BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI 2

LÊ THỊ THU GIANG

NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG GIẢI PHÓNG
CURCUMIN CỦA MÀNG BACTERIAL
CELLULOSE NẠP THUỐC IN VITRO
ĐỊNH HƯỚNG DÙNG QUA DA
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60 42 01 14

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
Hướng dẫn khoa học: TS. Nguyễn Xuân Thành

HÀ NỘI, 2017


LỜI CẢM ƠN
Em xin gửi lời biết ơn tới TS. Nguyễn Xuân Thành đã nhiệt tình hướng
dẫn và hết lòng giúp đỡ em trong thời gian làm luận văn vừa qua.
Em xin trân trọng cảm ơn Ban Giám hiệu, Phòng Sau đại học, các thầy
cô giáo trong khoa Sinh – KTNN, các thầy cô thuộc Viện nghiên cứu Khoa
học và Ứng dụng, Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2, đã tận tình giảng dạy,
tạo mọi điều kiện thuận lợi trong thời gian em học tập và làm nghiên cứu tại
trường.
Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, đồng nghiệp và bạn bè luôn
bên cạnh, động viên, khích lệ, giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này.
Hà nội, ngày 10 tháng 11 năm 2017
Học viên

Lê Thị Thu Giang


LỜI CAM ĐOAN
Tôi xin cam đoan đây là đề tài do chính tôi thực hiện. Các số liệu và kết
quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực, khách quan và chưa được tác giả
nào công bố trong bất cứ công trình nào.
Hà Nội, ngày 10 tháng 11 năm 2017
Học viên

Lê Thị Thu Giang


MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1
1. Lí do chọn đề tài......................................................................................... 1
2. Mục đích nghiên cứu.................................................................................. 5
3. Nhiệm vụ nghiên cứu ................................................................................. 5
4. Vật liệu và phạm vi nghiên cứu ................................................................. 5
5. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................... 5
6. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn ...................................................... 6
NỘI DUNG ....................................................................................................... 7
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN VỀ TÀI LIỆU..................................................... 7
1.1. Một vài đặc điểm của BC........................................................................ 7
1.1.1. Đặc điểm của A. xylinum .................................................................. 7
1.1.2. Đặc tính của màng BC ...................................................................... 8
1.1.3. Các phương pháp sản xuất BC từ A. xylinum................................. 10
1.1.4. Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng tạo
màng BC từ vi khuẩn A. xylinum ............................................................. 11
1.1.5. Ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng.................................... 13

1.1.6. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến khả năng tạo màng BC
từ vi khuẩn A. xylinum .............................................................................. 14
1.1.7. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng màng BC làm vật liệu hấp
thụ và giải phóng thuốc qua da ................................................................ 15
1.2. Sơ lược về Curcumin ............................................................................ 18
1.2.1. Hoạt tính sinh học của Curcumin ................................................... 18
1.2.2. Một số tính chất hóa lý của Curcumin ......................................... 19
1.2.3

Tính khả dụng sinh học của Curcumin ........................................ 20

1.2.4. Tình hình nghiên cứu trên thế giới và Việt Nam ............................ 22


CHƯƠNG 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................................ 25
2.1. Vật liệu nghiên cứu ............................................................................... 25
2.1.1. Giống vi khuẩn ................................................................................ 25
2.1.2. Nguyên liệu và hóa chất.................................................................. 25
2.1.3. Thiết bị và dụng cụ.......................................................................... 25
2.1.4. Môi trường lên men thu màng BC .................................................. 26
2.1.5. Môi trường pH dùng để xác định lượng thuốc giải phóng
thông qua hệ thống được thiết kế [dược điển vn] ..................................... 27
2.2. Phương pháp nghiên cứu ...................................................................... 27
2.2.1. Phương pháp tạo màng và hệ BC nạp thuốc Curcumin. ................ 27
2.2.1.1. Phương pháp lên men thu màng BC từ một số môi trường ......... 27
2.2.1.2. Phương pháp xử lý màng BC trước khi hấp thu thuốc ................ 27
2.2.1.3. Phương pháp đánh giá độ tinh khiết của màng BC .................... 29
2.2.2. Phương pháp dựng đường chuẩn của Curcumin ........................... 30
2.2.3. Phương pháp nghiên cứu giải phóng thuốc từ hệ BC nạp
thuốc với các loại màng BC trong các môi trường khác nhau. ................ 31

2.2.4. Phương pháp nghiên cứu giải phóng thuốc của màng BC qua
hệ thống Franz của các loại màng khác nhau. ......................................... 32
2.2.5. Phương pháp xác định lượng thuốc giải phóng của hệ BC nạp
thuốc .......................................................................................................... 33
2.2.6. Đánh giá động học giải phóng của thuốc từ màng BC .................. 33
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU ....................................................... 35
3.1. Kết quả tạo màng và xử lý màng BC từ các môi trường khác nhau ..... 35
3.1.1. Thu màng BC từ các môi trường lên men ....................................... 35
3.1.2. Quá trính xử lý màng BC trước khi hấp thu thuốc ......................... 35
3.1.3. Xác định điều kiện nuôi cấy để có độ dày màng BC thích hợp ...... 36
3.1.4. Đo bề dày màng BC ........................................................................ 37


3.1.5. Kiểm tra độ tinh khiết của màng BC .............................................. 39
3.1.6. Tìm sự hiện diện của protein trong màng BC tinh chế: ................. 40
3.1.7. Xác định pH của màng BC tinh chế................................................ 41
3.2. Lượng thuốc Curcumin hấp thụ vào màng BC ..................................... 42
3.3. Xác định tỉ lệ thuốc Curcumin giải phóng từ các hệ thống đã thiết
kế .................................................................................................................. 42
3.4. Đánh giá động học giải phóng của thuốc Curcumin từ màng BC ........ 51
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................................. 54
TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 55


DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

A.xylinum

Acetobacte xylinum


A – BC

Agitade – Bacterial cellulose

BC

Bacterial cellulose

BC – Cur

BC – Curcumin

CNM

Cao nấm men

et al

Cộng sự

MT1

Môi trường 1

MT2

Môi trường 2

MT3


Môi trường 3

S – BC

Static – Bacterial celllulose

SGF

Simulated gastric flulid

SIF

Simulated intestinal flulid


DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1. Thành phần dinh dưỡng của CNM ................................................... 9
Bảng 1.2. Thành phần dinh dưỡng của nước vo gạo ........................................ 9
Bảng 1.3. Thành phần dinh dưỡng của nước dừa già. .................................... 10
Bảng 1.4. Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến năng suất sản xuất màng BC .. 11
Bảng 2.1. Môi trường lên men tạo màng BC .................................................. 26
Bảng 2.2. Môi trường đệm với pH = 7,4......................................................... 27
Bảng 2.3. Giá trị mật độ quang (OD) của dung dịch Curcumin ở các nồng độ
(µg/ml) khác nhau (n = 3) ...................................................................... 30
Bảng 3.1. Kết quả thu màng BC tươi ở các độ dày khác nhau ……………..37
Bảng 3.2. Giá trị đo độ dày của màng gạo ...................................................... 38
Bảng 3.3. Giá trị đo độ dày của màng Dừa ..................................................... 38
Bảng 3.4. Giá trị đo độ dày của màng CNM .................................................. 39
Bảng 3.5. Kết quả đo pH ở các lô màng thí nghiệm ....................................... 41
Bảng 3.6. Tỷ lệ thể tích giữa màng BC và dung dịch thuốc. .......................... 42

Bảng 3.7. Tỷ lệ giải phóng thuốc Curcumin (%) của các màng BC hấp thụ
thuốc kích thước 10cmx5cm (n=3)....................................................... 44
Bảng 3.8. Tỷ lệ giải phóng thuốc Curcumin (%) của các màng BC hấp thụ
thuốc kích thước 5cmx3cm (n=3) ....................................................... 46
Bảng 3.9. Tỷ lệ giải phóng thuốc Curcumin (%) của các màng BC hấp thụ
thuốc (n=3) ........................................................................................... 49
Bảng 3.10. Các tham số của quá trình giải phóng thuốc từ các loại màng có độ
dày 0,5 cm (trong môi trường pH = 7,4) theo mô hình động học ......... 51
Bảng 3.11. Các tham số của quá trình giải phóng thuốc từ các loại màng dày
1cm (trong môi trường pH = 7,4) theo mô hình động học .................... 52


DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1. Qui trình xử lý màng BC thô .......................................................... 28
Hình 2.2. Đồ thị biểu diễn sự tương quan giữa độ hấp thụ và nồng độ
Curcumin (pH = 7.4) .......................................................................... 31
Hình 3.1. Hình ảnh màng BC lên men từ các môi trường .............................. 35
Hình 3.2. Màng BC thô ................................................................................... 35
Hình 3.3. Màng BC tinh khiết ......................................................................... 36
Hình 3.3. Hình ảnh đo độ dày màng 0,5cm và 1cm........................................ 38
Hình 3.5. Kết quả tìm sự hiện diện của đường glucose .................................. 41
Hình 3.6. Kết quả tìm sự hiện diện của protein trong dịch chiết màng BC............41
Hình 3.7. Quá trình giải phóng thuốc Curcumin từ màng BC hấp thụ thuốc43
Hình 3.8. Biểu đồ tỉ lệ giải phóng của các loại màng kích thước 10cmx5cm
dày 1cm ............................................................................................... 44
Hình 3.9. Biểu đồ tỉ lệ giải phóng của các loại màng kích thước 10cmx5cm
dày 0.5cm ............................................................................................ 45
Hình 3.10. Biểu đồ tỉ lệ giải phóng của các loại màng kích thước 5cmx3cm
dày 1cm ............................................................................................... 46

Hình 3.11. Biểu đồ tỉ lệ giải phóng của các loại màng kích thước 5cmx3cm
dày 0.5cm ............................................................................................ 47
Hình 3.12. Quá trình giải phóng thuốc Curcumin quamô hình khuếch tán
Franz.................................................................................................... 48
Hình 3.13. Biểu đồ tỉ lệ giải phóng của các loại màng có độ dày 0.5cm........ 49
Hình 3.14. Biểu đồ tỉ lệ giải phóng của các loại màng có độ dày 1cm........... 50


1
MỞ ĐẦU
1. Lí do chọn đề tài
Từ lâu nghệ vàng đã được sử dụng rộng rãi ở nhiều quốc gia châu Á với
vai trò làm gia vị, chất tạo màu trong thực phẩm, chất bảo quản và cũng là
một phương thuốc dân gian hiệu quả chữa trị nhiều loại bệnh khác nhau như
rối loạn tiêu hóa, viêm loét dạ dày, rối loạn chức năng gan mật, thấp khớp,
viêm xoang, hỗ trợ điều trị viêm nhiễm, giúp mau làn vết thương, mau liền da
và làm đẹp da.[1]
Chính vì vậy, trong nhiều thập kỉ qua, Curcumin đã trở thành đối tượng
thu hút hàng nghìn các nghiên cứu khác nhau và đã được chứng minh có
nhiều hoạt tính sinh học mạnh và đa dạng.
Hàng loạt công trình nghiên cứu in vitro và in vivo [1],[2],[3],[10],[26]và
nhiều nghiên cứu lâm sàng cho thấy Curcumin có tác dụng hỗ trợ và điều trị
rất nhiều loại bệnh lí khác nhau. Curcumin giúp làm giảm cholesterol trong
máu, ức chế sự oxy hóa LDL (lipoprotein tỷ trọng thấp), ức chế sự kết tụ tiểu
cầu, ngăn ngừa chứng nghẽn mạnh, bệnh nhồi máu cơ tim, ngăn chặn các
triệu chứng liên quan đến tiểu đượng tuyp 2, hỗ trợ ngăn ngừa các loại bệnh
như viêm thấp khớp, các bệnh đa sơ cứng, bệnh suy giảm trí nhớ, ức chế sự
nhân bản của vius HIV, hỗ trợ làm lành vết thương, trợ bảo vệ gan, tăng sự
đào thải, hỗ trợ trong việc bảo vệ cơ thể khỏi các bệnh đục thủy tinh thể, các
bệnh về phổi, xơ hóa phổi, xơ vữa động mạch. Curcumin là một hợp chất tự

