BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

VIỆN HÀN LÂM KH&CN VIỆT NAM

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC VÀ KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH
HỌC SAN HÔ MỀM SINULARIA DISSECTA Ở VIỆT NAM

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Học viên:

Vũ Anh Tú

Cao học:

Khóa 17

Chuyên ngành:

Sinh học thực nghiệm

Mã số:

60420114

Hướng dẫn khoa học:

TS. Nguyễn Hoài Nam

Hà Nội – 2015


Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Luận văn Thạc sĩ K17- Vũ Anh
Tú

Lời cảm ơn
Luận văn được hoàn thành tại Viện Hoá sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công
nghệ Việt Nam. Tôi xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Hoài Nam, người thầy đã tận tình
hướng dẫn, hết lòng chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ tôi trong thời gian làm luận văn.
Tôi cũng xin chân thành cảm ơn GS. VS Châu Văn Minh, TS Nguyễn Văn Thanh, TS Nguyễn
Xuân Cường và tập thể cán bộ phòng Dược liệu biển, Viện Hóa sinh biển đã tạo điều kiện,
giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận văn. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới TS Đỗ
Thị Thảo và các anh chị Phòng Thử nghiệm sinh học, Viện Công nghệ sinh học đã giúp đỡ và
tạo điều kiện cho tôi hoàn thành các nghiên cứu về hoạt tính sinh học và thử nghiệm dược
lý.
Tôi xin chân thành cảm ơn tới Lãnh đạo Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Trường
Đại học Thái Nguyên đã tạo điều kiện cho tôi được học tập và nghiên cứu. Tôi xin chân thành
cảm ơn gia đình và bạn bè đã động viên tôi trong suốt quá trình học tập nghiên cứu. Luận
văn này được hỗ trợ kinh phí và thực hiện trong khuôn khổ nội dung của Nhiệm vụ nhánh
Hợp tác quốc tế với L.B.Nga cấp Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam và Nhiệm
vụ Trọng điểm cấp Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, VAST.TĐ.ĐAB.02/13-15 do
TS. Nguyễn Hoài Nam làm chủ nhiệm.

Tác giả luận văn


Vũ Anh Tú

i


Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Luận văn Thạc sĩ K17- Vũ Anh
Tú

Lời cam đoan
Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi được thực hiện dưới sự
hướng dẫn của TS. Nguyễn Hoài Nam. Các số liệu, kết quả nêu trong Luận văn là trung
thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tôi xin cam đoan rằng
mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện Luận văn này đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn
trong Luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc.
Học viên thực hiện Luận văn

Vũ Anh Tú

ii


Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Luận văn Thạc sĩ K17- Vũ Anh
Tú

Danh mục chữ viết tắt


CC

Sắc ký cột (Collumn chromatography)

YMC

Sắc ký cột pha ngược

TLC

Sắc ký lớp mỏng (Thin Layer Chromatomatography)

MPLC

Sắc ký lỏng trung áp

NMR

Phổ cộng hưởng từ nhân (Nuclear Magnetic Resonance)

13C

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân cacbon 13 (Carbon-13 Nuclear Magnetic
Resonance Spectroscopy)

1H-NMR

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton (Proton Magnetic Resonance
Spectroscopy)


HMBC

Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết (Heteronuclear Multiple Bond
Connectivity)

HSQC

Phổ tương tác dị hạt nhân qua 1 liên kết (Heteronuclear Single-Quantum
Coherence)

Mp

Điểm nóng chảy (Melting point)

MTT

[3-(4,5-dimetylthiazol-2-yl)2,5-diphenyltetrazolium bromide]

LU-1

Dòng tế bào ung thư phổi người (Lung carcinoma cell line)

MCF-7

Dòng tế bào ung thư vú người (Human breast cancer cell line)

KB

Dòng tế bào ung thư biểu mô


HepG2
TBUT

Dòng tế bào ung thư gan người
Tế bào ung thư

iii


Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Luận văn Thạc sĩ K17- Vũ Anh
Tú

MỤC LỤC
1

MỞ ĐẦU
2

CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2

I.1. Giới thiệu về san hô mềm

I.2. Tình hình nghiên cứu về hóa học và hoạt tnh sinh học một số loài

9


san hô mềm điển hình thuộc giống Sinularia trên thế giới
I.3. Tình hình nghiên cứu về hóa học và hoạt tính sinh học giống

12

Sinularia trong nước
CHƯƠNG II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

13

II.1. Đối tượng nghiên cứu

13

II.2. Phương pháp nghiên cứu

14

II.2.1. Phương pháp thu thập mẫu sinh vật biển

14

II.2.2. Phương pháp nghiên cứu xử lý mẫu tạo dịch chiết

14

II.2.3. Phương pháp phân lập, xác định cấu trúc các hợp chất

16


II.2.4. Phương pháp nghiên cứu thử nghiệm hoạt tnh diệt tế bào ung thư

17

19

CHƯƠNG III. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ

19

III.1. Xử lý mẫu, tạo dịch chiết phục vụ nghiên cứu
III.2. Phân lập các hợp chất, hằng số vật lý, dữ liệu phổ của các hợp chất

20

III.3. Thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào các hợp chất phân lập được

25

28

CHƯƠNG IV. BÀN LUẬN KẾT QUẢ

28

IV.1. Kết quả xác định cấu trúc các hợp chất

52

IV.2. Đánh giá hoạt tnh gây độc tế bào các hợp chất phân lập được

53

KẾT LUẬN

55

Tài liệu tham khảo

58

Danh mục công trình công bố
PHỤ LỤC
iv


Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Luận văn Thạc sĩ K17- Vũ Anh
Tú

