BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
************

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN
BẮP CHUYỂN GEN BẰNG KỸ THUẬT
MULTIPLEX PCR

Ngành học

: CÔNG NGHỆ SINH HỌC

Sinh viên thực hiện

: NGUYỄN NGỌC NGÂN

Niên khóa

: 2008 – 2012

Tháng 07/2012


BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƢỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC
************

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
XÂY DỰNG QUY TRÌNH PHÁT HIỆN
BẮP CHUYỂN GEN BẰNG KỸ THUẬT
MULTIPLEX PCR

Hƣớng dẫn khoa học

Sinh viên thực hiện

TS. HUỲNH VĂN BIẾT

NGUYỄN NGỌC NGÂN

KS. NGUYỄN PHAN THÀNH

Tháng 07/2012


LỜI CẢM ƠN
Xin gửi những lời cảm ơn chân thành đến:
TS. Huỳnh Văn Biết, ngƣời đã hƣớng dẫn tôi rất nhiều về các kiến thức lý
thuyết.
KS. Nguyễn Phan Thành vì đã giúp đỡ tôi hoàn thiện các kỹ thuật thực
nghiệm để tôi hoàn thành tốt đề tài tốt nghiệp.
Viện Công nghệ Sinh học và Môi trƣờng đã tạo điều kiện thuận lợi về trang
thiết bị và hóa chất cho tôi trong quá trình làm thí nghiệm.
Bạn Nguyễn Hữu Nghĩa, Phạm Văn Lâm và những bạn cùng làm thí nghiệm
ở Viện Công nghệ Sinh học và Môi trƣờng đã giúp đỡ và ủng hộ tôi vƣợt qua những
giai đoạn khó khăn trong lúc thực hiện đề tài tốt nghiệp.
ThS. Tôn Bảo Linh vì đã giảng dạy cho tôi những kiến thức cơ bản về sinh

học phân tử, giúp tôi có nền tảng vững chắc khi thực hiện đề tài.
Bố, Mẹ đã động viên và ủng hộ con trong 6 tháng thực hiện đề tài.
Em Nguyễn Hoài Tiến, ngƣời luôn nỗ lực hết mình để tạo điều kiện tốt nhất
để tôi chuyên tâm thực hiện đề tài.
Ngƣời thực hiện
Nguyễn Ngọc Ngân

i


TÓM TẮT
Trong những năm gần đây, GMO đã trở thành vấn đề gây tranh cãi đối với
các nhà khoa học trên thế giới do những lợi ích to lớn mà nó đem lại cùng những
rủi ro chƣa đƣợc xác định rõ. Do đó, cần có quy chế về việc kiểm soát thực trạng
GMO tại Việt Nam bao gồm vận chuyển, sản xuất và dán nhãn GMO.
Mục đích của nghiên cứu này là xây dựng đƣợc quy trình phát hiện bắp
chuyển gen bằng kỹ thuật Multiplex PCR với cặp mồi 35S và Invertase vì bắp là
cây lƣơng thực phổ biến trên thế giới và ở Việt Nam.
Quy trình Multiplex PCR thích hợp nhất đƣợc đề xuất sau khi tối ƣu hóa
bằng cách thay đổi nồng độ mồi, Mg2+ và chu trình nhiệt. Quy trình gồm có Mg2+
với nồng độ 2 mM, nồng độ mồi IVR – F; IVR – R; 35S – F; 35S – R lần lƣợt là
0,13; 0,13; 0,33; 0,33 µM. Chu trình nhiệt của phản ứng nhƣ sau: tiền biến tính ở
95oC trong 5 phút; biến tính ở 95oC trong 30 giây; bắt cặp ở 54oC trong 30 giây; kéo
dài ở 72oC trong 20 giây. Giai đoạn kéo dài cuối cùng ở 72oC trong 5 phút.
Quy trình Multiplex PCR tối ƣu hóa đã đƣợc áp dụng thử trên một số mẫu
thực phẩm. Kết quả cho thấy phƣơng pháp Multiplex PCR có thể dùng cho việc
phát hiện gene Invertase và 35S trong mẫu thực phẩm có chứa thành phần từ bắp.

ii



SUMMARY
Recently, GMO is a controversial problem in the world because of its
advantages for human and potential risks which cannot be determined. So, Vietnam
needs a legal basis for importation, processing and labeling instructions for GMO in
the near future.
The purpose of this study is to design a protocol for detection of genetically
modified maize by Multiple PCR method using primer pairs which were specific to
Invertase gene and 35S gene because maize is the major cereal in all over the world
and Vietnam.
The suitable multiplex PCR protocol was established after optimizing by
changing concentration of primer, Mg2+ and cycling conditions. This protocol was
Mg2+ 2 mM, concentration of primer IVR – F; IVR – R; 35S – F; 35S – R were
0.13; 0.13; 0.33; 0.33 µM. The conditions of Multiplex PCR protocol were initial
denaturation at 95˚C for 5 min, followed by 35 cycles of amplification at 95˚C for
30 seconds, 54˚C for 30 seconds, 72˚C for 20 seconds and the final extension at
72˚C for 5 min.
Moreover, this protocol was applied to some of food samples. As the result,
the Multiplex PCR detected the Invertase gene and 35S gene from food samples
containing maize.
Keyword: GM maize, Invertase, 35S, PCR, food

iii


MỤC LỤC
Trang
Lời cảm ơn ......................................................................................................................i
Tóm tắt.......................................................................................................................... ii
Summary...................................................................................................................... iii