nhiên có tác dụng ức chế sự phát triển của khối u, tăng khả năng miễn dịch,
chất chống oxi hóa mạnh, chữa một số bệnh tiêu hóa, gan mật, kháng khuẩn,
chống viêm,… Sau khi sử dụng các biện pháp tích hợp hiện đại để chiết xuất
Curcumin thì các nhà khoa học nhận ra rằng cản trở lớn nhất khi áp dụng trên
người là Curcumin có tính kị nước cao, tính thấm và độ hòa tan kém nên sinh


2
khả dụng của Curcumin là rất thấp, mặt khác Curcumin có tốc độ chuyển hóa
và thải trừ nhanh, bị thủy phân trong môi trường kiềm và phân hủy khi gặp
ánh sáng, nhiệt độ cao và điều kiện oxi hóa. Khả năng hấp thu kém ở ruột có
thể do độ tan thấp, ngoài ra còn bị phân hủy ở pH trung tính hoặc kiềm và bị
ảnh hưởng chuyển hóa của các enzim. Nghiên cứu đánh dấu phóng xạ đã cho
thấy hầu hết liều uống được bài tiết trong phân và 1/3 Curcumin vẫn không
thay đổi cấu trúc.
Mặc dù Curcumin đã cho thấy khả năng chống lại nhiều bệnh nhưng
hiệu quả điều trị của nó được chứng minh là rất hạn chế. Nguyên nhân khả
dụng của Curcumin còn hạn chế là do kém hấp thu, chuyển hóa nhanh và bị
loại khỏi hệ thống nhanh chóng. Vì vậy để khắc phục những hạn chế trên thì
các nhà khoa học trên thế giới đã tiến hành rất nhiều nghiên cứu như: sử dụng
các chất phụ gia để ngăn chặn sự chuyển hóa Curcumin, sử dụng các hạt nano
– liposome – hay các phức hợp lồng phân tử Curcumin - cyclodextrin, tạo
micell với các chất diện hoạt, bào chế phức hợp phytosome, tạo tiểu phân
nano curcumin với các chất mang polymer, một số nghiên cứu còn tổng hợp
nên cấu trúc tương tự Curcumin nhằm tạo ra các chất nhiều ưu điểm hơn[10].
Hiện nay nhờ sự tiến bộ của khoa học kĩ thuật, những hiểu biết về da ở
mức độ phân tử, tế bào đã được xác định. Đặc biệt là những hiểu biết về tính
chất lí hóa của dược chất liên quan đến khả năng thấm qua da, vai trò của các
chất làm tăng độ thấm của dược chất, đã góp phần thúc đẩy việc nghiên cứu
các dạng bào chế mới phân phối thuốc qua đường da vào đến hệ tuần hoàn.

Hệ trị liệu qua da được thiết kế sao cho dược chất có thể giải phóng và
hấp thu qua da theo mức độ và tốc độ xác định để có tác động toàn thân và
kéo dài với những ưu điểm như: sự hấp thu qua da loại bỏ những yếu tố bất
lợi do ảnh hưởng của các yếu tố liên quan đến sinh lý trong ống tràng như pH,
thực phẩm, nước uống, nhu động ruột,... Thuốc được đưa vào hệ tuần hoàn


3
chung, không bị chuyển hóa qua gan lần đầu, tiện lợi và hữu hiệu hơn so với
đường uống và đường tiêm, linh động trong sử dụng vì có thể điều chỉnh nồng
độ thuốc trong máu bằng cách gỡ bỏ lớp thuốc dán [3].
Trong những năm gần đây đã có sự chú ý đặc biệt về việc sử dụng các
vật liệu sinh học trong các sản phẩm chăm sóc sức khỏe vì khả năng tái tạo,
tương thích sinh học và phân hủy sinh học của chúng. Một trong những vật
liệu sinh học có những đặc tính trên được chú ý là cellulose. Vật liệu này vượt
trội so với các polyme tự nhiên và tổng hợp khác [41]. Trong đó, Bacterial
Cellulose (BC) là đối tượng của nhiều nghiên cứu ứng dụng của các nhà khoa
học trong nước cũng như nước ngoài. Đây là một loại vật liệu mới, được ứng
dụng trong nhiều lĩnh vực như thực phẩm, y học, mỹ phẩm, ... Theo kết quả
nghiên cứu cho thấy màng BC được tạo nên từ các nguyên liệu rẻ tiền, dễ
kiếm, có thể sản xuất trên quy mô công nghiệp. Về mặt tính chất, BC có độ
tinh sạch lớn hơn rất nhiều so với các loại cellulose khác, có thể phân hủy
sinh học, tái chế hay phục hồi hoàn toàn. Ngoài ra, BC còn có độ bền tinh thể
cao, sức căng lớn, trọng lượng thấp, ổn định về kích thước. BC còn là một
mạng polyme sinh học có khả năng giữ nước rất lớn, giải phóng nước kéo dài.
Đồng thời BC còn có tính xốp, độ ẩm cao, có lực bền cơ học cao. Vì vậy, BC
có tiềm năng cao cho các ứng dụng trong các hệ thống giải phóng thuốc qua
da, qua đường miệng và mô - kỹ thuật, và một số ứng dụng y sinh học khác
[8],[15],[19],[22],[27],[29],…
Xét về tiềm năng làm hệ thống giải phóng thuốc qua da, ngoài những

