TRƯỜNG ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

======

NGUYỄN THỊ HƯỜNG

ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN VÀ NHÂN GIỐNG
TRÀ HOA VÀNG TAM ĐẢO (Camellia tamdaoensis Ninh et Hakoda)
BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY IN VITRO

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Hà Nội - 2017


TRƯỜNG ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

======

NGUYỄN THỊ HƯỜNG

ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN VÀ NHÂN GIỐNG
TRÀ HOA VÀNG TAM ĐẢO (Camellia tamdaoensis Ninh et Hakoda)
BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY IN VITRO

Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã ngành: 60420114

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
Người hướng dẫn: TS. Nguyễn Văn Việt

Hà Nội - 2017


i

LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi dưới sự hướng dẫn khoa
học của TS. Nguyễn Văn Việt. Các nội dung nghiên cứu, kết quả nghiên cứu trong đề
tài này là trung thực và chưa từng được ai công bố dưới bất kỳ hình thức nào.
Luận văn cũng sử dụng thông tin, số liệu từ các bài báo và nguồn tài liệu của
tác giả khác đều có trích dẫn và chú thích nguồn gốc đầy đủ.
Nếu có bất kỳ sự gian lận nào tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về nội dung
luận văn.
Học viên

Nguyễn Thị Hường


ii

LỜI CÁM ƠN

Tôi xin gửi lời cám ơn chân thành tới Phòng Đào tạo, Viện Sinh thái và Tài
nguyên sinh vật, Viện Hàm lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã trang bị kiến
thức cho tôi trong xuất quá trình học tập.
Đặc biệt tôi xin gửi lời cám ơn chân thành tới TS. Nguyễn Văn Việt, Viện Công

nghệ sinh học Lâm nghiệp, Trường Đại học Lâm nghiệp Việt Nam đã tận tình chỉ bảo
và hướng dẫn tôi trong xuất quá trình nghiên cứu đề tài và hoàn chỉnh Luận văn Thạc
sỹ này.
Tôi xin cám ơn các cán bộ Bộ môn Công nghệ tế bào và toàn thể cán bộ Viện
Công nghệ sinh học Lâm nghiệp, Trường Đại học Lâm nghiệp đã tạo điều kiện cho tôi
hoàn thành tốt đề tài nghiên cứu này. Xin cám ơn Ban quản lý Vườn quốc gia Tam
Đảo đã cho phép thu thập mẫu vật làm nguồn vật liệu cho đề tài.
Cuối cùng, tôi xin chân thành cám ơn gia đình, bạn bè và đông nghiệp đã luôn
sát cánh hỗ trợ và động viên tôi về cả vật chất và tinh thần trong xuất quá trình học tập
và nghiên cứu.
Xin chân thành cám ơn !

Hà nội, ngày

tháng

năm

Học viên

Nguyễn Thị Hường


iii

MỤC LỤC
LỜI CAM ĐOAN ............................................................................................................ i
LỜI CÁM ƠN ................................................................................................................. ii
MỤC LỤC ..................................................................................................................... iii
DANH MỤC CÁC HÌNH ...............................................................................................v

DANH MỤC CÁC BẢNG ............................................................................................ vi
ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................................1
CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU .................................................3
1.1.Giới thiệu về Trà hoa vàng Tam Đảo.....................................................................3
1.1.1.Hệ thống phân loại và phân bố ........................................................................3
1.1.2.Đặc điểm sinh học Trà hoa vàng Tam Đảo .....................................................3
1.1.3.Giá trị sử dụng cây trà hoa vàng ......................................................................4
1.2.Phân tích di truyền bằng kỹ thật RAPD–PCR .......................................................6
1.2.1.Kỹ thuật chỉ thị phân tử trong cải tiến di truyền Camellia ...............................6
1.2.2.Kỹ thật RAPD ..................................................................................................7
1.2.3.Vị trí và tầm quan trọng của đa dạng di truyền .............................................10
1.3.Cơ sở khoa học nuôi cấy mô tế bào thực vật .......................................................11
1.3.1.Khái niệm nuôi cấy in vitro ...........................................................................11
1.3.2.Cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô tế bào ......................................12
1.3.3.Ý nghĩa của nhân giống in vitro ....................................................................12
1.3.4.Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy...............................................................14
1.4.Các công trình nghiên cứu về chi Camellia .........................................................20
1.4.1.Các công trình nghiên cứu về chi Camellia trên thế giới ..............................20
1.4.2.Các công trình nghiên cứu về chi Camellia ở Việt Nam ...............................22
CHƯƠNG 2: MỤC TIÊU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..........26
2.1.Mục tiêu nghiên cứu.............................................................................................26
2.2.Đối tượng nghiên cứu ..........................................................................................26
2.3.Địa điểm và thời gian nghiên cứu ........................................................................27
2.4.Nội dung nghiên cứu ............................................................................................27
2.4.1.Phân tích đa hình ADN loài Trà hoa vàng Tam Đảo bằng kỹ thuật RAPD ..27


iv

2.4.2.Xây dựng quy trình nhân giống trà hoa vàng bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro

................................................................................................................................27
2.5.Phương pháp nghiên cứu......................................................................................28
2.5.1.Phân tích đa hình ADN loài Trà hoa vàng Tam Đảo.....................................28
2.5.2.Xây dựng quy trình nhân giống Trà hoa vàng Tam Đảo .................................31
2.6.Phương pháp đánh giá kết quả và xử lý số liệu ...................................................33
2.6.1.Chỉ tiêu theo dõi.............................................................................................33
2.6.2.Phương pháp xử lý số liệu ....................................................................................34
CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................................35
3.1.Kết quả phân tích đa hình ADN loài Trà hoa vàng Tam đảo ..............................35
3.1.1.Tách chiết ADN tổng số ................................................................................35
3.1.2.Khuếch đại PCR với 15 mồi RAPD ..............................................................36
3.1.3.Tương quan di truyền của 10 hệ gen nghiên cứu ..........................................37
3.2.Kết quả nhân giống in vitro Trà hoa vàng ...........................................................40
3.2.1.Kết quả khử trùng tạo mẫu sạch và tái sinhh chồi .........................................40
3.2.2.Kết quả tạo cụm chồi và nhân nhanh chồi .....................................................44
3.2.3.Nghiên cứu ra rễ tạo cây hoàn chỉnh. ............................................................53
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ................................................................56
4.1. Kết luận ...............................................................................................................56
4.1.1. Kết quả phân tích đa hình ADN bằng kỹ thuật RAPD .................................56
4.1.2. Kết quả nhân giống Trà hoa vàng Tam Đảo bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro
................................................................................................................................56
4.2. Kiến nghị .............................................................................................................57
TÀI LIỆU THAM KHẢO


v

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.1. Cây Trà hoa vàng Tam Đảo.............................................................................3

