BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA CHĂN NUÔI THÚ Y


LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
ĐÁNH GIÁ HIỆU GIÁ KHÁNG THỂ SAU TIÊM
PHÒNG VACCIN CÚM GIA CẦM TẠI MỘT SỐ
HUYỆN CỦA TỈNH ĐỒNG NAI

Sinh viên thực hiện: Trịnh Khánh Hòa
MSSV : 07159005
Lớp : Dược Y 33
Ngành: Dược Thú Y
Khóa : 2007-2012

-2012-

 
 


MỤC LỤC
MỤC LỤC .....................................................................................................................i 
DANH SÁCH CÁC BẢNG ........................................................................................iv 
DANH SÁCH CÁC HÌNH ..........................................................................................v 
DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT ........................................................................vi 
TÓM TẮT LUẬN VĂN ........................................................................................... vii 
Phần 1 MỞ ĐẦU ..........................................................................................................1 
Phần 2 TỔNG QUAN ..................................................................................................3 
2.1 Bệnh cúm gia cầm .............................................................................................3 

2.2 Căn bệnh ............................................................................................................4 
2.2.1 Hình thái .....................................................................................................4 
2.2.2 Cấu trúc ......................................................................................................5 
2.3 Miễn dịch học ....................................................................................................6 
2.3.1 Đáp ứng miễn dịch dịch thể: ......................................................................6 
2.3.2 Miễn dịch qua trung gian tế bào .................................................................7 
2.4 Truyền nhiễm học ..............................................................................................8 
2.4.1 Loài nhạy cảm ............................................................................................8 
2.4.2 Sức đề kháng ..............................................................................................8 
2.4.3 Sự bài thải và đường truyền lây của virus ..................................................9 
2.5 Sinh bệnh học...................................................................................................10 
2.5.1 Cơ chế sinh bệnh ......................................................................................10 
2.5.2 Thời gian ủ bệnh .......................................................................................10 
2.5.3 Triệu chứng lâm sàng ...............................................................................10 
2.6 Bệnh tích ..........................................................................................................12 
2.6.1 Bệnh tích đại thể .......................................................................................12 
2.6.2 Bệnh tích vi thể.........................................................................................12 
2.7 Chẩn đoán ........................................................................................................13 
2.7.1 Chẩn đoán lâm sàng .................................................................................13 

i
 


2.7.2 Chẩn đoán phòng thí nghiệm....................................................................13 
2.7.2.1 Chẩn đoán kháng nguyên .....................................................................13 
2.7.2.2 Phát hiện kháng thể ..............................................................................14 
2.8 Chỉ tiêu khảo sát ..............................................................................................15 
2.9 Phương pháp tính toán và xử lý số liệu ...........................................................15 
Phần 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................................17 

3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện ......................................................................17 
3.2 Đối tượng nghiên cứu ......................................................................................17 
3.3 Nội dung nghiên cứu........................................................................................17 
3.4 Vật liệu xét nghiệm ..........................................................................................17 
3.5 Nguyên liệu xét nghiệm ...................................................................................17 
3.6 Thiết bị, dụng cụ và hóa chất ...........................................................................18 
3.6.1 Thiết bị .....................................................................................................18 
3.6.2 Dụng cụ ....................................................................................................18 
3.6.3 Hóa chất ....................................................................................................18 
3.7 Phương pháp thực hiện ....................................................................................18 
3.8 Phương pháp xét nghiệm .................................................................................21 
3.8.1 Các bước chuẩn bị ....................................................................................21 
3.8.2 Phản ứng HA (heamagglutination test) ....................................................22 
3.8.3 Phản ứng HI (Heamagglutination Inhibitory) ..........................................24 
Phần 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .......................................................................27 
4.1 Tỷ lệ mẫu huyết thanh có kháng thể đủ bảo hộ với virus cúm gia cầm và giá
trị MG (phân tuýp H5) ...........................................................................................27 
4.2 Tỷ lệ mẫu huyết thanh có kháng thể đủ bảo hộ với virus cúm gia cầm và giá
trị MG (phân tuýp H5) theo huyện-thị xã ..............................................................28 
4.3 Tỷ lệ mẫu huyết thanh có kháng thể đủ bảo hộ với virus cúm gia cầm và giá
trị MG (phân tuýp H5) theo lứa tuổi ......................................................................31 
4.4 Tỷ lệ mẫu huyết thanh có kháng thể đủ bảo hộ với virus cúm gia cầm và giá
trị MG (phân tuýp H5) theo hướng sản xuất .........................................................33 

ii
 


4.5 Tỷ lệ mẫu huyết thanh có kháng thể đủ bảo hộ với virus cúm gia cầm và giá
trị MG (phân tuýp H5) theo quy mô ......................................................................35 

Phần 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................................38 
5.1 Kết luận ............................................................................................................38 
5.2 Đề nghị .............................................................................................................39 
TÀI LIỆU THAM KHẢO ..........................................................................................40 
PHỤ LỤC ...................................................................................................................45 

iii
 


DANH SÁCH CÁC BẢNG
 

Bảng 3.1 Các loại vaccine tiêm phòng bệnh cúm gia cầm ........................................20 
Bảng 3.2 Sơ đồ cách thực hiện phản ứng HA ...........................................................23 
Bảng 4.1 Tỷ lệ mẫu huyết thanh có kháng thể đủ bảo hộ với virus cúm gia cầm và
giá trị MG (phân tuýp H5) .........................................................................................27 
Bảng 4.2 Tỷ lệ mẫu huyết thanh có kháng thể đủ bảo hộ với virus cúm gia cầm
(phân tuýp H5) theo huyện-thị xã ..............................................................................28 
Bảng 4.3 Tỷ lệ mẫu huyết thanh có kháng thể đủ bảo hộ với virus cúm gia cầm và
giá trị MG (phân tuýp H5) theo lứa tuổi ....................................................................31 
Bảng 4.4 Tỷ lệ mẫu huyết thanh có kháng thể đủ bảo hộ với virus cúm gia cầm và
giá trị MG (phân tuýp H5) theo hướng sản xuất ........................................................33 
Bảng 4.5 Tỷ lệ mẫu huyết thanh có kháng thể đủ bảo hộ với virus cúm gia cầm và
giá trị MG (phân tuýp H5) theo quy mô ....................................................................35 
 
