradesh, Jammu-Kashmir, Manipur, Sikkim, Uttar Pradesh), phía bắc
Myanmar, Nepal (vùng núi Hymalaya), Pakistan, Indonesia, Philippin, Việt Nam
(Rushforth, 1987). Ở Việt Nam, loài này được tìm thấy ở một số vùng núi cao thuộc các
tỉnh Lào Cai (Hoàng Liên Sơn), Khánh Hòa, Lâm Đồng (Đà Lạt, Đơn Dương, Đức Trọng,
Lạc Dương), Hà Giang (Thái An-Quản Ba), độ cao phân bố 1400-1600 m hoặc hơn (Lê
Xuân Tùng, 1999).
Sự phân bố của Thông đỏ khá đa dạng trong khu vực Lâm Đồng, nhưng số lượng cá
thể ở mỗi nơi lại ít. Số lượng cá thể nhiều nhất tại khu vực Núi Voi (100 cây), tại đây cây
không bị che phủ và phát triển tương đối tốt. Ở những nơi bị che phủ như Lán Tranh thì
số lượng cá thể ít (1 cây). Có nơi cây lại già cỗi, chẳng hạn như khu vực Cổng Trời số
lượng cá thể là 20 cây nhưng lại già cỗi, gần như không phát triển nữa.

4


2.1.4. Sinh thái
Cây Thông đỏ thuộc loài Taxus wallichiana Zucc thường phân bố ở phạm vi độ cao
khoảng 2000-3500 m so với mặt biển. Thường tập trung theo dạng rừng từ đó hình thành
rừng nhiệt đới thường xanh.
Cây càng lớn đòi hỏi ánh sáng càng cao. Trong tầng ưu thế sinh thái, nơi nào có
khoảng trống, lượng ánh sáng nhiều thì cây phát triển mạnh và ngược lại.

Cây thường tập trung tại vùng khí hậu nhiệt đới gió mùa, nhiệt độ trung bình năm
20-25oC, độ ẩm đất 30-40%, độ ẩm không khí 85-90%. Thông đỏ phân bố ở vùng khí hậu
nhiệt đới núi thấp và trung bình có 2 mùa rõ rệt trong năm, mùa mưa kéo dài từ tháng 4
đến tháng 10, lượng mưa trung bình 1600-1800 mm (Tài liệu của Đài khí tượng - thủy
văn Lâm Đồng, 1980).
Thổ nhưỡng của cây thích hợp với đất có thành phần cơ giới nhẹ, thoát nước, phát
triển trên đất nâu vàng phiến thạch hay đất nâu đỏ trên đất bazan, độ pH đất dao động
trong khoảng từ 5,1 - 5,6.
Sự tập trung của loài thực vật này hình thành thảm thực vật ở Lâm Đồng, Thông đỏ
thường phân bố rải rác hỗn giao với các loài cây lá rộng thường xanh và cây lá kim với
kiểu rừng chính là hỗn giao cây lá rộng-cây lá kim. Trong kiểu thảm này chúng phân bố ở
tầng ưu thế sinh thái hợp với các loài Đỉnh tùng (Cephalotaxus mannii), Kim giao nam
(Nageia wallichiana), Thông tre lá dài (Podocarpus neriifolius), Thông nàng
(Dacrycarpus imbricatus), Du sam (Keteleeria evelyniana) và một số loài thuộc
Fagaceae, Ericaceae, Euphorbiaceae.
Hạt phát tán không xa (với bán kính 6-8 m so với từ tâm cây), nảy mầm và phát triển
nơi có độ ẩm cao, cường độ ánh sáng trung bình. Tỷ lệ nảy mầm trong tự nhiên rất thấp so
với số lượng hạt cây mang hàng năm (Nguyễn Đức Tố Lưu, 2004). Do đó, trong tự nhiên
thường ít gặp dạng tái sinh tự nhiên, cây mầm và cây non chịu bóng tốt.
2.2.
2.2.1.