Danh mục chữ viết tắt ..................................................................................................vi
Danh mục bảng ......................................................................................................... viii
Danh mục hình ............................................................................................................ix
Chƣơng 1 MỞ ĐẦU ...................................................................................................... 1
1.1. Đặt vấn đề ................................................................................................................ 1
1.2. Yêu cầu .................................................................................................................... 2
1.3. Nội dung thực hiện .................................................................................................. 2
Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU............................................................................. 3
2.1. Tổng quan về sinh vật chuyển gen (GMO) ............................................................. 3
2.1.1. Định nghĩa GMO .................................................................................................. 3
2.1.2. Quá trình tạo GMO ............................................................................................... 3
2.1.3. Promoter CaMV 35S ............................................................................................ 4
2.1.4. Các hƣớng chính trong tạo giống cây trồng chuyển gen ...................................... 5
2.1.4.1. Chuyển gen kháng sâu ....................................................................................... 5
2.1.4.2. Chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ ....................................................................... 5
2.1.4.3. Chuyển gen tạo cây kháng virus gây bệnh ........................................................ 6
2.1.4.4. Chuyển gen tạo cây sản xuất protein động vật .................................................. 6
2.1.4.5. Chuyển gen thay đổi hàm lƣợng, chất lƣợng các chất dinh dƣỡng của cây ...... 7
2.1.5. Lợi ích từ cây trồng chuyển gen ........................................................................... 7
2.1.6. Những nguy cơ tiềm ẩn của cây chuyển gen ........................................................ 8
iv


2.2. Sơ lƣợc về cây bắp................................................................................................... 8
2.3. Tình hình sản xuất bắp chuyển gen trong và ngoài nƣớc ....................................... 9
2. 3. Phƣơng pháp PCR phát hiện bắp chuyển gen ...................................................... 10
2.3.1. Giới thiệu chung ................................................................................................. 10
2.3.2. Nguyên tắc của phản ứng PCR ........................................................................... 10
2.3.3. Các thành phần của phản ứng PCR .................................................................... 11
2.3.4. Ứng dụng phƣơng pháp PCR để phát hiện bắp chuyển gen............................... 13

2.4. Tình hình nghiên cứu quy trình chẩn đoán bắp chuyển gen trong và ngoài nƣớc 14
2.3.1. Tình hình nghiên cứu quy trình chẩn đoán bắp chuyển gen ở ngoài nƣớc ........ 14
2.3.2. Tình hình nghiên cứu quy trình chẩn đoán bắp chuyển gen trong nƣớc ............ 15
Chƣơng 3 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP .............................................................. 16
3.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ......................................................................... 16
3.2. Vật liệu .................................................................................................................. 16
3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu ....................................................................................... 18
3.3.1. Phƣơng pháp ly trích DNA ................................................................................. 18
3.3.2. Phƣơng pháp kiểm tra sự hiện diện của trình tự 35S, Invertase trong mẫu ....... 19
3.3.2.1. Thí nghiệm 1 Khảo sát khả năng hoạt động của mồi ...................................... 19
3.3.2.2. Thí nghiệm 2 Khảo sát nồng độ mồi Invertase ............................................... 20
3.3.2.3. Thí nghiệm 3 Khảo sát nồng độ Mg2+ ............................................................. 21
3.3.2.4. Thí nghiệm 4 Khảo sát nhiệt độ bắt cặp tối ƣu ............................................... 21
3.3.2.5. Thí nghiệm 5 Khảo sát số chu kỳ cho phản ứng PCR ..................................... 22
3.3.2.6. Thí nghiệm 6 Khảo sát độ đặc hiệu của mồi ................................................... 22
3.3.2.7. Thí nghiệm 7 Áp dụng thử quy trình PCR trên mẫu thực phẩm ..................... 22
Chƣơng 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................. 23
4.1. Kết quả ly trích DNA ............................................................................................ 23
4.2. Kết quả thí nghiệm 1 Khảo sát khả năng hoạt động của mồi ................................ 24
v


4.3. Kết quả thí nghiệm 2 Khảo sát nồng độ mồi Invertase ......................................... 25
4.4. Kết quả thí nghiệm 3 Khảo sát nồng độ Mg2+ ....................................................... 26
4.5. Kết quả thí nghiệm 4 Khảo sát nhiệt độ bắt cặp tối ƣu ......................................... 27
4.6. Kết quả thí nghiệm 5 Khảo sát số chu kỳ cho phản ứng PCR .............................. 28
4.7. Kết quả thí nghiệm 6 Khảo sát độ đặc hiệu của mồi ............................................. 29
4.7. Kết quả thí nghiệm 7 Áp dụng thử quy trình PCR trên mẫu thực phẩm ............... 30
Chƣơng 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ....................................................................... 32
5.1 Kết luận................................................................................................................... 32

5.2. Đề nghị .................................................................................................................. 32
TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................... 33

vi


DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
35S

Promoter 35S

AMV

Alfa mosaic virus

Bp

Base pair

BSA

Bovine Serum Albumin

Bt

Bacillus thuringiensis

CaMV

Cauliflower mosaic virus


CMV

Cucumber mosaic virus

CTAB

Cetyl-trimetyl-ammonium-bromide

CTV

Citrus tristeze virus

DEPC

Diethyl pyrocarbonate

DNA

Deoxyribonucleic acid

dNTP

Deoxy nucleoside triphosphate

EDTA

Ethylene diamine tetra acetic acid

EU


European Union

F

Forward

FAO

Food and Agriculture Organization

GMO

Genetically modified organism

PCR

Polymerase Chain Reaction

PLRV

Potato leafroll virus

PRSV

Papaya ringspot virus

R

Reverse


RNA

Ribonucleic acid

TBE

Tris, Borate, EDTA

U

Unit

UV

Ultra violet

V

Volume

vii


DANH MỤC BẢNG
Trang
Bảng 3.1 Các mẫu sử dụng trong nghiên cứu ............................................................... 16
Bảng 3.2 Các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu .......................................................... 17
Bảng 3.3 Các hóa chất sử dụng trong ly trích............................................................... 17
Bảng 3.4 Các mồi sử dụng trong phản ứng Multiplex PCR ......................................... 18