 

iv
 



DANH SÁCH CÁC HÌNH
 

Hình 2.1 Hình thái của virus cúm chụp dưới kính hiển vi điện tử ..............................4 
Hình 2.2 Cấu trúc của virus cúm gia cầm ...................................................................5 
Hình 2.3 Vòng truyền lây virus cúm (Nguồn: www.Medical Ecology.org) ...............8 
Hình 2.4 Một số triệu chứng trên gà mắc bệnh cúm gia cầm....................................11 
Hình 2.5 Một số bệnh tích trên gà do virus cúm gây ra ............................................13 
 
 

v
 


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ARN

Acide ribonucléique

FAO

Food and Agriculture Organisation

HA

Hémagglutinine


IAHP

Influenza A hautement pathogène

IHA

Inhibition de l’hémagglutination

NA

Neuraminidase

OIE

Organisation Internationale des Epizooties (Ancienne appellation de
l'Organisation Mondiale de la Santé Animale)

PBS

Phosphate Buffer Saline

RT - PCR

Reverse transcriptase - polymerase chain reaction

UHA

Unité d’hémagglutination

vi

 


TÓM TẮT LUẬN VĂN

Đề tài “Đánh giá hiệu giá kháng thể sau tiêm phòng cúm gia cầm tại một số
huyện của tỉnh Đồng Nai” được thực hiện trong 4 tháng (2/2012-6/2012) tại 27
trại chăn nuôi thuộc 3 huyện của tỉnh Đồng Nai (Long Khánh, Thống Nhất, Trảng
Bom). Với 1070 mẫu huyết thanh được lấy tại các trại và sau đó được phân tích tại
phòng Chẩn Đoán Xét Nghiệm Thú Y của tỉnh Đồng Nai.
Phản ứng HI được sử dụng để phát hiện và đánh giá hiệu giá kháng thể trong
huyết thanh gà mà chúng tôi nghiên cứu. Tỷ lệ gà được bảo hộ và giá trị MG sau
tiêm phòng cúm gia cầm theo các yếu tố ảnh hưởng dựa trên sự sản sinh ra kháng
thể cũng được kiểm tra. Chúng tôi có các kết quả sau :
-

Tỷ lệ gà có kháng thể đủ bảo hộ sau khi tiêm là 95,7 % và MG = 104.

-

Theo huyện : Đàn gà của huyện Trảng Bom đạt tỷ lệ bảo bộ cao nhất (97,11
%) và MG = 112.

-

Theo lứa tuổi : tỷ lệ bảo hộ trên nhóm gà lớn hơn 40 tuần tuổi là cao nhất
(100 % ) và MG = 169.

-


Theo hướng sản xuất : tỷ lệ bảo hộ trên nhóm gà giống là cao nhất (99,12 %)
và MG = 112.

-

Theo quy mô tổng đàn : tỷ lệ bảo hộ trên nhóm quy mô lớn (> 20000 con) là
cao nhất (95,73 %) và MG = 104.

Theo kết quả thu được, chúng tôi đưa ra kết luận rằng việc tiêm phòng vaccin
chống cúm gia cầm ở 3 huyện của tỉnh Đồng Nai được thực hiện rất tốt.
Từ khóa : cúm gia cầm, IAHP, sự tiêm phòng, IHA, sự bảo hộ , giá trị MG.

 

vii
 


Phần 1
MỞ ĐẦU
Cúm gia cầm (Avian influenza) là một bệnh truyền nhiễm cấp tính của nhiều
loài bao gồm cả trên người và động vật do các phân type (subtype) của nhóm virus
cúm type A (Influenza virus A) thuộc họ Orthomyxoviridae gây nên.
H5N1 là một phân type virus cúm gia cầm có độc lực cao xuất hiện gần đây
tại các nước Châu Á, Châu Âu, Châu Phi đã được chứng minh là có khả năng lây
nhiễm từ động vật sang người và gây bệnh trên người trong các vụ dịch cúm gia
cầm những năm 1996 - 2008.
Tại Việt Nam, dịch cúm gia cầm H5N1 liên tục xảy ra từ cuối năm 2003 cho
đến nay đã gây thiệt hại kinh tế nặng nề cho các vùng bị dịch. Để chủ động khống
chế, tiến tới thanh toán bệnh cúm gia cầm, nhiều biện pháp tổng hợp đã được áp

dụng: giám sát sự tồn tại và lưu hành của virus, chẩn đoán sớm, tiêu hủy gia cầm
mắc bệnh và nghi mắc bệnh, tiêu độc, khử trùng các cơ sở chăn nuôi bị dịch, kiểm
dịch vận chuyển động vật, kiểm soát giết mổ, tăng cường các biện pháp an toàn sinh
học; tuyên truyền, giáo dục người dân chủ động phòng ngừa dịch bệnh và sử dụng
vaccine tiêm phòng. Trong các giải pháp phòng chống dịch bệnh nêu trên thì việc
sử dụng vaccine được xem như là một biện pháp nhằm làm giảm thiệt hại do bệnh
cúm gia cầm gây ra đối với ngành chăn nuôi gia cầm và cũng làm giảm nguy cơ lây
nhiễm của virus H5N1 sang người.
Đồng Nai là tỉnh nằm trong vùng kinh tế trọng điểm phía Nam, nên có nhiều
điều kiện thuận lợi cho ngành chăn nuôi nói chung, đặc biệt chăn nuôi gia cầm nói
riêng (hiện nay tổng đàn gia cầm của tỉnh là trên 9 triệu con). Do vậy, để bảo vệ đàn
gia cầm phục vụ cho công tác sản xuất thì việc tiêm phòng và giám sát virus cúm