Đặc tính và phân loại taxoid
Đặc tính của taxoid
Sau khi phát hiện ra taxol, một loại thuốc có khả năng điều trị ung thư do wani và cộng
sự 1976, một cuộc cách mạng trong nghiên cứu và phân lập các thành phần hoá học có

5



nguồn gốc tự nhiên và có hoạt tính sinh học trong điều trị bệnh bắt đầu bùng nổ. Tính cho
tới thời điểm năm 2003, trên thế giới đã có hơn 900 tạp chí, sách, bài báo nghiên cứu và
tổng hợp về loài Taxus. Điều đó cho thấy, công tác nghiên cứu trên loài này là vấn đề
được cả thế giới quan tâm nhờ tính chất ngừa ung thư đặc biệt của taxol. Cho tới nay các
nhà khoa học trên khắp thế giới vẫn tiếp tục nghiên cứu trên các loại taxoid khác nhau để
tìm kiếm thành phần mới có khả năng điều trị ung thư giống taxol nhưng có hoạt tính
dược lý khác nhau trên tế bào ung thư và các tác dụng y học khác. Theo Pezzuto (1996)
cephalomannine được sử dụng để điều trị bệnh leukemia được phân lập từ loài Taxus
wallichiana Zucc, theo Ojima và cộng sự (1997) thì docetaxel (tên thương mại là
taxotere) một thành phần bán tổng hợp tương tự taxol cũng được sử dụng trong điều trị
ung thư vú và ung thư buồng trứng. Ngoài ra, taxoid còn có một số điểm đặc biệt như
chúng chỉ xuất hiện trong loài Taxus, hầu hết những loại taxoid khó được tiến hành tổng
hợp trên qui mô công nghiệp do cấu trúc phức tạp, giá thành cao, hiệu suất thấp và chỉ có
thể thu được từ việc bán tổng hợp hoặc phân lập từ nguồn nguyên liệu sẵn có (Hideji
Itokawa, 2003). Chẳng hạn như 10-DAB có tỉ lệ lớn trong lá ở một số loài Taxus như là:
Taxus wallichiana Zucc (1092 µg/g), Taxus globosa (1395 µg/g), Taxus floridana (1689
µg/g), Taxus canadensis (2665 µg/g). Đó là một trong những tiền chất quan trọng trong
tổng hợp taxol (Erik, 2000).
2.2.2. Phân loại cấu trúc taxoid
Cho tới nay, hơn 360 loại taxoid khác nhau đã được phân lập từ thực vật. Theo Rao
(1995) chia taxoid vào 3 nhóm khác nhau đặc trưng của mỗi nhóm thì có cấu trúc 3 vòng
khác

nhau

là:

nhóm

taxoid


novel

(có

cấu

trúc

khung

cacbon

3

vòng

là 6/8/6) nhóm này chiếm đa số trong các loại cấu trúc taxoid, nhóm
11(15->1)-abeotaxoid (nhóm này có bộ khung cacbon là 5/7/6), nhóm 2(3->20)abeotaxoid (nhóm này có bộ khung cacbon là 6/10/6) (Hideji Itokawa, 2003).

6


Hình 2.2 Cấu trúc khung của 3 nhóm taxoid
2.3. Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ
Sắc ký là một phương pháp vật lý để tách một hỗn hợp gồm nhiều chất thành
những chất riêng lẻ dựa vào sự phân bố khác nhau của mỗi chất vào hai pha của hệ sắc
ký. Một hệ sắc ký luôn gồm hai pha là pha tĩnh và pha động. Có rất nhiều loại hệ sắc ký
khác nhau và người ta có thể phân chia chúng dựa vào bản chất pha, cơ chế tách hay cấu
hình của hệ sắc ký.

