BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP

XÁC ĐỊNH ĐẶC ĐIỂM ĐỊNH DANH VÀ GÂY BỆNH CỦA
Streptococcus agalactiae TRÊN CÁ RÔ PHI ĐỎ
(Oreochromis sp.) NUÔI BÈ

Họ và tên sinh viên: PHẠM THỊ THU SƯƠNG
Ngành: NUÔI TRỒNG THỦY SẢN
Chuyên ngành: NGƯ Y
Niên khóa: 2008– 2012

Tháng 07/2012


XÁC ĐỊNH ĐẶC ĐIỂM ĐỊNH DANH VÀ GÂY BỆNH CỦA
Streptococcus agalactiaeTRÊN CÁ RÔ PHI ĐỎ (Oreochromis sp.)NUÔI BÈ

Tác giả

PHẠM THỊ THU SƯƠNG

Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp bằng
Kỹ sư ngành Nuôi Trồng Thủy Sản, chuyên ngành Ngư Y

Giáo viên hướng dẫn
TS. NGUYỄN HỮU THỊNH

Tháng 07 năm 2012

i


CẢM TẠ
Xin gửi lời cảm ơn chân thành đến
Ban Giám Hiệu Trường Đại học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh.
Ban Chủ Nhiệm Khoa Thủy Sản và tất cả các thầy cô đã dùng hết tâm huyết
của mình để truyền đạt kiến thức, kinh nghiệm và tạo điều kiện học tập tốt nhất cho
tôi.
Lòng biết ơn sâu sắc đến thầy Nguyễn Hữu Thịnh đã tận tình hướng dẫn, giúp
đỡ và hỗ trợ tôi hoàn thành tốt khóa luận này.
Cảm ơn chị Truyện Nhã Định Huệ đã nhiệt tình giúp đỡ, chia sẻ kinh nghiệm
để khóa luận có thể thực hiện thuận lợi.
Cha mẹ và gia đình đã động viên, giúp đỡ và hỗ trợ về tinh thần lẫn vật chất cho
con trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài.
Xin gửi lời cảm ơn đến bạn bè, tập thể lớp DH08NY luôn khuyến khích, động
viên và chia sẻ với tôi trong suốt thời gian qua.
Do hạn chế thời gian cũng như về mặt kiến thức nên luận văn này không tránh
khỏi những thiếu sót rất mong nhận được sự góp ý và thông cảm của quý thầy cô và
các bạn để luận văn được hoàn chỉnh hơn.

ii


TÓM TẮT
Đề tài nghiên cứu:“Xác định đặc điểm định danh và gây bệnh của
Streptococcus agalactiaetrên cá rô phi đỏ (Oreochromis sp.)nuôi bè ”được tiến
hành tại ba tỉnh Đồng Nai, Đồng Tháp và An Giang, thời gian từ ngày 26/04/2012 đến
ngày 30/05/2012.
Đề tài được thực hiện với mục đích: Thu mẫu cá bệnh, ghi nhận bệnh tích để

xác định đặc điểm gây bệnh của Streptococcus agalactiae trên cá rô phi đỏ
Oreochromis sp. nuôi bè tại 3 tỉnh Đồng Nai, An Giang, Đồng Tháp. Qua đợt thu mẫu
này, tôi tiến hành mô tả và so sánh chi tiết các triệu chứng, bệnh tíchtrên cá rô phi đỏ
cụ thể như phân lập vi khuẩn, định danh sơ bộ, định danh bằng kit API 20 Strep, kiểm
tra khả năng dung huyết, phản ứng O – F test.
Về kết quả thu được: Qua 3 đợt thu mẫu, vi khuẩn Streptococcusagalactiae là
tác nhân chính gây bệnh trên cá rô phi đỏ trong đợt thu mẫu vào tháng 04 – 05/2012.
Bệnhxảy ra trên nhiều kích cỡ nhưng chủ yếu ở cá cỡ dưới 100 đến 500 g/con.Cá bệnh
với biểu hiện mắt lồi, xuất huyết da, mang, đuôi. Bệnh tích bên trong xoang bụng chủ
yếu gan sưng, nhạt màu, nhũn; lách sưng, nhũn; xuất hiện nhiều dịch viêm xoang
bụng. Khuẩn lạc Streptococcusagalactiaesau khi ủ ở 300C, trong 24 giờ, được xếp vào
ba

dạng

dựa

vào

kích

thước

khuẩn

lạc.

Khuẩn

lạc


vi

khuẩn

Streptococcusagalactiaedạng 1 có đường kính lớn nhất từ 0,5 – 1 mm và
Streptococcusagalactiaedạng 3 có đường kính nhỏ nhất từ 0,2 – 0,3 mm. Sau khi tiến
hành định danh bằng kit API 20 Strep với tỷ lệ chính xác 99,9 %, cả 3 dạng
Streptococcusagalactiaegây bệnh trên cá rô phi đỏ tại Đồng Nai, An Giang và Đồng
Tháp chỉ khác nhau ở hai phản ứng là ADH và TRE.

iii


MỤC LỤC
Trang
Trang tựa ....................................................................................................................... i
Cảm tạ ............................................................................................................................ ii
Tóm tắt ..........................................................................................................................iii
Mục lục ......................................................................................................................... iv
Danh sách các chữ viết tắt ............................................................................................ vi
Danh sách các hình ...................................................................................................... vii
Danh sách các bảng ....................................................................................................viii
Danh sách các biểu đồ .................................................................................................. ix
Chương 1MỞ ĐẦU...................................................................................................... 1
1.1 Đặt Vấn Đề .......................................................................................................... 1
1.2 Mục tiêu đề tài ..................................................................................................... 2
Chương 2TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................................... 3
2.1 Lịch sử và một số nghiên cứu về bệnh do Streptococcus agalactiae .................. 3
2.2 Vi khuẩn Streptococcus agalactiae ..................................................................... 4

