BỘ GIÁO DỤC và ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP. HỒ CHÍ MINH
KHOA CHĂN NUÔI – THÚ Y
****************

TRẦN THỊ HOÀNG HƯƠNG

PHÂN LẬP MYCOPLASMA HYOPNEUMONIAE (MH)
VÀ XÁC ĐỊNH TÍNH NHẠY CẢM VỚI
MỘT SỐ KHÁNG SINH
Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp bằng Bác sỹ thú y

Giáo viên hướng dẫn
TS. NGUYỄN THỊ PHƯỚC NINH
BSTY. LÊ THỊ TUYẾT TOAN

Tháng 08/2012

i


XÁC NHẬN CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN

Họ tên sinh viên thực hiện: Trần Thị Hoàng Hương
Tên luận văn: “Phân lập Mycoplasma hyopneumoniae (MH) và xác định
tính nhạy cảm với một số kháng sinh”.
Đã hoàn thành luận văn theo đúng yêu cầu của giáo viên hướng dẫn và các ý
kiến nhận xét, đóng góp của Hội đồng chấm thi tốt nghiệp Khoa ngày…………

Giáo viên hướng dẫn

TS. Nguyễn Thị Phước Ninh

ii


LỜI CẢM TẠ
5 năm học tập và thời gian thực tập tốt nghiệp đã trôi qua nhanh chóng, tôi
đã học hỏi được rất nhiều kiến thức và kinh nghiệm sống cho chính mình.
Con luôn luôn khắc ghi trong lòng ơn nghĩa của gia đình luôn bên cạnh,
không ngừng động viên, giúp đỡ để con có được như ngày hôm nay.
Chân thành cám ơn Ban Giám Hiệu trường Đại Học Nông Lâm Tp.HCM,
Ban Chủ Nhiệm khoa Chăn Nuôi Thú Y và Bệnh Viện Thú Y Trường Đại học Nông
Lâm TP.HCM đã dạy bảo, truyền đạt kiến thức, giúp đỡ và luôn tạo điều kiện thuận
lợi cho tôi học tập và rèn luyện.
Trân trọng biết ơn sâu sắc đến TS. Nguyễn Thị Phước Ninh và BSTY. Lê Thị
Tuyết Toan đã tận tình truyền đạt những kinh nghiệm và hướng dẫn em trong quá
trình nghiên cứu đề tài cũng như viết luận văn.
Chân thành cảm ơn anh Huỳnh, chị Tuyền, chị Mỹ và các bạn Phương Dung,
Hạnh Dung, Nga, Yên, Thắm, Phúc đã hết lòng giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận
lợi để tôi có thể hoàn thành tốt công việc của mình trong suốt thời gian thực tập.
Xin cảm ơn đến tất cả các anh chị, các bạn, các em trong khoa Chăn Nuôi
Thú Y và đặc biệt là tập thể lớp Thú Y 33, đã đồng hành chia sẻ những vui buồn và
hỗ trợ, giúp đỡ, động viên tôi trong suốt thời gian học tập cũng như hoàn thành đề
tài.

iii


TÓM TẮT LUẬN VĂN
Đề tài “Phân lập Mycoplasma hyopneumoniae (MH) và xác định tính nhạy

cảm với một số kháng sinh” được tiến hành tại phòng Vi sinh truyền nhiễm, khoa
Chăn Nuôi Thú Y và Bệnh Viện Thú Y trường đại học Nông Lâm Tp.HCM, thời
gian từ tháng 2 đến tháng 6 năm 2012.
Nghiên cứu này nhằm góp phần củng cố các phương pháp chẩn đoán MH.
Chúng tôi tiến hành đánh giá những mẫu phổi có bệnh tích chung theo công
thức của Christensen (1999) rồi thu thập một số mẫu phổi nghi ngờ nhiễm MH để
phân lập trên môi trường Friis’ và xác định sự có mặt của MH bằng kỹ thuật PCR.
Qua khảo sát 59 mẫu phổi chúng tôi ghi nhận được kết quả như sau:
Tỷ lệ phổi có bệnh tích chung trên heo tại lò mổ là 85,51 % (49/59), trên heo
khảo sát tại bệnh viện thú y là 100 % (16/16).
Tỷ lệ phổi có bệnh tích đặc trưng do MH trên heo tại lò mổ là 91,83 %
(45/49), trên heo tại bệnh viện thú y là 100 % (16/16).
Trên những phổi có bệnh tích nghi ngờ nhiễm MH xuất hiện từ 2 – 5 loại
bệnh tích. Trong đó, bệnh tích nhục hóa chiếm tỷ lệ cao nhất (91,83 %).
Chúng tôi thu thập 24 mẫu phổi có bệnh tích nghi ngờ do MH, sau khi phân
lập và kiểm tra PCR, kết quả thu được như sau:
Việc phân lập MH cho kết quả nghi ngờ dương tính trên môi trường canh
Friis’ là 66,67 % (16/24), trên môi trường thạch Friis’ là 41,67 % (10/24).
Kỹ thuật PCR để xác định MH trên mẫu phổi heo có bệnh tích nghi ngờ do
MH cho kết quả dương tính trên các phổi khảo sát ở lò mổ và ở BVTY lần lượt là
36,36 % (4/11) và 38,46 % (5/13), từ môi trường canh là 25 % (6/24), từ môi trường
thạch là 12,50 % (3/24).
Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) các gốc MH phân lập được với 3
loại kháng sinh tylosin, chlortetracycline, enrofloxacin có hàm lượng 0,25 μg/ml
cho kết quả hầu hết các gốc MH phân lập được kháng với các kháng sinh ở nồng độ
trên. Có một gốc MH (6) là nhạy với tylosin, chlortetracycline ở nồng độ 0,003906
g/ml.