1
 


gia cầm phải được thực hiện đầy đủ. Hằng năm, tỉnh đã thực hiện công tác tiêm
phòng cúm gia cầm định kỳ 2 lần trong năm đối với các hộ nuôi gia cầm nhỏ lẻ và
giám sát định kỳ việc tiêm phòng cúm ở các trang trại chăn nuôi gà (tỷ lệ tiêm
phòng đạt trên 96% tổng đàn gia cầm trong diện tiêm). Sau mỗi đợt tiêm phòng đều
lấy mẫu đánh giá mức độ đáp ứng miễn dịch của đàn gia cầm được tiêm phòng.
Việc đánh giá đáp ứng miễn dịch của đàn gia cầm sau khi sử dụng vaccine là
một việc hết sức cần thiết, lâu dài. Để từ đó có thể giúp cơ quan thú y đưa ra những
chiến lược phù hợp trong công tác phòng chống dịch cúm gia cầm. Xuất phát từ
những lý do như trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài “Đánh giá hiệu giá
kháng thể sau tiêm phòng cúm gia cầm tại một số huyện của tỉnh Đồng Nai”.
Mục tiêu
Đánh giá đáp ứng miễn dịch trên đàn gia cầm của tỉnh Đồng Nai được tiêm
phòng vaccine phòng bệnh cúm gia cầm bằng phản ứng HI.


2
 


Phần 2
TỔNG QUAN
2.1 Bệnh cúm gia cầm
Bệnh cúm gia cầm do virus cúm type A gây ra, là một bệnh truyền nhiễm
cực kỳ nguy hiểm bởi chủng virus gây bệnh luôn biến đổi để tránh sự nhận biết,
bao vây và tiêu diệt của cơ thể ký chủ. Bệnh được tổ chức dịch tể thế giới (OIE) xếp
vào danh mục bảng A - các bệnh nguy hiểm.
Năm 412 trước công nguyên một bệnh giống như bệnh cúm đã được
Hippocrate mô tả, bệnh cúm được ghi nhận đầu tiên ở Italy vào năm 1878 và được
gọi là bệnh “dịch tả gà” (Fowl plague).
Năm 1984, một ổ dịch nghiêm trọng trên gà đã xảy ra ở miền Bắc nước Ý và
lan truyền ra các nước khác như: Áo, Đức, Bỉ và Pháp. Đến năm 1901, Centanni và
Savunozzi cho rằng bệnh cúm là do một loại vi sinh vật đi qua màng lọc gây ra.
Năm 1902, lần đầu tiên người ta phân lập được virus cúm - đó là virus cúm type A
(H7N7) đã gây dịch cúm gà ở nước Ý trước đó. Đến năm 1933, virus cúm type A
(H1N1) gây bệnh trên người mới được phân lập.
Các ổ dịch gần đây đã được thông báo ở một số nước như: Năm 1991, bệnh
cúm gia cầm do subtype H5N1 xảy ra trên gà tây tại Anh; tại Australia năm 1992 1994 do subtype H7N3; subtype H5N2 tại Mexico năm 1994 - 1995; H5N1 (Hồng
Kông, 1997); H5N2 (Italy, 1997); H7N4 (Australia, 1997); H7N1 (Italy, 1999 2000); H7N3 (Chile, 2002); H7N7 (Hà Lan, 2003); H7N3 (Canada, 2004); H5N2
(Mỹ và Nam Phi, 2004); H5N1 (Trung Quốc, Hồng Kông, Indonesia, Nhật Bản,
Lào, Malaysia, Hàn Quốc và Thái Lan, 2002 - 2005) (Kamps và ctv, 2006)

3
 



Tại Việt Nam, dịch cúm gia cầm xuất hiện từ cuối tháng 12/2003, tại trại gà
giống của công ty CP đóng tại xã Thủy Xuân Tiên, huyện Chương Mỹ, tỉnh Hà Tây.
Cùng thời gian này, dịch cũng xảy ra ở hai tỉnh Tiền Giang và Long An sau đó dịch
lan ra toàn quốc. Tính từ thời điểm từ 12/2009 đến 4/2008 đã có 6 đợt dịch cúm gia
cầm xảy ra trên cả nước (Văn Đăng Kỳ, 2008) và cho đến nay dịch cúm vẫn còn
đang tiếp tục lây lan, gây nhiều thiệt hại cho ngành chăn nuôi của nước ta.
2.2 Căn bệnh
2.2.1 Hình thái
Virus cúm gia cầm có dạng hình cầu và cũng có thể là đa hình thái, có kích
thước khoảng 80 - 120 nm. Bên ngoài có các gai như gai HA có dạng hình gậy và
gai NA có hình nấm. Cấu trúc bộ gen của virus bao gồm 8 phân đoạn RNA, mã hoá
cho các protein: PB2, PB1, PA, HA, NP, NA, M và NS (Cox và ctv, 2000).