Hình 3.1. Kết quả điện di ADN tổng số trên gel agarose 1% .......................................35
Hình 3.2. Điện di đồ sản phẩm khuyếch đại từ mồi CP1 và mồi CP9 trên gel agarose
1,2% ...............................................................................................................................37
Hình 3.3. Biểu đồ mô tả quan hệ di truyền của 10 mẫu trà hoa vàng. ..........................39
Hình 3.4. Biểu đồ ảnh hưởng của thời gian khử trùng đến tỷ lệ tạo mẫu sạch và tái sinh
chồi ................................................................................................................................41
Hình 3.5. Một số hình ảnh tái sinh trà hoa vàng từ phôi hạt .........................................42
Hình 3.6. Hạt chè nảy mầm trên môi trường WPM ......................................................43
Hình 3.7. Chồi Trà hoa vàng Tam Đảo tái sinh trên môi trường WPM ........................46
Hình 3.8. Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng nhân nhanh chồi in vitro .........48
Hình 3.9. Ảnh hưởng của loại và hàm lượng đường đến nuôi cấy in vitro Trà hoa vàng ...50
Hình 3.10. Cụm chồi trà hoa vàng phát triển trên môi trường MT7 ..............................52
Hình 3.11. Biểu đồ ảnh hưởng tổ hợp nồng độ IBA và NAA đến khả năng ra rễ in
vitro ................................................................................................................................54
Hình 3.12. Ảnh hưởng của nồng độ IBA và NAA đến khả năng ra rễ in vitro.............55


vi

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 2.1. Trình tự các cặp mồi sử dụng ........................................................................26
Bảng 2.2. Thành phần phản ứng dùng cho mỗi phản ứng RAPD - PCR ......................29
Bảng 2.3. Chương trình chạy của phản ứng PCR .........................................................30
Bảng 3.1. Nồng độ và độ tinh sạch các mẫu ADN tổng số (pha loãng 10 lần) .............36
Bảng 3.2. Phân đoạn RAPD đa hình thu được từ 15 mồi RAPD ..................................36
Bảng 3.3. Hệ số tương đồng di truyền Jaccard ..............................................................38
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của thời gian khử trùng đến tỷ lệ tạo mẫu sạch và tái sinh chồi .......40
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của điều kiện khử trùng tới khả năng nảy mầm .........................43
Bảng 3.6. Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng nhân nhanh chồi............44

Bảng 3.7. Ảnh hưởng của nồng độ BAP đến khả năng nhân nhanh chồi .....................47
Bảng 3.8. Ảnh hưởng của loại và hàm lượng đường đến khả năng nhân nhanh chồi..49
Bảng 3.9. Ảnh hưởng của nồng độ BAP và kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi ....51
Bảng 3.10. Ảnh hưởng tổ hợp nồng độ IBA và NAA đến khả năng ra rễ in vitro .......53


vii

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Tên viết tắt

Tên đầy đủ

Dịch nghĩa

AFLP

Amplified fragment length polymorphism

CTAB

Hexadecyltrimethylammonium bromide

DNA

Deoxyribonucleic acid

EBA

Extraction Bufer A


Đệm chiết A

EBB

Extraction Bufer B

Đệm chiết B

EDTA

Ethylenediaminetetraacetic acid

EST

Expressed Sequence Tag

PCR

Polymerase Chain Reaction

BAP

6- Benzylaminopurin

IBA

Indol- 3- acetic acid

RAPD


Random amplification polymorphism DNA

RFLP

Retriction fragment length polymorphism

α- NAA
WPM
MS
VQG

ADN

α- Naphthyacetic acid
Woody Plant Medium- Lloyd G, Mc CownB,
1980
Murashige và Skoog, 1962
Vườn quốc gia


1

ĐẶT VẤN ĐỀ
Trà hoa vàng Tam Đảo (Camellia tamdaoensis Ninh et Hakoda) là một loài thực
vật hạt kín thuộc họ Chè (Theaceae) được phát hiện và công bố vào năm 2007, là loài
trà đặc hữu ở Vườn Quốc gia Tam Đảo, Vĩnh Phúc và là một trong hơn 30 loài trà hoa
vàng đã được phát hiện và công bố trên thế giới. Theo thống kê cho đến nay, có
khoảng 28 loài được tìm thấy ở Trung Quốc và hơn 24 loài trà hoa vàng được tìm thấy
ở Việt Nam 45. Trà hoa vàng được biết đến là loại cây dược liệu có giá trị cao.

Thành phần các chất trong trà hoa vàng có tác dụng phòng chống ung thư, củng cố tính
đàn hồi của thành mạch và điều hòa huyết áp... Ngoài ra, các loài trà hoa vàng nói
riêng và chi Camellia nói chung có hoa to, màu sắc rực rỡ và lạ mắt, thường ra hoa vào
dịp Tết Nguyên đán nên thu hút được sự quan tâm của các nhà chơi cây cảnh.
Với các giá trị lớn cả về mặt khoa học và kinh tế, việc đánh giá, bảo tồn và quản
lý nguồn gen và công tác nghiên cứu đa dạng di truyền các loài trà hoa vàng trở nên vô
cùng quan trọng. Ngày nay, bên cạnh phương pháp truyền thống sử dụng chỉ thị hình
thái, chỉ thị phân tử ADN được đánh giá là phương pháp hữu hiệu trong việc nghiên
cứu, xác định mối quan hệ di truyền của các cá thể trong cùng một loài hoặc giữa các
loài, là cơ sở cho việc phân loại dưới loài, phát hiện loài mới và mối quan hệ tiến hóa
giữa các loài [31]. Trong số các chỉ thị phân tử đánh giá đa dạng di truyền, kỹ thuật
RAPD (Randomly amplified polymorphic DNA) được sử dụng khá rộng rãi bởi kỹ
thuật này đơn giản, có độ tin cậy và chính xác cao thường được sử dụng trong các
nghiên cứu sâu ở mức độ phân tử đối với tất cả các đối tượng thực vật. Ứng dụng kỹ
thuật RAPD trong công tác nghiên cứu đa dạng di truyền quần thể loài Trà hoa vàng
Tam Đảo để chọn ra được những cá thể có tính đa hình ADN cao phục vụ một số công
tác nghiên cứu khác.
Những năm gần đây, do khai thác không hợp lý nên trữ lượng các loài trà hoa
vàng ở Vườn quốc gia Tam Đảo đang suy giảm nghiêm trọng, đặc biệt là loài Trà hoa
vàng Tam Đảo. Nhằm bảo vệ, lưu trữ và phát triển nguồn gen các loài trà hoa vàng
phục vụ cho công tác nghiên cứu, khai thác và sử dụng bền vững trong tương lai, việc
lựa chọn ra một phương pháp nhân giống tối ưu các loài trà hoa vàng trở nên vô cùng