2.3.1. Sắc ký hấp phụ
2.3.1.1. Sắc ký cột cổ điển
Sắc ký cột cổ điển là tên gọi để chỉ loại sắc ký sử dụng một ống hình trụ, được đặt
dựng đứng với đầu trên có thể hở hoặc kín, đầu dưới có gắn một khóa. Pha tĩnh là những
hạt có kích thước khác nhau sẽ được nhồi vào ống hình trụ. Mẫu cần tách được đưa vào
lên trên bề mặt của pha tĩnh. Pha động là dung môi sẽ được rót liên tục vào đầu cột. Nhờ
trọng lực, dung môi chảy từ trên xuống sẽ kéo theo những phân tử thích hợp làm chúng
tách ra khỏi hỗn hợp. Như vậy, yếu tố quyết định đến hiệu quả của sắc ký cột phụ thuộc
vào việc lựa chọn pha động, độ đặc khít của cột, dung môi sử dụng, tốc độ giải li, nên cần
phải lưu ý chúng. Ưu điểm của phương pháp là pha tĩnh và dụng cụ thí nghiệm tương đối
rẻ, dễ kiếm, có thể triển khai với một lượng lớn mẫu chất. Đây là phương pháp thường
được sử dụng để phân tách các chất ra khỏi hỗn hợp (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007).
2.3.1.2. Sắc ký lớp mỏng
Trong sắc ký lớp mỏng, pha tĩnh rắn sẽ được tráng thành một lớp mỏng, đều lên
một tấm kính, nhôm hay plastic. Để đưa mẫu lên những lớp mỏng đã được tráng này,
người ta dùng vi quản. Vi quản là một ống thủy tinh có đường kính trong rất nhỏ, một đầu
7


được vút nhọn. Sau khi mẫu đã được chấm lên bản, người ta sẽ cho bản vào một cái cốc
chứa sẵn dung môi với lượng thích hợp để giải li.
Để quá trình sắc ký lớp mỏng đạt kết quả tốt, ta cần phải lưu ý một số điểm như
khi chấm mẫu không được để vết chấm loang quá rộng, bình (cốc) giải li phải bão hòa
dung môi. Người ta sử dụng sắc ký lớp mỏng để lựa chọn dung môi phù hợp cho việc giải
li,

xác

định


một

cách

tương

đối

độ

tinh

khiết

của

chất

thu

được,

biết được số các hợp chất trong mẫu ban đầu hay để theo dõi quá trình sắc ký cột.
Đây là một kĩ thuật ít tốn chất hấp phụ, đòi hỏi ít mẫu chất nghiên cứu, diễn ra nhanh.
Do đó, đây là phương pháp cũng được nhiều nhà nghiên cứu hóa học các hợp chất thiên
nhiên sử dụng nhiều trong phòng thí nghiệm (Phương pháp nghiên cứu dược liệu, 2010).
2.3.1.3. Sắc ký nhanh- cột khô
Sắc ký nhanh cột khô có là hình thức sắc ký sử dụng hệ thống hút phía dưới giúp
dòng chảy của dung môi qua cột nhanh hơn và có một số đặc điểm sau:
Để gia tăng vận tốc giải ly của pha động do một lực hút tạo chân không ở đầu ra

của cột nhờ một máy bơm hút loại nhẹ.
Sắc ký chớp nhoáng sử dụng pha tĩnh có thể là silica gel loại dùng cho sắc ký cột,
nghĩa là dạng hạt có kích thước 40-63 µm, còn sắc ký nhanh cột khô sử dụng silica gel
loại dùng cho sắc ký lớp mỏng (cỡ hạt 15-40 µm) hoặc alumina loại dùng cho sắc ký lớp
mỏng (10 µm, diện tích bề mặt riêng lớn: 500 m2.g-1)
Trong quá trình giải ly, cột sắc ký có thể được rút khô sau mỗi phân đoạn thu được
(Nguyễn Kim Phi Phụng, 2010).
2.3.2. Phương pháp phổ nghiên cứu cấu trúc của hợp chất hữu cơ
Trong quá trình trích li cô lập các hợp chất mới từ cây cỏ, các nhà hóa học cần xác
định cấu trúc của các hợp chất này. Việc xác định cấu trúc của một hợp chất như thế được
dựa vào các phương pháp hóa lý như điểm chảy, năng lực triền quang, MS, IR, NMR,
UV.
Phổ MS cung cấp các thông tin về kích thước, công thức nguyên của phân tử. Phổ IR
cung cấp thông tin về các nhóm định chức. Phổ NMR giúp thấy rõ hơn về khung sườn
carbon-hydrogen của hợp chất cần khảo sát. Phổ UV-Vis chỉ được sử dụng khi phân tử