iv



MỤC LỤC
Trang
Trang tựa ......................................................................................................................i
Xác nhận của giáo viên hướng dẫn ............................................................................ ii
Lời cảm tạ ................................................................................................................. iii
Tóm tắt luận văn ........................................................................................................iv
Mục lục ....................................................................................................................... v
Danh sách các bảng ....................................................................................................ix
Danh sách các hình ..................................................................................................... x
Danh sách các sơ đồ và biểu đồ .................................................................................xi
Chương 1 MỞ ĐẦU .................................................................................................. 1
1.1 Đặt vấn đề .............................................................................................................1
1.2 Mục đích và yêu cầu .............................................................................................2
1.2.1 Mục đích.............................................................................................................2
1.2.2 Yêu cầu...............................................................................................................2
Chương 2 TỔNG QUAN .......................................................................................... 3
2.1 Bệnh viêm phổi địa phương truyền nhiễm ............................................................3
2.1.1 Lịch sử và phân bố địa lý ...................................................................................3
2.1.2 Căn bệnh.............................................................................................................4
2.1.3 Đặc điểm Mycoplasma .......................................................................................5
2.1.3.1 Đặc điểm sinh học ...........................................................................................5
2.1.3.2 Đặc điểm nuôi cấy...........................................................................................5
2.1.3.3 Sức đề kháng ...................................................................................................5
2.1.3.4 Phân bố tự nhiên..............................................................................................6
2.1.4 Đặc điểm MH .....................................................................................................6
2.1.5 Truyền nhiễm học MH .......................................................................................6
2.1.5.1 Loài mắc bệnh .................................................................................................6
2.1.5.2 Chất chứa mầm bệnh .......................................................................................7


v


2.1.5.3 Đường xâm nhập và lây bệnh .........................................................................7
2.1.5.4 Cơ chế sinh bệnh .............................................................................................7
2.1.6 Triệu chứng ........................................................................................................8
2.1.7 Bệnh tích ............................................................................................................8
2.1.7.1 Bệnh tích đại thể..............................................................................................8
2.1.7.2 Bệnh tích vi thể ...............................................................................................9
2.1.8 Chẩn đoán...........................................................................................................9
2.1.8.1 Chẩn đoán lâm sàng ........................................................................................9
2.1.8.2 Chẩn đoán phòng thí nghiệm ........................................................................10
2.1.9 Điều trị và phòng bệnh .....................................................................................10
2.1.9.1 Điều trị ..........................................................................................................10
2.1.9.2 Phòng bệnh ....................................................................................................10
2.2 Những phương pháp xác định MH .....................................................................11
2.2.1 Quan sát đánh giá bệnh tích phổi .....................................................................11
2.2.2 Phân lập MH ....................................................................................................12
2.2.2.1 Môi trường nuôi cấy ......................................................................................12
2.2.2.2 Ý nghĩa của các thành phần trong môi trường nuôi cấy MH ........................12
2.2.3 Kỹ thuật PCR ...................................................................................................13
2.4 Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của MH với một vài kháng sinh .......15
2.4.1 Kháng sinh .......................................................................................................15
2.4.2 Các kháng sinh sử dụng trong đề tài ................................................................16
2.4.2.1 Tylosin...........................................................................................................16
2.4.2.2 Chlortetracycline ...........................................................................................16
2.4.2.3 Enrofloxacin ..................................................................................................17
2.4.3 Thử khả năng nhạy cảm với kháng sinh của MH bằng phương pháp MIC .....17
2.5 Sơ lược một số nghiên cứu liên quan đến đề tài .................................................18
Chương 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ........................... 19

3.1 Thời gian và địa điểm..........................................................................................19
3.1.1 Thời gian ..........................................................................................................19

vi


3.1.2 Địa điểm ...........................................................................................................19
3.2 Đối tượng nghiên cứu..........................................................................................19
3.3 Dụng cụ và vật liệu thí nghiệm ...........................................................................19
3.4 Nội dung nghiên cứu ...........................................................................................20
3.5.1 Đánh giá bệnh tích và mức độ hư hại của mẫu phổi heo thu thập được ..........20
3.5.2 Phân lập MH ....................................................................................................21
3.5.3 Định danh MH bằng phản ứng PCR ................................................................22
3.5.3.1 Ly trích ADN ................................................................................................22
3.5.3.2 Tiến hành phản ứng PCR ..............................................................................23
3.5.4 Tìm hiểu sự nhạy cảm của các gốc MH phân lập được với kháng sinh ..........23
3.6 Công thức tính .....................................................................................................26
3.7 Xử lý số liệu ........................................................................................................26
Chương 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .............................................................. 27
4.1 Kết quả đánh giá bệnh tích đại thể trên phổi ...................................................... 27
4.1.1 Đánh giá bệnh tích chung trên phổi .................................................................27
4.1.1.1 Tỷ lệ phổi có bệnh tích ..................................................................................27
4.1.1.2 Đánh giá mức độ tổn thương chung trên phổi ..............................................28
4.1.1.3 Các bệnh tích thường gặp trên phổi khảo sát ................................................29
4.1.2 Tỷ lệ phổi có bệnh tích nghi ngờ do MH .........................................................31
4.2 Kết quả phân lập MH trên môi trường thạch và canh Friis’ ...............................32
4.3 Kết quả định danh MH bằng kỹ thuật PCR từ mẫu phổi ....................................34
4.4 Kết quả kháng sinh đồ .........................................................................................35
Chương 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................... 40
5.1 Kết luận ...............................................................................................................40