Hình 2.1 Hình thái của virus cúm chụp dưới kính hiển vi điện tử
(Nguồn : />
4
 


2.2.2 Cấu trúc
Virus cúm thuộc nhóm virus RNA sợi đơn, chuỗi âm (-) có vỏ bọc và có phổ
gây bệnh rất rộng từ các loài chim đến động vật có vú, kể cả con người.
Virus cúm được chia ra làm 5 type khác nhau: virus cúm type A, B, C,
Thogotovirus (phân lập được trên ve) và Isavirus (phân lập được trên cá hồi)
(Wright và ctv, 2007); sự phân chia này dựa trên bản chất kháng nguyên của protein
khung (M) và nucleocapside (NP) của virus. Virus cúm type B và C chỉ gây bệnh
nhẹ ở người và heo, trong khi virus cúm type A chính là tác nhân gây ra các đại
dịch cúm và đã cướp đi sinh mạng của hàng chục triệu người trên khắp thế giới.
Đặc trưng của virus cúm type A so với cúm type B và C là có sự đa dạng rất

lớn của 2 glycoprotein: Haemagglutinin (HA) và neuraminidase (NA). Các virus
cúm được phân loại thành các subtype dựa trên cấu trúc của các protein bề mặt HA
và NA. Cho đến nay, người ta xác định có tất cả 16 subtype HA và 9 subtype NA
hiện diện trong tự nhiên (Fouchier và ctv, 2005).

Hình 2.2 Cấu trúc của virus cúm gia cầm
(Nguồn : )

5
 


2.3 Miễn dịch học
2.3.1 Đáp ứng miễn dịch dịch thể:
Gia cầm sau khi nhiễm virus tự nhiên hoặc tiêm vaccine phòng bệnh cúm
đều tạo kháng thể hệ thống cũng như kháng thể ở niêm mạc.
Ở gà và gà tây kháng thể IgM sớm sản xuất, phát hiện được ở 5 ngày sau khi
gia cầm nhiễm virus và kháng thể IgY cũng được tìm thấy được sau đó.
Dựa vào cấu trúc virus người ta thấy rằng các protein bề mặt (HA và NA) có
khả năng tạo kháng thể trung hòa và tạo đáp ứng miễn dịch bảo vệ.
Ít nhất có 5 vị trí kháng nguyên đã được xác định đối với virus cúm người,
mỗi vị trí đều có khả năng tạo kháng thể trung hòa (Wiley và ctv, 1981). Các quan
sát tương tự cũng được thực hiện đối với virus cúm H5 (Philpott và ctv, 1989).
Kháng thể kháng lại protein HA là yếu tố quyết định chủ yếu để bảo vệ vật chủ
chống lại bệnh (Johansson và ctv, 1989), và ở gia cầm tiêm chủng vaccine phòng
bệnh chủ yếu là dựa trên phân type HA. Tầm quan trọng của protein HA đối với sự
bảo vệ được chứng minh bởi việc gia cầm bảo hộ gia cầm khi tiêm vaccine chỉ có
chứa protein HA. Hiệu giá kháng thể đối với protein HA thường được đo bằng phản
ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI). Sự hiện diện kháng thể HI (khi ở độ pha
loãng huyết thanh ≥ 1/16) ở gia cầm có tương quan chặt chẽ với sự bảo hộ khi công

cường độc virus có cùng phân type HA. Sự đồng nhất giữa HA của virus vaccine và
virus thực địa càng lớn thì khả năng giảm bài thải virus và khả năng bảo hộ càng
cao (Swayne và Halvorson, 2003).
Protein NA cũng tạo ra kháng thể trung hòa ở gà và vaccine đặc hiệu NA có
thể bảo hộ chống lại virus cúm độc lực cao (HPAI) (Rott và ctv, 1974; MacNulty và
ctv, 1986). Kháng thể protein NA được xem là ít quan trọng hơn kháng thể protein
HA, nhưng ít nhất ở chuột sự bảo hộ cũng đã được chứng minh khi chủng vaccine
DNA (bao gồm cả gen HA và NA) (Chen và ctv, 1999). Tuy nhiên, chuột được tiêm
chủng gen NA chỉ làm giảm bài thải virus, trong khi chủng vaccine mang gen HA
làm ngừng hoàn toàn sự bài thải virus (Johansson và ctv, 1989).

6
 


Các protein khác của virus cũng có khả năng tạo kháng thể: Kháng thể đối
với protein M2 không bảo hộ hoàn toàn nhưng làm giảm lượng virus bài thải vào
tạo sự bảo hộ nhất định đối với bệnh (Slepushkin và ctv, 1995; Zebedee và ctv,
1988; Frace và ctv, 1999).
Đặc biệt là các protein M1 và NP đều là các kháng nguyên quan trọng sử
dụng trong các thử nghiệm chẩn đoán. Các kháng nguyên này có sự bảo tồn trình tự
cao, cho phép phát hiện kháng thể từ những chim nhiễm bất kỳ type virus cúm A
nào.
Kháng thể tiết ra trong đáp ứng miễn dịch niêm mạc rất có thể đóng một vai
trò quan trọng trong sự hồi phục của chim nhiễm bệnh và tạo ra sự bảo hộ cho
những đợt nhiễm bệnh tiếp theo, đặc biệt đối với virus cúm độc lực trung bình
(MPAI) nhiễm chủ yếu qua niêm mạc.
Nghiên cứu về kháng thể thụ động, nhiều bằng chứng cho thấy kháng thể
này có thể ngăn ngừa triệu chứng lâm sàng và gây chết cho gia cầm con khi thực
hiện công cường độc bằng chủng virus độc lực cao (HPAI) mà tương đồng về