8


chứa một hệ nhiều nối đôi liên hợp và được ứng dụng rộng rãi để phân tích định lượng.
Mẫu phải đạt được từ 95% trở lên về độ tinh khiết thì mới đủ tiêu chuẩn đo phổ (Nguyễn
Kim Phi Phụng, 2005).
2.4. Các công trình nghiên cứu trên thế giới và trong nước về loài Taxus wallichiana Zucc

2.4.1. Các công trình nghiên cứu trên thế giới về loài Taxus wallichiana Zucc
2.4.1.1. Nghiên cứu từ giai đoạn 1970- 1999
Cho tới thời điểm này thì trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu về phân
lập các hợp chất từ cây thông đỏ Taxus wallichiana Zucc, ngoài taxoid ra còn có một số
hợp chất khác đã được phân lập được tóm tắt từ năm 1970- 1999 (Virinder, 1999) và được
liệt kê trong bảng 2.1.

Bảng 2.1 Các hợp chất phân lập được từ Taxus wallichiana Zucc trên thế giới từ năm
1979-1999
Hợp chất
(1)

Tên hợp chất

Tài liệu tham khảo

(2)

(3)
Taxoid

1

Taxusin

Chattopadhyay và ctv (1996a, 1997)

2

2-Deacetyl-5-decinnamoyltaxinine J

Zhang và ctv (1995c)

3

2-Deacetoxydecinnamoyltaxinine J


Chattopadhyay Sharma (1995)
Chattopadhyay và Sharma (1995),

4

Zhang và ctv (1995c) và

2α-Deacetoxytaxinine J

Chattopadhyay, Saha, Kulshrestha,
Sharma, Kumar (1996b)

5

1-Hydroxy-2-deacetyltaxinine J

Zhang và ctv (1995c)

6

2’-Desacetoxyaustrospicatin

Barboni và ctv (1994a)

7

7,2’-Didesacetoxyaustrospicatin

8


Barboni và ctv (1994a) và Zhang,
Fang, Liang, và He (1994)
Chattopadhyay và ctv (1996a,

Taxadiene

1997)

9


Bảng 2.1 (tt) Các hợp chất phân lập được từ Taxus wallichiana Zucc trên thế giới
từ năm 1979-1999
(1)
9

(2)
2-Deacetoxytaxinine B

(3)
Shrestha, Chetri B, anskota, Manandhar, và
Taylor (1997)

10

19-Debenzoyl-19-

Barboni và ctv (1995b)z

acetyltaxinine M

11

1β-Hydroxybaccatin I

Miller, Powell, Smith (Jr), Arnold, và Clardy
(1981) và Chattopadhyay và ctv (1996b)

12

Taxuspine V

Barboni và ctv (1997)

13

Baccatin III

Wang (1997)

14

19-Hydroxybaccatin III

McLaughhlin, Miller, Powell, và Smith (Jr)
(1981)

15

10-Deacetylbaccatin III


Vander Velde và ctv (1994), Zhang và ctv
(1995) Singh và ctv (1997) và Wang (1997)

16

10-Deacetyltaxol

McLaughlin và ctv (1981) và Wang (1997)

17

Paclitaxel (Taxol)

Miller và ctv (1981), Vander Velde và ctv
(1994), Zhang và ctv (1995c), Singh và ctv
(1997)

18

10-Deacetyltaxol-7-xyloside

19

7-Xylosyltaxol

20

7-Xylosyl-10-deacetyltaxol C

Zhang và ctv (1995c)