MỞ ĐẦU
Cùng với sự tiến hóa nhanh của văn minh nhân loại và sự phát triển vượt bậc của
khoa học kỹ thuật thì các căn bệnh nguy hiểm cũng đã gia tăng rất nhiều, đặc biệt có thể thấy
sự gia tăng ngày một lớn của căn bệnh ung thư quái ác, thuộc tứ chứng nan y trong y học. Nó
đã gây ra nỗi ám ảnh đáng sợ cho loài người. Và các biệt dược phục vụ công tác chữa bệnh,
các thực phẩm chức năng hỗ trợ phục hồi sức khỏe giúp người bệnh có thể chống lại bệnh tật
tốt nhất đang được các nhà khoa học rất chú trọng nghiên cứu.
Các sinh vật biển có thể đã có rất nhiều người biết đến như Hải sâm, Sao biển, Cá
ngựa, cầu gai, san hô, bọt biển… hay gần gũi hơn nữa là các thực phẩm giàu dinh dưỡng
trong bữa ăn như các loài ốc, sò, cá, cua, sứa biển … đang được nghiên cứu rất nhiều theo

hướng thực phẩm hoặc thực phẩm chức năng. Nghiên cứu về nguồn hợp chất thiên nhiên
biển đã được bắt đầu từ những năm 50 của thế kỷ trước và đang ngày càng nhận được sự
quan tâm của các nhà khoa học trên thế giới. Những nghiên cứu về nguồn dược liệu biển
trong thời gian gần đây tăng cả về chất lượng và số lượng và đã đạt được những thành quả
rất đáng chú ý. Đã có nhiều hợp chất có nguồn gốc biển trở thành các loại thuốc quan trọng
trong các lĩnh vực của cuộc sống loài người. Các sinh vật biển trở thành tâm điểm cho nhiều
công trình nghiên cứu có ý nghĩa to lớn cho sức khỏe và đời sống. Các nguồn dược liệu từ sinh
vật biển có thể bổ sung, hỗ trợ và còn có thể điều trị các căn bệnh nguy hiểm ngày càng gia
tăng trong xã hội phát triển.
Nghiên cứu về thành phần hóa học và các hoạt tnh sinh học trong các loài san hô sẽ
góp phần chuyển những sinh vật không có giá trị về mặt hải sản trở thành những sinh vật biển
có giá trị trong nghiên cứu y dược. Chính vì vậy, hiện này đang có rất nhiều nghiên cứu tập
trung vào tìm kiếm các hợp chất từ san hô mềm và nghiên cứu hoạt tnh sinh học các hợp
chất phát hiện được.

1


Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Luận văn Thạc sĩ K17- Vũ Anh
Tú

CHƯƠNG I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU I.1. Giới
thiệu về san hô mềm
San hô là loài sinh vật biển thuộc lớp Anthozoa, lớp Anthozoa được chia thành hai
phân lớp tùy theo số xúc tu, hoặc các đường đối xứng và một loạt các bộ phận tương ứng với
kiểu xương ngoài và bao gồm phân lớp san hô có tám xúc tu được gọi là san hô tám ngăn
Octocorallia, và phân lớp san hô có số xúc tu lớn hơn tám và là bội số của sáu được gọi là san
hô sáu ngăn Hexacorallia. Các san hô mềm, san hô sừng và bút chì biển thuộc phân lớp san hô

Octocorallia, san hô cứng nằm trong phân lớp Hexacorallia. Theo thống kê trên thế giới, phân
lớp Octocorallia có khoảng 2000 loài chia làm 310 giống và 45 họ.
San hô là những sinh vật rất đơn giản, chúng tồn tại ở khắp các vùng biển, nông cũng
như sâu và là những cá thể hình trụ rất nhỏ có hàng xúc tu ở đỉnh, được sử dụng để bắt mồi
trong môi trường nước. Mặc dù trông giống như cây, san hô thực sự là những động vật và cấu
tạo tương tự như con sứa và hải quì, chúng thuộc vào nhóm động vật biển có các trâm gây
ngứa (thích ty bào). Có đến hàng trăm kiểu san hô khác nhau nhưng tất cả đều do các cá thể
nhỏ bé, còn gọi là polyp tạo nên. Các cá thể này tiết ra canxi cacbonat để tạo bộ xương cứng,
xây nên các rạn san hô tại các vùng biển nhiệt đới. Trên thế giới, rạn san hô ngầm ước tính
bao phủ trên 284.300 km2, chủ yếu ở vùng biển Ấn Độ - Thái Bình Dương (91,9%). Các rạn san
hô mềm phân bố rộng rãi trên đại dương thế giới và có vai trò quan trọng trong hệ sinh thái
rạn san hô, chúng tạo ra nguồn vật chất hữu cơ, habitat, tham gia tạo rạn. Cuộc sống cộng
sinh của san hô mềm với các loài tảo biển đã tạo nên đặc điểm sinh học vô cùng thú vị của san
hô mềm. Rất nhiều hợp chất thứ cấp như các ditecpen dạng cembranoid, các steroids … từ
san hô mềm có thể được sinh ra từ những mối tương tác với môi trường sinh thái như vậy [1]
Tuy một đầu san hô trông như một cơ thể sống, nhưng nó thực ra là đầu của nhiều cá
thể giống nhau hoàn toàn về di truyền, đó là các polip. Các polip là các sinh vật đa bào với
nguồn thức ăn là nhiều loại sinh vật nhỏ hơn, từ sinh vật phù du tới các loài cá nhỏ.

2


Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Luận văn Thạc sĩ K17- Vũ Anh
Tú

Polip thường có đường kính một vài milimet, cấu tạo bởi một lớp biểu mô bên
ngoài và một lớp mô bên trong giống như sứa được gọi là ngoại chất. Polip có hình dạng đối
xứng trục với các xúc tu mọc quanh một cái miệng ở giữa - cửa duy nhất tới xoang vị (hay dạ