2.2.1 Phân loại ........................................................................................................ 4
2.2.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hoá ............................................................................ 4
2.2.3 Triệu chứng, bệnh tích của cá bị bệnh Streptococcus agalactiae ................. 7
2.2.3.1 Triệu chứng ............................................................................................ 7
2.2.3.2 Bệnh tích................................................................................................. 7
2.2.4 Dịch tễ của bệnh ............................................................................................ 7
2.2.5 Chẩn đoán bệnh ............................................................................................. 8
2.2.6 Phương pháp phòng trị bệnh ......................................................................... 8
Chương 3VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................................ 10
3.1 Thời Gian Và Địa Điểm Nghiên Cứu ................................................................ 10
3.2 Vật Liệu Nghiên Cứu ......................................................................................... 10
3.2.1 Dụng cụ ....................................................................................................... 10
3.2.2 Hóa chất và môi trường............................................................................... 10
iv


3.2.2.1 Hóa chất ................................................................................................ 10
3.2.2.2 Môi trường ............................................................................................ 11
3.3 Phương Pháp Nghiên Cứu ................................................................................. 11
3.3.1 Phương pháp thu mẫu cá bệnh .................................................................... 11
3.3.2 Phương pháp chung..................................................................................... 11
3.3.3 Phương pháp giải phẫu cá ........................................................................... 12
3.3.4 Phương pháp cấy phân lập vi khuẩn ........................................................... 14
3.3.5 Phương pháp cấy thuần ............................................................................... 14
3.3.6 Phương pháp định danh vi khuẩn................................................................ 14
3.3.6.1 Định danh sơ bộ.................................................................................... 14
3.3.6.2 Định danh bằng bộ kit API 20 Strep .................................................... 16
3.3.6.3 Phản ứng O - F test ............................................................................... 19
3.4 Phương pháp phân tích và xử lý số liệu ............................................................. 19
Chương 4KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................. 20

4.1 Một số chỉ tiêu chất lượng nước trong quá trình thu mẫu ................................. 20

4.2 Kết quả khảo sát tình hình nuôi cá rô phi đỏ ở 7 hộ nuôi .................................. 20
4.3 Kết quả thu mẫu và phân lập vi khuẩn .............................................................. 23
4.3.1 Biểu hiện bệnh tích ..................................................................................... 23
4.3.2 Kết quả phân lập vi khuẩn........................................................................... 27
4.4 Kết quả định danh chủng vi khuẩn phân lập từ cá thu mẫu ............................... 28
4.4.1 Định danh sơ bộ .......................................................................................... 28
4.4.2 Định danh bằng kit API 20 Strep ................................................................ 31
4.4.2.1 Phản ứng dung huyết ............................................................................ 31
4.4.2.2 Kết quả định danh bằng kit API 20 Strep............................................. 32
4.4.3 Phản ứng O – F test ..................................................................................... 36
Chương 5KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ...................................................................... 38
5.1 Kết Luận............................................................................................................. 38
5.2 Đề nghị ............................................................................................................... 38
TÀI LIỆU THAM KHẢO......................................................................................... 39
PHỤ LỤC ................................................................................................................... 41
v


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
BHIA

Brain Heart Infusion Agar

SBA

Sheep Blood Agar

DO


Dissolve Oxygen

pH

Potential of Hydrogen

CFU

Conoly forming unit

H&E

Hematoxylin và Eosin

g

Gram

kg

Kilogram

mg

Milligram

mL

Milliliter


mm

Millimeter

o

Degree Celsius

µm

Micrometer

STT

Số thứ tự

L

Liver

K

Kidney

S

Spleen

B


Brain

C

vi


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1 Vi khuẩn Streptococcus agalactiae .................................................................... 4
Hình 3.1 Phương pháp nghiên cứu chung ....................................................................... 12
Hình 3.2 Ba đường cắt mổ xoang bụng ........................................................................... 13
Hình 3.3 Bốn đường cắt mổ sọ não cá ............................................................................ 13
Hình 4.1 Mắt cá rô phi đỏ khỏe và bệnh ......................................................................... 26
Hình 4.2 Cá rô phi đỏ khỏe và bị trướng bụng ................................................................ 26
Hình 4.3 Hậu môn cá khỏe và bệnh ................................................................................ 26
Hình 4.4 Cơ quan bên trong xoang bụng của cá khỏe và bệnh ....................................... 27
Hình 4.5 Khuẩn lạc S. agalactiae dạng 1 và dạng 2 ở 300C, 24 giờ ............................... 28
Hình 4.6 Khuẩn lạc S. agalactiae dạng 3 ở 300C, 24 giờ ................................................ 28
Hình 4.7 Hình dạng soi tươi của 3 dạng vi khuẩnS. agalactiae ...................................... 29
Hình 4.8 Hình dạng nhuộm gram của 3 dạng vi khuẩn S. agalactiae ............................. 30
Hình 4.9 Phản ứng catalase và oxidase của 3 dạng vi khuẩn S. agalactiae .................... 30
Hình 4.10Ba dạng vi khuẩnS. agalactiae không lan rộng khỏi vết cấy .......................... 30
Hình 4.11 Khả năng dung huyết β của vi khuẩn S. agalactiae dạng 1 ........................... 31
Hình 4.12 Khả năng dung huyết β của vi khuẩn S. agalactiae dạng 2 ........................... 31
Hình 4.13 Khả năng dung huyết β của vi khuẩn S. agalactiae dạng 3 ........................... 32
Hình 4.14 Kết quả định danh bằng API 20 Strep của vi khuẩn S. agalactiae dạng 1..... 34
Hình 4.15 Kết quả định danh bằng API 20 Strep của vi khuẩn S. agalactiae dạng 2..... 34
Hình 4.16 Kết quả định danh bằng API 20 Strep của vi khuẩn S. agalactiae dạng 3..... 34