đặc điểm lợi thế trên, màng BC còn là hàng rào cản oxi và các sinh vật khác,
ngăn cản sự phân hủy các cơ chất ở trong tế bào và sự tác động của UV. Đồng
thời BC cũng là vật liệu không gây kích ứng da (do có bản chất là saccarit),
an toàn cho da [29].


4
Gần đây, một số nghiên cứu trên thế giới về việc ứng dụng màng BC làm
vật liệu hấp thu và giải phóng thuốc qua da với một số loại thuốc có hiệu quả
rõ rệt, khắc phục được nhược điểm của thuốc ở dạng thông thường. Việc sử
dụng màng BC cho việc thẩm thấu qua da của nhiều thuốc, cụ thể là lidocaine
[52], [53], ibuprophen [53], caffeine [49], diclofenac [50], amoxicillin [48],
benzalconium chloride [22] và sulfadiazine bạc [44] cho kết quả tích cực. Các
kết quả nghiên cứu này đã chứng minh rằng các tính chất cơ học của BC có
độ bền và trương nở tương tự như da người; hỗ trợ sự phát triển, lây lan, và di
chuyển của tế bào da của con người [15],[17],[22].
Lợi thế lớn nhất từ việc sử dụng màng BC nạp thuốc là khả năng chữa lành
vết thương, đặc tính bảo vệ, không dị ứng với da và khả năng hấp thu dịch tiết
với việc giải phóng các loại thuốc trị liệu có liên quan. Hầu hết các chế phẩm
đắp qua da được sản xuất bởi các vật liệu khác nhau. Do đó, một hệ thống nạp
thuốc có khả năng giải phóng thuốc kéo dài có ít lớp, hoặc thậm chí một lớp duy
nhất có thể đơn giản hóa quy trình sản xuất và giảm chi phí [8], [52].
Trong điều trị nhiễm khuẩn trên da không có triệu chứng toàn thân được
khuyến cáo tránh sử dụng các chế phẩm kháng sinh thường được dùng rộng
rãi toàn thân như penicilin, sulfonamid, streptomycin, gentamicin,..., do có
khả năng gây mẫn cảm và tạo thuận lợi cho phát triển vi khuẩn kháng thuốc.
Để giảm thiểu phát triển vi khuẩn kháng thuốc, chỉ dùng các chế phẩm chứa
các loại kháng sinh bôi trên da.
Với mục đích nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc Curcumin của hệ
thống màng BC nạp thuốc Curcumin với các loại màng BC được tạo ra từ

những môi trường khác nhau định hướng sử dụng tạo hệ trị liệu phóng thích
dược chất kéo dài dùng qua da. Vì vậy chúng tôi đã chọn đề tài: “Khả năng
giải phóng Curcumin của màng Bacterial Cellulose nạp thuốc in vitro
định hướng dùng qua da”.


5
2. Mục đích nghiên cứu
Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc Curcumin của hệ thống màng BC
nạp thuốc Curcumin với các điều kiện giải phóng khác nhau định hướng sử
dụng tạo hệ trị liệu phóng thích dược chất kéo dài dùng qua da.
3. Nhiệm vụ nghiên cứu
 Tạo màng BC và hệ BC nạp thuốc Curcumin.
 Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc của hệ BC nạp thuốc Curcumin
trong môi trường pH=7.4
 Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc của màng BC qua hệ thống
Franz.
4. Vật liệu và phạm vi nghiên cứu
 Vật liệu nghiên cứu: Màng BC; thuốc Curcumin, da động vật thực
nghiệm....
 Phạm vi nghiên cứu: Nghiên cứu khả năng giải phóng thuốc Curcumin
từ hệ BC nạp thuốc Curcumin in vitro.
 Địa điểm nghiên cứu: Viện Nghiên cứu Khoa học và Ứng dụng,
Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2.
5. Phương pháp nghiên cứu
 Phương pháp tạo màng và hệ BC nạp thuốc Curcumin .
 Phương pháp nghiên cứu giải phóng thuốc từ hệ BC nạp thuốc với các
loại màng BC khác nhau trong môi trường pH = 7,4.
 Phương pháp nghiên cứu khả năng giải phóng và thấm qua da động vật
thực nghiệm của thuốc từ hệ BC nạp thuốc.

 Phương pháp xác định lượng thuốc giải phóng của hệ BC nạp thuốc.
 Phương pháp xử lý thống kê.


6
6. Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn
6.1. Ý nghĩa khoa học
Tiếp tục nghiên cứu tiềm năng của hệ BC nạp thuốc trong việc sản xuất
hệ trị liệu giải phóng kéo dài qua da. Việc nghiên cứu ứng dụng hệ BC nạp
thuốc nhằm khắc phục hạn chế của thuốc Curcumin dạng thương mại sẽ mở
ra một hướng sản xuất thuốc hiệu quả.
Đánh giá những ưu nhược điểm của màng BC nạp Curcumin để từ đó đề
xuất hướng nghiên cứu trên các thuốc khác định hướng sử dụng qua da.
6.2. Ý nghĩa thực tiễn
Nếu đề tài thành công thì sẽ giúp bào chế hệ trị liệu phóng thích dược
chất kéo dài dùng qua da nhằm khắc phục nhược điểm của thuốc, tăng hiệu
qua chữa trị và giảm giá thành.