2

cấp thiết. Trong số các phương pháp nhân giống hiện nay, phương pháp nhân giống in
vitro có ý nghĩa rất lớn với các ưu điểm nổi bật: có thể nhân số lượng cây lớn trên quy
mô công nghiệp, sản phẩm sạch bệnh và có tính đồng nhất về hệ số di truyền cũng như
hệ số nhân giống 15.

Xuất phát từ nhu cầu thực tiễn nêu trên, chúng tôi thực hiện đề tài: Đánh giá đa
dạng di truyền và nhân giống Trà hoa vàng Tam Đảo (Camellia tamdaoensis Ninh
et Hakoda) bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro.


3

1.
1.1.

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU

Giới thiệu về Trà hoa vàng Tam Đảo

1.1.1. Hệ thống phân loại và phân bố
Hệ thống phân loại
Giới

: Plantae

Bộ

: Ericales

Họ

: Theaceae

Chi


: Camellia

Loài

: C. Tamdaoensis

Tên khoa học: Camellia tamdaoensis
Ninh et Hakoda

Hình 1.1. Cây Trà hoa vàng Tam Đảo
( />
Trà hoa vàng Tam Đảo có tên khoa học là C. tamdaoesis Ninh et Hakoda là một
loại thực vật hạt kín thuộc họ Chè (Theacea), là loài đặc hữu của Vườn Quốc gia Tam
Đảo, phân bố ở sườn dốc phía Tây Nam dãy núi Tam Đảo, ở độ cao 200 - 600m. Họ
Chè chưa thống nhất với nhau về số lượng chi loài, theo L. Watson và M.J. Dallwitz
liệt kê khoảng 18 chi với 500 loài. Phần lớn các chi có nguồn gốc từ miền Đông Châu
Á, từ Malaysia về phía bắc tới Nhật Bản, với một vài chi có ở Nam và Trung Mỹ. Hai
chi Franklinia và Gordonia cũng có các loài có nguồn gốc Đông Nam Hoa Kỳ 45 .
1.1.2. Đặc điểm sinh học Trà hoa vàng Tam Đảo
Cây Trà hoa vàng Tam Đảo là thân gỗ nhỏ hay cây bụi, nhánh, không lông, cao 2
- 4m, mọc rải rác trong rừng. Thân tròn, thẳng, có màu trắng nhạt, cành non và ngọn
có màu nâu đỏ. Lá có cuống, hình trái xoan dài, đầu lá nhọn, lá dài 9,5 - 14,5 cm, rộng


4

3,5 - 5,0 cm, lá đơn mọc cách không có lá kèm, lá non màu nâu đỏ và mọc chúc xuống
rất đặc trưng. Hệ gân lá nổi cả 2 mặt, có 8 - 9 đôi, gân phụ hợp mép, phiến lá dày,
cứng và dài, mép lá có răng cưa.
Hoa mọc độc trên cuống dài 7 - 10 mm, lá bắc 5, lá đài 5, cánh hoa 8 - 10. Nhị

nhiều, bầu nhụy không lông, vòi nhụy 3 - 4, dính nhau một phần. Hoa nở lâu tàn, có
thể duy trì được 8 - 10 ngày. Mùa hoa từ tháng 10 đến tháng 12. Quả Trà thuộc loại
quả nang có từ 1 - 4 hạt. Quả trà có dạng hình tròn, tam giác, vuông tùy theo số hạt,
đường kính 3 cm. Khi chín, vỏ quả nứt ra. Vỏ trà gồm gồm 6 - 7 lớp tế bào tạo thành
lớp vỏ cứng phía trong là lớp lụa mỏng, màu nâu, nhiều gân, có tác dụng vận chuyển
nước và dinh dưỡng. Nhân trà có 2 là mầm. Lá mầm chiếm 3/4 khối lượng hạt trà, là
nơi dự trữ dinh dưỡng 45.
Trà hoa vàng Tam Đảo là loài rễ hỗn hợp gồm rễ trụ, rễ bên và rễ hấp thụ. Rễ trụ
ăn sâu vào đất. Rễ bên và rễ hấp thụ phân bố từ tầng canh tác [45]. Trà rụng lá hàng
năm vào mùa khô, sinh trưởng nhịp điệu rõ. Mùa ra hoa từ tháng 10 đến 12 hoa nở lâu
tàn có thể từ 8 đến 10 ngày. Trà có thể thích hợp với vùng nhiệt đới nóng ẩm. Nhiệt độ
thích hợp nhất để Trà hoa vàng Tam Đảo sinh trưởng tốt, sản lượng cao là những nơi
có nhiệt độ bình quân trên 200C, độ ẩm không khí 85% - 90% lượng mưa 1000 - 2000
mm, có độ cao 300 - 500 m so với mặt nước biển.
Trà có yêu cầu khá khắt khe đối với đất. Đất thích hợp với sự sinh trưởng và phát
triển của Trà hoa vàng Tam Đảo là đất tơi xốp, nhiều mùn, thoát nước, nhưng đủ ẩm,
hơi chua có pH = 4,5 - 5,5. Trà hoa vàng Tam Đảo là cây ưu sáng mạnh, nên nơi có đồi
gò, trồng thưa, tán cây xòe rộng thì trà ra nhiều hoa và lá trà to. Những nơi khe núi, chân
núi thiếu ánh sáng hoa bé hơn quả cũng kém mặc dù cây có thể mọc tốt [45].
1.1.3. Giá trị sử dụng cây trà hoa vàng
Các loài thuộc chi chè nói chung và các loài thuộc họ trà (chè) nói riêng đã được con
người sử dụng vào nhiều mục đích khác nhau. Dựa trên những công bố chúng ta có thể
xếp thành các nhóm chính sau:


5



Dùng làm đồ uống

Đây là một giá trị đáng kể và phổ biến không chỉ với trà hoa vàng mà còn đối với

các loài thuộc chi Camellia nói chung. Từ những năm trước Công nguyên, người Trung
Quốc đã sử dụng trà như một thứ nước uống và trà được phổ biến ở nhiều nước châu Á
sau đó. Với một số nước như Nhật Bản, Trung Quốc thức uống từ trà đã trở thành một nét
văn hóa đặc trưng. Ở Việt Nam, cây trà cũng được trồng từ khá lâu, hầu như tỉnh nào
cũng có cây trà. Tuy nhiên, phổ biến hiện nay vẫn là các loài trà xanh, trà hoa vàng còn
chưa được biết đến nhiều. Một ưu điểm so với trà xanh thông thường đó là chiết xuất từ lá
trà hoa vàng không chứa caffeine vốn là một chất chiếm tỷ lệ đáng kể ở trà xanh 12.