dày), cả thức ăn và bã thải đều đi qua cái miệng này.
Dạ dày đóng kín tại đáy polip, nơi biểu mô tạo một bộ xương ngoài được gọi là đĩa
nền. Bộ xương này được hình thành bởi một vành hình khuyên chứa canxi ngày càng dày
thêm. Các cấu trúc này phát triển theo chiều thẳng đứng và thành một dạng ống từ đáy
polip, cho phép nó co vào trong bộ xương ngoài khi cần trú ẩn.
Polip mọc bằng cách phát triển khoang hình cốc (calices) theo chiều dọc, đôi khi chia
thành vách ngăn để tạo một đĩa nền mới cao hơn. Qua nhiều thế hệ, kiểu phát triển này tạo
nên các cấu trúc san hô lớn chứa canxi, và lâu dài tạo thành các rạn san hô.
Sự hình thành bộ xương ngoài chứa canxi là kết quả của việc polip kết lắng aragonit
khoáng từ các ion canxi thu được từ trong nước biển. Tuy khác nhau tùy theo loài và điều
kiện môi trường, tốc độ kết lắng có thể đạt mức 10 g/m² polip/ngày. Điều này phụ thuộc
mức độ ánh sáng, sản lượng ban đêm thấp hơn
90% so với giữa trưa.
Các xúc tu của polip bẫy mồi bằng cách sử dụng các tế bào châm được gọi là
nematocyst. Đây là các tế bào chuyên bắt và làm tê liệt các con mồi như sinh vật phù du, khi
có tiếp xúc, nó phản ứng rất nhanh bằng cách tiêm chất độc vào con mồi. Các chất độc này
thường yếu, nhưng ở san hô lửa, nó đủ mạnh để gây tổn thương cho con người. Các loài sứa
và hải quỳ cũng có nematocyst. Chất độc mà nematocyst tiêm vào con mồi có tác dụng làm tê
liệt hoặc giết chết con mồi, sau đó các xúc tu kéo con mồi vào trong dạ dày của polip bằng
một dải biểu mô co giãn được gọi là hầu.
Các polip kết nối với nhau qua một hệ thống phức tạp gồm các kênh hô hấp tiêu hóa
cho phép chúng chia sẻ đáng kể các chất dinh dưỡng và các sinh vật cộng sinh. Đối với các loài
san hô mềm, các kênh này có đường kính khoảng 50-500μm

3


Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Luận văn Thạc sĩ K17- Vũ Anh

Tú

và cho phép vận chuyển cả các chất của quá trình trao đổi chất và các thành phần tế bào.
Ngoài việc dùng sinh vật phù du làm thức ăn, nhiều loài san hô, cũng như các nhóm
Thích ti (Cnidaria) khác như hải quỳ (ví dụ giống Aiptasia), hình thành một quan hệ cộng sinh
với nhóm tảo vàng đơn bào thuộc chi Symbiodinium. Thông thường, một polip sẽ sống cùng
một loại tảo cụ thể. Thông qua quang hợp, tảo cung cấp năng lượng cho san hô và giúp san
hô trong quá trình canxi hóa. Tảo hưởng lợi từ một môi trường an toàn, và sử dụng điôxít
cacbon và các chất chứa nitơ mà polip thải ra.

Hình I.1a. Cận cảnh các polip và tế bào châm ( Nguồn internet)

Sinh sản Hữu tnh
San hô chủ yếu sinh sản hữu tnh, với 25% san hô phụ thuộc tảo (san hô đá) tạo thành
các quần thể đơn tnh trong khi phần còn lại là lưỡng tnh. Khoảng 75% san hô phụ thuộc
tảo "phát tán con giống" bằng cách phóng các giao tử (trứng và tinh trùng) vào trong
nước để phát tán các quần thể san hô ra xa. Các giao tử kết hợp với nhau khi thụ tinh để
hình thành một ấu trùng rất nhỏ gọi là planula, thường có màu hồng và hình ôvan; một
quần thể san hô cỡ trung bình mỗi năm có thể tạo vài nghìn ấu trùng này để vượt qua xác
suất rất nhỏ của việc ấu trùng tạo được một quần thể mới.

4


Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Luận văn Thạc sĩ K17- Vũ Anh
Tú

Ấu trùng planula bơi về phía ánh sáng, thể hiện quang xu hướng tnh dương, lên đến

vùng nước bề mặt nơi chúng trôi dạt và phát triển một thời gian trước khi bơi trở lại xuống
phía đáy biển để tìm một bề mặt mà nó có thể bám vào đó và xây dựng một quần thể mới.
Nhiều giai đoạn của quá trình này có tỷ lệ thất bại lớn, và mặc dù mỗi quần thể san hô phát
tán hàng triệu giao tử, chỉ có rất ít quần thể mới được hình thành. Thời gian từ khi phóng giao
tử cho đến khi ấu trùng định cư thường là 2 hoặc 3 ngày, nhưng có thể kéo dài đến 2 tháng.
Ấu trùng san hô phát triển thành một polip san hô và cuối cùng trở thành một đầu san hô
bằng cách sinh sản vô tính tạo các polip mới.
Hầu hết các loài san hô, mà không phải san hô đá, đều không phát tán giao tử. Các
loài này phóng tinh trùng nhưng giữ trứng, cho phép phát triển các ấu trùng planula lớn hơn
để sau này khi thả ra sẽ đủ sẵn sàng để lắng xuống. Ấu trùng phát triển thành polip san hô và
cuối cùng trở thành đầu san hô bằng mọc chồi vô tính và phát triển để tạo ra các polip mới.
Việc phóng giao tử đồng bộ thường xảy ra và rất điển hình tại các rạn san hô, ngay cả
khi tại rạn có nhiều loài, tất cả san hô trên rạn phóng giao tử vào cùng một đêm. Sự đồng bộ
này rất thiết yêu để các giao tử đực và cái có thể gặp nhau để tạo thành ấu trùng planula.
Những dấu hiệu hướng dẫn cho việc phóng giao tử rất phức tạp, nhưng xét thời gian ngắn, nó
bao gồm các thay đổi về mặt trăng, thời gian mặt trời lặn, và có thể cả tn hiệu hóa học. Việc
phóng giao tử đồng thời có thể tạo ra kết quả là sự hình thành các dạng san hô lai, có lẽ
tham gia vào quá trình tạo loài san hô mới. Tại một số nơi, hiện tượng san hô phóng giao tử
có thể rất nổi bật, thường xảy ra vào ban đêm, nước biển vốn trong trở nên mờ đục bởi các
"đám mây" giao tử.
San hô phải phụ thuộc vào các dấu hiệu môi trường, tùy theo từng loại, để xác định
thời gian chính xác để giải phóng các giao tử vào trong nước. Có hai phương pháp mà san hô
dùng để sinh sản hữu tính, chúng khác nhau ở chỗ giao tử cái có được giải phóng hay không:
San hô gieo rắc, phần lớn trong chúng sinh sản hàng loạt, phụ thuộc nặng nề vào các
dấu hiệu môi trường, do ngược lại với san hô ấp trứng, chúng giải