Hình 4.17 Ba dạng vi khuẩnS. agalactiae không phản ứng với glucose......................... 37

vii


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Trang
Bảng 2.1 Các đặc điểm sinh hóa của S. agalactiae phân lập bởi nhiều tác giả ........... 5
Bảng 2.2 Các đặc điểm sinh hóa thông thường của S. agalactiae từ một số tác giả .... 6
Bảng 3.1 Thuốc thử và cách đọc kết quả các phản ứng sinh hóa trong API 20 Strep 18
Bảng 3.2Cách đọc kết quả phản ứng O – F test .......................................................... 19
Bảng 4.1Chỉ tiêu chất lượng nước trong các bè nuôi .................................................. 20
Bảng 4.2 Kích cỡ cá dễ mắc bệnh do S. agalactiae qua quá trình điều tra ................. 21
Bảng 4.3 Biểu hiện bệnh của cá ở các bè nuôi ............................................................ 23
Bảng 4.4 Số mẫu vi khuẩn Streptococcus agalactiae phân lập ở mỗi tỉnh ................. 27
Bảng 4.5 Kết quả định danh sơ bộ............................................................................... 29
Bảng 4.6 Kết quả sự hiện diện của ba dạng S. agalactiae tại ba tỉnh ......................... 33
Bảng 4.7 Kết quả test kit API 20 Strep ....................................................................... 35

viii


DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ
Trang
Biểu đồ 4.1 Tỷ lệ kích cỡ cá rô phi đỏ thu mẫu mắc bệnh do S. agalactiae ..................... 22
Biểu đồ 4.2 Tỷ lệ bệnh tích bên ngoài của cá rô phi đỏ (Oreochromis sp.) ...................... 24
Biểu đồ 4.3 Tỷ lệ bệnh tích bên trong xoang bụng của cá rô phi đỏ (Oreochromis sp.) .. 24

ix



Chương 1
MỞ ĐẦU
1.1Đặt Vấn Đề
Trong thời gian qua, nghề nuôi trồng thủy sản đã không ngừng phát triển và ngày
càng có vị trí quan trọng trong nền kinh tế của nước ta.Các mặt hàng thủy sản nuôi
xuất khẩu chủ yếu là tôm và cá tra. Đa dạng hóa loài nuôi làm phong phú nguồn
nguyên liệu phục vụ cho thị trường trong nước và tăng cường khả năng xuất khẩu là
một trong những chủ trương của Bộ Thủy Sản. Để đáp ứng cho nhu cầu đó, nghề nuôi
cá rô phi cũng ngày càng được mở rộng và phát triển. Trong vài chục năm trở lại đây,
một dòng cá rô phi mới – là con lai giữa các loài cá rô phi thuộc giốngOreochromis,
gọi là cá rô phi đỏ (dựa vào màu sắc) đã được nhân giống thành công. Cùng với cá rô
phi dòng GIFT (Genetically improved farmed Tilapia), cá rô phi đỏđãđược Bộ Thủy
Sản (cũ) chọn làmđối tượng nuôi trong chương trình nuôi cá rô phi xuất khẩu.Có thể
nói cá rô phi là một trong những loài cá nuôi kinh tế nhất và là loài có sức đề kháng
cao hơn so với các loài khác. Trong tương lai, cá rô phi sẽ là sản phẩm thay thế cho
các loài cá thịt trắng khai thác từ tự nhiên đang ngày càng cạn kiệt (WFC (World
Financial Center), 2003).
Tuy nhiên, ngày nay khi áp dụng mô hình nuôithâm canh và phát triển bè nuôi quá
nhiều, cá rô phi đỏ cũng sẽdễ dàngphát sinhdịch bệnh thường xuyên. Bệnh trên cá rô
phi xảy ra khắp nơi đã gây tổn thất rất lớn đến người nuôi. Bệnh ở cá rô phi gồm bệnh
do vi khuẩn, virus, nấm và ký sinh trùng. Ở Việt Nam, bệnh thường xảy ra trên cá rô
phido vi khuẩn Streptococcussp.Đây cũnglà nguyên nhân gây nên thiệt hại lớnlàm ảnh
hưởng đến hiệu quả kinh tế của ngành nuôi trồng thủy sản thế giới. Ước tính thiệt hại
do Streptococcussp.hằng năm khoảng 150 triệu USD (Shoemaker và Klesius, 1997).
1


Để nghiên cứu, đánh giá và khắc phục thiệt hại do vi khuẩn Streptococcus sp. gây
ra trên cá rô phi, trong thời gian gần đây có nhiều tác giả trong và ngoài nước đã

nghiên cứu, mô tả đặc điểm bệnh tích và khả năng gây bệnh của Streptococcus sp.
trên cá rô phi nhưng chỉ dừng ở mức rất tổng quát, sơ lược, chưa phân tích chi tiết
từng bệnh tích, triệu chứng cụ thể cũng như mô tả các đặc điểm sinh hóa của
Streptococcus agalactiae.
Trước nhu cầu thực tiễn đó, được sự phân công của Khoa Thủy Sản và Bộ Môn
Bệnh Học, Trường Đại Học Nông Lâm TP.HCM, tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:“
Xác định đặc điểm định danh và gây bệnh của Streptococcus agalactiae trên cá rô
phi đỏ (Oreochromis sp.) nuôi bè ”.
1.2 Mục tiêu đề tài
Phân lập và định danh Streptococcus agalactiae từ cá rô phi đỏ nuôi bè tại ba tỉnh
Đồng Nai, An Giang và Đồng Tháp.
Mô tả đặc điểm triệu chứng, bệnh tích trên cá rô phi bệnh.