7
NỘI DUNG
CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN VỀ TÀI LIỆU
1.1. Một vài đặc điểm của BC
1.1.1. Đặc điểm của A. xylinum
Vi khuẩn A. xylinum là trực khuẩn hình que, kích thước khoảng 2μm,
đứng riêng lẻ hoặc xếp thành chuỗi, không có khả năng di động. Các tế bào
được bao bọc bởi màng nhầy có bản chất là cellulose. Chúng tích lũy khoảng
4.5% acid acetic trong môi trường, khi nồng độ acid vượt quá giới hạn cho
phép, nó sẽ ức chế hoạt động của vi khuẩn.
A. xylinum thường sống chung với nấm chè trong một loại nước giải khát

dân gian làm từ chè loãng gọi là “Thủy hoài sâm”.
Vi khuẩn A. xylinum thuộc nhóm vi khuẩn gram âm, hiếu khí bắt buộc,
không sinh bào tử. Thường sống trong giấm, rượu nhạt, nước ép hoa quả và
có cả trong đất. Theo Bergey [21], nhiệt độ thích hợp cho vi khuẩn A. xylinum
là 25 – 300C, pH tối ưu là 5.4 – 6.2.
Khi nuôi cấy theo phương pháp tĩnh, vi khuẩn tổng hợp những miếng
cellulose trên bề mặt của dịch nuôi cấy, tại ranh giới giữa bề mặt dịch lỏng và
không khí giàu oxi. Các miếng BC này được gọi là BC trên môi trường tĩnh
(S – BC: Static – Bacterial Cellulose) trong đó chuỗi β-1,4–glucan xếp song
song quanh trục, A. xylinum tạo ra cellulose nhiều hơn và tạo thành màng dày
trên bề mặt môi trường. Màng BC thu được dẻo, dai, dày, có màu trắng trong
hơi ngà màu vàng.
Khi nuôi cấy theo phương pháp động (A – BC: Agitated – Bacterial
Cellulose), một lượng nhỏ cellulose được hình thành dưới dạng huyền phù
phân tán trong đó chuỗi β-1,4- glucan xếp một cách ngẫu nhiên. BC được tạo
ra bằng phương pháp nuôi cấy động dưới dạng các hạt nhỏ, các sợi rối rắm,
cong và không trật tự do sự dao động của môi trường nuôi cấy.


8
Lượng BC được tạo ra giữa hai phương pháp nuôi cấy động và tĩnh cũng
khác nhau: khối lượng màng khô của phương pháp nuôi cấy động nhỏ hơn so
với nuôi cấy tĩnh [4], [23].
1.1.2. Đặc tính của màng BC
Trong nuôi cấy tĩnh, BC tích lũy trên bề mặt môi trường dinh dưỡng
lỏng thành lớp màng mỏng như da, sau khi tinh chế và làm khô tạo thành sản
phẩm tương tự như giấy da với độ dày 0.01 - 0.5nm. Màng BC sản xuất bởi
các chủng A. xylinum có độ tinh sạch cao so với màng PC như hemicellulose,
pectin và lignin. Nó thể hiện tính độc nhất và cấu trúc đặc tính sinh hóa như
sợi nano siêu mịn với cấu trúc mạng (1.5 – 2 nm chiều rộng) (Patel & Suresh

2008) [55], trơ, có thể bị phân hủy sinh học, không độc, không gây dị ứng và
ổn định về hóa học (Amin et al., 2012; Grzegorczyn & Slezak 2007;
Neelobon S et al., (2007) [16], [33], [46]. BC thể hiện độ hấp thụ nước tốt do
cấu trúc mặt lưới của nó cung cấp một diện tích bề mặt lớn đảm bảo cho nó
hấp thụ nước một cách tốt nhất (khoảng 200 lần trọng lượng của nó) (Patel &
Suresh, 2008; Wippermann et al., 2009) [47], [57]. Ngoài ra, nghiên cứu cho
thấy BC có độ kết tinh và độ bền cơ học cao, khả năng đàn hồi tốt và độ bền
ướt cao do cấu trúc mạng lưới xơ thống nhất và siêu mịn của nó. Đặc biệt, nó
có khả năng cản khuẩn mà không làm thay đổi cấu trúc hay tính chất (Czaja et
al., 2007; Hu et al., 2009; Wan et al., 2009) [28], [36], [55]. Với các đặc tính
trên, BC rất phù hợp để chọn lựa cho ứng dụng hấp thu và giải phóng thuốc.
Nguyên liệu để nuôi A. xylinum nhằm thu màng BC là môi trường tổng hợp từ
các nguồn dinh dưỡng cần thiết như nguồn cacbon, nitơ, nguồn sulfur và
phospho, các yếu tố tăng trưởng và các yếu tố vi lượng. Nhu cầu sử dụng
đường của A. xylinum là rất lớn và giữ vai trò quan trọng trong quá trình tổng
hợp BC nên có rất nhiều nghiên cứu và đề nghị sử dụng các sản phẩm thứ cấp
trong các ngành công nghiệp khác như: rỉ đường, nước dừa già, nước mía,...