Bảng 3.5 Các hóa chất sử dụng trong phản ứng PCR .................................................. 18
Bảng 3.6 Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR trong thí nghiệm 1................................. 19
Bảng 3.7 Thành phần phản ứng PCR trong thí nghiệm 1............................................. 20
Bảng 3.8 Thành phần phản ứng PCR trong thí nghiệm 2............................................. 20
Bảng 3.9 Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR trong thí nghiệm 2................................. 21
Bảng 3.10 Thành phần phản ứng PCR trong thí nghiệm 3........................................... 21
Bảng 3.11 Thành phần phản ứng PCR trong thí nghiệm 4........................................... 22
Bảng 3.12 Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR ở thí nghiệm 4 ..................................... 22

viii


DANH MỤC HÌNH
Trang
Hình 2.1 Quá trình cơ bản tạo cây trồng chuyển gen ..................................................... 3
Hình 2.2 Trình tự Nucleotide của promoter 35S ............................................................ 4
Hình 2.3 Vi khuẩn Bacillus thuringiensis và cấu trúc của Bt toxine ............................. 5
Hình 2.4 Cây bắp trên đồng ruộng Việt Nam................................................................. 8
Hình 2.5 Diện tích cây trồng chuyển gen trên thế giới từ năm 1996 đến 2011 ........... 10
Hình 2.6 Tóm tắt sơ đồ phản ứng PCR ........................................................................ 11
Hình 2.7 Thermus aquaticus......................................................................................... 12
Hình 4.1 Kết quả điện di DNA ly trích từ mẫu tƣơi..................................................... 23
Hình 4.2 Kết quả ly trích mẫu thực phẩm .................................................................... 23
Hình 4.3 Kết quả khảo sát độ hoạt động của mồi ........................................................ 24
Hình 4.4 Sản phẩm PCR ở các nồng độ mồi khác nhau .............................................. 26
Hình 4.5 Sản phẩm PCR ở các nồng độ Mg2+ khác nhau ............................................ 27
Hình 4.6 Kết quả khảo sát nhiệt độ ............................................................................. 27
Hình 4.7 Kết quả khảo sát số chu kỳ ........................................................................... 28
Hình 4.8 Kết quả khảo sát độ đặc hiệu của mồi .......................................................... 29
Hình 4.9 Kết quả áp dụng quy trình PCR trên mẫu thực phẩm ................................... 30


ix


Chƣơng 1 MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Công nghệ sinh học (CNSH) với nền tảng cơ bản là sinh học phân tử, công
nghệ tế bào, công nghệ enzyme và protein, ... ngày càng có nhiều ứng dụng quan trọng
trong cuộc sống con ngƣời. Một trong những kết quả nổi trội từ việc ứng dụng công
nghệ sinh học hiện nay là sinh vật biến đổi gen (Genetically Modified Organism –
GMO). Trong đó, cây trồng biến đổi gen là dạng nhận đƣợc nhiều sự quan tâm của các
nhà khoa học, các nhà lãnh đạo cũng nhƣ ngƣời dân trên thế giới nhất.
Kỹ thuật biến đổi gen đã giúp con ngƣời tạo đƣợc nhiều cây trồng năng suất
cao, phẩm chất tốt do chúng có các đặc tính nhƣ: khả năng kháng bệnh, kháng sâu hại,
kháng thuốc diệt cỏ, tăng khả năng chịu mặn, chịu hạn, ... Cùng với các kỹ thuật canh
tác hiện đại, cây trồng biến đổi gen đã làm gia tăng sản lƣợng lƣơng thực, thực phẩm
lên gấp nhiều lần. Các giống biến đổi gen đang đƣợc trồng nhiều nhất hiện nay là đậu
nành, bắp, lúa mì, bông vải. Trong số đó, bắp chuyển gen là loại cây trồng đƣợc đặc
biệt quan tâm vì đây là loại lƣơng thực phổ biến trên toàn thế giới.
Sự ra đời của bắp chuyển gen mang lại rất nhiều lợi ích cho con ngƣời, là lựa
chọn tối ƣu cho vấn đề giải quyết nạn đói ở các nƣớc nghèo. Tuy nhiên, việc phát triển
bắp chuyển gen nói riêng, hay GMO nói chung, vẫn là một vấn đề gây tranh cãi trong
cộng đồng các nhà khoa học. Các hiểm họa đƣợc cho là tiềm ẩn trong bắp chuyển gen
nhƣ nguy cơ gây dị ứng khi đƣa gen lạ vào cơ thể hay nguy cơ phát tán nguồn gen lạ
vào môi trƣờng,… Tuy nhiên, cho đến nay, vẫn chƣa có bằng chứng cụ thể chứng
minh các rủi ro của GMO. Trƣớc những nguy cơ tiềm ẩn đó, đòi hỏi phải có biện pháp
kiểm soát GMO. Chính vì vậy, một số nƣớc trên thế giới vẫn chấp nhận sử dụng GMO
nhƣng kèm theo đó là những quy định cụ thể về việc dán nhãn. Khi lƣợng GMO tồn
tại trong sản phẩm đạt một ngƣỡng nhất định (tùy theo quy định của từng nƣớc hay
từng tổ chức) thì bắt buộc phải có dán nhãn sản phẩm. Ở Việt Nam hiện nay đã bắt đầu

trồng bắp chuyển gen thí điểm ở Vũng Tàu, nhƣng chƣa áp dụng triệt để các quy định
về vấn đề này. Hơn nữa, thực trạng thực phẩm chứa bắp chuyển gen trên địa bàn
TPHCM vẫn chƣa đƣợc kiểm soát rõ ràng. Từ nhu cầu đó, đề tài "Xây dựng quy trình
phát hiện bắp chuyển gen bằng kỹ thuật Multiplex PCR" đƣợc thực hiện.
1


1.2. Yêu cầu
Tối ƣu quy trình ly trích DNA từ các mẫu bắp và thực phẩm có chứa bắp.
Xây dựng đƣợc quy trình PCR phát hiện bắp chuyển gen.
1.3. Nội dung thực hiện
Xây dựng quy trình ly trích DNA trên mẫu tƣơi và mẫu thực phẩm.
Xây dựng quy trình Multiplex PCR với mồi chuyên biệt cho trình tự promoter
35S và trình tự đối chứng nội là gen Invertase.
Thực hiện phản ứng Multiplex PCR với một số mẫu thực phẩm.

2


Chƣơng 2 TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1. Tổng quan về sinh vật chuyển gen (GMO)
2.1.1. Định nghĩa GMO
Hiện nay trên thế giới có rất nhiều định nghĩa về GMO. Tuy nhiên, định nghĩa
chung nhất, theo FAO, sinh vật chuyển gen là sinh vật đƣợc biến đổi di truyền bằng
cách thêm vào một hoặc nhiều gen (gọi là gen chuyển), thƣờng là từ các loài khác.
Bằng cách đó, vật chất di truyền của chúng đã đƣợc biến đổi theo những cách không
xảy ra trong tự nhiên nhƣ các quá trình lai chéo hay biến đổi tự nhiên. Đối với thực
vật, thuật ngữ này đƣợc dùng để chỉ các loại cây trồng mà bộ gen của chúng đã đƣợc
chuyển nạp ổn định những gen hữu ích mới bằng các kĩ thuật chuyển nạp gen và trong
đa số trƣờng hợp các gen này đƣợc biểu hiện và tổng hợp ra các sản phẩm của chúng.