2


Chương 2
TỔNG QUAN TÀI LIỆU
2.1 Lịch sử và một số nghiên cứu về bệnh do Streptococcusagalactiae
Vi khuẩn Streptococcussp. phân bố rộng rãi trong môi trường tự nhiên. Trong
đó Streptococcus agalactiae có phổ ký chủ rộng, gây bệnh cho cả người, gia súc và
cá.Ngoài ra, chúng còn ảnh hưởng đến các loài động vật khác nhưcá sấu, ếch, hải cẩu
hoặc cá heo(Theo www.moredun.org.uk).Theo Đinh Thị Thủy và ctv (2005), từ năm
2003 – 2004 vi khuẩnphân lập được từ cá rô phi bệnh có tần suất cao nhất ở một số
tỉnh đồng bằng sông Cửu Long như An Giang, Tiền Giang và Vĩnh Long là vi khuẩn
Streptococcussp. chiếm 95 – 100 %. Bệnh thường xuất hiện ở cá từ 1 – 5 tháng tuổi,
không gặp ở cá nhỏ hơn 1 tháng tuổi. Tỷ lệ xuất hiện cao nhất vào mùa khô (tháng 1 –
4) và kéo dài đến tháng 6 – 7 trong mùa mưa. BệnhStreptococcussp. cũng xảy ra ở một
số tỉnh đồng bằng sông Hồng như Hà Nội, Quảng Ninh, Hải Phòng, Hải Dương, Bắc
Giang gây tỷ lệ chết cao nhất có thể lên đến 100% (Nguyễn Viết Khuê và ctv, 2009).

Cho đến nayở các nướcđã có nhiều công trình nghiên cứu mô tả triệu chứng và
bệnh tích của cá rô phi bị bệnh do Streptococcus agalactiae như nghiên cứu
củaAlHarbi (1996), Evans và ctv (2002), Amal và ctv (2008). Ở Việt Nam,hiện nay
các nghiên cứu về bệnh cá rô phi chưa nhiều, chỉ có vài công trình nghiên cứu
nhưngchủ yếu tập trung vào ký sinh trùng và chưa có hoặc có rất ít nghiên cứu về tác
nhân virus hay vi khuẩn gây bệnh trên cá rô phi. Những công trình nghiên cứu bệnh do
Streptococcus agalactiaetrên cá rô phi tại Việt Nam đã được báo cáonhư nghiên cứu
về ký sinh trùng trên một số dòng cá rô phi vằn ở Bắc Ninh và Quảng Bình (Bùi
Quang Tề và ctv, 1999; trích bởi Nguyễn Tri Cơ, 2004). Ký sinh trùng ở những giai
đoạn khác nhau trên ba dòng cá rô phi nuôi (Oreochromis niloticus) như dòng Thái,
dòng Việt và dòng GIFT (Genetically improved farmed Tilapia) tại miền Bắc Việt
3


Nam (Bùi Quang Tề và Đặng Thị Lụa, 1999; trích bởi Nguyễn Tri Cơ, 2004). Tuy
nhiên, việc mô tả đặc điểm của bệnh cũng như phân loại định danh vi khuẩn này trên
cá rô phi chỉ dừng ở mức sơ lược.
2.2 Vi khuẩn Streptococcus agalactiae
2.2.1 Phân loại
Lớp: Bacilli
Bộ: Lactobacillales
Họ: Streptococcaceae
Giống: Streptococcus (Rosenbach, 1884)
Loài: Streptococcus agalactiae (Lehmann và Neumann, 1896)
2.2.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hoá
Vi khuẩn Streptococcussp. có dạng hình cầu hoặc hình ovan, có thểđứng riêng lẻ,
thành từng đôi hay tạo thành chuỗi dài từ 3 – 5 tế bào đến 10 – 15 tế bào, đường kính
nhỏ hơn 2 μm. Đây là vi khuẩn gram dương, hiếu khí hoặc yếm khí tùy nghi, không di
động, oxydase (-), catalase (-), không sinh bào tử.Vi khuẩn Streptococcussp. lên men
trong môi trường glucose, nhu cầu dinh dưỡng cần thiết cho sự phát triển khá cao

(Theo Bùi Quang Tề,2006).