subtype HA và NA trong vòng 2 tuần đầu sau khi gia cầm nở (Swayne và
Halvorson, 2003).
2.3.2 Miễn dịch qua trung gian tế bào
Cả kháng thể và các tế bào lympho T hoạt hóa đều được tạo ra trong đáp ứng
miễn dịch đối với virus (Zinkernagel, 1994). Đối với virus cúm gia cầm, khi không
có sự tái sản virus, các virus cúm gia cầm làm tăng đáp ứng của các tế bào lympho
ngoại biên và các thymocyte của gà khi được hoạt hóa bởi concanavalin A (Holt và
ctv, 1990) theo một phương thức phụ thuộc liều lượng, dẫn đến tăng hoạt tính IL-2
ở điều kiện phòng thí nghiệm.
Cơ chế tác dụng của các tế bào lympho T hỗ trợ (CD4+) và lympho T gây
độc (CD8+) trong đáp ứng miễn dịch chống lại virus cúm trên gia cầm chưa được
hiểu biết đầy đủ. Nhiều nghiên cứu cho thấy miễn dịch đối với virus H9N2 vô hoạt
trên gà có thể bảo hộ trong thời gian ngắn khi công cường độc virus cúm độc lực
cao (HPAI) H5N1 nhờ miễn dịch qua trung gian tế bào nhưng lại không thể ngăn

7
 


ngừa hoàn toàn khả năng nhân lên của virus cúm trong đường tiêu hóa (Suarez và
Schultz - Cherry, 2000).
2.4 Truyền nhiễm học
2.4.1 Loài nhạy cảm
Virus cúm A gây bệnh trên nhiều loài động vật (bao gồm: người, heo, ngựa,
động vật có vú ở biển và các loài cầm, chim). Bệnh thường xảy ra trên gà và gà tây,
nhiều loài chim hoang dã (đặc biệt là thuỷ cầm và chim biển cũng nhạy cảm với
virus cúm A). Trong khi đó virus cúm B thường thấy ở hải cẩu và virus cúm C
thường có ở heo.

Hình 2.3 Vòng truyền lây virus cúm (Nguồn: www.Medical Ecology.org)

2.4.2 Sức đề kháng
Virus cúm gia cầm có sức đề kháng yếu với các tác nhân vật lý như nhiệt độ,
pH quá cao hay quá thấp. Ở môi trường không đẳng trương và khô virus bị bất hoạt.
Vì virus này có thành phần vỏ envelope là lipid nên bị bất hoạt bởi các chất tẩy rửa
hữu cơ như desoxycholate và sodium dodecylsulfate. Khi có sự hiện diện của các
chất hữu cơ, virus cúm có thể bị phá hủy bởi các hoạt chất hóa học như aldehydes
(formaldehyde hay gluteraldehyde), beta - propiolactone, và binary ethylenimine.
Các chất tẩy rửa hóa học cũng có thể tiêu diệt virus như phenolic,
ammonium ion (gồm có chất tẩy có ammonium bậc 4). Các tác nhân oxy hóa như
sodium hypochlorite, axit loãng và hydroxylamine cũng tiêu diệt được virus.

8
 


Khi ở trong dịch tiết mũi, phân, virus được các chất hữu cơ bao quanh làm
tăng sức đề kháng với các tác nhân lý, hóa học. Ở điều kiện lạnh và ẩm virus có thể
tồn tại lâu. Virus ở trong dịch lỏng có thể tồn tại được 105 ngày trong mùa đông và
tồn tại trong phân 30 - 35 ngày ở 4°C và 7 ngày ở 20°C.
2.4.3 Sự bài thải và đường truyền lây của virus
Virus cúm gia cầm bài thải ra môi trường qua chất tiết từ miệng, mũi, kết
mạc và qua phân, vì virus được nhân lên ở các cơ quan hô hấp, tiêu hóa, thận và
sinh sản. Khi gây bệnh cho gà 3 - 4 tuần tuổi bằng virus chủng độc lực cao (HPAI),
ghi nhận sự hiện diện virus trong mẫu hầu họng (qua vết phết hầu họng khoảng
104,2–7,7 EID50/ml chất tiết đường hô hấp) và sự hiện diện virus trong mẫu phân (qua
vết phết lỗ huyệt khoảng 102,5–4,5 EID50/mg phân). Đối với chủng virus cúm độc lực
thấp (LPAI) thì sự bài thải virus có thấp hơn, trong mẫu hầu họng (qua vết phết hầu
họng khoảng 101,1-5,5 EID50/ml chất tiết đường hô hấp) và trong mẫu phân (vết phết
lỗ huyệt khoảng 101,0-4,3 EID50/mg phân) (Swayne và Beck, 2005).
Sự lây nhiễm virus giữa các loài chim xảy ra thông qua sự tiếp xúc trực tiếp

hoặc gián tiếp với thú bệnh hoặc với môi trường đã bị nhiễm. Virus sẽ xâm nhập
vào cơ thể qua đường niêm mạc hoặc mũi.
Các loài chim hoang hay thuỷ cầm bị lây nhiễm qua đường miệng do tiếp
xúc với nước nhiễm virus. Virus nhân lên với số lượng lớn trong đường tiêu hóa của
chúng, nhưng thường không có dấu hiệu lâm sàng và virus sẽ được bài thải qua
phân với nồng độ cao, tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình lây lan. Mặt khác virus
có thể tồn tại hơn 3 tháng trong nước ngọt có độ kiềm nhẹ và ở nhiệt độ vừa phải.
Vì vậy, các loài chim hoang dã hay thuỷ cầm là nguồn lưu trữ mầm bệnh và là mối
đe doạ nguy hiểm.
Sự lây truyền virus từ trại này sang trại khác là do sự di chuyển loài cầm đã
bị nhiễm virus. Vật liệu, xe tải chở thức ăn, dụng cụ chăn nuôi, quần áo, giày dép,
thú hoang (chuột, mèo,…) thậm chí cả con người đóng vai trò mang virus rất quan
trọng, là nhân tố trung gian chủ yếu truyền lây virus từ nơi này sang nơi khác.
Trong trường hợp nhiễm virus độc lực cao, sự lan truyền sẽ xảy ra rất nhanh.