2.1.2. Quá trình tạo GMO
Quá trình tạo GMO thƣờng ứng dụng nhiều kỹ thuật phức tạp và đa dạng. Tuy
nhiên, có thể tóm tắt chung thành các bƣớc cơ bản nhƣ sau:
-

Ly trích acid nucleic (DNA/RNA)

-

Dòng hóa gen (còn gọi là tạo dòng gen)

-

Thiết kế vector cho quá trình chuyển gen

-

Chuyển gen

-

Lai tạo giống

Hình 2.1 Quá trình cơ bản tạo cây trồng chuyển gen
(Nguyễn Hữu Trưởng, 2005)
3


Theo Glick và Pasternar (2007) thì mỗi kỹ thuật trong quá trình cơ bản tạo
GMO đều có ảnh hƣởng lớn đến kết quả sản phẩm. Tuy nhiên, quan trọng nhất trong

quá trình vẫn là kỹ thuật đƣa vector chứa gen chuyển vào tế bào sinh vật hay còn gọi là
kỹ thuật biến nạp gen. Có nhiều phƣơng pháp giúp biến nạp gen trên thực vật, mỗi
phƣơng pháp đều có ƣu và khuyết điểm riêng nhƣng có thể chia thành 2 nhóm chính:
-

Biến nạp trực tiếp (phƣơng pháp xung điện, polyethylen glycol, …)

-

Biến nạp gián tiếp (phƣơng pháp bắn gen, phƣơng pháp dùng vi khuẩn
Agrobacterium, …)

2.1.3. Promoter CaMV 35S
Để tạo cây chuyển gen có hiệu quả cao trong sản xuất và thƣơng mại, việc điều
hòa sự biểu hiện gen hữu ích đƣợc chèn vào trong bộ gen của cây trồng rất quan trọng.
Điều này đƣợc thực hiện nhờ gắn vào gen hữu ích một promoter và terminator nhằm
điều khiển sự biểu hiện của gen đó. Các nhà khoa học trên thế giới đã tìm ra rất nhiều
promoter có thể sử dụng trong quá trình chuyển gen, tuy nhiên trong số đó promoter
CaMV 35S là loại có mặt trong hầu hết các sản phẩm thực vật chuyển gen hiện nay.
(Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 2008)

Hình 2.2 Trình tự Nucleotide của promoter 35S (Nguyễn Hữu Trưởng, 2005)
Vào đầu thập niên 80, Chua và các cộng sự tại trƣờng Đại Học Rockefeller đã
phân lập đƣợc một promoter cho phép phiên mã toàn bộ bộ gen của Cauliflower
mosaic virus (CaMV) xâm nhiễm vào củ cải. Promoter này đƣợc đặt tên là CaMV 35S
promoter do hệ số lắng của toàn bộ bản sao promoter là 35S. Promoter 35S là một
promoter cơ bản rất mạnh, có thể hoạt hóa phiên mã trong mọi loài thực vật và cho
phép biểu hiện gen ở mức độ cao trong cây hai lá mầm. Tuy nhiên, nó kém hiệu quả
trong cây một lá mầm, đặc biệt là trong ngũ cốc.
4



2.1.4. Các hƣớng chính trong tạo giống cây trồng chuyển gen
2.1.4.1. Chuyển gen kháng sâu
Trong thời gian 30 năm gần đây, trong sản xuất nông nghiệp, ngƣời ta sử dụng
thuốc trừ sâu vi sinh Bt do khuẩn Bacillus thuringiensis tạo ra. Vi khuẩn này sản sinh
ra các protein kết tinh rất độc đối với ấu trùng của côn trùng nhƣng không gây độc đối
với động vật có xƣơng sống. Vi khuẩn này sản sinh 3 ngoại độc tố và một nội độc tố.
Nội độc tố đóng vai trò quan trọng nhất do tinh thể của nó khi cho vào một côn trùng
sẽ bị các enzyme protease phân giải thành các đoạn peptide, trong đó có đoạn có khối
lƣợng khoảng 68.000 dalton chứa khoảng 12.000 acid amin làm hỏng ruột côn trùng.
Năm 1987, các nhà nghiên cứu ở Bỉ đã tách đƣợc gen mã hóa cho protein độc tố này.
các gen mã hóa độc tố này nằm trên plasmid của vi khuẩn, đƣợc gọi chung là Cry.

Hình 2.3 Vi khuẩn Bacillus thuringiensis và cấu trúc của
Bt toxine (www.biokurs.de)
Các gen này đƣợc tách ra, xác định trình tự, tiến hành tổng hợp, và thiết kế vào
các vector chuyển gen, sau đó chuyển vào các cây trồng nhƣ bông, bắp, đậu nành, lúa.
Kết quả là tạo ra hàng loạt cây trồng kháng sâu.
2.1.4.2. Chuyển gen kháng thuốc diệt cỏ
Trong nền sản xuất nông nghiệp hiện đại ở quy mô sản xuất lớn cần phải sử
dụng thuốc diệt cỏ dại. Tuy nhiên, khi phun thuốc thì không chỉ cỏ dại mà đến cây
trồng cũng bị ảnh hƣởng, đặc biệt là lúa. Để tránh vấn đề đó, ngƣời ta đã tạo ra cây
5


trồng kháng thuốc diệt cỏ bằng cách chuyển các gen tạo enzyme làm mất hoạt tính của
thuốc diệt cỏ. Gen này là gen tạo enol pyruvat sikimat phosphate synthetase (EPSPS),
một loại enzyme có chức năng chuyển hóa sản phẩm quang hợp thành acid skimic ở
dạng mạch vòng cần thiết cho quá trình trao đổi chất của cỏ.