Hình 2.1 Vi khuẩn Streptococcus agalactiae
(Nguồn: />Vi khuẩn Streptococcus sp. phát triển tốt trên môi trường TSA (Trypticase Soya
Agar) có thêm 0,5% glucose, môi trường BHIA (Brain Heart Infusion Agar), môi
trường THBA (Todd Hewitt Broth Agar) và môi trường thạch máu cừu, máu
4


ngựa(Horse blood agar)... Khi nuôi cấy trên môi trường thạch vi khuẩn có dạng chuỗi
ngắn (5 - 7 tế bào), trên môi trường canh có dạng chuỗi dài.
Kết quả một số phản ứng sinh hóa của vi khuẩn S. agalactiae:
Bảng 2.1 Các đặc điểm sinh hóa của S. agalactiae phân lập bởi nhiều tác giả
(Duremdez và ctv,2004)

Test

Dung huyết β
Duremdez và
ctv
(2004)
-/β
+
+
+
+
+
-

Không dung huyết

Eldar Baya Wikinson Robinson
và ctv và ctv
và ctv
và Meyer
(1994) (1990)
(1973)
(1966)
+/+
-/-/c
γ
γ
γ
γ
+
c
c
+
+
c
c
c
+
c
c
c
c
c
c
c
c

c
c
c
c
c
c
c
c
+
c
c
c
+
c
c
c
+
+
c
c
c
c

OF test
Haemolysis
Catalase
Oxidase
Acetoin production
Hippurate
Esculin

Tinh bột
Pyrrolidonylarylamidase
α-Galactosidase
β-Glucorinase
β-Galactosidase
Alkaline phosphatase
Leucine arylamidase
Arginine dihydrolase
Mannitol
Phát triển ở:
10o C
-(15oC)
c
c
o
o
37 C
+
+(30 C)
c
c
o
45 C
-(40oC)
c
Phát triển ở pH 9,6
+
c
c
c

Phát triển trong môi trường có chứa:
4,0% NaCl
+
c
c
+
6,5% NaCl
-(6,0%)
10% dịch mật
c
c
40% dịch mật
c
Ghi chú: (+): Dương tính; (-): Âm tính; β: Dung huyết β; γ: Không dung huyết; c:
Chưa được báo cáo.
5


Vi khuẩn không phát triển ở điều kiện nhiệt độ 10oC và 45oC (Buller, 2004). Nhiệt
độ nuôi cấy thích hợp từ 28 - 300C, sau 24 - 48 giờ nuôi cấy, vi khuẩn tạo khuẩn lạc
nhỏ (0,5 - 0,7 mm) màu trắng đục, hình tròn hơi lồi, ngoại lệ có một số chủng tạo
khuẩn lạc màu trắng trong, có tính nhầy sau 24 giờ nuôi cấy. Lớp chất nhầy đó là
mucopolysaccharide do chủng này tiết ra và thể hiện độc lực của nó, tức là lớp nhầy
càng dày thì độc lực của vi khuẩn càng cao (Nguyễn Hữu Thịnh, 2010).
Bảng 2.2 Các đặc điểm sinh hóa thông thường của S. agalactiaetừ một số tác giả (Ali
và ctv, 2010)
Ali và ctv

Duremdez và


Salvador và

Yuasa và

(2010)

ctv (2004)

ctv (2005)

ctv(2008)

Malaysia

Kuwait

Brazil

Thái Lan

+, hình cầu

+, hình cầu

+, hình cầu

+, hình cầu

Hemolysis


β

β

γ

β

Catalase

-

-

-

-

Oxidase

-

-

-

-

Esculin


-

-

-

-

Sorbitol

-

-

-

-

Lactose

-

-

-

-

Trehalose


+

+

+

+

-

-

-

c

Test

Nhuộm gram

Phát triển trong môi
trường bổ sung 6,5%
NaCl
Ghi chú: (+): Dương tính; (-): Âm tính; β: Dung huyết β; γ: Không dung huyết; c:
Chưa được báo cáo.
Từ bảng kết quả 2.1 và bảng 2.2, tôi nhận thấy rằng bảng kết quả các đặc điểm
sinh hóa của S. agalactiae phân lập của Duremdez và ctv (2004 ), đã đưa ra nhiều
phản ứng sinh hóa và so sánh kết quả nghiên cứu này với nhiều tác giả khác. Tuy
nhiên, theo bảng 2.2, Ali và ctv (2010) tuy đưa ra ít phản ứng sinh hóa nhưng tác giả
đã bổ sung thêm một số phản ứng mà Duremdez và ctv (2004) chưa báo cáo như

nhuộm gram, Sorbitol, Lactose và Trehalose.
6


2.2.3 Triệu chứng, bệnh tích của cá bị bệnh Streptococcus agalactiae
Ali và ctv (2011) đã tiến hành gây bệnh thực nghiệm cho cá giống cá rô phi đỏ
bằng S. agalactiae và kết luận rằng S. agalactiae phân lập từ cá rô phi nhiễm bệnh tự
nhiên có thể gây bệnh lại trên cá giống của cá rô phi đỏ thí nghiệm thông qua phương
pháp tiêm vào xoang bụng và phương pháp ngâm. Dấu hiệu bệnh tích, các biểu hiện
chung và dấu hiệu mô học tương tự như mô tả từ cá bệnh tự nhiên.
2.2.3.1 Triệu chứng
Vi khuẩnStreptococcussp. có khuynh hướng tấn công vào hệ thần kinh trung
ương của cá rô phi nên cá bệnh có triệu chứng chung khá điển hình vớinhững biểu
hiện bất thường như hoạt động bơi lội hỗn loạn và mất định hướng, xoay tròn, cong
thân (uốncong cơ thể hình chữ C).Cá bệnh tập trung thành từng cụm ở nền đáy, thường
giảmăn hay bỏ ăn(Ali và ctv, 2011).
2.2.3.2 Bệnh tích
2.2.3.2.1 Bệnh tích bên ngoài
Một số biểu hiện đặc trưng là mắt đục, lồi một bên, hai bên hoặc có khi mắt xẹp
xuống lõm vào trongvà có thể xuất huyết.Có thể thấy ổ mủ ở hàm dưới, gốc vây, ổ mủ
vỡ ra thành loét.Xuất huyết ở da thường được nhìn thấy ở quanh vùngmiệng cá hoặc ở
các gốc vây.Bệnh nặng, bụng cá trương to, tích dịch xoang bụng. Một số còn biểu hiện
lồi lỗ hậu môn và lỗ sinh dục.
2.2.3.2.2 Bệnh tích bên trong
Vi khuẩn Streptococcussp. nhanh chóng đi đến hệ tuần hoàn và lan tỏa đến tất
cả các cơ quan nội tạng nên bệnh thường gây xuất huyết, hoại tử gan, lách, thận thành
những đốm màu nhạt ở cá rô phi (Bùi Quang Tề, 2006). Theo Ali và ctv (2011), cá rô
phi bệnh có gan sưng, thận và lách có hiện tượng sung huyếtđôi khi mềm nhũn, bóng
hơi phình to, não mềm, tắc mạch máu. Đôi khi cá trướng bụng, dạ dày và ruột trống
rỗng hoặc tích dịch xoang bụnghơi vàng(Springer, 2007).Mộtsố trường hợpviêm phúc