5


Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật


Luận văn Thạc sĩ K17- Vũ Anh
Tú

phóng cả tinh trùng lẫn trứng vào trong nước. San hô sử dụng các dấu hiệu dài hạn như độ
dài thời gian ban ngày, nhiệt độ nước, và/hoặc tốc độ thay đổi nhiệt độ; và dấu hiệu ngắn hạn
thông thường nhất là chu kỳ trăng, với lúc mặt trời lặn điều khiển thời gian giải phóng.
Khoảng 75% các loài san hô là san hô gieo rắc, phần lớn trong chúng là phụ thuộc tảo vàng
đơn bào hay san hô tạo rạn. Các giao tử với sức nổi dương trôi nổi về phía bề mặt nơi sự thụ
tinh diễn ra để tạo thành các ấu trùng planula. Các ấu trùng planula bơi về phía ánh sáng bề
mặt để đi vào các dòng chảy, nơi chúng ở lại khoảng 2 ngày, nhưng có thể tới 3 tuần, và trong
một trường hợp đã biết là 2 tháng, sau đó chúng chìm xuống và biến hóa thành các polip và
tạo thành các quần thể mới.
San hô ấp trứng thông thường nhất là không phụ thuộc tảo vàng đơn bào (không tạo
rạn), hoặc một số san hô phụ thuộc tảo vàng đơn bào trong các khu vực có tác động của sóng
hay luồng chảy mạnh. San hô ấp trứng chỉ giải phóng tinh trùng, với sức nổi âm, và có thể lưu
trữ trứng đã thụ tinh trong vài tuần, giảm bớt nhu cầu đối với các sự kiện sinh sản đồng bộ
hàng loạt, nhưng nó vẫn có thể xảy ra. Sau khi thụ tinh thì san hô giải phóng các ấu trùng
planula đã sẵn sàng chìm lắng xuống.

Hình I.1b. Các khoang hình cốc (đĩa nền) của Orbicella annularis cho thấy 2 phương pháp
nhân giống: mọc chồi (khoang nhỏ ở giữa) và phân chia (khoang đôi lớn). (Nguồn
internet)

6


Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Luận văn Thạc sĩ K17- Vũ Anh

Tú

Sinh sản Vô tính
Tại các đầu san hô, các polip giống hệt nhau về di truyền sinh sản vô tnh để phát triển
quần thể. Điều này được thực hiện bằng nảy mầm hay mọc chồi (khi một polip mới mọc ra từ
một polip trưởng thành), hoặc phân chia (thành 2 polip lớn bằng polip ban đầu), cả hai được
minh họa trong hình về Orbicella annularis.
Mọc chồi: Mở rộng kích thước của quần thể san hô. Nó diễn ra khi corallite mới mọc ra
từ polip trưởng thành. Khi polip mới phát triển nó sinh ra xoang vị (dạ dày), tua cảm và miệng.
Khoảng cách giữa các polip mới và trưởng thành tăng lên, và cùng với nó là coenosarc (cơ thể
chung của quần thể; xem hình minh họa tại phần cấu tạo). Việc mọc chồi có thể diễn ra theo
các cách sau:
 Phân chia theo chiều dọc bắt đầu với mở rộng polip ra, sau đó phân chia xoang vị.
Miệng phân chia và các tua cảm mới hình thành. Khác biệt với điều này là mỗi polip phải hoàn
thiện phần bị mất của mình về cơ thể và bộ xương ngoài.
 Mọc chồi nội tua cảm hình thành từ các đĩa miệng của polip, nghĩa là cả hai polip có
cùng kích thước và nằm trong cùng một vòng tua cảm.
 Mọc chồi ngoại tua cảm tạo thành từ đáy của polip, và các polip mới là nhỏ

7


Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật

Luận văn Thạc sĩ K17- Vũ Anh
Tú

hơn.
 Phân chia theo chiều ngang diễn ra khi các polip và bộ xương ngoài phân
chia theo chiều ngang thành hai phần. Điều này có nghĩa là một polip có đĩa nền (đáy) còn

polip kia có đĩa miệng (đỉnh). Hai polip mới cũng phải tự hoàn thiện các phần bị mất.
 Phân đôi diễn ra ở một số san hô, trong đó quần thể có khả năng tự tách thành 2
hay nhiều quần thể trong các giai đoạn đầu của sự phát triển của chúng.
Cả quần thể san hô có thể sinh sản vô tnh qua sự phân mảnh hay thoát ra ngoài, khi
một mảnh vỡ từ một đầu san hô được sóng đem đi nơi khác có thể tiếp tục phát triển tại địa
điểm mới.
 Polip thoát ra ngoài diễn ra khi một polip từ bỏ quần thể và tái thiết lập trên một nền
mới để tạo ra quần thể trưởng thành mới.

8


 Phân mảnh, trên thực tế có thể coi như là một kiểu của phân đôi, với các cá thể bị vỡ
ra khỏi quần thể do bão hay trong các tình huống khác mà việc vỡ ra này có thể xảy ra. Các cá
thể tách biệt có thể bắt đầu cho các quần thể mới.
Các rạn san hô Việt Nam nằm trên vùng nước nông, mặc dù không có các rạn san hô
cực lớn nhưng các rạn san hô Việt Nam có đặc tnh đa dạng cao và có đặc tính khu vực về
sinh thái rõ rệt, điều này chỉ ra sự tồn tại của các phần dị dưỡng bên trong của các loài. Trong
số khoảng gần 400 loài san hô (thuộc về 80 giống loài và 17 họ khác nhau) có mặt ở Việt
Nam, theo một số tài liệu báo cáo thì hiện nay nước ta có khoảng 55 loài san hô mềm và 29
giống loài. Kết quả phân tích các rạn san hô ở vùng biển Hạ Long, quần đảo Long Châu (Quảng
Ninh), đảo Cồn Cỏ (Quảng Trị), bán đảo Sơn Trà (Đà Nẵng) và vùng bờ biển Hải Vân (Thừa
Thiên Huế) trong nhiều năm qua phát hiện có 46 loài san hô mềm, thuộc 10 họ,
24 giống loài, trong đó đảo Cồn Cỏ là nơi có độ phủ san hô mềm cao nhất, hai chi Lobophytum
và Sinularia phát triển mạnh, tạo thành từng đám lớn, có nơi phủ dày đặc hàng chục mét
vuông. Theo báo cáo kết quả đánh giá độ đa dạng sinh học của Khu bảo tồn biển vịnh Nha
trang do Viện Hải dương học thực hiện năm 2005 cho thấy mức độ giàu có, phong phú và duy
trì ổn định của san hô ở khu vực này. Điển hình, ở khu Đông hòn tre có khoảng 150 loài, ở
Tây Nam Hòn Mun có khoảng
120 loài, trong đó có chi Sinularia, Lobophytum, Sarcophyton... [1, 2].