Dùng làm dầu ăn
Hạt của các loại trà có thể để chưng cất dầu. Ở Trung Quốc và Nhật Bản, dầu ăn

chiết từ hạt trà khá phổ biến. Dầu của hơn 200 loài thuộc chi trà đã được sử dụng làm thực
phẩm và dùng cho các ngành công nghiệp khác. Ngoài ra, một số hợp chất trong lá và quả
trà như acid tanic, oleic acid… là những thành phần quan trọng được sử dụng trong công
nghiệp dược phẩm 12.


Dùng làm thuốc chữa bệnh
Giá trị dược liệu là giá trị đáng quý nhất của cây trà hoa vàng. Ngày nay, các công

trình khoa học đã chỉ ra ngày càng nhiều công dụng của cây trà. Riêng đối với cây trà hoa
vàng, các nghiên cứu đã cho thấy trà hoa vàng có khả năng kiềm chế sự sinh trưởng của
các khối u đến 33,8%, giúp giảm đến 35% hàm lượng cholesterol, 36,1% lượng
lipoprotein trong máu, cao hơn 10% so với các biện pháp sử dụng tây dược hiện nay. Các
chế phẩm từ trà hoa vàng có khả năng làm giảm biểu hiện chứng xơ vữa động mạch, điều
hòa huyết áp. Bên cạnh đó, một số bệnh về đường hô hấp, bài tiết đều có thể sử dụng
thuốc uống này như một phương pháp chữa trị đơn giản và sớm mang lại kết quả 12.

Đất nước Trung Quốc từ lâu đã khai thác tiềm năng to lớn từ giá trị dược liệu của
cây trà hoa vàng. Họ đã xây dựng nên Vườn Camellia Quốc tế, trồng nhân tạo vùng trà
hoa vàng nguyên liệu, nghiên cứu và sản xuất thành công các chế phẩm từ trà hoa vàng
như: Golden Camellia, Superior tea… là những mặt hàng có giá trị và đem lại nguồn lợi
nhuận khổng lồ hàng năm. Việt Nam cũng là một trong số các nước có số trà hoa vàng


6

phong phú bậc nhất thế giới, tuy nhiên việc nghiên cứu ứng dụng và khai thác giá trị dược
liệu của các loài này còn chưa được chú trọng. Công tác bảo tồn chưa được tốt, lượng cá
thể tự nhiên hàng năm suy giảm đáng kể là một thực trạng đáng buồn và đe dọa trực tiếp
đến nguồn gen quý giá này 12.


Dùng làm cây cảnh
Chi trà là chi có hoa lớn, đẹp, nhiều màu sắc, một số loài hoa nở đúng vào dịp Tết

Nguyên đán nên thường được sử dụng để chơi như cây cảnh. Việc lai tạo, phối hợp các
màu hoa cũng thu hút sự chú ý và quan tâm của các nhà lai tạo, làm tăng giá trị của cây trà
lên nhiều lần nếu có thể tạo ra giống trà có màu hoa hiếm và độc 12.
1.2.

Phân tích di truyền bằng kỹ thật RAPD – PCR

1.2.1. Kỹ thuật chỉ thị phân tử trong cải tiến di truyền Camellia
Cải tiến cây trồng được bắt đầu ngay từ khi con người bắt đầu trồng cây. Hiệu
ứng di truyền nút cổ chai được áp dụng ngay trong quá trình thuần hóa sớm và các
hoạt động nhân giống hiện đại dẫn đến các giống cây trồng chỉ mang một phần các
biến đổi hiện tại trong bộ gene 52.

Trà là dị hợp tử cao, việc lai xa cho thấy sự biến đổi liên tục trong các đặc điểm
hình thái, sinh lý và sinh hóa. Các dòng có năng suất và chất lượng cao hơn được tạo
ra trở nên phổ biến thông qua vi nhân giống. Công việc này đã bắt đầu thay thế nhân
giống bằng hạt từ những năm 1960 53. Các dòng là đồng nhất về di truyền cũng như
tương đồng về năng suất và chất lượng. Lựa chọn dòng vô tính là một phương pháp cải
tiến giống cây trà quan trọng được áp dụng rộng rãi bởi sự đa dạng hệ gen trong nguồn
hạt giống hiện có 29. Tuy nhiên, nhược điểm của vi nhân giống là sự thay đổi năng
suất dưới các điều kiện bất lợi và dễ bị tấn công quy mô lớn bởi sâu bệnh hại. Khả
năng thích ứng hoặc kháng cự không được xem xét đầy đủ trong nỗ lực cải thiện giống
vốn có thể được thực hiện cho Camellia. Sự phụ thuộc vào một số lượng hạn chế các
dòng có thể dẫn đến mất mát nguồn tài nguyên di truyền có giá trị và làm tăng rủi ro
tiềm ẩn tự nhiên như sâu bệnh hại.