5.2 Đề nghị ................................................................................................................40
Tài liệu tham khảo..................................................................................................... 41
Phụ lục....................................................................................................................... 44

vii


DANH SÁCH CÁC CHỮ VIẾT TẮT
ADN

: Acid Deoxyribonucleic

APP

: Actinobacillus pleuropneumoniae

ARN

: Acid Ribonucleic

BHI

: Brain Heart Infusion broth

Bp

: base pair

BVTY


: Bệnh Viện Thú Y

CCU

: Colour Changing Unit

CFU

: Colony – Forming Unit

Đc

: đối chứng

ELISA

: Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay

kp, kDa

: kilobase pair, kilo dalton

MH

: Mycoplasma hyopneumoniae

MIC

: Minimum Inhibitory Concentration


PBS

: Phosphate Buffered Saline

PCR

: Polymerase Chain Reaction

PPLO

: Pleuro – Pneumoniae – Like – Organism

PRDC

: Porcine Respiratory Disease Complex

PRRS

: Porcine Respiratory Reproductive Syndrome

SDS

: Sodium dodecyl Sulfate

Taq

: Thermus aquaticus

TBE


: Tris Borate EDTA

TE

: Tris EDTA

UI

: unit international

UV

: utral violet

viii


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Trang
Bảng 3.1 Bố trí lấy mẫu phổi có bệnh tích nghi ngờ ................................................ 21 
Bảng 3.2 Đếm đơn vị đổi màu ................................................................................. 24 
Bảng 3.3 Cách tiến hành MIC................................................................................... 25
Bảng 3.4 Số lượng gốc MH phân lập được thực hiện phương pháp MIC............... 26
Bảng 4.1 Tỷ lệ phổi có bệnh tích….……………………………………………… 27
Bảng 4.2 Mức độ tổn thương trên các phổi có bệnh tích .......................................... 28 
Bảng 4.3 Tỷ lệ các loại bệnh tích trên các phổi khảo sát .......................................... 29 
Bảng 4.4 Bảng số tần suất xuất hiện các loại bệnh tích trên phổi ............................ 30 
Bảng 4.5 Tỷ lệ phổi có bệnh tích nghi ngờ do MH trong đánh giá .......................... 31 
Bảng 4.6 Kết quả phân lập MH trên môi trường Friis’ sau 7 – 10 ngày nuôi cấy.... 32 
Bảng 4.7 Kết quả PCR định danh MH từ thạch và canh Friis’ nghi ngờ dương tính

...................................................................................................................................33 
Bảng 4.8 Kết quả định danh MH bằng kỹ thuật PCR từ mẫu phổi .......................... 34 
Bảng 4.9 Kết quả thực hiện MIC với các kháng sinh ............................................... 36 
 

ix


DANH SÁCH CÁC HÌNH
Trang
Hình 2.1 Nguyên tắc của phản ứng PCR .................................................................. 14 
Hình 4.1 Phổi heo có bệnh tích nhục hóa ................................................................. 37 
Hình 4.2 Canh khuẩn đổi màu từ đỏ sang vàng sau 7 ngày nuôi cấy ....................... 37 
Hình 4.3 Khuẩn lạc nghi ngờ MH sau 7 và 10 ngày nuôi cấy ................................. 37 
Hình 4.4 Kết quả PCR từ mẫu phổi .......................................................................... 38 
Hình 4.5 Kết quả PCR từ mẫu thạch có khuẩn lạc nghi ngờ MH............................. 38 
Hình 4.6 Kết quả PCR từ mẫu canh .......................................................................... 38 
Hình 4.7 Kết quả MIC với kháng sinh enrofloxacin ................................................ 39 
Hình 4.8 Kết quả MIC với kháng sinh tylosin .......................................................... 39 
Hình 4.9 Kết quả MIC với kháng sinh chlortetracycline ......................................... 39 
 
 

x


DANH SÁCH CÁC BIỂU ĐỒ VÀ SƠ ĐỒ
Trang
Sơ đồ 3.1 Các bước tiến hành nghiên cứu ................................................................ 20 
Biểu đồ 4.1 Kết quả xác định MH từ thạch và canh bằng kỹ thuật PCR.................. 33


xi


Chương 1
MỞ ĐẦU
1.1 Đặt vấn đề
Trong số các bệnh truyền nhiễm trên đường hô hấp của heo thì bệnh viêm
phổi địa phương do Mycoplasma hyopneumoniae (MH) đã và đang gây thiệt hại
kinh tế không nhỏ cho ngành chăn nuôi heo. Đây là bệnh hô hấp mãn tính gây viêm
phế quản – phổi, tiến triển chậm, ho kéo dài nhiều tuần, tỷ lệ mắc bệnh cao, ít gây
chết nhưng heo bệnh chậm lớn, giảm năng suất và gây tốn kém chi phí thức ăn và
điều trị. Đồng thời bệnh làm suy giảm hệ miễn dịch, mở đường cho nhiều bệnh
truyền nhiễm nguy hiểm khác.
Hiện nay bệnh đã có mặt ở hầu hết các trại chăn nuôi heo ở Việt Nam và thế
giới, nhất là chăn nuôi công nghiệp tập trung với mật độ cao. Do đó yêu cầu đặt ra
là cần phải kiểm soát được bệnh viêm phổi địa phương trong ngành chăn nuôi heo
và công tác nghiên cứu, chẩn đoán nguyên nhân gây bệnh để đưa ra biện pháp
phòng trị hữu hiệu đóng vai trò rất quan trọng. Việc ứng dụng kỹ thuật PCR để chẩn
đoán MH rất hiệu quả và nhanh chóng đã được kiểm chứng. Tuy MH thuộc nhóm
vi sinh vật đặc biệt, rất khó phân lập, nuôi cấy nhưng việc này rất cần thiết cho các
phương pháp chẩn đoán phòng thí nghiệm cũng như thử nghiệm kháng sinh đồ để
xác định tính nhạy cảm của MH với một số kháng sinh phục vụ cho công tác phòng
và trị bệnh.
Từ những thực tế trên, được sự đồng ý của bộ môn Vi Sinh Truyền Nhiễm,
khoa Chăn Nuôi Thú Y, trường Đại Học Nông Lâm Thành Phố Hồ Chí Minh, dưới
sự hướng dẫn của TS. Nguyễn Thị Phước Ninh, BSTY. Lê Thị Tuyết Toan chúng
tôi thực hiện đề tài: “Phân lập Mycoplasma hyopneumoniae (MH) và xác định
tính nhạy cảm với một số kháng sinh”


1


1.2 Mục đích và yêu cầu
1.2.1 Mục đích
Phân lập Mycoplasma hyopneumoniae (MH) từ mẫu phổi có bệnh tích và
định danh bằng kỹ thuật PCR. Xác định tính nhạy cảm của MH với một số kháng
sinh bằng kháng sinh đồ để phục vụ cho công tác phòng trị bệnh do MH.
1.2.2 Yêu cầu
Thu thập mẫu phổi của heo nghi ngờ nhiễm MH
Đánh giá mức độ hư hại của phổi heo qua bệnh tích đại thể
Phân lập MH từ mẫu phổi heo có bệnh tích nghi ngờ
Ứng dụng kỹ thuật PCR để chẩn đoán MH từ mẫu phổi
Thực hiện kháng sinh đồ với 3 loại kháng sinh: tylosin, chlortetracycline và
enrofloxacin.