Cơ chế của thuốc diệt cỏ là kìm hãm enzyme EPSPS. Tuy nhiên, khi hàm lƣợng
enzyme EPSPS gia tăng lên nhiều lần thì cỏ sẽ có thể không bị ảnh hƣởng bởi thuốc
diệt cỏ. Dựa vào nguyên lý đó, ngƣời ta đã tách và cải biến các gen mã hóa EPSPS từ
vi sinh vật hay từ những loại thực vật chịu đƣợc thuốc diệt cỏ và chuyển chúng vào
cây trồng. Sản phẩm của quá trình sẽ là cây trồng có hàm lƣợng và hoạt tính enzyme
EPSPS cao gấp 4 lần so với bình thƣờng. Nhờ vậy, những cây trồng chuyển gen
EPSPS sẽ chống chịu đƣợc với thuốc diệt cỏ.
2.1.4.3. Chuyển gen tạo cây kháng virus gây bệnh
Bệnh ở thực vật do virus gây ra thƣờng rất nghiêm trọng và không thể dùng các
loại thuốc thông thƣờng để phòng trừ. Do đó, ngƣời ta đã tiến hành tạo cây kháng
virus bằng một số cách nhƣ chuyển hóa gen mã hóa protein vỏ virus, chuyển gen có
trình tự đối bản với RNA virus, chuyển gen tạo enzyme phân giải virus, ….
Phổ biến nhất trong quá trình tạo cây kháng virus là phƣơng pháp chuyển gen
mã hóa protein vỏ virus. Sự có mặt của gen này trong tế bào thực vật sẽ gây hiệu ứng
kìm hãm sự tổng hợp protein vỏ của gen tạo vỏ ở virus. Nhờ cơ chế kìm hãm đó mà
virus không nhân lên đƣợc. Một số loại thực vật đƣợc chuyển gen bằng cách ứng dụng
phƣơng pháp này là: đu đủ kháng virus gây bệnh đốm vòng, cây thuốc lá kháng virus
khảm dƣa chuột, cây thuốc lá kháng virus khảm alfa, khoai tây kháng virus xoăn lá,
cam, quít kháng virus gây tàn lụi tristeza, ...
2.1.4.4. Chuyển gen tạo cây sản xuất protein động vật
Sản xuất protein động vật bằng phƣơng pháp nuôi cấy mô hoặc nuôi cấy tế bào
động vật rất tốn kém và dễ bị tạp nhiễm. Vì vậy, cần phải phát triển một phƣơng pháp
tạo protein động vật từ các nguồn khác. Do nhu cầu đó, các nhà khoa học đã tìm và
thực hiện phƣơng pháp chuyển các gen mã hóa cho protein động vật vào thực vật
nhằm biến thực vật thành nguồn sản xuất protein động vật.
Ví dụ, gen tổng hợp một loại protein trong sữa ngƣời là lactoferrin đã đƣợc
chuyển vào khoai tây, lúa và thu đƣợc cây khoai tây, lúa có khả năng tổng hợp
lactoferrin. Tuy nhiên, hàm lƣợng lactoferrin đƣợc tổng hợp trong khoai tây thấp hơn
6



nhiều so với lúa. Tính đến hiện nay, các nhà nghiên cứu đã tạo đƣợc giống lúa có thể
đạt hàm lƣợng tới 5 gam lactoferrin trong 1 kg gạo và khá ổn định qua các thế hệ.
2.1.4.5. Chuyển gen thay đổi hàm lƣợng, chất lƣợng các chất dinh dƣỡng của cây
Bắp và đậu nành là 2 loại lƣơng thực phổ biến cho ngƣời và gia súc. Tuy nhiên,
chúng đều chứa rất ít Methionin. Ngƣời ta đã tiến hành nghiên cứu chuyển gen mã hóa
để sản xuất nhiều Methionin vào bắp và đậu nành để thu đƣợc các cây có hàm lƣợng
Methionin lên đến 8% trong tổng số protein trong hạt.
Một nghiên cứu khác là sản xuất lúa Golden rice có khả năng tổng hợp βcaroten nhằm giải quyết vấn đề thiếu vitamin A ở ngƣời. Trong gạo thông thƣờng
không chứa β-caroten nhƣng lại chứa tiền chất của β-caroten, là geranyl
pyrophosphate. Ngƣời ta đã chuyển nhóm gen mã hóa các enzyme nhƣ phytoen
synthetase, phytoen desaturase, caroten desaturase, lycopen β-cyclase vào lúa. Các
enzyme này giúp chuyển hóa pyrophosphate thành β-caroten (Lê Trần Bình, 2008).
2.1.5. Lợi ích từ cây trồng chuyển gen
Nhờ có công nghệ gen mà cây trồng đã có năng suất tăng đột biến, cung cấp đủ
thực phẩm cho con ngƣời. Hơn nữa, công nghệ gen cũng giúp tạo ra nhiều loại cây
trồng có hàm lƣợng dinh dƣỡng cao nhƣ lúa Golden rice hay loại cây trồng có thời
gian bảo quản lâu hơn nhƣ cà chua đƣợc chuyển gen chín chậm.
Các sinh vật chuyển gen với gen chuyển đƣợc phân lập từ bất kỳ sinh vật nào
khác sẽ có đặc tính mới nhƣ mong muốn. Do đó, ranh giới giữa giống, loài trong việc
tạo giống cây trồng sẽ bị xóa bỏ, giúp con ngƣời dễ dàng hơn trong việc chọn lọc
giống mới với các ƣu điểm vƣợt trội. Nhƣ vậy, các thực phẩm đƣợc sản xuất từ sinh
vật chuyển gen sẽ có giá thành thấp hơn do chúng có khả năng chống chịu cao, làm gia
tăng năng suất lên nhiều lần. Các loại thực phẩm giàu dinh dƣỡng cũng sẽ trở nên phổ
biến hơn và an toàn hơn với ngƣời dùng.
2.1.6. Những nguy cơ tiềm ẩn của cây chuyển gen
Vấn đề lo ngại nhất của cây trồng chuyển gen là những ảnh hƣởng đối với môi
trƣờng. Các cây có thể kháng với côn trùng có hại thì cũng có thể diệt cả côn trùng có
lợi. Một số nghiên cứu chỉ ra rằng, phấn hoa cây bắp chuyển gen kháng sâu có thể diệt
các ấu trùng bƣớm nữ hoàng. Ngoài ra, gen từ cây chuyển gen cũng có thể bị phát tán

sang các loài thực vật khác sống gần đó thông qua hiện tƣợng thụ phấn chéo. Các cây

