BỘ GIÁO DỤC và ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA CHĂN NUÔI - THÚ Y
*****************

KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
PHÂN LẬP MỘT SỐ CHỦNG LACTOBACILLUS CÓ LỢI TỪ
PHÂN HEO CON

Sinh viên: TRẦN THANH TIẾN
Lớp:

DH07DY

Ngành:

Thú Y chuyên ngành Dược

Niên khóa: 2007-2012

Tháng 08/2012


BỘ GIÁO DỤC và ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
KHOA CHĂN NUÔI - THÚ Y
*****************

TRẦN THANH TIẾN

PHÂN LẬP MỘT SỐ CHỦNG LACTOBACILLUS CÓ LỢI TỪ

PHÂN HEO CON

Khóa luận được đệ trình để đáp ứng yêu cầu cấp bằng Bác sỹ thú y
Chuyên ngành Dược

Giáo viên hướng dẫn
TS. HỒ THỊ KIM HOA
BSTY. LÊ HỮU NGỌC

Tháng 08/2012

i
 


PHIẾU XÁC NHẬN CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN
Họ và tên: TRẦN THANH TIẾN
Lớp: DH07DY
Tên đề tài: “Phân lập một số chủng Lactobacillus có lợi từ phân heo con”
Khóa luận đã được thực hiện theo đúng yêu cầu của giáo viên hướng dẫn và các ý
kiến, đóng góp của hội đồng chấm luận văn.
Ngày.....tháng.....năm 2012
Giáo viên hướng dẫn

TS. HỒ THỊ KIM HOA

ii
 



LỜI CẢM TẠ
Con xin dâng lòng thành kính đến cha mẹ và các thành viên trong gia đình - những
người đã hết lòng nuôi dưỡng, quan tâm và động viên con. Đó chính là nguồn động
viên to lớn để con cố gắng vươn lên trong học tập.
Tôi xin chân thành biết ơn Ban Giám Hiệu Trường Đại học Nông Lâm Thành phố
Hồ Chí Minh, ban Chủ Nhiệm khoa Chăn Nuôi - Thú Y cùng toàn thể thầy cô đã
tận tình giảng dạy tôi trong suốt thời gian học tại trường.
Tôi xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Hồ Thị Kim Hoa và BSTY. Lê Hữu Ngọc đã
nhiệt tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt thời gian thực hiện đề tài.
Tôi xin gửi lời cảm ơn đến anh Vũ Ngọc Kim Khánh đã tận tình giúp đỡ và đồng
hành với tôi trong quá trình làm đề tài.
Tôi xin chân thành cảm ơn các anh chị, các bạn trong phòng thực tập “Kiểm nghiệm
Súc sản, Khoa Chăn nuôi - Thú y, Trường Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí
Minh đã tạo mọi điều kiện cho tôi hoàn thành đề tài. Cảm ơn tập thể lớp DH07DY
đã giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tại trường.

TRẦN THANH TIẾN

iii
 


MỤC LỤC
Trang
Trang tựa……………………………………………………………………………...i
PHIẾU XÁC NHẬN CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN.......................................... ii
LỜI CẢM TẠ ............................................................................................................ iii
MỤC LỤC ................................................................................................................. iv
DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT ......................................................................... vi
DANH SÁCH CÁC BẢNG ..................................................................................... vii

DANH SÁCH CÁC HÌNH ..................................................................................... viii
TÓM TẮT LUẬN VĂN ........................................................................................... ix
CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU ..............................................................................................1
1.1. Đặt vấn đề ............................................................................................................1
1.2. Mục tiêu ...............................................................................................................2
1.3. Yêu cầu.................................................................................................................2
CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN ......................................................................................3
2.1 Hệ vi sinh vật đường ruột động vật .......................................................................3
2.2 Nhóm vi khuẩn sinh a-xít lac-tic ...........................................................................5
2.3 Kháng sinh trong chăn nuôi ..................................................................................8
2.4 Những hệ lụy của việc sử dụng kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi .................12
2.5 Đại cương về probiotics ......................................................................................15
2.5.1 Giới thiệu về probiotics ....................................................................................15
2.5.2 Vai trò của probiotics .......................................................................................16
2.6 Sử dụng probiotics trong chăn nuôi ....................................................................18
CHƯƠNG 3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................22
3.1 Thời gian và địa điểm thực hiện..........................................................................22
3.2 Nội dung nghiên cứu ...........................................................................................22
3.3 Phương pháp nghiên cứu.....................................................................................22
3.3.1 Đối tượng lấy mẫu và phương pháp lấy mẫu ...................................................22
3.3.2 Phân lập vi khuẩn .............................................................................................23