9
để làm nguyên liệu trong nuôi cấy A. xylinum. Trong đề tài nghiên cứu này tôi
đã sử dụng ba môi trường để làm nguyên liệu nuôi cấy A. xylinum, đó là môi
trường CNM, nước dừa già và nước vo gạo. Theo [7] thì thành phần dinh
dưỡng của các môi trường như sau:
Bảng 1.1. Thành phần dinh dưỡng của CNM
Giá trị dinh dưỡng

100g

Calo


185kcal

Lipid

0.9g

Cholesterol

0g

Natri

2.962mg

Kali

2.100mg

Cacbohydrat

20g

Chất xơ

7g

Đường

1.6g


Protein

24g

Vitamin A

0IU

Vitamin C

0mg

Canxi

67mg

Sắt

4mg

Bảng 1.2. Thành phần dinh dưỡng của nước vo gạo
Thành phần

Hàm lượng

Vitamin nhóm B ( B1, B2, B5, B6)

30% - 60%


Protein

15.7%

Đường

2%

Khoáng chất

Fe ( 7% - 8%) , Zn ( 12% - 13%)

Acid amin

leucine , valine , lysine


10
Bảng 1.3. Thành phần dinh dưỡng của nước dừa già.
Nước (%)

94.99 Đồng (mg/100g)

0.04

Protein (%)

0.72

Mangan (mg/100g)


0.142

Chất béo toàn phần (%)

0.2

Selen (µg/100g)

1

Cacbohydrat (%)

3.17

Vitamin C (mg/100g)

2.4

Đường (%)

2.16

Vitamin B1 (mg/100g)

0.03

Canxi (mg/100g)

24


Vitamin B2 (mg/100g)

0.057

Sắt (mg/100g)

0.29

Vitamin B3 (mg/100g)

0.08

Magiê (mg/100g)

25

Vitamin B5 (mg/100g)

0.043

Photpho (mg/100g)

20

Vitamin B6 (mg/100g)

0.032

Kali (mg/100g)


250

Vitamin B9 (µg/100g)

3

Natri (mg/100g)

105

Kẽm (mg/100g)

0.1

1.1.3. Các phương pháp sản xuất BC từ A. xylinum
1.1.3.1. Lên men tĩnh
Môi trường dinh dưỡng để lên men A. xylinum được cho vào các khay
lên men có bề mặt thoáng rộng. Trong quá trình lên men các khay được đậy
bằng giấy báo có độ xốp, giúp tạo độ thông khí giữa môi trường lên men và
môi trường bên ngoài nhưng vẫn tránh được khả năng nhiễm khuẩn. Nhiệt độ
thích hợp cho quá trình lên men là 28 – 300C. Sợi cellulose mới được tổng
hợp sẽ di chuyển lên bền mặt của môi trường nuôi cấy tạo thành lớp màng
cellulose nằm ở mặt phân cách giữa môi trường lỏng và không khí. Cellulose
tiếp tục được tổng hợp bám lên màng cellulose bên trên. Sau 7 - 10 ngày có
thể thu BC [46].
1.1.3.2. Lên men động
Vi khuẩn A. xylinum thường được nuôi cấy trong môi trường nuôi cấy
lắc. Cấy dịch huyền phù vi khuẩn đã được hoạt hóa vào môi trường nuôi cấy



11
đã chuẩn bị sẵn trong các bình tam giác erlen rồi đem đi lắc trong các máy lắc
ổn nhiệt ở 28 – 300C, 180 – 200 vòng /phút [56]. BC được tạo ra từ môi
trường lắc có dạng hạt nhỏ, hạt hình sao và các sợi dài, chúng phân tán rất tốt
trong môi trường. Lượng O2 hòa tan trong môi trường ảnh hưởng lớn đến sự
sinh trưởng và khả năng tổng hợp BC của vi khuẩn A. xylinum. Do đó, quá
trình lên men đạt hiệu quả cao, các receptor có sục khí thường xuyên được sử
dụng lên men [35].
1.1.4. Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng tạo màng BC
từ vi khuẩn A. xylinum
1.1.4.1. Ảnh hưởng hàm lượng glucose
Sự hình thành màng BC, vi khuẩn chịu ảnh hưởng trực tiếp của thành
phần môi trường dinh dưỡng đặc biệt là nguồn cacbon có ảnh hưởng mạnh
mẽ tới sinh trưởng cũng như tổng hợp cellulose của A. xylinum. Cacbon có
trong tế bào chất, thành tế bào, trong tất cả các phân tử enzyme, axit nucleic
và các sản phẩm trao đổi chất. Chính vì vậy, những hợp chất chứa hữu cơ có
chứa cacbon có ý nghĩa hàng đầu trong đời sống của vi sinh vật [6].
Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến năng suất sản xuất màng BC được thể
hiện ở bảng 1.4 [6].
Bảng 1.4. Ảnh hưởng của nguồn cacbon đến năng suất sản xuất màng BC
Nguồn cacbon

Năng suất tổng

Nguồn cacbon

Năng suất tổng hợp

Monosaccharide


hợp cellulose

Disaccharide

cellulose

D – Glucose

100

Lactose

16

D – Fructose

92

Mantose

7

D – Galactose

15

Sucrose

33


D – Xylose

11

Cellobiose

D – Arabinos

14

D – Sorbose

11

7 - 11


12
1.1.4.2. Ảnh hưởng của hàm lượng (NH4)2SO4
Nguồn nitơ cung cấp cho cơ thể vi sinh vật nguyên liệu để hình thành
các nhóm amin (-NH2 và –NH-) trong các phân tử aminoaxit, nucleotit, các
bazơ dị vòng và các hợp chất hóa học trong nguyên sinh chất giúp cho sinh
vật sinh trưởng và phát triển [6]. Nguồn nitơ dễ hấp thụ nhất đối với vi sinh
vật là NH3 và NH4+. Vi sinh vật có khả năng đồng hóa tốt nitơ chứa trong các
thức ăn hữu cơ. Do đó, khi nuôi cấy vi khuẩn A. xylinum người ta thường sử
dụng nguồn nitơ vô cơ là (NH4)2SO4, NH4NO3, nguồn nitơ hữu cơ là pepton,
cao thịt, cao nấm men [9].
1.1.4.3. Ảnh hưởng của hàm lượng KH2PO4
Photpho có ảnh hưởng rất lớn đến quá trình trao đổi chất của vi khuẩn