San hô cứng (hard coral)

San hô mềm (Soft coral)

Hình I.1c. Hình ảnh của một số loài san hô mềm do nhóm nghiên cứu chụp được
trong chuyến khảo sát vùng biển Việt Nam trên tàu Akademic oparin( Chương trình hợp tác
với liên bang Nga )


San hô mềm Sinularia dissecta Tixier-Durivault, 1945 thuộc ngành Cnidaria, lớp
Anthozoa, phân lớp Octocorallia, bộ Alcynoceae, họ Alcyoniidae, giống Sinularia.
Sinularia dissecta Tixier-Durivault là một loài san hô mềm sinh sống trong vùng nước biển
mặn, tập trung nhiều và đa dạng ở độ sâu khoảng 15-20m, quanh các rạn san hô của các đảo
hay các bãi đá ngầm. Loài san hô mềm này được phân bố rải rác dọc bờ biển Việt Nam như
đảo Phú Quốc, Thổ Chu, Nam Du (Kiên Giang), Côn Đảo (Bà Rịa-Vũng Tàu), bãi đá ngầm, Phú
Quý (Bình Thuận), quần đảo Trường Sa, vịnh Vân Phong (Khánh Hòa),đảo Lý Sơn (Quảng
Ngãi), Cù lao Xanh (Bình Định), Cù lao Chàm, bán đảo Sơn Trà, quần đảo Hoàng Sa (Đà Nẵng),
đảo Cát Bà, Cô tô, Vịnh Hạ Long (Quảng Ninh) …và một số vùng bờ biển, đảo khác đã được
khảo sát ở biển Đông Việt Nam.
I.2. Tình hình nghiên cứu về hóa học và hoạt tnh sinh học một số loài san hô mềm điển
hình thuộc giống Sinularia trên thế giới
Những nghiên cứu về các chất có hoạt tnh sinh học từ san hô mềm thuộc giống
Sinularia thực sự khởi phát từ những nghiên cứu khảo sát tác dụng chữa ung thư vòm họng
các dịch chiết của các loài san hô mềm như S. grandilobata, S. parva, S. triangula, S.
scabra, S. nanolobata và S. gibberosa đã được tiến hành với mô hình sử dụng dòng tế bào
SCC25 và dòng tế bào HaCaT, kết quả nghiên cứu trên mô hình trên cho thấy dịch chiết của
các loài nêu trên có tác dụng gây chết các tế bào SCC25 và HaCaT theo chương trình, kết quả
này cũng mở ra một hướng nghiên cứu tìm kiếm các hoạt chất có khả năng điều trị bệnh ung
thư vòm họng từ loài san hô mềm Sinularia [3]. Trong khuôn khổ của luận văn, tổng quan này

chỉ đề cập những nghiên cứu hóa học và hoạt tnh sinh học điển hình của một số loài san hô
mềm thuộc giống Sinularia, những loài này được nghiên cứu nhiều và có những kết quả hoạt
tnh rất đáng quan tâm [4-8]. Năm 2012, các hợp chất mới như 9,11-secosteroid (1), 8α
3β,11-dihydroxy-5α,6α-expoxy-24-methylene9,11-secocholestan-9-one (2), granosolide A (3), cùng với một số steroid đã biết như 3β,11dihydroxy-5β,6β-expoxy-24-methylene-9,11-secocholestan-9-one (4) đã được phát hiện từ
dịch chiết EtOAc của san hô mềm Sinularia granosa, các thử nghiệm sinh học cho thấy các
hợp chất mới phân lập được từ loài S. granosa thể


hiện hoạt tính diệt tế bào ung thư trên một số dòng tế bào [9]. Cùng tại thời điểm đó, các
hợp chất thuộc nhóm norcembranoidal diterpene như 5-episinuleptolide acetate (5),
scabrolide D (6) được phân lập từ loài Sinularia sp ở khu vực biển Đông, hợp chất 5episinuleptolide acetate có kết quả gây độc tế bào đối với một số dòng tế bào gây u, các
đánh giá về hoạt tnh trên in vitro, in vivo hợp chất này cho thấy đây là một hợp chất tiềm
năng trong việc bao vây tế bào gây u và gây chết tế bào này theo chương trình [9-10]. Tiếp
tục hướng nghiên cứu các chất gây độc tế bào từ san hô mềm, các nhà khoa học đã tìm ra 7
hợp chất mới thuộc nhóm diterpenoid như fexibilisolides C-G (7-11), fexibilisin C (12), và
một hợp chất có khung mới 11,12-secofexibillin (13) từ san hô mềm Sinularia fexibilis. Hợp
chất mới Flexibilisin C (12), và chất có khung mới 11,12-secoflexibillin (13) có kết quả gây độc
tế bào trên hai dòng tế bào HeLa, B16. Ngoài ra, fexibilisin C (12) được coi là hoạt chất có tác
dụng gây độc tế bào tiềm năng trên hai dòng tế bào SK-Hep1 và B16 [11]. Các tác giả Shi Shen
và cộng sự còn phân lập được năm hợp chất thuộc khung cembrane mới, các hợp chất này
được đặt tên lần lượt là pavidolides A (13)–E (17), đây là lần đầu tiên các hợp chất này được
phân lập từ loài san hô mềm Sinularia pavida, cùng với sarcophytin (18) và chatancin (19)
[12]. Cùng với các nghiên cứu về cấu trúc, nghiên cứu về hoạt tnh gây độc tế bào cho thấy
pavidolides B (14) và C (15) thể hiện khả năng ức chế khá mạnh dòng tế bào ung thư máu
người HL-60 [13]. Năm 2013, một hợp chất dạng diterpenoid mới, hợp chất leptoclalin A (20),
cùng với một số hợp chất cũ thuộc norcembranoid diterpene, được phân lập từ loài san hô
mềm nhân tạo Sinularia leptoclados. Hợp chất leptoclalin A (20) rất hiếm gặp trong các loài
san hô mềm, hợp chất này có khả năng ức chế một số dòng tế bào ung thư như dòng T-47 D
và K-562 [11]. Gần đây nhất, hợp chất 5-Episinuleptolide acetate (21), một hợp chất có tác
dụng gây độc tế bào được phân lập từ san hô mềm Sinularia sp, hợp chất này có tác dụng ức

chết các dòng tế bào K562, Molt 4 và HL 60. Những nghiên cứu sâu hơn về hoạt tnh sinh học
hợp chất 5-Episinuleptolide acetate (21) cho thấy (21) có tác dụng gây độc tế bào rất nhạy đối
với dòng tế bào ung thư máu người HL 60 [14].