2


Chương 2
TỔNG QUAN
2.1 Bệnh viêm phổi địa phương truyền nhiễm
Bệnh viêm phổi địa phương truyền nhiễm còn gọi là bệnh viêm phổi dịch
vùng (Enzootic Pneumonia of Swine = EP) hay suyễn heo do Mycoplasma
hyopneumonia (MH) gây ra, thường ở dạng mãn tính, gây viêm phế quản, phổi tiến
triển chậm, ho kéo dài nhiều tuần, heo chậm lớn, sức đề kháng bệnh yếu.
Đây là bệnh đường hô hấp trên heo phổ biến ở nước ta và trên thế giới. Bệnh
được xem là nguyên nhân quan trọng gây thiệt hại kinh tế do làm giảm sức đề
kháng, giảm năng suất chăn nuôi, heo còi cọc, chậm lớn, tỷ lệ tiêu tốn thức ăn cao,
tăng chi phí thuốc điều trị (Nguyễn Thị Phước Ninh, 2010).

Thiệt hại do bệnh còn nghiêm trọng hơn khi có sự tương tác phức tạp giữa
nhiễm MH với các tác nhân gây bệnh khác, quản lý kém và điều kiện môi trường
không tốt. Các vi khuẩn khác như Streptococcus, Staphylococcus, Bordetella
bronchiseptica, Actinomyces pyogenes, Actinobacilus pleunopneumoniae (APP),
Pasteurella mutocida, Klebsiella và Salmonella cũng tham dự làm bệnh trầm trọng
hơn (Straw và Clark, 1999; trích dẫn bởi Quách Tuyết Anh, 2003).
2.1.1 Lịch sử và phân bố địa lý
Năm 1892 Nocard và Roux phát hiện ra loài vi sinh vật này trên bò bị viêm
phổi (Lê Anh Phụng, 1996). Năm 1898 hai ông đã phân lập được loài vi sinh vật
này trên phổi những bò bị viêm phổi và đặt tên là PPLO (Pleuro Pneumoniae Like
Organisum). Đến năm 1929 hai ông mới đề nghị đặt tên là Mycoplasma (Trần Thị
Bích Liên và Tô Minh Châu, 2001).
Năm 1933, Kobe phát hiện bệnh viêm phổi mãn tính trên heo và ông gọi là
cúm heo (trích dẫn bởi Đỗ Tiến Duy, 2004).

3


Năm 1965, Mare và ctv đã phân lập được một loài Mycoplasma trên heo bị
viêm phổi và gây bệnh thực nghiệm, từ đó đề nghị đặt tên loại vi sinh vật này là
Mycoplasma hyopneumoniae (MH) (trích dẫn bởi Nguyễn Tất Toàn, 2004).
Ở Việt Nam, theo Nguyễn Như Pho (2003) bệnh được phát hiện từ đàn heo
ngoại nhập vào miền Bắc, sau đó lan nhanh nhưng chưa xác định được nguyên nhân
gây bệnh. Hiện nay bệnh xảy ra hầu như ở khắp các trại trong nước.
2.1.2 Căn bệnh
Theo bảng phân loại của Bergeys (1995) (trích dẫn Hoàng Văn Đức, 2008)
MH thuộc:
Giới

Bacteria


Ngành

Firmicutes

Lớp

Mollicutes

Bộ

Mycoplasmatales

Họ

Mycoplasmataceae

Giống

Mycoplasma

Loài

Mycoplasma hyopneumoniae

Theo Razin và ctv (1998) (trích dẫn Hoàng Văn Đức, 2008), Mycoplasma
không có thành tế bào, được bao bọc bởi màng nguyên sinh chất có 3 lớp. Trong 6
giống của lớp Mollicutes thì giống Mycoplasma có số lượng loài phong phú nhất
với hơn 80 loài đã được mô tả. Theo Barbara (1999), Mycoplasma có hơn 13 loài
gây bệnh trên heo với các loài phổ biến là:

- M. hyopneumonia gây bệnh viêm phổi địa phương
- M. hyorhinis gây viêm khớp và viêm đa thanh dịch mãn tính ở heo 3 – 10
tuần tuổi
- M. synoviae gây viêm khớp ở heo 12 – 14 tuần tuổi
- M. floculare hiện diện trong đường hô hấp của heo nhưng không gây bệnh
(trích dẫn Lê Thị Tuyết Toan, 2010).