9
 


Chim hoang và vịt đóng vai là nhân tố truyền lây virus gây bệnh thể độc lực
thấp tới các đàn gia cầm và nếu như virus cứ tiếp tục lưu hành vài tháng trong quần
thể gia cầm, nó có thể đột biến thành một virus gây bệnh ở thể độc lực cao. Tuy
nhiên đến nay chưa có bằng chứng cho thấy chim hoang là nguồn tàng trữ virus
H5N1 gây bệnh thể độc lực cao cho gà.
Trước đây, các ổ dịch cúm gia cầm thể độc lực cao thường bắt đầu bằng việc
một virus có độc lực thấp xâm nhập vào đàn. Virus độc lực thấp này thường có vật
chủ tàng trữ là chim hoang. Sau đó, virus lưu hành vài tháng trong quần thể gia cầm
nuôi và đột biến từ chủng có khả năng gây bệnh nhẹ thành chủng có khả năng gây
bệnh thể độc lực cao với tỷ lệ chết trên gia cầm lên đến 100%. Vịt nuôi không có
triệu chứng lâm sàng của bệnh và điều này có thể trực tiếp lây truyền virus gây bệnh

thể độc lực cao vào đàn gia cầm. Người ta cũng giả định là vịt có biểu hiện khỏe
mạnh cũng có thể truyền virus trực tiếp sang cho heo và người.
2.5 Sinh bệnh học
2.5.1 Cơ chế sinh bệnh
Khi gia cầm bị nhiễm virus cúm, virus sẽ nhân lên trên lớp tế bào niêm mạc
đường hô hấp và đường tiêu hóa. Tùy theo độc lực và ái lực của virus (hướng
đường ruột, hô hấp, thần kinh hay đa hướng) virus theo máu và đến cơ quan hô hấp,
tiêu hóa, sinh sản gây triệu chứng và bệnh tích, hoặc có thể không có biểu hiện nào
cả. Trong phòng thí nghiệm, virus có thể gây bệnh trên gà, gà tây, vịt và chuột (Trần
Thanh Phong, 1996).
2.5.2 Thời gian ủ bệnh
Thời gian ủ bệnh cúm rất ngắn chỉ vài giờ đến 3 ngày sau khi virus cúm gà
xâm nhập. Theo ghi nhận khi dịch cúm nổ ra và chậm nhất là 14 ngày sau khi gây
nhiễm thì cả đàn gà bị bệnh (Lê Văn Năm, 2004).
2.5.3 Triệu chứng lâm sàng
Triệu chứng bệnh phụ thuộc rất nhiều vào các yếu tố của virus như: Độc lực,
số lượng virus, tuổi, giới tính và các yếu tố môi trường như sức đề kháng của đàn
gà, mật độ chuồng, tiểu khí hậu chuồng nuôi (nhiệt độ, ánh sáng,…). Trên đàn gà

10
 


mắc bệnh xuất hiện các triệu chứng điển hình về đường hô hấp, tiêu hóa, sinh sản
(giảm sản lượng trứng) và thần kinh (Lê Văn Năm, 2004).
Triệu chứng hô hấp thường xuất hiện đầu tiên và khá điển hình: Gia cầm mắc
bệnh có biểu hiện khẹt, lắc đầu, vảy mỏ, chảy nước mũi, nước mắt, khó thở, mí mắt
bị viêm sưng mọng, mặt phù nề và đầu sưng, mào và tích bị dày lên do thủy thũng,
có rất nhiều điểm hoặc đám xuất huyết.
Thịt gà bị cúm thường thâm xám, xuất huyết dưới da vùng chân là những

biểu hiện đặc trưng bệnh cúm gà.
Gà bị tiêu chảy nặng, phân loãng trắng hoặc trắng xanh, bệnh lây lan rất
nhanh. Năng suất trứng giảm rõ rệt.
Các biểu hiện thần kinh thể hiện như: Con vật đi lại không bình thường, run
rẩy, mệt mỏi, nằm li bì tụm thành từng đống với nhau (Lê Văn Năm, 2004).
Ngoài ra, một số trường hợp dịch cúm gia cầm xảy ra nhưng không thấy xuất
hiện các triệu chứng lâm sàng trên đàn gia cầm nhiễm bệnh (Lê Văn Năm, 2004).

Hình 2.4 Một số triệu chứng trên gà mắc bệnh cúm gia cầm

11
 


2.6 Bệnh tích
2.6.1 Bệnh tích đại thể
Mức độ biến đổi các bệnh tích phụ thuộc nhiều vào độc lực của virus và quá trình
diễn biến của bệnh (Lê Văn Năm, 2004).
Trường hợp bệnh nhẹ: Viêm mũi từ thể cata, serofibrin đến nhầy có mủ và bị
casein hóa gây nghẹt mũi, thối mí mắt. Mổ khám thấy khí quản phù nề, dọng nhiều
rỉ dịch. Túi khí dầy lên và có nhiều fibrin bám dính. Phúc mạc bị viêm nặng từ cata
đến fibrin. Buồng trứng bi viêm xuất huyết, trứng non dập vỡ, ống dẫn trứng viêm rỉ
dịch đến hình thành casein. Ruột bị viêm xuất huyết từ cata đến fibrin, nặng nhất là
vùng ruột non, ruột thừa và hậu môn (Lê Văn Năm, 2004).
Trường hợp bệnh nặng: Nhiều trường hợp thấy trong ổ dịch cúm là gia cầm
mắc bệnh chết quá nhanh, không để lại bệnh tích điển hình gì. Nhưng đại bộ phận
những gia cầm khác thì có biến đổi bệnh tích đại thể khá rõ: Mũi bị viêm tịt; mào
tích thâm tím, sưng dày lên, xuất huyết điểm và hoại tử. Khi cắt đôi mào hoặc tích
thấy bên trong màu vàng xám, óng ánh như gelatin. Mí mặt và mặt phù nề, đầu sưng
to. Xuất huyết dưới da: chân, kẽ móng chân và một số vùng khác. Xuất huyết và