Nghiên cứu về các chất có hoạt tnh sinh học từ loài San hô mềm Sinularia dissecta
Tixier-Durivault cũng thu hút được rất nhiều nhà khoa học trên thế giới. Năm 1999, các nhà
khoa học Ấn Độ cũng đã phân lập được 5 hợp chất dạng steroids từ loài san hô mềm
Sinularia dissecta Tixier-Durivault trong đó có 4 hợp chất

mới

dạng

polyhydroxy

steroids là 1,3,6,11-tetraacetate-cholestan1β,3β,5α,6β,11α-pentol

(22),

24-Methylene-1,3,6,11-tetraacetate-cholestan-

1β,3β,5α,6β,11α-pentol

(23),

24-Methylene-1,3,6,11-tetraacetate-cholestan-

1β,3β,5α,6α,11α-pentol


(24),

24(R)-Methyl-11α,12α

triacetatecholestan-1α,3β,6β -triol (25) [15]

-epoxy-1,3,6-


OAc
OAc
OAc

OAc
OAc
22

OH
OAc

O
A
c

23
OH
OAc

OAc
OAc

OAc

O
OAc
24

OH
OAc

O
A

25
OAc

c
Cũng từ loài Sinularia dissecta Tixier-Durivault, năm 2005 nhóm tác giả Pengfei Jin và
cộng sự cũng đã phân lập được 15 hợp chất dạng polyhydroxylated steroids trong đó có 6
chất mới là 3β-acetoxy-1α,11α-dihydroxygorgost-5-en-18- oic acid (26), gorgost-5-en-1
α,3β,11α,18-tetrol (27), 18-acetoxy-1α,3β,11α- trihydroxygorgost-5-ene(28),

24(S)-3β-

acetoxy-1α, 11α-dihydroxyergost-5-en18-oic acid (29), 24(S)-ergost-5-en-1α,3β,11α,18-tetrol (30), dissectolide (31) và
9 hợp chất đã biết được mô tả ở [16]. Một ví dụ khá điển hình là hoạt chất Sinuflexlin,
một hoạt chất kiểu biscembranoid, hoạt chất này được tìm thấy dưới dạng khung
biscembranoid mới, có hoạt tnh gây độc tế bào mạnh phân lập được từ loài san hô mềm
Sinularia flexibilis [17], hoạt chất này hiện đang được thử lâm sàng giai đoạn I với định hướng
dung làm thuốc chữa ung thư [18]. Năm 2003, trong chương trình nghiên cứu các chất có
hoạt tnh sinh học từ san hô mềm do nhóm nghiên cứu của Atallah và cộng sự, các hoạt chất

dạng Norditerpene thể hiện hoạt tính gây độc tế bào trên dòng tế bào ung thư người KB và
Hepa đã được tìm thấy


I.3. Tình hình nghiên cứu về hóa học và hoạt tính sinh học giống Sinularia trong nước
San hô mềm thuộc giống Sinularia chưa có nhiều nghiên cứu ở Việt Nam. Nghiên cứu
ở Việt Nam đầu tiến đối với loài San hô mềm thuộc giống Sinularia được bắt đầu trên loài
Sinularia maxima với việc phân lập và xác định cấu trúc được 19 hợp chất trong đó có 11 hợp
chất mới như 12-hydroxy-scabrolide A (33), 13-epi-scabrolide C (34), sinumaximol A (35)–
I(43), cùng với 8 hợp chất đã biết như scabrolide A (44), yonarolide (45), 5-epi-norcembrene
(46), ineleganolide (47), norcembrene-5 (48), sethukarailin (49), (1S,2E,4S,6E,8S,11R)2,6,12(20)-cembratriene-4,8,11- triol (50) và isomandapamate (51). Các hợp chất này hiện đã
được nghiên cứu về hoạt tính kháng viêm, trong số các hợp chất nêu trên, các hợp chất 13epi- scabrolide C (34), sinumaximol B (36), C(37), và yonarolide (45) thể hiện tiềm năng hoạt
tnh kháng viêm [19-21]. Năm 2013, một nhóm tiếp tục nghiên cứu loài Sinularia dissecta
Tixier-Durivault, đã phân lập được một steroid mới là hợp chất dissesterol,

hợp chất

dissesterol và các hợp chất phân lập được đã được nghiên cứu hoạt tnh kháng viêm và một
số hoạt tính khác, kết quả cho thấy hợp chất dissesterol thể hiện hoạt tnh kháng viêm với giá
trị IC50 là 4.0 ± 0.1 μM [22].
Trên cơ sở đó, luận văn với tiêu đề “Nghiên cứu thành phần hóa học và khảo sát
hoạt tính sinh học san hô mềm Sinularia dissecta ở Việt Nam” được thực hiện. Luận văn
có mục tiêu phân lập được một số hợp chất steroid trong loài san hô mềm Sinularia dissecta
ở Việt Nam, khảo sát hoạt tnh sinh học gây độc tế bào của chúng nhằm tìm kiếm những hợp
chất có hoạt tnh tốt, tạo cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo trong hướng nghiên cứu các
chất có hoạt tnh sinh học từ san hô mềm ở Việt Nam.
NỘI DUNG CỦA LUẬN VĂN GỒM:
1. Phân lập một số hợp chất hóa học từ san hô mềm Sinularia dissecta.
2. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất đã phân lập được.
3. Đánh giá hoạt tính sinh học của các hợp chất đó theo hướng hoạt tính gây độc tế

bào.