nên khi thay đổi nồng độ, hợp chất photpho trong môi trường sẽ dẫn đến thay
đổi các quá trình tổng hợp. Hàng loạt các chất hợp phần có chứa photpho, tế
bào chất và chất nhân. Photpho ngoài việc tham gia cấu tạo nên thành phần
của tế bào nó còn có vai trò quan trọng trong tổng hợp cellulose ở vi khuẩn A.
xylinum. Để đảm bảo nguồn dinh dưỡng photpho, người ta sử dụng các loại
photpho vô cơ như KH2PO4, K2HPO4, KNO3,... [6]. Việc bổ sung photphat
(nhất là photphat kali) vào các môi trường dinh dưỡng còn có tác dụng tạo ra
tính đệm của môi trường [6].
Ngoài ra, còn nhiều nguyên tố vi lượng cũng có vai trò ảnh hưởng đến
sinh trưởng của vi khuẩn A. xylinum và quá trình hình thành màng BC như
Mg, Fe, S, Ca, Mn, Na, Cl,... Nếu thiếu một trong số các nguyên tố vi lượng
thì vi khuẩn A. xylinum không thể sinh trưởng và phát triển bình thường được.
Đối với vi khuẩn A. xylinum, nguyên liệu chủ yếu hiện nay được sử dụng
là nước dừa già, nước vo gạo, dịch hoa quả, rỉ đường,... khi nuôi cấy không
cần phải bổ sung các nguyên tố vi lượng nữa [7].


13
1.1.5. Ảnh hưởng của chất kích thích sinh trưởng
Các vitamin như: vitamin B6, vitamin B3 được xác định là cần thiết cho
sự tăng trưởng tế bào và tổng hợp cellulose, trong khi vitamin B2 và vitamin
B5 cho kết quả ngược lại.
Nước dừa già là nguyên liệu chủ yếu được sử dụng để nuôi cấy vi khuẩn
A. xylinum thu màng BC. Tùy theo giống dừa, tuổi của quả dừa mà các thành
phần hóa học trong nước dừa có khác nhau. Lượng đường và protein trong
nước dừa tăng lên khi dừa gần già (cao nhất là vào tháng thứ 9, sau đó giảm
dần). Đường trong quả dừa có thể là glucose, fructose, sucrose hay sorbitol
[11]. Ngoài ra, trong nước dừa còn có nhiều khoáng chất, vitamin, axit
amin,... phù hợp cho quá trình sinh trưởng và quá trình hình thành màng BC
của vi khuẩn A. xylinum [11].

Môi trường nuôi cấy A. xylinum là môi trường tổng hợp từ các nguồn
dinh dưỡng cần thiết như nguồn cacbon, nitơ, nguồn sulfur và phospho, các
yếu tố tăng trưởng và các yếu tố vi lượng. Ngoài ra, nước vo gạo cũng được
xem là môi trường thích hợp trong nuôi cấy A. xylinum.
Nước vo gạo là môi trường thích hợp để nuôi cấy vi khuẩn vì trong nước
vo gạo chứa nhiều chất dinh dưỡng và các chất kích thích tố tăng trưởng như
nhóm vitamin B1, B3, B5, nhóm khoáng chất như sắt, đồng, kẽm và các acid
amin.
Nước vo gạo sau khi vo được sử dụng không quá 3 giờ, tránh để nước bị
chua làm cho đường, vitamin và các chất dinh dưỡng khác giảm đi dẫn đến
cho hiệu suất kém.
Trong quá trình tăng trưởng, nitơ là một trong những nguồn dinh dưỡng
để sinh tổng hợp các cấu tử của tế bào. Vì vậy, pepton có ảnh hưởng rõ rệt
đến sự tăng trưởng của vi khuẩn trong khi cao nấm men không ảnh hưởng
nhiều đến sự tăng trưởng của A. xilynum [6], [7].


14
1.1.6. Ảnh hưởng của điều kiện nuôi cấy đến khả năng tạo màng BC từ vi
khuẩn A. xylinum
1.1.6.1. Độ pH
Vi khuẩn A. xylinum phát triển thuận lợi trên môi trường có pH thấp. Do
đó, trong môi trường nuôi cấy cần bổ sung thêm acid acetic nhằm acid hoá
môi trường. Đồng thời acid acetic còn có tác dụng sát khuẩn, giúp ngăn chặn
sự phát triển của các vi sinh vật có hại [7].
1.1.6.2. Nhiệt độ
Theo Beyger (1992) [18] nhiệt độ thích hợp với vi khuẩn A. xylinum từ
0

25 - 30 C. Ở nhiệt độ thấp quá trình lên men xảy ra chậm. Ở nhiệt độ cao sẽ

ức chế hoạt động và đến mức nào đó sẽ đình chỉ sự sinh sản của tế bào và
hiệu suất lên men sẽ giảm.
1.1.6.3. Độ thông khí
Vi khuẩn A. xylinum là vi khuẩn hiếu khí bắt buộc. Điều kiện tiên quyết
khi lên men tạo sinh khối là điều kiện thông khí. Trong cơ chế của quá trình
lên men, lượng oxi cần cung cấp là tương đối lớn. Trong thực tế độ thông khí
quyết định đến năng suất tổng hợp BC. Vì vậy hình thức sục khí cung cấp oxi
và sử dụng cánh khuấy trong lên men động là phù hợp cho sản lượng BC cao
trong lên men chìm. Lên men tĩnh cần sử dụng dụng cụ có bề mặt rộng,
thoáng và lớp môi trường mỏng [21], [36].
Wanatabe và Yamanaka (2009) [55] phát hiện ra áp suất oxi cũng ảnh
hưởng đến khả năng hình thành cellulose vi khuẩn. Cellulose hình thành dưới
áp suất oxi thấp có sự phân nhánh nhiều hơn so với trong điều kiện áp suất oxi
cao. Do đó ảnh hưởng trực tiếp đến hình dạng và độ chịu lực của lớp màng BC.
1.1.6.4. Thời gian nuôi cấy
Trong môi trường dinh dưỡng lỏng, sau 24 giờ nuôi cấy sẽ xuất hiện một
lớp đục trên bề mặt, phía dưới có những sợi tơ nhỏ hướng lên. Sau 36 - 48
giờ, hình thành một lớp trong và ngày càng dày.