7

Bởi vậy, đa dạng di truyền là quan trọng cho khả năng tồn tại lâu dài và thích ứng
với những thay đổi của điều kiện môi trường. Việc nghiên cứu đa dạng di truyền quần
thể, hạt giống là cần thiết trước khi thay thế các giống trà có sự tương đồng di truyền.
Các chỉ thị phân tử trong đánh giá đa dạng di truyền, cũng như bản đồ di truyền phân
tử, bản đồ liên kết phân tử là điều cấp thiết cho cải thiện nguồn gene trà. Trong đó,
nghiên cứu đa dạng di truyền là bước đầu tiên quyết làm cơ sở định hướng cho xây
dựng các chương trình bảo tồn thích hợp 27.
Ở Trà, theo Bandyopadhyay et al., 2011 27, các chỉ thị phân tử đã được áp
dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền là RAPD bởi: Wachira et al., 1995, 1997;
Kaundan et al., 2000; Young-Goo et al., 2002; Chen et al., 2002 và Mewan et al.,
2005; chỉ thị ISSR bởi Mondal 2002 và Yao et al., 2005; Chỉ thị AFLP bởi: Paul et al.,
1997; Wachira et al., 2001; Balasaravanan et al., 2003; Mishra et al., 2004 và Sharma
et al., 2009; chỉ thị SSR bởi Freeman et al., 2004; Zhao et al., 2007 và Hung et al.,
2008. Bên cạnh đó các chỉ thị lục lạp như matK, rbcL, trnH-psbA, psbK-psbI bởi:

Katoh et al., 2003 40; Nguyễn Đức Thành, 2015 16; Hà Văn Huân và cs, 2015 5.
Trong đề tài này tác giả lựa chọn kỹ thuật RAPD cho nghiên cứu đa dạng di
truyền 10 cá thể Trà hoa vàng Tam đảo (Camellia tamdaoensis Hakoda et Ninh) nhằm
xác định tính đa dạng di truyền làm cơ sở cho lựa chọn vật liệu vào mẫu in vitro.
1.2.2. Kỹ thật RAPD
Kỹ thuật RAPD dựa trên kỹ thuật PCR, bằng cách sử dụng những primer ngắn (8
- 20 nucleotide) có trình tự biết trước, bắt cặp và nhân bản ngầu nhiên những đoạn
ADN có trình tự bổ sung với trình tự của các primer. Theo nguyên tắc, khi 2 cá thể
hoàn toàn giống nhau, sau khi thực hiện phản ứng PCR - RAPD ở điều kiện như nhau
sẽ tạo ra số lượng các đoạn băng giống nhau và chiều dài tương ứng bằng nhau.
Khi có đột biến làm xuất hiện hay mất đi một vị trí bắt cặp ngẫu nhiên sẽ tạo ra
số lượng và chiều dài các đoạn DNA khác nhau giữa các cá thể, vì vậy kỹ thuật RAPD
có thể phát hiện đột biến. Một trong những giới hạn của PCR chuẩn đối với ALP
marker là mọi thông tin về chuỗi mã di truyền đầu tiên phải được biết rõ trước khi
chuẩn bị các primer tương ứng. Vì thế, việc áp dụng nó để nghiên cứu DNA genome


8

của một giống cây trồng mới sẽ gặp nhiều khó khăn. Vào đầu thế kỷ 20, một kỹ thuật
phân tử mới dựa trên nguyên tắc PCR với tên gọi RAPD (Randomly amplified
polymorphic DNA) đã được ra đời một cách độc lập tại hai phòng thí nghiệm khác
nhau (Wiliam, 1990; Welsh và ctv., 1991) 60.
a. Nguyên lý của kỹ thuật RAPD
Về cơ bản kỹ thuật RAPD được thực hiện theo ba bước:
 Tách chiết DNA tổng số, nhân DNA bằng máy PCR
 Điện di trên gel agarose hoặc gel polyacrylamid
 Xác định tính đa dạng di truyền bằng các phần mềm thông dụng (NTSYSpc 2.1,
UPGMA cluster, Gelcompar, lập dedrogram)
Cơ sở của kỹ thuật RAPD là sự nhân bản ADN genom bằng phản ứng PCR với

các mồi ngẫu nhiên để tạo ra sự đa hình ADN do sự sắp xếp hoặc mất nucleotide ở vị
trí bắt mồi (Williams et al, 1991).
Mồi sử dụng cho kỹ thuật RAPD là các mồi ngẫu nhiên, thường là 10 nucleotide
và có nhiệt độ kéo dài mồi thấp (34- 37oC). Mặc dù trình tự mồi RAPD là ngẫu nhiên
nhưng phải đạt được hai tiêu chí là: tỷ lệ G - C tối thiểu phải là 40% (thường là 50 80%) và không có trình tự bazo đầu xuôi và ngược giống nhau.
Trong phản ứng này, các primer đơn gắn vào hai điểm khác nhau ở hai mạch đơn
đối diện của ADN khuôn. Nếu các điểm gắn primer nằm trong khoảng có thể nhân bản
được (thường 200 - 2000 nuclotide) thì đoạn ADN sẽ được nhân lên.
Sự có mặt của sản phẩm này được quan sát thông qua điện di trên gel agarose
hoặc polyacrylmide đã chứng tỏ có sự tương đồng hoàn toàn hay một phần giữa ADN
genome với các primer oligonucleotide. Các primer dùng trong RAPD có kích thước
ngắn nên dễ tìm được các đoạn tương đồng trên các mạch đơn ADN trong genome. Vì
thế, nó là một phương pháp hiệu quả để xác định tính đa hình về trật tự nucleotide giữa
các cá thể.


9

b. Ưu điểm, hạn chế của kỹ thuật RAPD
RAPD là một phương pháp nhanh để phát hiện đa hình vì kỹ thuật này không đòi
hỏi việc phân lập và đọc trình tự, có thể phát hiện nhiều locus cùng một lúc.
Ưu điểm
Vể mặt kỹ thuật:
- Kỹ thuật RAPD dễ thực hiện và dễ thành công do không cần biết trước trình tự
bộ gen của đối tượng cần nghiên cứu;
- Thao tác đơn giản;
- Chất lượng ADN khuôn không cần độ tinh sạch cao;
- Thời gian thực hiện nhanh, khả năng nhân bản cao.
Về mặt kinh tế:
- Chi phí thực hiện thấp;

- Kỹ thuật RAPD thường được sử dụng kết hợp với những kỹ thuật cao cấp khác
để đánh giá đa dạng di truyền và nhận diện chỉ thị phân tử có độ tin cậy cao;
- Chỉ thị RAPD không cần biết trước trình tự nuclotide của đoạn ADN cần khuếch
đại, quy trình tiến hành nhanh, dễ làm, ít tốn kém, cho đa hình cao, tiến hành chỉ với
một lượng nhỏ ADN tính bằng nanogram và trên một số lượng mẫu thí nghiệm lớn.
Đồng thời RAPD không dùng chất phóng xạ để phát hiện đa hình. Do đó RAPD
thường dùng trong phân tích và xác định mối quan hệ thân thuộc giữa các cây trồng
hay giữa các cá thể để phục vụ công tác lai tạo hoặc phân loại.
Ngoài những ứng dụng trong nghiên cứu sự đa dạng sinh học và nguồn gốc di
truyền của các loài động vật, thực vật và vi sinh vật, chỉ thị RAPD cũng được sử dụng
cho các mục đích sau:
- Lập bản đồ liên kết, xác định những gen liên kết với một tính trạng nào đó như
tính trạng chất lượng sợi ở cây bông, tính trạng kháng virus ở cà chua;
- Phân tích cấu trúc di truyền của quần thể;
- In dấu vân tay (DNA fingerprinting);
- Phát hiện sự khác biệt trong các dòng soma (somaclonal variation).