4


2.1.3 Đặc điểm Mycoplasma
2.1.3.1 Đặc điểm sinh học
Mycoplasma thuộc lớp Mollicutes, là những Procaryotes nhỏ nhất, bộ gen
khoảng 5.108 dalton, nhỏ hơn so với vi khuẩn (2.109), có thể qua được lọc 0,22 µm.
Chúng thiếu gen tổng hợp thành tế bào, màng tế bào giống màng tế bào chất
của vi khuẩn. Vì không có khung chống đỡ nên chúng mềm yếu và hình dạng dễ
biến đổi như hình cầu, que, xoắn, vòng. Mycoplasma khó bắt màu với thuốc nhuộm
thông thường, muốn quan sát được dưới kính hiển vi người ta phải nhuộm bằng
phương pháp Giemsa (Trần Thanh Phong, 1996).
Sinh sản bằng cách phân đôi, một số sinh sản dạng kéo dài và cắt đứt thành
những thể nhỏ có đường kính 0,3 µm (trích dẫn Hoàng Văn Đức, 2008).
2.1.3.2 Đặc điểm nuôi cấy
Việc nuôi cấy và phân lập Mycoplasma đòi hỏi môi trường giàu dưỡng chất,
mọc chậm, dễ bị lấn át bởi các vi khuẩn khác và nấm. Hầu hết các Mycoplasma
sống kị khí, cần bổ sung 5 – 10 % CO2, nhiệt độ thích hợp 370C, pH = 7 – 8.
Trong môi trường thạch sau 2 – 6 ngày nuôi cấy quan sát dưới kính hiển vi
thấy khuẩn lạc nhỏ đường kính 0,02 – 0,5 mm, không có dạng trứng chiên và không
mọc xuyên trong thạch. MH mọc chậm khi nuôi cấy trên môi trường canh, màu của
môi trường chuyển từ đỏ sang vàng sau khi ủ từ 3 – 28 ngày. MH mọc chậm trong
những lần cấy chuyển đầu nhưng sau 3 đến 10 lần cấy chuyển sẽ trở nên thích nghi

phát triển nhanh chóng trong khoảng 24 – 48 giờ (trích dẫn Nguyễn Thị Phước
Ninh, 2010).
2.1.3.3 Sức đề kháng
Do không có thành peptidoglycan nên Mycoplasma rất nhạy cảm với các tác
nhân vật lý, hóa học.
Trong điều kiện khô Mycoplasma bị bất hoạt sau 48 giờ, trong môi trường
nước mưa (2 – 70C) có thể tồn tại đến 17 ngày, trong phổi ở - 250C tồn tại 2 tháng, 9
– 11 ngày ở nhiệt độ 1 – 60C và chỉ 3 – 7 ngày ở 17 – 250C

5


Các kháng sinh tetracycline, chloramphenicol và aminosides phong bế sinh
tổng hợp acid nhân ngăn trở sự nhân lên của Mycoplasma. Các kháng sinh chỉ tác
động lên thành tế bào như penicilin không có tác dụng với các Mycoplasma (Trần
Thanh Phong, 1996).
2.1.3.4 Phân bố tự nhiên
Trong tự nhiên, MH sống ở dạng tự do hoại sinh hay ký sinh, những loại gây
bệnh hay không gây bệnh đều tìm thấy trên màng nhày đường hô hấp, tiêu hóa, sinh
dục và tuyến vú.
2.1.4 Đặc điểm MH
Theo Trần Thanh Phong (1996), ngoài những đặc điểm chung của giống,
MH còn có những đặc điểm riêng sau: Sản sinh cytokin (vô hoạt ở 1000C/5 phút),
thời gian tăng trưởng dài hơn các Mycoplasma khác 5 – 7 ngày. Kích thước khuẩn
lạc 200 – 400 µm (sau 5 – 10 ngày nuôi cấy) nhưng không lồi lên giữa như các
Mycoplasma khác. Mọc tốt nếu có 5 – 10 % CO2.
Cấu trúc kháng nguyên gồm nhiều loại
Lactate dehydrogenase protein 36 kDa
Các protein có trọng lượng phân tử: 40, 43, 64, 97 kDa (giúp phân biệt với
M. floccularc, M. hyorhinis).

2.1.5 Truyền nhiễm học MH
2.1.5.1 Loài mắc bệnh
Trong tự nhiên MH chỉ gây bệnh trên heo. Heo ở tất cả các lứa tuổi đều mắc
bệnh nhưng cảm thụ mạnh nhất là giai đoạn nuôi thịt (khoảng 2 tháng tuổi). Heo
con sơ sinh thường cảm nhiễm từ mẹ hoặc từ môi trường, trong điều kiện môi
trường xấu có thể phát bệnh lúc một tháng tuổi hoặc sau cai sữa.
Heo nuôi thịt giai đoạn cuối cũng dễ mắc bệnh nhưng tỷ lệ giảm dần, giống
heo ngoại nhập nội có tỷ lệ mắc bệnh cao hơn giống heo lai và heo thuần giống nội.
Heo nái mang thai cũng dễ cảm nhiễm với mầm bệnh.
Ở phòng thí nghiệm thường gây bệnh trên heo con 10 – 21 ngày tuổi (trích
dẫn Huỳnh Lê Ngọc Diễm, 2008).

6


2.1.5.2 Chất chứa mầm bệnh
Mầm bệnh tập trung chủ yếu ở các tổ chức phổi, chất tiết đường hô hấp.
Ngoài ra, trong các hạch bạch huyết dọc khí quản cũng chứa nhiều MH, do đó có
thể phân lập MH từ các hạch bạch huyết này. Heo khỏi bệnh vẫn mang mầm bệnh
trên đường hô hấp từ vài tháng đến cả năm (Nguyễn Như Pho, 1999)
2.1.5.3 Đường xâm nhập và lây bệnh
MH chủ yếu xâm nhập và lây truyền bệnh qua đường hô hấp. Sự tiếp xúc
trực tiếp là điều kiện lý tưởng để bệnh truyền từ heo bệnh, heo mang trùng tới heo
khỏe. MH tồn tại trong đàn bằng cách truyền lây từ heo mẹ sang heo con, từ heo nái
sang heo thịt, từ heo lớn sang heo nhỏ.
Một vài heo nhiễm bệnh trong đàn khi tiếp xúc với heo khỏe, hoặc sau một
vài cơn ho sẽ bài xuất mầm bệnh qua các hạt chất tiết lơ lửng trong không khí, heo
khỏe mạnh hít phải sẽ mắc bệnh, từ đó sẽ hình thành đàn heo nhiễm bệnh mới.
Mầm bệnh có thể phát tán trong không khí với đường kính lớn hơn 3,2 km.
Yếu tố môi trường, điều kiện chăn nuôi, vệ sinh chăm sóc không tốt sẽ tạo điều kiện