mạc nên viêm dính nội quan với nhau và viêm dính thành bụng, có hiện tượng xuất
huyết não(Nguyễn Hữu Thịnh, 2010).
2.2.4 Dịch tễ của bệnh
Dịch bệnh nguy hiểm thường xảy ra ở cá rô phi (Oreochromis sp.)nuôi thâm
canh,cao nhất vào mùa khô (tháng 1 – 4) và kéo dài đến các tháng trong mùa mưa (từ
7


tháng 7 – 10).Cá cỡ lớn (trên 100 g) mẫn cảm với bệnh hơn cá cỡ nhỏ(Đinh Thị Thủy
và ctv, 2005; trích bởi Nguyễn Thị Phước Thắm, 2009).Bệnh xảy ra do cá bị stress
trong thời gian dài nguyên nhân chủ yếu là nhiệt độ nước tăng cao(30,5 – 32oC), DO
thấp dướimức 3 mg/L, mật độ nuôi dày, cho ăn dư thừacũng góp phần làm tăng các
mối nguy liên quan đến bệnh. Bệnh lây lan theo chiều ngang từcá thể này sang cá thể
khác, từ cá chết hoặc bệnh sang cá khoẻ(cá khoẻ ăn cá bệnh, ăn thịt lẫn nhau, do vết
thương trên da...) và từ môi trường nước vào cá.
Bệnh ở giai đoạn cấp tính thường xảy ra vào mùa nóng khi nhiệt độ nước cao
và tỷ lệ chết có thể trên 50 % trong khoảng từ 2 – 3 tuần. Bệnh mãn tính khi nhiệt độ,
tỷ lệ chết thấp hơn và chết kéo dài trong nhiều tuần, cá chết rải rác(Nguyễn Hữu
Thịnh, 2010 ).
2.2.5 Chẩn đoán bệnh
Chẩn đoán sơ bộ tại ao nuôi:dựa vào triệu chứng bệnh tích, xem xét mức độ cá
chết, cỡ cá, loài, thời gian xảy ra dịch bệnh. Kiểm tra 5 - 10 cá bệnh, xem xét các dấu
hiệu bệnh lý bên ngoài và bên trong cơ thể cá.Để chẩn đoán bệnh chính xác, tiến hành
phết kính mẫu gan, thận, lách, não, soi tươi, nhuộm gram quan sát dưới kính hiển vi.
Ở phòng thí nghiệm: phân lập vi khuẩn từ các nội quan lách, thận, não, gan cá
bệnh. Sử dụng môi trường thạch máu (Blood agar) kiểm tra khả năng dung huyết của
vi khuẩn.Môi trường BHIAlà môi trường giàu dinh dưỡng nên vi khuẩn có thể phát
triển tốt và có dạng chuỗi dài, môi trường THBA(Todd Hewitt Broth Agar), môi
trườngTSAđể xem hình dạng khuẩn lạc. Nuôi cấy vi khuẩn ở 30oC, sau 24 – 48 giờ
hình thành khuẩn lạc nhỏ trên môi trường, đường kính 0,5 – 1,0 mm, màu trắng sữa,

hình tròn, lồi, trơn nhẵn (Bùi Quang Tề, 2006).Định danh bằng các phản ứng sinh hóa,
có thể sử dụng phương pháp cổ điển hoặc sử dụng các Kit phản ứng sinh hóa (Kit API
20 Strep).
2.2.6 Phương pháp phòng trị bệnh
Quản lý tốt là điều cần thiết để đi đến thành công trong nghề nuôi trồng thủy
sản.Cá chết hoặc cá bệnh, cá lờ đờ là nguồn lây lan mầm bệnh, do đó cần phải loại bỏ
ra khỏi ao, lồng nuôi, giảm cho ăn, tránh cho ăn dư thừa, giảm mật độ nuôi, vệ sinh bể
nuôi thường xuyên, vớt cá bệnh, cá chết ra khỏi ao. Tránh đến mức tối đa chuyển đàn,
chia đàn, phân cỡ cá trong thời gian dịch bệnh thường xảy ra.Đây là những nhân tố
8


tạo điều kiện thuận lợi để mầm bệnh phát triển. Vì vậy, ta cần nâng cao sức đề kháng
của cá nuôi bằng cách bổ sung vitamin C vào thức ăn trong mùa bệnh.
Điều trị bệnh ở cá rô phi do vi khuẩn Streptococcussp. gây ra bằng kháng sinh
như erythromycin liều 25 – 50 mg/kg cá/ngày cho ăn 4 – 7 ngày(Nguồn:
). Kháng sinh chỉ có thể điều trị bệnh ở giai đoạn sớm của
bệnh. Tuy nhiên, trong hầu hết các trường hợp cho cá ăn kháng sinh không hiệu quả
bởi cá bị nhiễm bệnh sẽ chán ăn, giảm ăn. Việc sử dụng kháng sinh cần được chú ý vì
sử dụng kháng sinh liên tục với liều lượng cao dần sẽ gây ra hiện tượng kháng thuốc
của vi khuẩn và ảnh hưởng đến dư lượng kháng sinh tồn dư trong thịt cá.
Hiện nay tại Việt Namchưa có vaccine thương mại có hiệu quả để phòng bệnh
do vi khuẩn Streptococcusagalactiaegây ra. Tuy nhiên, trong tương lai gần thì việc
phòng bệnh bằng vaccine sẽ là phương án tối ưu làm giảm thiệt hại về kinh tế do bệnh
gây ra.