Zhang và ctv (1995c)
Zhang và ctv (1995c) và Chattopadhyay và
ctv (1996a, 1997)
Vander Velde và ctv(1994), Zhang và ctv

21

Cephalomannine

(1995c), Rao và ctv (1996), Singh và ctv (1997) và
Wang (1997)

22

10-Deacetylcephalomannine

McLaughlin và ctv (1981)

10


Bảng 2.1 (tt) Các hợp chất phân lập được từ Taxus wallichiana Zucc trên thế giới
từ năm 1979-1999
(1)
23

24
25

(2)


(3)
Appendino và ctv (1992a), Bombardelli

14β-Hydroxy-10-deacetylbaccatin III

và Gabetta (1998)

2-Debenzoyl-14-β-benzoyloxy-10-

Appendino và ctv (1993e)

deacetylbaccatin III
Baccatin IV

Chattopadhyay và ctv (1996b)

11(15→1)abeotaxane
26

Brevifoliol

Vander Velde và ctv (1994)

27

13-Acetylbrevifoliol

Chattopadhyay và ctv (1996b)


28
29

30

10-Debenzoyl-2-α-acetoxybrevifoliol

Barboni và ctv (1995b)

7-Deacetoxy-10-debenzoylbrevifoliol

Appendino và ctv (1993a),
Barboni và ctv (1993)
Appendino và ctv (1993a),

10-Debenzoylbrevifoliol

Barboni và ctv (1993)
Vander Velde và ctv (1994),

31

Taxchinin A

32

Taxchinin H

Barboni và ctv (1995b)


33

Taxacustin

Zhang và ctv (1995c)

34

Taxayuntin

Zhang và ctv (1995c)

35

10-Debenzoyltaxchinin C

Chattopadhyay và ctv (1996a, 1997)

36

10,13-deacetyl abeobaccatin IV

37

7,9,13-Deacetyl abeobaccatin IV

38

10,15-Epoxy-11(15→1)abeo-10-


Chattopadhyay và ctv (1996b)

Chattopadhyay, Sharma, Appendino, và
Gariboldi (1995)
Chattopadhyay, Saha, Kulshrestha,
Sharma, và Roy (1997)
Appendino và ctv (1993e)

deacetylbaccatin III

11


Bảng 2.1 (tt) Các hợp chất phân lập được từ Taxus wallichiana Zucc trên thế giới
từ năm 1979-1999
(1)

(2)

(3)

Non-taxoid isoprenoid
44

Isolariciresinol

Chattopadhyay và ctv (1997)

45


α-Conidendrin

Miller và ctv (1982)

46

β-Conidendrin

Miller và ctv (1982)

47

Taxiresinol

Chattopadhyay và ctv (1997)

Flavonoid
Parveen, Taufeeq, Khan (1985) và

48

Ginkgetin

49

Sciadopitysin

50

Sequoiaflavone


51

Kayaflavone

Singh và ctv (1997)

52

Amentoflavone

Qiu và ctv (1989), Das ctv (1994a)

Qiu, Lian, Ma, He (1989)
Khan và ctv (1976) và Aljancic,
Popovic, & Stefanovic (1995)
Parveen và ctv (1985), Qiu và
ctv (1989)

Hợp chất khác
4-(4’-Hydroxyphenyl)-2R53

butanol[(-)-

Singh và ctv (1997)

rhododendrol/betuligenol
54

Deglycosylicariside B4


Appendino và ctv (1993b)

55

Dehydrovomifoliol

Appendino và ctv (1993b)

56

Vomifoliol

Appendino và ctv (1993b)

57

β-Orcinolcarboxylate

Shrestha và ctv (1997)

Cấu trúc tương ứng của các hợp chất trong bảng 2.1.

12


Hình 2.3 Cấu trúc của taxoid (1-7)

13



Hình 2.4 Cấu trúc của taxoid (8-12)

14