7


hoang dại sẽ có khả năng kháng đƣợc thuốc diệt cỏ, cạnh tranh với cây trồng chuyển
gen. Các loài sâu bệnh cũng có thể tăng cƣờng tính kháng với chất độc tiết ra từ cây.
Một vấn đề khác, các sản phẩm chuyển gen thƣờng là protein, do vậy có thể các
thực phẩm từ GMO mang những chất gây dị ứng với ngƣời dùng. Hơn nữa, nhiều
vector chuyển gen mang các gen chỉ thị là gen kháng kháng sinh. Các gen này có thể
thông qua cây trồng chuyển gen trao đổi với các vi sinh vật khác nhau, tạo nên các vi
sinh vật kháng kháng sinh. Khi vi sinh vật này xâm nhập vào cơ thể ngƣời và gây bệnh
thì không thể sử dụng kháng sinh để chữa trị đƣợc (Nguyễn Văn Mùi, 2009).
2.2. Sơ lƣợc về cây bắp:
Bắp (tên khoa học là Zea mays L.) có nguồn gốc từ loại cỏ Teosinte hoang dại
tại Mexico. Bắp là một loại ngũ cốc quan trọng, đứng thứ ba sau lúa mì và lúa gạo,
góp phần nuôi sống gần 1/3 dân số trên toàn thế giới. Sản lƣợng sản xuất bắp ở thế
giới trung bình hàng năm từ 696,2 đến 723,3 triệu tấn (năm 2005-2007). Trong đó Mỹ
sản xuất 40,62% tổng sản lƣợng bắp và 59,38% do các nƣớc khác sản xuất. Sản lƣợng
bắp xuất khẩu trên thế giới trung bình hàng năm từ 82,6 đến 86,7 triệu tấn. Trong đó,
Mỹ xuất khẩu 64,41 % tổng sản lƣợng và các nƣớc khác chiếm 35,59 %.

Hình 2.4 Cây bắp trên đồng ruộng Việt Nam
(www.my.opera.com)
Ở Việt Nam, bắp là cây lƣơng thực đứng hàng thứ 2 sau lúa gạo. Diện tích gieo
trồng và năng suất, sản lƣợng bắp cũng tăng mạnh, từ hơn 200 ngàn ha với năng suất 1
tấn/ha (năm 1960), đến năm 2009 đã vƣợt ngƣỡng 1 triệu ha với năng suất 43 tạ/ha. So
với các nƣớc thì năng suất bắp ở ta vẫn thuộc loại khá thấp. Đặc biệt tại một số địa
8



phƣơng miền núi vùng sâu, vùng xa của các tỉnh Lai Châu, Sơn La, Thanh Hóa, Quảng
Nam, Lâm Đồng… một số đồng bào dân tộc ít ngƣời sử dụng bắp là nguồn lƣơng
thực, thực phẩm chính. Việc sử dụng các giống bắp địa phƣơng và tập quán canh tác
lạc hậu dẫn đến năng suất bắp ở đây chỉ đạt trên dƣới 1 tấn/ha. Sản lƣợng bắp trong
nƣớc vẫn chƣa đáp ứng đủ nhu cầu mà hàng năm chúng ta còn phải nhập khẩu khá
nhiều bắp hạt (trị giá trên 500 triệu USD) để sản xuất thức ăn gia súc (Ngân hàng kiến
thức trồng ngô, Viện khoa học Nông nghiệp Việt Nam, 2012).
2.3. Tình hình sản xuất bắp chuyển gen trong và ngoài nƣớc:
Trên thế giới thì diện tích cây bắp biến đổi gen là lớn thứ 2, chỉ sau đậu nành,
với diện tích 25,2 triệu ha, chiếm 25% diện tích cây trồng biến đổi gen. Cây bắp biến
đổi gen đƣợc trồng nhiều nhất ở Mỹ, Argentina, Brasil, Canada, Nam Phi, … Cây bắp
chủ yếu đƣợc nghiên cứu, sản xuất và sử dụng giống có tính trạng chống chịu thuốc
trừ cỏ, kháng sâu, chịu hạn. Năm 2006, thêm một số nƣớc thuộc liên minh Châu Âu
(EU) lần đầu tiên đƣa bắp chuyển gen Bt vào trồng đại trà.

Hình 2.5 Diện tích cây trồng chuyển gen trên thế giới từ năm 1996 đến 2011 (Clive
James, 2012)
9


Bắp là cây trồng đƣợc các quốc gia trên thế giới cấp phép sử dụng làm thực
phẩm và thức ăn chăn nuôi nhiều nhất với tổng số 35 giống khác nhau, vƣợt hẳn cây
trồng đứng thứ 2 là bông (với 19 giống khác nhau). Giống bắp đƣợc cấp phép nhiều
nhất là bắp kháng sâu bệnh (MON810) và bắp kháng thuốc trừ cỏ (NK603), cả 2 giống
đều đƣợc 18 nƣớc cấp phép. (trích dẫn bởi Bùi Văn Hiệu, 2008)
Riêng tại Việt Nam, vào ngày 5/9/2005, TPHCM đã tiến hành trồng thử nghiệm
2 loại bắp chuyển gen trên diện tích 1000m2 ở quận 12. 2 loại bắp nói trên là bắp
kháng thuốc diệt cỏ và kháng sâu. Tính đến hiện nay, nƣớc ta đã tiến hành trồng thử
bắp chuyển gen ở nhiều địa phƣơng khác trong cả nƣớc nhƣ Vũng Tàu, Tây Nguyên.

(trích dẫn bởi Bùi Văn Hiệu, 2008)
2. 3. Phƣơng pháp PCR phát hiện bắp chuyển gen
2.3.1. Giới thiệu chung
Phƣơng pháp PCR (Polymerase Chain Reaction) đƣợc Kary Mullis và cộng sự
(Mỹ) phát minh năm 1985 và kể từ đó đã đƣợc sử dụng rộng rãi trong các nghiên cứu
y học và sinh học, phục vụ những mục đích khác nhau nhƣ bệnh di truyền, chẩn đoán
bệnh nhiễm trùng, tách dòng gen. Tháng 10 năm 1993, Kary Mullis cùng với Micheal
Smith đã nhận giải Nobel hóa học nhờ thành tựu này.