10

Nhược điểm
Tuy có nhiều ứng dụng trong nghiên cứu đa dạng di truyền những chỉ thị RAPD
cũng có một số hạn chế như sau:
- Có tính trội do đó khó phân biệt được những gen lặn hay cá thể di hợp tử;
- Có tính chất ngẫu nhiên nên sản phẩm PCR thường không thống nhất;
- Cần phải có các thiết bị điện toán để xử lý số liệu;
- Độ tin cậy còn tùy thuộc vào kỹ thuật cá nhân;
- Kỹ thật RAPD có độ chính xác không cao;
- Không ổn định (thể hiện ở mức độ lặp lại giống nhau thấp);
- Khả năng nhân bản trong phản ứng PCR cao nhưng khả năng xuất hiện đa hình

thấp;
- Khả năng nhận diện chỉ thị phân tử thấp và độ tin cậy không cao (William và cs,
1993).
1.2.3. Vị trí và tầm quan trọng của đa dạng di truyền
Đa dạng di truyền là biểu hiện sự đa dạng của các biến dị có thể di truyền trong
một loài, một quần xã hoặc giữa các loài, các quần xã. Xét cho cùng, đa dạng di truyền
chính là sự biến dị của sự tổ hợp trình tự của bốn cặp bazơ cơ bản, thành phần nucleic
acid, tạo thành mã di truyền [3].
Đa dạng di truyền là cơ sở cho việc tuyển chọn lai tạo những giống, loài mới; đa
dạng về loài thường là đối tượng khai thác phục vụ mục đích kinh tế; đa dạng về hệ sinh
thái có chức năng bảo vệ môi trường sống; đồng thời các hệ sinh thái được duy trì và
bảo vệ chính là nhờ sự tồn tại của các quần thể loài sống trong đó. Phần đa dạng sinh
học do con người khai thác sử dụng gọi là đa dạng sinh học nông nghiệp [20].
Giá trị của đa dạng di truyền thể hiện ở ba mặt chính [35]:
Giá trị ổn định: Đa dạng di truyền tạo ra sự ổn định cho các hệ thống nông
nghiệp ở quy mô toàn cầu, Quốc gia và địa phương. Sự thiệt hại của một giống cây
trồng cụ thể được bù đắp bằng năng suất của các giống hoặc cây trồng khác.


11

Giá trị lựa chọn: Đa dạng di truyền tạo ra bảo hiểm sinh học cần thiết chống lại
những thay đổi bất lợi của môi trường do việc tạo ra những tính trạng hữu ích như tính
kháng sâu bệnh hay tính thích nghi. Giá trị của đa dạng di truyền được thể hiện thông
qua việc sử dụng và khai thác các tính trạng quý, hiếm của tài nguyên di truyền thực
vật như tính chống chịu, năng suất, chất lượng và khả năng thích nghi.
Năm 1946, giống lúa mỳ lùn Nhật Bản Norin 10 được nhập vào Mỹ và đã góp
phần quan trọng trong cải tạo giống và tăng năng suất lúa mỳ. Các giống lúa trồng có
nguồn gốc Đông Bắc Ấn Độ được sử dụng là nguồn kháng sâu, bệnh cho các vùng
khác nhau trên thế giới. Những tính trạng này đã góp phần tăng sản lượng lúa bình

quân của châu Á lên 30% giữa những năm 1981 và 1986 [35].
Giá trị khai thác: Đa dạng di truyền được xem là kho dự trữ tiềm năng các tài
nguyên chưa biết đến. Đây cũng là lý do cần phải duy trì cả các hệ sinh thái hoang dã
lẫn các hệ thống nông nghiệp truyền thống.
1.3.

Cơ sở khoa học nuôi cấy mô tế bào thực vật

1.3.1. Khái niệm nuôi cấy in vitro
Nuôi cấy in vitro là thuật ngữ mô tả các phương pháp nuôi cấy các bộ phận thực
vật (tế bào đơn, mô, cơ quan) trong ống nghiệm có chứa môi trường dinh dưỡng thích
hợp như muối khoáng, vitamin, đường và các chất điều hòa sinh trưởng thực vật trong
điều kiện vô trùng và được kiểm soát.
Nuôi cấy mô tế bào bao gồm các kỹ thuật sau:
 Nuôi cấy cây non và cây trưởng thành.
 Nuôi cấy các cơ quan: rễ, thân, lá, hoa, quả, bao phấn…
 Nuôi cấy phôi non, và phôi trưởng thành.
 Nuôi cấy mô sẹo.
 Nuôi cấy tế bào đơn (huyền phù tế bào).
 Nuôi cấy protoplast (nuôi cấy tế bào trần).
Kỹ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật cho phép tái sinh chồi hoặc cơ quan từ
các mô như lá, thân, hoa, rễ, củ hoặc đỉnh sinh trưởng. Hiện nay, các nhà khoa học sử