9


Chương 3

VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Thời Gian Và Địa Điểm Nghiên Cứu
Thời gian thực hiện: từ tháng 04/2012 đến tháng 05/2012.
Địa điểm thu mẫu cá bệnh ở các bè nuôi tại:
Xã Hiệp Hòa, Phường Thống Nhất, TP Biên Hòa, Tỉnh Đồng Nai.
Xã Tịnh Thới, Huyện Cao Lãnh, Tỉnh Đồng Tháp.
Xã Mỹ Hiệp, TP Long Xuyên, Tỉnh An Giang.
Địa điểm phân tích mẫu: phòng bệnh học Khoa Thủy Sản trường Đại học Nông
Lâm TP. Hồ Chí Minh.
3.2 Vật Liệu Nghiên Cứu
3.2.1 Dụng cụ
Đĩa petri, đèn cồn, que cấy thẳng, que cấy vòng, ống nghiệm, lame, lamelle,
pipette, micropipette, đầu tuýp, ống đong, cốc thủy tinh, bình tam giác, giấy bạc, bình
xịt cồn, bông thấm nước có tẩm cồn, bông không thấm nước và bộ dụng cụ giải phẫu
(bao gồm dao mổ, kéo, kẹp).
Tủ sấy, tủ hấp, tủ ủ, kính hiển vi, máy vortex, máy lắc, cân điện tử, găng tay, tủ
lạnh.
3.2.2 Hóa chất và môi trường
3.2.2.1Hóa chất
Hóa chất dùng nhuộm gram: thuốc nhuộm tím crystal violet, dung dịch lugol,
cồn 950 và safranin.
Hóa chất thử phản ứng catalase: H2O2, dung dịch đệm phosphate pH 7,4.
Hóa chất thử phản ứng oxidase: đĩa giấy có tẩm hóa chất N,N,N,N –
tetramethyl – 1,4 – p – phenylenediamine dihydrochlorid 1%, ascorbic acid 0,2%.
Nước cất, dầu soi kính, nước muối sinh lý tiệt trùng, cồn 70o.
10


Hóa chất dùng định danh API 20 Strep: API suspension medium 2ml, NIN,
VP1, VP2, ZYMA, ZYMB, dầu khoáng.

3.2.2.2 Môi trường
Môi trường Brain heart infusion agar (BHIA) dùng để nuôi cấy vi khuẩn.
Môi trường O - F test dùng để kiểm tra khả năng sử dụng glucose của vi khuẩn
trong điều kiện có oxy và không có oxy.
Môi trường thạch máu cừu Sheep Blood Agar (SBA) 5% máu cừu, dùng để
kiểm tra khả năng dung huyết của vi khuẩn.
3.3 Phương Pháp Nghiên Cứu
3.3.1Phương pháp thu mẫu cá bệnh
Chọn ngẫu nhiên 3 hộ nuôi cá rô phi đỏ lồng bè xã Hiệp Hòa, TP Biên Hòa,
tỉnh Đồng Nai, 2 hộ ởxã Mỹ Hiệp, TP Long Xuyên, tỉnh An Giang và 2 hộ ở xã Tịnh
Thới, huyện Cao Lãnh, tỉnh Đồng Tháp để thu thập mẫu cá bệnh còn sống với số
lượng mỗi hộ nuôi từ 1 - 20 mẫu.Kiểm tra ngay khi vớt cá ra khỏi mặt nước. Quan sát
và ghi nhận lại những triệu chứng bệnh tích bên ngoài và bên trong cơ thể cá bệnh.
Thực tế, trong 3 đợt thu mẫu bệnh, đã thu được 55 mẫu cá bệnh bao gồm 23 mẫu cá
tại Đồng Nai, 12 mẫu cá tại An Giang và 20 mẫu cá tại Đồng Tháp.
3.3.2 Phương pháp chung
Tiến hành phân lập và định danh vi khuẩn có trong các mẫu gan, thận, lách và
não của cá rô phi đỏ tại nơi dịch bệnh đang xảy ra.
Sơ đồ phương pháp chung:

11


Mẫu cá

Mổ khám

Ghi nhận bệnh tích

Lấy mẫu vi khuẩn (Gan, thận, lách, não)


Cấy lên môi trường BHIA

Nuôi cấy 300C, 24 giờ
Khuẩn lạc đặc trưng
Cấy thuần trên BHIA
Nuôi cấy 300C, 24 giờ

Định danh API 20 Strep
Phản ứng sinh hóa

Nhuộm gram

Kết luận

Hình 3.1 Phương pháp nghiên cứu chung
3.3.3 Phương pháp giải phẫu cá
Đặt cá lên khay mổ, đánh vẩy tại những vùng da cần giải phẫu. Dùng cồn 700sát
trùng mặt ngoài cơ thể cá tại những vị trí giải phẫu để tránh sự nhiễm tạp các vi khuẩn
bên ngoài.Dụng cụ giải phẫu phải được vô trùng trước và sau khi tiến hành thao tác
trên từng cơ quan.
12


Mổ xoang bụng cá bằng 3 đường cắt:
Đường thứ nhất: Bắt đầu từ trước hậu môn, theo đường giữa thành bụng đến
trước nắp mang.
Đường thứ hai: Bắt đầu từ trước hậu môn chạy lên phía trên, dọc theo thành
ngực trái đến nắp mang.
Đường thứ ba: Nối đường thứ nhất và đường thứ hai bằng một đường cắt

ngang.