gây hoại tử ở gan, lách, thận. Dạ dày tuyến, van hồi manh tràng, niêm mạc hậu môn
xuất huyết từ cata đến fibrin rất nặng, thận sưng rất to và căng phồng. Tụy teo, dòn
do mất nước, tim bơi trong màng tim xuất hiện thẩm dịch vàng và xuất huyết điểm.
Xuất huyết dưới da và cơ ở vùng đùi, ngực. Xuất huyết mỡ bụng, mỡ bao tim, mỡ
màng treo ruột luôn là bệnh tích đặc trưng. Xuất huyết niêm mạc khí quản, bên
trong nhiều nước dãi (Lê Văn Năm, 2004).
2.6.2 Bệnh tích vi thể
Các biến đổi đặc trưng về tổ chức học như phù nề, xung huyết, xuất huyết và thâm
nhập lympho đơn nhân ở cơ vân, cơ tim, lách, phổi, mào tích, gan, thận, mắt và thần
kinh (Lê Văn Năm, 2004).

12
 


Hình 2.5 Một số bệnh tích trên gà do virus cúm gây ra
2.7 Chẩn đoán
2.7.1 Chẩn đoán lâm sàng
Gà, vịt thường mắc bệnh cúm ở mọi lứa tuổi, nhưng thường gặp từ 4 đến 46
tuần tuổi. Song bệnh nặng nhất ở gia cầm đang đẻ và lúc đẻ cao nhất hoặc lần đầu
tiên bị bệnh cúm. Bệnh nổ ra dồn dập và nhanh chóng trở thành dịch chủ yếu trong
vài giờ đến vài ngày.
Cần thực hiện chẩn đoán phân biệt các triệu chứng và bệnh tích với những
bệnh khác như: Newcastle, viêm thanh khí quản truyền nhiễm (ILT), viêm phế quản
truyền nhiễm (IB), bạch lỵ,… và bệnh cúm thường ghép với bệnh hô hấp do vi
khuẩn Mycoplasma.
2.7.2 Chẩn đoán phòng thí nghiệm
2.7.2.1 Chẩn đoán kháng nguyên
+ Phân lập virus: Lấy 0,2 - 0,3 ml nước bệnh phẩm (được lấy từ thẩm
xuất ở khí quản hoặc hậu môn gà bệnh hoặc gà mới chết, được nuôi cấy ở


13
 


môi trường chứa hàm lượng kháng sinh cao) tiêm vào xoang niệu mô của
phôi gà 9 - 11 ngày tuổi. Các phôi bi tạm nhiễm sẽ chết sau 24 giờ và phải
được bỏ đi. Số phôi sống còn lại sau 24 giờ được theo dõi đến 72 giờ. Có thể
lấy nước phôi từ những phôi chết trong khoảng 48 giờ và sau 48 giờ hoặc từ
phôi chưa chết đến 72 giờ xác định virus. Đây là khoảng thời gian mà số
lượng virus (nếu có) đạt mức lý tưởng (Lê Văn Năm, 2004).
+ Kỹ thuật test nhanh: Test Directigen phát hiện kháng nguyên virus
cúm trong mẫu bệnh phẩm và dịch niệu mô của phôi trứng gà đã được tiêm
truyền virus. Ưu điểm của test Directigen là tốn ít thời gian, thao tác đơn
giản, dễ thực hiện. Tuy nhiên, hạn chế của test Directigen là chỉ phát hiện
được virus cúm type A mà không xác định được phân type.
+ Kỹ thuật dùng kháng thể huỳnh quang phát hiện nhanh virus cúm
gia cầm trong dịch niệu mô.
+ Kỹ thuật dùng kháng thể đơn dòng phát hiện kháng nguyên virus
trong mô bằng việc nhuộm immunoperoxidase.
+ Kỹ thuật Realtime RT - PCR (Reverse Transcriptase – Polymerase
Chain Reaction): Đây là một kỹ thuật tiên tiến nhằm phát hiện và xác định hệ
gen của virus cúm, đặc biệt là khi trong mẫu chứa một lượng rất ít virus. Do
hệ gen của virus cúm là một chuỗi RNA đơn nên cần tổng hợp một DNA bổ
sung (cDNA) trước khi được nhân lên. Enzyme RT (Reverse Transcriptase)
là một polymerase được dùng để tổng hợp nên cDNA. Do đó, quá trình nhân
hệ gen RNA của virus cúm được gọi là RT - PCR (Cục Thú y, 2006).
2.7.2.2 Phát hiện kháng thể
Sử dụng các phản ứng huyết thanh học dùng để chứng minh sự hiện
diện của kháng thể đặc hiệu đối với virus cúm gia cầm 7 ngày sau khi nhiễm.