CHƯƠNG II. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU II.1. Đối tượng
nghiên cứu
Địa điểm khảo sát và thu thập mẫu tại Hải Vân-Sơn Chà ( TP.Huế ). Mẫu được
thu thập vào tháng 4 năm 2014 ( Ký hiệu là Mẫu số 02 ). Đối tượng mẫu được PGS. TS Đỗ
Công Thung, Viện Tài nguyên và Môi trường Biển Hải phòng định loài. Mẫu được chia làm 2
phần, một phần làm nghiên cứu hóa học và sinh học, một phần nhỏ để làm tiêu bản định loài
(chụp hình tiêu bản, và dùng cho các giám định cần thiết). Tiêu bản được lưu tại Viện Tài
nguyên và Môi trường biển, và lưu tại Viện Hóa sinh biển, Viện Hàn lâm Khoa học và Công
nghệ Việt Nam.

Hình II.1. Ảnh mẫu và ảnh tiêu bản Sinularia dissecta Tixier-Durivault, 1945
Kết quả phân tch mẫu cho thấy mẫu Sinularia dissecta Tixier-Durivault,
1945 có những thông tin như sau:
Kích thước tập đoàn: Kích thước rộng của các tập đoàn đã gặp có những cụm khoảng
vài trăm cm2 nhưng cũng có bắt gặp những cụm khoảng 1 m2. Chiều cao từ chân đế lên tới
đỉnh của các tập đoàn khoảng 5 - 7 cm. Các thùy cao từ 2 –
5 cm, dày từ 0,5-1,5 cm


Hình thái tập đoàn:Tập đoàn dạng phiến với các thùy nhô lên có dạng mào gà. Các
thùy mỏng,dẹt, thấp, thẳng, sắp xếp theo chiều dọc, chiều cao nhất khoảng
50 mm sắp xếp tương đối dày trên phiến của tập đoàn.
Màu sắc:Màu sắc ngoài tự nhiên của tập đoàn là màu nâu, ngả vàng. Sau khi qua quá
trình xử lý và bảo quản thì đa số các tập đoàn có màu trắng.
Polyp: Trong điều kiện tự nhiên các polyp nhô ra quan sát thấy kích thước khoảng 1
mm.
II.2. Phương pháp nghiên cứu

II.2.1. Phương pháp thu thập mẫu sinh vật biển
a. Phương pháp khảo sát, thu mẫu ngoài thực địa
Phương pháp điều tra thành phần loài: san hô mềm được thu mẫu bằng phương pháp
lặn SCUBA. Mẫu san hô mềm được cố định trong dung dịch nước biển – Formalin 4% sau 18
– 22 tiếng, rửa sạch bằng nước biển, bảo quản bằng Ethanol 70 %.
b. Phương pháp phân tích mẫu vật và số liệu trong phòng thí nghiệm và giám định
tên khoa học
Bước 1: Sử dụng dung dịch NaOCl làm tan lớp mô, thu vi xương tại các vị trí khác nhau
trên tập đoàn san hô mềm.
Bước 2: Sử dụng kính hiển vi quang học và điện tử, phần mềm chụp ảnh đo độ dài NIS
– Elements F 3.0 quan sát và đo, chụp vi xương.
Bước 3: Phân loại theo phương pháp hình thái học vi xương san hô mềm
(Nuting, C.C., 1910; Verseveldt, J., 1980a, b, 1982; Grasshoff, M., 1999; Fabricus
& Alderslade, 2001; Utinomi).
II.2.2. Phương pháp nghiên cứu xử lý mẫu, tạo dịch chiết
a.Phương pháp xử lý mẫu
Việc xử lý các mẫu sinh vật biển được thực hiện theo quy trình thống nhất đã được
xây dựng qua các nhiệm vụ khoa học của Viện Hóa sinh biển, cụ thể:


Bước 1. Mẫu san hô mềm sau khi lấy ra khỏi tủ lạnh âm sâu được tiến hành rã đông
bằng cách để trên bệ rửa thí nghiệm, cho nước sạch chảy đều trên bề mặt của mẫu nghiên
cứu, các lớp đá bao quang mẫu san hô mềm được tan từ từ để lộ phần thân của mẫu san hô
mềm. Mẫu được ngâm trong nước lạnh trong thời gian từ 2-3 tiếng nhằm loại bỏ từ từ hàm
lượng muối vô cơ.
Bước 2. Sau khi mẫu san hô mềm đã được rã đông, loại bỏ các phần túi nylon và các
thành phần sinh vật biển khác bám trên bề mặt của mẫu san hô mềm. Lưu lại tiêu bản mẫu,
để mẫu sinh vật biển lên mặt bàn thí nghiệm và chụp ảnh để lưu phần mẫu trước khi xử lý.
Bước 3. Sau khi mẫu san hô mềm đã được loại bỏ các thành phần nylon và các thành
phần khác, mẫu được để trên túi lưới ở nhiệt độ phòng cho đến khi khô hết bề mặt của phần

thân mẫu san hô mềm. Mẫu được cân để thu được khối lượng thực tế trước khi tiến hành xử
lý.
Bước 4. Mẫu được cắt nhỏ thành từ phiến, chiều rộng và dài của phiến tùy theo độ
cứng của mẫu san hô mềm. Các phiến càng mỏng thì khả năng làm khô mẫu và say mẫu càng
thuận lợi.
Bước 5. Sấy và làm khô các mẫu san hô mềm. Các mẫu san hô mềm sau khi đã được
cắt thành các phiến nhỏ được chuyển vào túi lưới và tiến hành làm khô sơ bộ bằng phương
pháp sấy khô trên thiết bị tủ sấy chân không hoặc phơi dưới điều kiện ánh sáng mặt trời (có
tránh tia tử ngoại). Trong quá trình sấy mẫu này, khối lượng mẫu san hô mềm giảm xuống rất
nhanh.
Bước 6. Làm khô mẫu trên thiết bị đông khô
Bước 7. Nghiên mẫu thành bột mịn bằng thiết bị nghiên mẫu.
b. Phương pháp nghiên cứu tạo dịch chiết phân đoạn
Bước 1. Chuẩn bị mẫu thử: Các mẫu san hô mềm được lấy lượng 5 mg mẫu khô, cho
vào bình định mức 10 ml.
Bước 2. Đánh số thứ tự và ký hiệu các bình chiết mẫu. Thêm dung môi theo thứ tự
tăng dần độ phân cực, dung môi được thêm đến vạch định mức.