15
Theo Thesis Holmes (2004) [51], hàm lượng glucose trong môi trường
giảm dần sau 150 giờ nuôi cấy. Sau khi glucose trong môi trường hết thì vi
khuẩn bắt đầu sử dụng axit gluconic và 5 – keto axit gluconic trong quá trình
trao đổi chất. Tác giả cho rằng sau 6 ngày độ kết tinh của màng đạt đến trạng
thái tốt nhất.
1.1.6.5. Ảnh hưởng giữa bề mặt và thể tích dịch nuôi cấy (tỷ lệ S/V)
Theo tác giả Đinh Thị Kim Nhung và cs [5], [6] khả năng hình thành
màng tốt nhất ở tỷ lệ S/V = 0.8 với chiều cao môi trường trong dụng cụ lên
men h = 1.25cm.

1.1.7. Tình hình nghiên cứu và ứng dụng màng BC làm vật liệu hấp thụ và
giải phóng thuốc qua da
1.1.7.1. Trên thế giới
Với những đặc tính độc đáo trên, BC là vật liệu hấp dẫn cho các nhà
khoa học nghiên cứu ứng dụng trong nhiều lĩnh vực trong đó có lĩnh vực dùng
BC làm vật liệu hấp thụ và giải phóng thuốc qua da.
Một số nghiên cứu trên thế giới về khả năng hấp thụ và giải phóng thuốc
của màng BC định hướng sử dụng qua da với một số loại thuốc đã cho thấy
có hiệu quả rõ rệt, khắc phục được một số nhược điểm của thuốc ở dạng
thông thường.
Một trong những ứng dụng y sinh học nổi tiếng nhất của BC là như là
một một màng cản khuẩn cho những vết thương hở nghiêm trọng. Các nghiên
cứu của (Fontana và cộng sự (1990); Czaja và cộng sự (2007) đã chỉ ra BC có
khả năng băng kín vết thương, duy trì dịch tiết, làm giảm đau vết thương, tăng
tốc tái tạo tế bào, làm giảm tỷ lệ nhiễm trùng vết thương, giảm sẹo và dễ dàng
tháo gỡ, kiểm tra. Bên cạnh đó, với vết thương mất da, nhiễm trùng trên da,
BC đáp ứng được nhu cầu giữ ẩm cho da, tránh da bị khô.


16
Để tăng khả năng giữ ẩm cho da của BC, một số tác giả nghiên cứu về
lidocaine [52], [53], ibuprophen [53], caffeine [49], diclofenac [50],
amoxicillin [48], benzalconium chloride [22] cho thấy việc bổ sung glycerol
vào màng BC giúp màng linh động hơn và tạo điều kiện giữ ẩm cho bề mặt
da. Tất cả các loại thuốc trên đã được thử nghiệm in vitro cho thẩm thấu qua
da và so sánh với cách thức thông thường. Kết quả cho thấy lidocaine
hydrochloride giải phóng từ BC qua màng da nhân tạo chậm hơn ibuprofen
(một chất ưu lipit). Kết quả này cho thấy màng BC có cấu trúc mạng không
gian ba chiều phức tạp đã làm cho sự khuếch tán của thuốc được kéo dài và
làm giảm tỷ lệ giải phóng thuốc khi so sánh với các cách thức thông thường,

đây là một lợi thế cho việc điều trị dài hạn của thuốc mà không gây tình trạng
quá mẫn [53]. Bên cạnh đó, Luan J. và cộng sự (2012) [44] đã nghiên cứu
màng BC cho băng vết thương nạp sulfadiazine bạc, một loại thuốc phổ biến
được sử dụng trong điều trị vết thương nhiễm khuẩn do bỏng. Nó đã được
chứng minh rằng sau khi sử dụng màng BC ngâm tẩm bạc sulfadiazine, hoạt
động kháng khuẩn đối với P. aeruginosa, E. coli và S. aureus đạt hiệu quả tốt
hơn dạng kem bôi hay dung dịch thông thường.
Nghiên cứu của Wei B. và cộng sự (2011) cho thấy màng khô BC thu
được sau khi ngâm trong benzalkonium chloride (một tác nhân kháng khuẩn)
có khả năng giải phóng thuốc trên mỗi đơn vị diện tích bề mặt đã được tìm
thấy là 0,116 kg/cm2, và tác dụng của thuốc kéo dài ít nhất 24h chống lại hoạt
động của S. aureus và B. subtilis. Sợi BC với các hạt nano bạc đã sản xuất
thành công lên đến 99,99% hoạt tính kháng khuẩn chống lại E. coli và S.
Aureus. Đồng thời trong các thí nghiệm trên vết thương hở bị nhiễm khuẩn,
BC cũng có vai trò như màng cản khuẩn, giảm sự xâm nhập của vi khuẩn
mới, giúp vết thương nhanh hồi phục [22]. Nghiên cứu khác cho thấy việc sử
dụng nanocomposites bạc với BC đã cho hiệu quả kháng khuẩn cao. Các S-