Có nhiều kỹ thuật được dùng để chẩn đoán virus cúm bằng phương pháp
huyết thanh học như
+ Phản ứng ELISA (Enzyme linked immunosorbent assay): Phát
hiện kháng thể dựa vào việc gắn kháng nguyên đăc hiệu virus cúm ở đáy

14
 


giếng phản ứng (Kháng nguyên được gắn có thể là kháng nguyên virus cúm
type A, kháng nguyên cúm H5). Kháng nguyên này sẽ kết hợp đặc hiệu với
kháng thể có trong mẫu huyết thanh xét nghiệm.
+ Phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI - haemagglutinin
inhibition): Phát hiện kháng thể kháng virus cúm (phân type H5) ở gia cầm
sau khi nhiễm virus cúm H5 hoặc tiêm phòng vaccine H5. Khi gặp kháng thể
đặc hiệu thì kháng nguyên chuẩn sử dụng trong phản ứng sẽ kết hợp với
kháng thể. Sau đó, khi cho hồng cầu vào sẽ tụ lại đáy giếng của đĩa phản
ứng. Việc đọc kết quả sẽ dựa vào độ pha loãng cao nhất của kháng thể mà ở
đó hồng cầu bị đóng nút (tụ lại đáy giếng). Ưu đểm của phản ứng này là dễ
thực hiện và cho kết quả chính xác cao.
+ Phản ứng kết tủa khuyếch tán trên thạch (AGID - Agar gel
immunodiffusion): Phát hiện kháng thể kháng virus cúm gia cầm type A.
+ Phản ứng miễn dịch huỳnh quang (IFT - Immunofluorescent test):
Phát hiện kháng thể kháng một phân type NA đặc hiệu.
2.8 Chỉ tiêu khảo sát
Tỷ lệ cá thể và tỷ lệ đàn gia cầm có đủ kháng thể bảo hộ sau tiêm phòng
vaccine.
Tỷ lệ bảo hộ theo địa điểm, lứa tuổi, qui mô,hướng sản xuất của các đàn gia
cầm khảo sát.
2.9 Phương pháp tính toán và xử lý số liệu

- Đánh giá kết quả tiêm phòng vaccine (theo hướng dẫn đánh giá kết quả sau
tiêm phòng của Cục Thú y, 2009)
+ Mẫu huyết thanh đủ bảo hộ cho cá thể gia cầm sau khi tiêm vaccine phòng
bệnh cúm là mẫu có hiệu giá kháng thể HI ≥ 4log2.
+ Đàn bảo hộ là đàn có ≥ 80% mẫu huyết thanh đạt hiệu giá kháng thể HI
bảo hộ

15
 


+ Tỷ lệ bảo hộ: Tỷ lệ giữa số mẫu có hiệu giá kháng thể bảo hộ và số mẫu
xét nghiệm
(số mẫu bảo hộ / số mẫu xét nghiệm) * 100
+ Tỷ lệ gà có kháng thể đủ bảo hộ sau tiêm phòng có giá trị MG ≥ 16 (theo
Chi Cục Thú Y tỉnh Đồng Nai, 2012)
+ Giá trị MG (Medica Geometrica) trung bình hình học của quần thể khảo
sát dựa theo công thức sau :
Log2N = (Số lượng mẫu * Log2N ở cùng độ pha loãng)/ số lượng mẫu kiểm
tra
(Bảng tra kết quả được trình bày ở phần phụ lục).
- Dùng trắc nghiệm 2 của phần mềm minitab 14 for window để so sánh tỷ
lệ bảo hộ trên đàn gia cầm khảo sát, so sánh thêm phân bố của tỷ lệ bảo hộ theo
loài, qui mô chăn nuôi, lứa tuổi khác nhau. Sự khác biệt được xem là có ý nghĩa khi
xác suất p < 0,05.

16
 



 

Phần 3
NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện
Thời gian thực hiện đề tài: Tháng 02/2012 đến 06/2012
Địa điểm thực hiện: Trạm Chẩn đoán Xét nghiệm Thú y - Chi cục Thú y
Đồng Nai
3.2 Đối tượng nghiên cứu
Đàn gia cầm bao gồm: Gà đẻ, gà giống, gà hậu bị của các trại chăn nuôi
thuộc 3 huyện (Long Khánh, Thống Nhất, Trảng Bom) của tỉnh Đồng Nai.
3.3 Nội dung nghiên cứu
Xác định hiệu quả đáp ứng miễn dịch của việc tiêm vaccine phòng bệnh
3.4 Vật liệu xét nghiệm
Mẫu xét nghiệm kháng thể
Lấy mẫu huyết thanh: Mẫu máu được lấy từ tĩnh mạch cánh của gà. Người
lấy máu dùng một tay cố định cánh gia cầm, tay còn lại nhổ lông bộc lộ tĩnh mạch
cánh, vị trí lấy máu được sát trùng bằng cồn 70oC. Tiếp theo, dùng xylanh lấy 3 - 5
ml máu, kéo pittông trong xylanh về phía sau và để máu đông trong xylanh, để
nghiêng xylanh 45o và để yên trong 1 - 2 giờ, chắt lấy huyết thanh. Tất cả các mẫu
huyết thanh sau khi được lấy đều phải có ký hiệu để tránh nhầm lẫn. Mẫu huyết
thanh nếu chưa xét nghiệm ngay có thể được bảo quản lạnh ở 4oC trong vòng 1
tuần. Muốn bảo quản mẫu huyết thanh lâu hơn thì giữ ở -20oC.
3.5 Nguyên liệu xét nghiệm
Kháng nguyên chuẩn H5N1: AIV Antigen H5N1 (A/Ck/Scotland/H5N1/59).
Kháng nguyên virus cúm gà được bất hoạt bằng β-propiolactone, kháng nguyên ở
dạng đông khô. Kháng nguyên này có nguồn gốc từ phòng thí nghiệm VLA-Anh

17