Hình

2.6

Kary

Mullis

và

Micheal

Smith

(www.biocadmin.otago.ac.nz)
2.3.2. Nguyên tắc của phản ứng PCR
PCR là phƣơng pháp in vitro sử dụng các cặp mồi là những đoạn
Oligonucleotide ngắn để tổng hợp các bản sao của một trình tự DNA đặc biệt trên
10



DNA mẫu nhờ hoạt động của enzyme polymerase. Các cặp mồi sẽ bắt cặp bổ sung với
mạch khuôn DNA và kéo dài nhờ hoạt động của enzyme polymerase để hình thành
một đoạn DNA hoàn chỉnh. Phản ứng PCR là một chuỗi phản ứng nhiều chu kỳ, mỗi
chu kỳ gồm 3 giai đoạn nhƣ sau:
-

Giai đoạn biến tính: chuỗi DNA mạch đôi tách ra thành DNA mạch đơn.

-

Giai đoạn bắt cặp: mồi sẽ bắt cặp bổ sung với DNA mạch khuôn.

-

Giai đoạn kéo dài: tổng hợp chuỗi DNA mới giống với trình tự DNA khuôn.

Hình 2.7 Tóm tắt phản ứng PCR (Phạm Hùng Vân, 1996)
2.3.3. Các thành phần của phản ứng PCR
- DNA mẫu: là chuỗi Nucleotide mà phản ứng PCR sẽ khuếch đại lên để phát hiện
trình tự DNA đặc biệt mà ta quan tâm. DNA mẫu nên thật tinh sạch, không chứa các
chất gây ức chế phản ứng PCR để giúp thu đƣợc kết quả tối ƣu.
- Primer (hay còn gọi là đoạn mồi): là những đoạn Nucleotide ngắn (18 đến 30
base), có thể bắt cặp bổ sung với đoạn khởi đầu và đoạn kết thúc của trình tự DNA đặc
biệt mà ta muốn khuếch đại. Trong phản ứng PCR, ngƣời ta thƣờng dùng ít nhất một
cặp mồi, trong đó có một mồi xuôi và một mồi ngƣợc. Kích thƣớc của sản phẩm PCR
sẽ phụ thuộc vào vị trí bắt cặp của cặp mồi này. Vị trí bắt cặp của chúng trên chuỗi
đích càng xa thì kích thƣớc sản phẩm càng lớn và ngƣợc lại. Cặp mồi trong phản ứng
11



PCR có vai trò rất quan trọng, vì nó quyết định tính đặc hiệu của phản ứng. Nếu cặp
mồi đƣợc chọn càng đặc hiệu cho DNA mục tiêu, tức chỉ bắt cặp đúng trình tự DNA
mục tiêu và không bắt cặp trên các chuỗi DNA khác thì phản ứng có tính đặc hiệu
càng cao.
- dNTP (deoxy nucleoside triphosphate): là các đơn vị cần thiết để tổng hợp nên
DNA. dNTP có cấu tạo gồm một đƣờng deoxyribose có gắn một base (A, T, G, C) tại
vị trí carbon số 1 (C1). Ba phân tử phosphate (triphosphate) đƣợc gắn tại carbone số 5
(C5) của phân tử deoxyribose này và đây là nơi mà dNTP gắn vào đầu 3' của chuỗi bổ
sung trên chuỗi đích. Năng lƣơng để cho phản ứng này xảy ra đƣợc lấy từ các nối
phosphate giàu năng lƣơng của triphosphate trên dNTP. Điều đó giải thích tại sao phải
sử dụng dNTP trong phản ứng PCR chứ không phải dNDP (diphosphate) hay dNMP
(monophosphate).
- Enzyme polymerase: xúc tác kéo dài đoạn mồi để tổng hợp mạch DNA mới từ các
đơn vị dNTP. Enzyme polymerase sử dụng trong phản ứng PCR phải là enzyme chịu
đƣợc nhiệt độ cao, không bị phân hủy qua giai đoạn đầu của phản ứng, khi nhiệt độ để
biến tính DNA mạch đôi có thể lên đến 94oC hay 95oC. Chính vì vậy, ngƣời ta thƣờng
sử dụng enzyme polymerase trích từ vi khuẩn Thermus aquaticus, là các vi khuẩn sống
đƣợc ở suối nƣớc nóng, gọi là Taq polymerase (Phạm Hùng Vân, 1996).

Hình 2.8 Thermus aquaticus (www.en.wikipedia.org)
- Buffer (dung dịch đệm cho phản ứng): thƣờng chứa Tris HCL 10 mM, KCL
50Mm và MgCl2 1.5mM. Ngoài ra dung dịch đệm PCR còn có thể chứa BSA hay
12


Gelatine tùy thuộc vào từng phản ứng. Trong các thành phần trên, có ảnh hƣởng lớn
nhất đối với hiệu quả và tính đặc hiệu của quá trình PCR là nồng độ Mg2+. Tuy nhiên,
nồng độ ion này sẽ khác nhau tùy từng phản ứng và đƣợc xác định thông qua nhiều thử
nghiệm (Hồ Huỳnh Thùy Dƣơng, 2008).
2.3.4. Ứng dụng phƣơng pháp PCR để phát hiện bắp chuyển gen