thuận lợi mở đường cho MH xâm nhập và gây bệnh ( trích dẫn Lê Thị Tuyết Toan,
2010).
2.1.5.4 Cơ chế sinh bệnh
Theo Loper (2001) (trích dẫn Nguyễn Thị Phước Ninh, 2010), cơ chế gây bệnh
do MH chưa được giải thích đầy đủ. Tuy nhiên người ta biết rằng MH kết dính với
lông rung của tế bào biểu mô đường hô hấp bằng một protein kết dính duy nhất, làm
lông rung ngưng hoạt động rồi nhân lên ở đó, gắn chặt vào lông rung trên tế bào
biểu mô của khí quản, phế quản và tiểu phế quản ở vùng bụng thùy đỉnh của phổi.
Ngay khi gắn vào biểu mô đường hô hấp, MH kích thích bạch cầu trung tính tràn vào
niêm mạc khí – phế quản, làm mất một lượng lớn lông rung, kích thích tăng sản bạch cầu
lympho trong vùng phế quản và lôi cuốn bạch cầu đơn nhân vào mô kẽ tiểu phế quản –
phế nang; yếu tố độc lực của MH cũng làm giảm hoạt động thực bào của bạch cầu trung
tính trong phổi và làm thay đổi cấu tạo hóa học của chất nhầy, dẫn đến nhiễm trùng phổi
khi có tác nhân gây bệnh kế phát như P. mutocida, B. bronchiseptica, A. pyogenes .

7


2.1.6 Triệu chứng
MH gây bệnh viêm phổi mãn tính, tỷ lệ heo nhiễm bệnh cao (70 – 100 %)
nhưng tỷ lệ chết thấp (2 – 20 %). Thời gian nung bệnh biến đổi từ 1 – 3 tuần, bệnh
được ghi nhận vào lúc 2 tuần tuổi nhưng lan truyền rất chậm nên nhiều heo không
có triệu chứng cho đến 3 – 6 tuần tuổi (Đặng Thị Thu Hường, 2005).
Triệu chứng chính là heo ho kinh niên nên chậm lớn.Giai đoạn đầu heo ho
kéo dài và liên tục vài tuần cho đến cả tháng, một số heo không ho hoặc ho ít,
cường độ ho mạnh nhất trên heo vỗ béo, phổ biến là ho lúc heo di chuyển và sau khi
bị rượt đuổi (Ross, 1992, trích dẫn Nguyễn Thị Phước Ninh, 2010).
Theo Trần Thanh Phong (1996), heo bệnh với nhiều thể khác nhau. Những
heo mắc bệnh có thể chết hoặc hồi phục lại nhưng khả năng hồi phục rất chậm, heo
còi cọc, tăng trọng bình quân kém (15 – 20 %), lượng tiêu tốn thức ăn tăng hơn

25% so với bình thường, có trường hợp không tăng trọng sau vài tháng nuôi dưỡng.
Trong trường hợp cấp tính, heo ở mọi lứa tuổi có thể nhiễm bệnh, biếng ăn,
sốt cao 40,6 – 41,70C và ho (Taylor, 1993). Heo đang lớn và heo trưởng thành
thường chết do nhiễm trùng thứ phát và stress. Nếu khỏi bệnh heo chậm tăng trưởng
và phát triển (trích dẫn Lê Thị Tuyết Toan, 2010).
2.1.7 Bệnh tích
2.1.7.1 Bệnh tích đại thể
Phổi có những vùng đỏ sậm ở thùy tim, những phổi bị ảnh hưởng trở nên rắn
chắc sau 13 ngày bị nhiễm. Sau khi bệnh 3 tuần, vùng phổi rắn chắc chuyển màu từ
đỏ nhạt sang hồng xám, bệnh tích này biến mất sau 80 – 100 ngày bị bệnh (Nguyễn
Tất Toàn, 2004).
Trong giai đoạn đầu và giữa của bệnh, đường hô hấp thường có dịch viêm
dạng cata, hạch lympho quanh phế quản, tiểu phế quản và quanh mạch máu sưng to
gấp 2 – 5 lần bình thường (thủy thũng nhưng không có xuất huyết), khi không có
phụ nhiễm, bệnh tích thường chỉ chiếm 1/10 phổi nhưng khi có nhiễm trùng thứ
phát bệnh tích mở rộng có thể đến 1/2 – 2/3 phổi (Trần Thanh Phong, 1996).

8


2.1.7.2 Bệnh tích vi thể
Theo Whitleston (1972) (trích dẫn Nguyễn Thị Phước Ninh, 2010), trong phế
nang có sự tập trung của bạch cầu trung tính, sự thâm nhiễm của tế bào lympho vào
quanh các tiểu động mạch, tiểu tĩnh mạch và quanh đường thở, sau 10 – 15 ngày có
thể thấy rõ sự tích tụ nhiều dịch chất và tế bào đơn nhân lớn, vách liên phế nang dày
hơn. Bệnh tích nặng hơn vào khoảng 17 – 40 ngày sau khi heo cảm nhiễm. Vùng
bệnh tích đang lành có nhiều phế nang bị xẹp, khí thũng và những nốt lympho tăng
sinh mạnh mẽ, đặc biệt là trong đường thở. Hệ thống lông rung bị bào mòn, lòng
phế quản có nhiều chỗ tổn thương làm phế quản dày lên, bên trong chứa nhiều dịch
chất và tế bào bạch cầu gây hẹp phế quản, từ đó gây khó thở cho heo (Kwon và ctv,