Bước 3. Toàn bộ các bình chiết được cho lên máy lắc ngang, lắc đều cho dung môi
thấm đều trên bột san hô mềm. Để lắng trong khoảng 1-2 giờ.
Bước 4. Lọc mẫu, phần dịch lọc được cất loại dung môi trên thiết bị cấy quay, dịch
thô thu được cho vào lọ nhỏ phục vụ cho việc kiểm tra lượng vết chất và khả năng hoàn tan
mẫu nghiên cứu.
Bước 5. Sử dụng sắc ký bảng mỏng TLC và hệ dung môi CHCl3: MeOH
với tỷ lệ thích hợp để đánh giá các mẫu thô thu được.
II.2.3. Phương pháp nghiên cứu phân lập và xác định cấu trúc hoá học
a. Phương pháp phân lập chất
Sắc ký lớp mỏng (TLC): Sắc ký lớp mỏng được thực hiện trên bản mỏng tráng sẵn
DC-Alufolien 60 F254 (Merck 1,05715), RP18 F254s (Merck). Phát hiện chất bằng đèn tử

ngoại ở hai bước sóng 254 nm và 365 nm hoặc dùng thuốc thử là dung dịch H2SO4 10% được
phun đều lên bản mỏng, sấy khô rồi hơ nóng trên bếp điện từ từ đến khi hiện màu.
Sắc ký lớp mỏng điều chế: Sắc ký lớp mỏng điều chế thực hiện trên bản mỏng
tráng sẵn Silica gel 60G F254 (Merck, ký hiệu 105875), phát hiện vệt chất bằng đèn tử ngoại
hai bước sóng 254 nm và 365 nm, hoặc cắt rìa bản mỏng để phun thuốc thử là dung dịch
H2SO4 10%, hơ nóng để phát hiện vệt chất, ghép lại bản mỏng như cũ để xác định vùng chất,
sau đó cạo lớp Silica gel có chất, giải hấp phụ bằng dung môi thích hợp.
Sắc ký cột (CC): Sắc ký cột được tiến hành với chất hấp phụ là Silica gel pha thường
và pha đảo. Silica gel pha thường có cỡ hạt là 0,040-0,063 mm (240430 mesh). Silica gel pha đảo ODS hoặc YMC (30-50 m, FuJisilisa Chemical
Ltd.).
Hệ thống sắc ký lỏng trung áp (MPLC): Hệ thống bao gồm Detector UV- vis bước
sóng từ 200-900 nm, bộ lấy mẫu tự đồng (fraction collector) kèm theo với các dãy ống
nghiệm kích thước thay đổi tuy theo lượng mẫu, hệ thống bơm (pump) với khả năng điều
chỉnh áp từ 1 đến 10 bar, tốc độ dòng từ 1 ml/phút đến


200 ml/phút; Cột tách SNAP loại C8, C18 với dung lượng từ 100 g đến 450g mẫu đầu vào.
Hệ thống lấy mẫu tự động (Fraction collector-DC1200). Mẫu được đưa qua cột sắc ký
bằng thủy tinh với pha tnh là silicagel pha thường hoặc pha đảo. Cơ chế phân tách dựa trên
sự tương tác giữa chất và pha tĩnh, dung môi với tỷ lệ phù hợp. Mẫu được thu thập thông qua
máy lấy mẫu tự động.
Các thiết bị sử dụng nêu trên thuộc viện Hóa sinh biển.
b. Phương pháp xác định cấu trúc hóa học các hợp chất
Sử dụng kết hợp nhiều phương pháp phổ hiện đại như: Điểm nóng chảy (Mp) đo trên
máy Thermo Mel Temp 3.0.; Độ quay cực []D đo trên máy JASCO P-2000 polarimeter; Phổ
khối lượng (ESI-MS): Phổ khối lượng phun mù điện tử (Electron Spray Ionization mass
spectra) được đo trên máy AGILENT 1100
HPLCD Trap. Thiết bị của viện Hóa sinh biển.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR): Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR (500 MHz)
và 13C-NMR (125 MHz) được đo trên máy Bruker AM500 FT-NMR Spectrometer. Thiết bị của

viện Hóa học.
Phổ tử ngoại đo trên máy JASCO V630 của viện Hóa sinh biển.
II.2.4.Phương pháp nghiên cứu thử nghiệm hoạt tính diệt tế bào ung thư
Phương pháp thử độ độc tế bào in vitro được Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ (National
Cancer Institute – NCI) xác nhận là phép thử độ độc tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện
các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt TBUT ở điều kiện in vitro. Phép thử này
được thực hiện bởi anti-proliferation KIT theo đúng hướng dẫn của nhà sản xuất (Promega).
Phép thử được thực hiện trong điều kiện cụ thể như sau:
Bước 1: Chất thử (10 l) pha trong DMSO 10% được đưa vào các giếng của khay 96
giếng để có nồng độ sàng lọc là 20 g/ml. Chất thử có hoạt tnh được xác định IC50 nhờ dải
nồng độ 100 g/ml; 20 g/ml; 4 g/ml; 0.8 g/ml.


Bước 2:Tế bào hỗn dịch được đếm trong buồng đếm để điều chỉnh mật độ cho phù hợp
với thí nghiệm.
Bước 3:Thêm vào các giếng thí nghiệm lượng tế bào phù hợp (trong 190 l môi trường)
và để chúng phát triển trong vòng từ 3 ngày.
Bước 4:Một khay 96 giếng khác không có chất thử nhưng có TBUT (200 l)
sẽ được sử dụng làm đối chứng âm.
Bước 5:Thêm 20l dung dịch cơ chất MTS. Ủ ở 37oC trong 1-4 giờ. Sau đó đưa lên máy
lắc đĩa lắc nhẹ trong 10 phút và sử dụng máy ELISA Plate Reader (Bio-Rad) để đọc kết quả về
hàm lượng màu qua phổ hấp phụ ở bước sóng 515nm hoặc 540nm. Khả năng sống sót của tế
bào khi có mặt chất thử sẽ được xác định thông qua công thức sau:
[OD(chất thử) – OD(môi trường trắng)] x 100