Với ƣu điểm là có độ nhạy và độ đặc hiệu cao, PCR là phƣơng pháp thƣờng
đƣợc sử dụng trong các nghiên cứu chẩn đoán bắp chuyển gen. Tuy nhiên, hạn chế của
phƣơng pháp này là có thể gây hiện tƣợng dƣơng tính giả với tỉ lệ thấp do các
promoter và terminator mà ta phát hiện có thể bắt nguồn từ virus hay vi khuẩn hiện
diện trên cây trồng. Để nhận biết đƣợc bắp chuyển gen, các nhà khoa học sẽ thiết kế
mồi đặc hiệu cho trình tự promoter 35S và terminator NOS do chúng hiện diện trong
phần lớn cây trồng chuyển gen trên thế giới. Theo GS.TS. Phạm Thị Anh Thƣ, tại hội
thảo “Giới thiệu về sinh vật chuyển gen” vào ngày 5/5/2005, cho biết 95% cây chuyển
gen tại châu Âu có mang promoter 35S (p35S) và terminator NOS (Tnos) kiểm soát
trình tự gen đƣợc chuyển vào trong cây chuyển gen. Khi mẫu phân tích có một trong
hai trình tự này thì mẫu đó 95% là có chuyển gen, ngƣợc lại khi kết quả mẫu phân tích
không có cả hai trình tự này thì ta cũng có thể kết luận mẫu 95% không có chuyển gen.
(trích dẫn bởi Nguyễn Hữu Trƣởng, 2005)
Hiện nay, để cải thiện quy trình PCR phát hiện bắp chuyển gen, các nhà nghiên
cứu thƣờng bổ sung thêm mồi cho trình tự gen Invertase nhằm kiểm soát phản ứng.
Theo Trần Thị Lệ (2006), Invertase là gen có mặt trong tất cả các giống bắp, kể cả bắp
chuyển gen. Việc sử dụng mồi cho trình tự gen Invertase trong quy trình PCR phát
hiện bắp chuyển gen giúp kiểm soát phản ứng do Invertase hiện diện trong suốt đời
sống của cây bắp, có mặt trong tất cả các bộ phận và cơ quan.
2.4. Tình hình nghiên cứu quy trình chẩn đoán bắp chuyển gen trong, ngoài nƣớc
2.3.1. Tình hình nghiên cứu quy trình chẩn đoán bắp chuyển gen ở ngoài nƣớc
Năm 1999, Lipp và ctv đã bắt đầu sử dụng kỹ thuật PCR với đoạn mồi chuyên
biệt cho trình tự 35S và trình tự terminator NOS để phát hiện bắp và đậu nành chuyển
gen từ các mẫu thu thập trên thị trƣờng EU. Quy trình PCR đƣợc sử dụng trong nghiên
cứu này có thể phát hiện đƣợc các mẫu có chứa 2% GMO. Trong 105 mẫu khảo sát
vẫn có 3 hiện tƣợng âm tính giả do mồi cho trình tự NOS không có độ nhạy cao và 2
mẫu dƣơng tính giả, do bị tạp nhiễm trong quá trình làm thí nghiệm.
13



Năm 2002, Chieuh và ctv đã thực hiện thiết kế quy trình PCR phát hiện 6 giống
bắp chuyển gen khác nhau trong thực phẩm ở Đài Loan. Mồi đƣợc thiết kế tùy theo
gen chuyển và gen Zein trên bắp. Kết quả cho thấy phƣơng pháp PCR vẫn có thể phát
hiện đƣợc gen Zein dù mẫu đã qua xử lý nhiệt ở 100oC trong 120 phút hoặc 121oC
trong 30 phút. Trong các mẫu thực phẩm đã phát hiện đƣợc 6 mẫu có chứa bắp chuyển
gen. Giống bắp chuyển gen đƣợc sử dụng nhiều nhất là MON810.
Năm 2003, James và ctv đã sử dụng kỹ thuật Multiplex PCR để tìm các gen
chuyển trong 4 mẫu bắp chuyển gen ở Canada. Mồi đƣợc thiết kế theo từng gen
chuyển và gen Invertase. Phản ứng PCR phát hiện đƣợc các giống bắp chuyển gen
gồm có Event176, Bt11, MON810, T14/25. Riêng trên mẫu T14/25, mồi 35S khuếch
đại đƣợc 2 đoạn có kích thƣớc lần lƣợt là 152 bp và 485 bp.
Năm 2004, Heo và ctv cũng đã làm thí nghiệm dùng kỹ thuật PCR trên các
dòng bắp chuyển gen khác nhau ở Hàn Quốc. Quy trình ly trích DNA đƣợc sử dụng là
CTAB. Trong thí nghiệm này, mồi đƣợc thiết kế theo gen chuyển và gen Zein trên bắp.
Kết quả thí nghiệm xác định đƣợc một số mẫu thực phẩm có chứa giống bắp chuyển
gen GA21, nhƣng không xác định đƣợc lƣợng bắp chuyển gen trong mẫu.
Năm 2006, Mendoza và ctv đã sử dụng bộ kit ly trích DNA theo phƣơng pháp
Wizard và sử dụng kỹ thuật Multiplex PCR với 2 cặp mồi khuếch đại cho đoạn
promoter 35S và gen Zein với các mẫu đƣợc thu thập ở Mexico. Phƣơng pháp PCR
trong thí nghiệm này có thể phát hiện đƣợc bắp chuyển gen kể cả trong mẫu dầu. Độ
nhạy của phƣơng pháp cũng khá cao, có thể phát hiện đƣợc mẫu chỉ có chứa 0,1% bắp
chuyển gen. Mồi Zein đƣợc sử dụng nhƣ đối chứng nội cho phản ứng PCR.
Cũng trong năm 2006, Randhawa và Firke cũng thực hiện thí nghiệm xây dựng
quy trình PCR để phát hiện bắp và đậu tƣơng chuyển gen ở Ấn Độ. Mồi đƣợc sử dụng
cho quy trình PCR phát hiện bắp chuyển gen là 35S và Invertase. Sản phẩm Invertase
có xuất hiện trên tất cả các mẫu bắp. Kết quả của thí nghiệm này là quy trình PCR có
độ nhạy và độ đặc hiệu cao, có thể sử dụng để phát hiện bắp chuyển gen trên thị
trƣờng Ấn Độ. Nghiên cứu cũng chỉ ra rằng mồi cho trình tự terminator NOS có độ
nhạy không cao. Do đó, chƣa thể phát hiện thực phẩm chuyển gen bằng mồi NOS.
Năm 2010, Shrestha và ctv đã thực hiện một nghiên cứu nhằm khảo sát các mẫu

bắp ở thị trƣờng Nepal bằng cách sử dụng kỹ thuật Multiplex PCR với mồi cho trình
tự giống MON810, T25, NK603 và Zein. Kết quả cho thấy không có mẫu bắp chuyển
14