2002, trích dẫn Nguyễn Ngọc Hoa Xuân, 2009).
Tuy nhiên cả hai cách đánh giá bệnh tích này đều có những hạn chế do có
nhiều vi rút hoặc vi khuẩn khác cũng gây ra những bệnh tích tương tự. Hơn nữa
bệnh tích trên phổi do MH không đặc trưng. Do đó bệnh thường xảy ra do nhiễm
phức hợp làm cho việc chẩn đoán bệnh khó khăn và phức tạp hơn (Thacker, 2001,
trích dẫn Nguyễn Thị Phước Ninh, 2010).
2.1.8 Chẩn đoán
2.1.8.1 Chẩn đoán lâm sàng
Dịch tễ học: bệnh xảy ra trong điều kiện vệ sinh nuôi dưỡng chăm sóc kém,
chuồng nuôi có độ thông thoáng không tốt, mật độ nuôi dày, bệnh phát triển chậm
và lây lan nhanh. Triệu chứng lâm sàng bao gồm ho kinh niên, khó thở, tần số hô
hấp cao, heo ngồi kiểu chó, chậm tăng trưởng, còi cọc, tử số thấp.
Bệnh tích trên phổi có nhiều vùng bị gan hóa, nhục hóa, tụy tạng hóa mang
tính đối xứng. Bệnh tích đại thể khá đặc trưng nhưng không chuyên biệt vì có
trường hợp bệnh tích tương tự nhưng lại do các tác nhân khác gây ra như
Pasteurella, Salmonella, Streptococcus pneumonniae, Haemophilus hoặc do loài
Mycoplasma khác (Huỳnh Lê Ngọc Diễm, 2008).

9


2.1.8.2 Chẩn đoán phòng thí nghiệm
Việc chẩn đoán MH bằng nuôi cấy phân lập thường gặp nhiều khó khăn
nhưng cần thiết cho việc xác định sự hiện diện của MH trên phổi của heo.
Người ta có thể sử dụng phương pháp huyết thanh học để chuẩn đoán như
kết hợp kháng nguyên – kháng thể (HI), phản ứng kết hợp bổ thể (CF), phản ứng
miễn dịch huỳnh quang và ELISA. Ngoài ra nếu dùng X – quang trên tim phổi cho
thấy ở vành tim và đường huyết quản mờ đi (Nguyễn Ngọc Hoa Xuân, 2009).
Kỹ thuật PCR được sử dụng ngày càng nhiều vì có độ chính xác cao, ít tốn
thời gian, có thể phát hiện trực tiếp kháng nguyên và chẩn đoán MH trước khi có

đáp ứng miễn dịch dịch thể (Mattsson, 1994, trích dẫn Nguyễn Tất Toàn, 2004).
2.1.9 Điều trị và phòng bệnh
2.1.9.1 Điều trị
Bệnh do MH là tiền đề cho những bệnh kế phát khác, do đó cần chẩn đoán,
phát hiện nhanh để cách ly ngay những heo có triệu chứng bệnh và kết hợp dùng
kháng sinh với tăng cường trợ sức, trợ lực và cải thiện môi trường.
MH nhạy cảm với các kháng sinh ở nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) như
enrofloxacin 0,05 g/ml, flumequine 0,5 g/ml, tiamulin 0,025 g/ml, tylosin 0,025
g/ml, oxytetracycline 0,25 g/ml (Hannan, 2000).
Theo Nguyễn Như Pho (1999) bệnh có thể điều trị bằng các loại kháng sinh
nhóm tetracycline, macrolide và quinolone. Nhưng khi hệ thống lông rung đã bị hư
hại thì việc dùng kháng sinh chỉ diệt MH chứ không giúp tái tạo lại hệ thống lông
rung, yếu tố tự bảo vệ mất đi, thú dễ dàng tái nhiễm các mầm bệnh gây viêm phổi
chỉ một thời gian ngắn sau khi ngưng dùng thuốc. Để hạn chế sự phát triển của bệnh
và phụ nhiễm, khi đàn heo có triệu chứng ho nhiều cần trộn kháng sinh vào thức ăn.
2.1.9.2 Phòng bệnh
Cần phối hợp tốt các biện pháp sau để cho hiệu quả tốt nhất
Để kiểm soát hiệu quả bệnh này các trại cần thực hiện tốt các biện pháp an
toàn sinh học, cải thiện tiểu khí hậu chuồng nuôi; có chế độ dinh dưỡng hợp lý, hạn
chế bụi từ thức ăn và môi trường; kiểm tra kỹ trước khi mua heo, cách ly trước khi

10


nhập đàn; thực hiện “cùng vào, cùng ra” ngăn ngừa bệnh lây ngang giữa các đàn;
dùng kháng sinh cho heo nái từ khi mang thai đến khi đẻ để tạo những đàn heo với
mức nhiễm MH thấp.
Phòng bệnh bằng vaccine cho kết quả khả quan hơn, tuy vaccine không ngăn
ngừa được bệnh nhưng làm giảm đáng kể bệnh tích trên phổi. Theo Clack (1999)
tiêm vaccine cho nái mang thai giúp heo con nhận được lượng kháng thể qua sữa

đầu cao hơn gấp 3 lần so với bình thường. Ở Việt Nam một số vaccine phòng bệnh
do MH như Respisure R, Respisure One, Hyoresp, Respifen...(trích dẫn Nguyễn Thị
Thanh Trúc, 2009).
Theo Maes và ctv (2008), để kiểm soát bệnh trên đường hô hấp trong đó có
bệnh viêm phổi địa phương, các kháng sinh nhóm tetracycline và macrolide thường
được sử dụng nhất. Ngoài ra người ta còn dùng các kháng sinh khác tác động lên
MH như lincosamide, pleuromutilin, fluoroquinolon, florfenicol (trích dẫn Nguyễn
Văn Nhã, 2010).
2.2 Những phương pháp xác định MH
2.2.1 Quan sát đánh giá bệnh tích phổi
Phổi bệnh cần được quan sát tất cả các thùy, mở khí quản, sờ nắn để đánh giá
mức độ chắc của phổi, xem sự phân bố và màu sắc của bệnh tích, đồng thời kiểm tra
mặt cắt của phổi.Phổi bệnh được đánh giá mức độ hư hại dựa vào bệnh tích trên bề
mặt phổi như xuất huyết, viêm dính, phù, nhục hóa, hóa gan, hoại tử, ổ mủ, nhạt
màu, xẹp. .. đặc trưng cho bệnh do MH gây ra. Hư hại trên bề mặt phổi tính theo tỉ
lệ (%) hư hại của từng thùy phổi và tính tỉ lệ (%) trung bình hư hại của toàn phổi
dựa theo công thức được đề nghị bởi Christensen (1999).
Bệnh tích đại thể nghi ngờ MH được dựa vào những biểu hiện như bệnh tích
hiện diện hai bên phổi thùy đỉnh, thùy tim, thùy phụ và phần trước thùy hoành cách
mô. Bệnh tích thể cấp tính phổi có màu đỏ sậm, màu hồng, phù. Ở thể mãn tính, phổi
có màu đỏ sậm đến xám, phổi xẹp và phân ranh giới rõ ràng giữa vùng bệnh tích với
vùng phổi bình thường. Hạch lympho phế quản và hạch lympho màng trung thất sưng
lớn.