Hình 3.2 Ba đường cắt mổ xoang bụng
Mổ sọ não: Sát trùng vùng da xung quanh vùng sọ não cá, sau đó cắt 4 đường
cắt nối lại với nhau.

Hình 3.3 Bốn đường cắt mổ sọ não cá
13


3.3.4 Phương pháp cấy phân lập vi khuẩn
Tách lấy gan, thận, lách đặt lên một miếng bông gòn đã tẩm cồn 700, sau đó sát
trùng mặt ngoài của cơ quan này.
Dùng kéo cắt ngang cơ quan này và chấm lên đĩa thạch.
Dùng que cấy vòng ria 3 - 4 lần trên mặt thạch BHIA ở một góc. Quay đĩa
thạch sang hướng khác và cấy ria từ 1 vạch thành 3 - 4 đường sao cho đường cấy sau
không trùng lên đường cấy trước. Lặp lại theo hướng tiếp theo mục đích là pha loãng
mật độ vi khuẩn đính trên đầu que cấy. Ủ các đĩa ở 30oC, 24 giờ (Nguyễn Hữu Thịnh,
Lưu Thị Thanh Trúc,2009).
3.3.5 Phương pháp cấy thuần
Mục đích của việc cấy thuần là để định danh vi khuẩn đã phân lập. Chọn những
khuẩn lạc đặc trưng, riêng lẻ từ các đĩa phân lập và tiến hành cấy ria vào một đĩa
BHIA khác. Đặt các đĩa thạch đã cấy vào tủ ủ ở 300C, 24 giờ. Tiến hành tiếp tục ít
nhất hai lần đến khi ta quan sát thấy không có khuẩn lạc khác biệt (hình dạng, kích cỡ,
màu sắc).
3.3.6 Phương pháp định danh vi khuẩn
3.3.6.1 Định danh sơ bộ
3.3.6.1.1 Phương pháp soi tươi vi khuẩn
Nhỏ một giọt nước muối sinh lý vô trùng lên lame. Từ đĩa thạch đã được làm
thuần, dùng que cấy khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn, lấy khuẩn lạc rời có hình dạng

đặc trưng và làm huyền phù vi khuẩn vào giọt nước trên lame, đặt lamelle lên và quan
sát hình thái vi khuẩn dưới kính hiển vi ở vật kính dầu có độ phóng đại 1000 lần.
3.3.6.1.2 Nhuộm gram
Từ đĩa thạch cấy vi khuẩn đã được làm thuần, chọn những khuẩn lạc rờicó thời
gian ủ 24 giờ tiến hành nhuộm gram.
• Các bước tiến hành nhuộm gram:
Nhỏ một giọt nước muối sinh lý vô trùng lên lame.
Dùng que cấy vòng khử trùng để nguội, chọn lấy khuẩn lạc riêng lẻ và làm
huyền phù vi khuẩn vào giọt nước trên lame.
Để khô tự nhiên trong không khí.
14


Sau khi vết bôi đã khô, ta cố định mẫu bằng cách hơ thật nhanh mẫu qua ngọn
lửa đèn cồn 3 - 4 lần.
Nhỏ crystal violet lên vết bôi trong 30 giây.
Đổ bỏ crystal violet, rửa với nước cất.
Cho dung dịch lugol cố định màu crystal violet trong 1 phút.
Đổ bỏ lugol, rửa với nước cất.
Nghiêng lame, nhỏ dung dịch tẩy (cồn 950) đến khi mất màu hoàn toàn, rửa lại
bằng nước.
Cho dung dịch safranin lên vết bôi trong 60 – 80 giây.
Đổ bỏ dung dịch, rửa nước để khô lame.
Quan sát trên kính hiển vi.
● Quan sát trên kính hiển vi
Vi khuẩn bắt màu tím đỏ là vi khuẩn G+.
Vi khuẩn bắt màu hồng là vi khuẩn G-.
3.3.6.1.3 Thử nghiệm Catalase
Nhằm xác định sự có mặt của enzyme catalase của một số vi khuẩn hô hấp kỵ
khí tùy ý.

● Phương pháp tiến hành:
Nhỏ 1 giọt thuốc thử catalase lên lame.
Lấy khuẩn lạc cần thử nghiệm từ môi trường nuôi cấy bằng pipet Pasteur, hoặc
que cấy platin.
Trộn đều khuẩn lạc với thuốc thử.
●Đọc kết quả:
Kết quả được đọc ngay sau 1 – 2 giây.
Phản ứng dương tính: Xuất hiện bọt khí.
Phản ứng âm tính: Không có bọt khí.
3.3.6.1.4 Thử nghiệm Oxidase
Thử nghiệm này nhằm xác định sự hiện diện của enzyme oxidase.
● Phương pháp tiến hành:
Đặt đĩa giấy tẩm hóa chất lên lame sạch.
Làm ẩm đĩa giấy bằng nước muối sinh lý tiệt trùng, không làm quá ướt.
15