12

dụng hệ thống nuôi cấy mô thực vật để nghiên cứu tất cả các vấn đề có liên quan đến
thực vật như sinh lý học, sinh hoá học, di truyền học và cấu trúc thực vật. Kỹ thuật
nuôi cấy mô thực vật cũng mở rộng tiềm năng nhân giống vô tính đối với các loài cây
trồng quan trọng, có giá trị về mặt kinh tế và thương mại trong đời sống hàng ngày của

con người.
1.3.2. Cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô tế bào
Cở sở của phương pháp nuôi cấy mô tế bào dựa trên ba tính chất cơ bản của tế
bào đó là: tính toàn năng, sự biệt hóa và phản biệt hóa và sự trẻ hóa.
 Tính toàn năng của tế bào
“Tế bào bất kì của sinh vật nào cũng đều mang toàn bộ thông tin di truyền
(ADN) cần thiết và đủ cho cả sinh vật đó. Khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều
có thể phát triển thành một cá thể hoàn chỉnh”. Gottlieb Haberlandt (1902), nhà thực
vật người Đức đã đặt nền móng cho nuôi cấy mô tế bào thực vật đưa ra trong cuốn
sách “Thực nghiệm về nuôi cấy tế bào tách rời” [15][21].
 Sự biệt hóa và phản biệt hóa
Sự phân hóa tế bào là sự chuyên hóa các tế bào thành các mô chuyên hóa chức
năng khác nhau trong cơ thể. Tuy nhiên, khi tế bào đã chuyên hóa chúng hoàn toàn
mất đi khả năng phân chia của mình. Trong những điều kiện thích hợp, chúng lại có
thể trở về dạng tế bào phôi sinh và phân chia mạnh mẽ như tế bào ban đầu có khả năng
tạo thành cây con hoàn chỉnh. Quá trình này gọi là sự phản phân hóa tế bào [21].
 Sự trẻ hóa tế bào
Khả năng tái sinh của các bộ phận non trẻ tốt hơn các bộ phân trưởng thành, đời
sống của dòng vô tính là vô hạn. Vì vậy trẻ hóa là biện pháp quan trọng trong nhân
giống sinh dưỡng [21].
1.3.3. Ý nghĩa của nhân giống in vitro
Nuôi cấy mô tế bào thực vật, thực chất là một phương pháp nhân giống vô tính.
Đối với nhiều loài thực vật quý hiếm, có giá kinh tế và ý nghĩa sinh học cao, gặp khó
khăn trong vấn đề nhân giống hữu tính thì nhân giống vô tính in vitro là công cụ vô


13

cùng hữu ích. Nhưng trên thực tế có nhiều loại thực vật nhân giống hữu tính bằng hạt
có hệ số nhân cao nhưng vẫn tiến hành nhân giống vô tính in vitro là do:

Các phương pháp nhân giống hữu tính bằng hạt mặc dù cho hệ số nhân giống
cao, dễ bảo quản và vận chuyển nhưng với một số cây trồng, khi nhân giống bằng hạt
sẽ cho các cây con không hoàn toàn giống bố mẹ cả về hình thái và thành phần hóa
học. Sự không đồng nhất này gây ra khó khăn trong việc đưa cây vào sản xuất theo
dây chuyền công nghiệp, vì các cây con có chất lượng sản phẩm không đồng đều, làm
giảm giá trị thương phẩm. Đặc biệt, đối với cây thuốc thì việc không đồng đều về chất
lượng hay chính là hàm lượng các chất hoạt tính sẽ dẫn đến hậu quả là nguyên liệu
không ổn định, không đáp ứng được nhu cầu sản xuất. Ví dụ: đối với các cây lấy tinh
dầu, việc nhân giống bằng hạt dẫn tới sự phân ly không đều về hàm lượng các thành
phần hoạt chất.
Để khắc phục những nhược điểm trên, phương pháp nhân giống vô tính được áp
dụng đã mang lại nhiều hiệu quả kinh tế và ý nghĩa sinh học lớn. Phương pháp nhân
giống vô tính đã khắc phục được nhiều nhược điểm của nhân giống hữu tính, ưu điểm
lớn nhất của nhân giống vô tính là các cây con đồng đều về mặt di truyền do duy trì
được các tính trạng của cây mẹ, nên có thể sản xuất đại trà cho sản phẩm có chất lượng
ổn định; rút ngắn thời gian từ khi trồng đến thu hoạch tạo điều kiện cho tăng vụ, tăng
sản lượng đối với những cây có thời gian nảy mầm của hạt kéo dài… Mặc dù vậy,
phương pháp nhân giống vô tính truyền thống (chiết, giâm, ghép) vẫn còn nhiều nhược
điểm như sự lây nhiễm bệnh qua nguyên liệu thường phổ biến và phức tạp, hệ số nhân
thấp…
Để khắc phục các nhược điểm của phương pháp nhân giống vô tính truyền thống,
một phương pháp nhân giống khác đã được áp dụng rộng rãi trên thế giới cũng cũng
như ở Việt Nam, đó là phương pháp nhân giống in vitro, phương pháp này có nhiều ưu
điểm nổi trội như:
-

Hệ số nhân giống cao, từ một cây trong vòng một năm có thể tạo thành hàng triệu
cây. Hệ số nhân giống ở các loại cây khác nhau nằm trong phạm vi 36 đến 1012 /
năm, cao hơn bất cứ phương pháp nhân giống nào.



14

-

Tính đồng nhất và ổn định di truyền cao: Các cây con được tạo ra giống hệt cây bố
mẹ ban đầu. Theo lý thuyết từ bất kỳ một cây chọn lọc ưu việt nào đều có thể tạo ra
một quần thể với độ đồng đều cao, số lượng không hạn chế.

-

Nâng cao chất lượng giống do tạo được các giống sạch bệnh, loại bỏ được các
nguồn vi khuẩn, virus, nấm bệnh. Trong công tác nhân giống, vấn đề được quan
tâm hàng đầu là số lượng và chất lượng giống. Bằng phương pháp nuôi cấy đỉnh
sinh trưởng, người ta đã tạo được giống cây hoàn toàn sạch virus.

-

Nhân giống in vitro có thể nhân nhanh cây không kết hạt hoặc kết hạt kém trong
những điều kiện sinh thái nhất định.

-

Có tiềm năng công nghiệp hóa, do chủ động về chế độ chăm sóc và chiếu sáng,
nhiệt độ… nên có thể sản xuất quanh năm trong một dây truyền sản xuất liên tục

-

Tạo được cây có kiểu gen mới bằng xử lý đa bội.


-

Bảo quản và lưu giữ được tập đoàn gen.
Bên cạnh những ưu điểm trên, nhân giống in vitro vẫn không tránh khỏi một số

nhược điểm như:
-

Hạn chế về chủng loại sản phẩm: Nhiều loài thực vật quý hiếm chưa thể tiến hành
nhân giống do gặp khó khăn liên quan tới lý thuyết nuôi cấy và tái sinh thực vật.

-

Chi phí sản xuất cao do nhân giống in vitro đòi hỏi trang thiết bị hiện đại và lao
động có tay nghề.