11


2.2.2 Phân lập MH
2.2.2.1 Môi trường nuôi cấy
Vì bản chất bộ gen MH không có hầu hết các gen sinh tổng hợp acid amin, acid

béo, tiền chất và các vitamin, chúng phải phụ thuộc vào vật chủ để phát triển nên MH
rất khó nuôi cấy thành công trên môi trường không có tế bào. Do đó môi trường nuôi
cấy MH đòi hỏi phải có nhiều dưỡng chất, đồng thời được thêm chất ức chế các vi sinh
vật khác. Môi trường Friis’ thường được dùng trong phân lập MH.
Công thức môi trường Friis’ (Freundt, 1983, trích dẫn Nguyễn Thị Phước Ninh, 2010)
Dung dịch muối đệm Hanks (10 X)/PBS

30 ml

Nước cất 2 lần

720 ml

BHI

5g

Mycoplasma broth base

7,5 g

Lactalbumin hydrolysate

1,25 g

Yeast extract

0,5 g

Phenol red (0,1 %)


13,7 ml

Điều chỉnh pH tới 7,8 và hấp khử trùng ở 1210C trong 20 phút, bổ sung thêm:
Glucose (50 %)

2,5ml

Huyết thanh ngựa

100ml

Huyết thanh heo bất hoạt ở 560C trong 30 phút

100ml

Fresh yeast extract (50 %)

36,5 ml

Thalium acetate (2 %)

5,5ml

Penicillin

2000 UI / môi trường

Môi trường thạch Friis’: từ môi trường canh trên cho thêm thạch nguyên chất
(6g trong 1 lít môi trường).

2.2.2.2 Ý nghĩa của các thành phần trong môi trường nuôi cấy MH
BHI (Brain heart infusion both): là chất căn bản trong môi trường nuôi cấy
của nhiều Mycoplasma khác nhau do chứa nhiều chất dinh dưỡng.
Yeast extract: chất chiết nấm men tươi, là chất dịch lỏng tiết ra từ nấm men
đã lên men, chứa nhiều acid nucleic và tiền chất của nó.

12


Huyết thanh: cung cấp acid béo và cholesterol dễ đồng hóa và không độc,
giúp tổng hợp màng.
Phenol red: chất chỉ thị màu để kiểm tra sự phát triển của MH
Penicillin: ngăn cản sự phát triển của các vi khuẩn Gram dương
Thalium acetate: cản trở sự phát triển của vi khuẩn Gram âm và nấm
(Nguyễn Thị Phước Ninh, 2010)
2.2.3 Kỹ thuật PCR
PCR là kỹ thuật dùng để khuếch đại đoạn gen lên hàng triệu bản do Karl
Mullis và ctv phát minh ra vào năm 1985. Mục đích của phản ứng PCR là nhằm tạo
ra một số lượng rất lớn các bản sao của một đoạn gen di truyền nào đó xảy ra trong
một thời gian ngắn nhờ hoạt động của men ADN polymerase và một cặp mồi đặc
hiệu cho đoạn ADN này.
Thành phần của một phản ứng PCR bao gồm: ADN cần xác định, hỗn hợp
gồm enzyme tổng hợp ADN chịu nhiệt, 4 loại dNTP, dung dịch đệm cho phản ứng
và magnesium, hai đoạn nucleotide mồi. Các thành phần trên được trộn đều và đặt
vào máy luân nhiệt.
Tất cả ADN polymerase khi hoạt động tổng hợp một mạch ADN mới từ
mạch khuôn đều cần sự hiện diện của những mồi chuyên biệt. Mồi là những đoạn
ADN ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một đầu của mạch khuôn và ADN
polymerase sẽ nối dài mồi để hình thành mạch mới. Nếu cung cấp 2 mồi chuyên
biệt để bắt cặp bổ sung với hai đầu của trình tự ADN sẽ tổng hợp được đoạn ADN

nằm giữa hai mồi. Đoạn mồi tác động lên đầu 3’ – 5’ gọi là mồi xuôi, tác động lên
đầu 5’ – 3’ gọi là mồi ngược.
* Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ có 3 bước:
Bước 1: biến tính ADN ở 950C trong 4 phút, phân tử ADN từ mạch đôi tách
hai mạch đơn làm mạch khuôn cho sự tổng hợp hai mạch bổ sung.
Bước 2: gồm 35 chu kỳ với biến tính 950C trong 45 giây, ủ bắt cặp ở 600C
trong 1 phút và kéo dài ở 720C trong 2 phút.

13


Bước 3: kéo dài chuỗi ở 720C trong 7 phút. Dưới tác động của ADN
polymerase, các nucleotide lần lượt gắn vào mồi theo nguyên tắc bổ sung với mạch
khuôn. Mạch mới tạo thành từ mồi được nối dài.
Trong phản ứng PCR, một chu kỳ bao gồm 3 bước trên sẽ được lặp lại nhiều
lần, làm gia tăng số lượng sản phẩm theo cấp số nhân. Sau 30 – 40 chu kỳ, sự
khuếch đại cho ra khoảng 106 bản sao.
Sau phản ứng PCR, các ADN sản phẩm có thể quan sát thấy thông qua việc
điện di sản phẩm PCR trên gel agarose 1,5 % được nhuộm bởi ethidium bromide và
quan sát dưới tia UV (bước sóng 312 nm)

Hình 2.1 Nguyên tắc của phản ứng PCR
(Nguồn: />
14