-

Hiện tượng sản phẩm bị biến đổi kiểu hình mà nguyên nhân là do biến dị soma, đã
làm cho các cây con không giữ được kiểu hình của bố mẹ (đặc biệt là khi nuôi cấy
từ callus).
Trong quá trình nuôi cấy, các mô tế bào thực vật thực hiện quá trình phản biệt

hóa rồi lại biệt hóa để cho ra cây hoàn chỉnh. Mỗi đối tượng thực vật có đặc tính khác
nhau, do đó có những cách thức biến đổi khác nhau, mặc dù kết quả cuối cùng là tái
sinh cây hoàn chỉnh nhưng không phải chỉ có một phương phức chung cho tất cả các
thực vật.
1.3.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến nuôi cấy
a) Ảnh hưởng của điều kiện khử trùng mẫu cấy



15

Việc khử trùng mẫu trước khi đưa vào nuôi cấy là một vấn đề cần thiết, vì mẫu
cấy ở trong tự nhiên tiếp xúc với môi trường xung quanh nên mang rất nhiều vi khuẩn,
nấm… Nhưng, do mức độ nhiễm của mỗi loại mẫu là khác nhau và đặc điểm của từng
loại mẫu cũng khác nhau nên cần có sự thử nghiệm về khử trùng mẫu cấy nhằm thu
được lượng mẫu vô trùng nhiều mà tốn ít nhiên liệu ban đầu.
Khả năng tiêu diệt nấm và khuẩn của hóa chất khử trùng phụ thuộc vào nồng độ,
thời gian xử lý và mức độ xâm nhập của chúng vào các ngóc ngách trên bề mặt của mô
cấy.
Thời gian khử trùng là một điều kiện quan trọng, nó phụ thuộc vào từng loại
dung dịch khử trùng và đặc điểm của từng loại mẫu cấy.Với hypoclorite, người ta
thường khử trùng trong thời gian 15 - 30 phút, HgCl2 thường có thời gian ít hơn. Thời
gian quá lâu, dung dịch khử trùng xâm nhập vào mẫu có thể gây chết mẫu, thời gian
quá ngắn sẽ không loại bỏ hết nấm và vi khuẩn nên mẫu dễ bị nhiễm.
Sau khi khử trùng, mẫu cây được đặt vào các môi trường nuôi cấy, từ đây giai
đoạn nuôi cấy in vitro bắt đầu. Thành phần của môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng
quyết định tới nuôi cấy.
b) Ảnh hưởng của các thành phần hóa học
Có rất nhiều loại môi trường nuôi cấy như MS, N6, SH, AA,…môi trường nuôi
cấy thường nuôi cấy thường được pha với nồng độ đậm đặc được gọi là dung dịch mẹ
(Stock). Một số công thức môi trường thường được sử dụng chủ yếu để nuôi cấy mô
và tế bào thực vật như môi trường MS (Murashige và Skoog), B5 (Gamborg và cộng
sự), SH (Schenk và Hilderbrandt) có hàm lượng khoáng đa lượng cao và một số môi
trường khác được mô tả bởi White, Gautheret, Nitsch, Loyd và Mc Cown có hàm
lượng khoáng đa lượng thấp hơn [21]. Mặc dù nhu cầu dinh dưỡng của các loại mô
nuôi cấy là rất khác nhau nhưng môi trường nuôi cấy mô thực vật đặc trưng chứa các
thành phần sau:



Các nguyên tố đa lượng: Bao gồm các loại muối của nitrogen, potassium,

calcium, phosphorus, magnesium và sulfur. Đây là sáu nguyên tố chính cần thiết cho
sinh trưởng của thực vật bậc cao.


16



Các nguyên tố vi lượng: Bao gồm các loại muối của sắt, kẽm, mangan, boron,

copper, molybdenum và cobalt ở dạng hợp chất vô cơ.


Nguồn carbon: Các mẫu nuôi cấy mô thực vật nói chung không thể quang hợp

được, hoặc nếu có quang hợp được thì cường độ rất thấp do thiếu clorophin, nồng độ
CO2 và nhiều điều kiện khác… Vì vậy cần đưa thêm những hợp chất hydratcacbon
vào thành phần môi trường. Loại hydratcacbon được sử dụng phổ biến là fructose,
glucose, maltose, sucrose…[21].


Các tác nhân làm rắn (tạo gel) môi trường: Quyết định trạng thái vật lý của

môi trường nuôi cấy. Các môi trường đặc có chứa đủ hàm lượng chất tạo gel làm cho
chúng đông lại ở nhiệt độ bình thường (25 - 300C). Chất tạo gel phổ biến hay dùng là
agar (thạch), phytagel chúng gồm một khối polysaccarit có khối lượng phân tử cao,
được lấy ra từ rong biển [21].



Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật: Các chất điều hòa sinh trưởng là thành

phần không thể thiếu trong môi trường nuôi cấy, có vai trò quan trọng trong quá trình
phát sinh hình thái thực vật in vitro. Hiệu quả tác động của chất điều hòa sinh trưởng
phụ thuộc vào: nồng độ sử dụng, hoạt tính vốn có của chất điều hòa sinh trưởng, mẫu
nuôi cấy. Có 5 nhóm chất điều hoà quan trọng trong nuôi cấy mô thực vật: auxin,
gibberellin, cytokinin, abscisic acid và ethylen [21].
Nhóm auxin: Đưa vào môi trường nuôi cấy nhằm thúc đẩy sự sinh trưởng và giãn
nở của tế bào, tăng cường các quá trình sinh tổng hợp và trao đổi chất, kích thích hình
thành rễ và tham gia vào cảm ứng phát sinh phôi vô tính. Các loại auxin thường sử
dụng cho nuôi cấy: IAA (Indole acetic acid), IBA(Indole butyric acid), α - NAA(αNaphthalene acetic acid)... Hàm lường sử dụng từ 0,1 - 2,0 mg/l.
Nhóm cytokinin: Kích thích sự phân chia tế bào, sự hình thành và sinh trưởng
của chồi in vitro. Các cytokinin có biểu hiện ức chế sự tạo rễ và sự sinh trưởng của mô
sẹo nhưng có ảnh hưởng rõ rệt đến phát sinh phôi vô tính của mẫu nuôi cấy. Các loại
cytokinin thường sử dụng cho nuôi cấy: Zeatin (6-4 – hydroxy – 3 – metyl – but – 2enylaminopurien), Kinetin (6-furfurylamino purien), BAP (Benzyamino purien), TDZ
(Thidiazuron)… Hàm lượng sử dụng của các loại cytokinin dao động từ 0,1- 2,0 mg/l.