iv
 


3.3.3 Định danh các gốc vi khuẩn nghi ngờ Lactobacillus spp. bằng phản ứng PCR ..
............................................................................................................................25
3.3.4 Kiểm tra khả năng ức chế một số vi khuẩn gây bệnh cơ hội và vi khuẩn gây
bệnh của các Lactobacillus spp. phân lập .................................................................26

3.3.5 Kiểm tra khả năng đề kháng một số kháng sinh của các gốc vi khuẩn............28
CHƯƠNG 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ..........................................................30
4.1 Phân lập vi khuẩn Lactobacillus spp...................................................................30
4.2 Kiểm tra khả năng ức chế coliforms, E. coli và Salmonella sp. .........................31
4.3 Khả năng đề kháng kháng sinh ...........................................................................36
CHƯƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ...............................................................40
5.1 Kết luận ...............................................................................................................40
5.2 Hạn chế................................................................................................................40
5.3 Đề nghị ................................................................................................................40
TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................41
PHỤ LỤC .................................................................................................................51

v
 


DANH SÁCH CÁC TỪ VIẾT TẮT
CFU:

Colony - forming unit

CTAB:

Cetyl Trimethylammonium Bromide

EMB:

Ethylene Methylene Blue Agar

ETEC:


Enterotoxigenic Escherichia coli

FAO:

Food and Agriculture Organization

GAO:

General Accounting Office

LDC:

Lysine Decarboxylase Broth

PCR:

Polymerase Chain Reaction

MR:

Methyl red

MHA:

Mueller Hinton Agar

MRSA:

De Man, Rogosa, Sharpe Agar


MRSB:

De Man, Rogosa, Sharpe Broth

NCCLS:

National Commite for Clinical Laboratory Standards

TBE:

Tris base - Borate - EDTA Buffer

TE:

Tris base - EDTA Buffer

TSI:

Triple Sugar Iron Agar

TSB:

Trypticase Soy Broth

TSA:

Tryptic Soy Agar

VP:


Voges Proskauer

WHO:

World Health Organization

XLD:

Xylose Lysine Deoxycholate Agar

vi
 


DANH SÁCH CÁC BẢNG
Bảng 2.1: Sự phân bố vi khuẩn ở các đoạn ruột non (log10CFU/ml) .........................5
Bảng 2.2: Những kháng sinh cho phép sử dụng kích thích tăng trọng ở châu Âu ...10
Bảng 2.3: Danh sách kháng sinh được phép sử dụng trong chăn nuôi ở Mỹ ...........11
Bảng 2.4: Các loại kháng sinh trong phòng và trị bệnh tiêu chảy............................12
Bảng 2.5: Kết quả kháng sinh đồ đối với E. coli (α-haemolysis) ............................13
Bảng 2.6: Danh sách hóa chất và kháng sinh cấm sử dụng ở Việt Nam ..................14
Bảng 2.7: Danh sách các loại bacteriocin.................................................................17
Bảng 3.1: Tiêu chuẩn CLSI đối với họ Enterobacteriaceae (2010) ........................29
Bảng 4.1: Kết quả thí nghiệm Lactobacillus spp. đối kháng coliforms ...................32
Bảng 4.2: Đường kính vòng vô khuẩn đối với E. coli và Salmonella sp. ................33
Bảng 4.3: Đường kính vòng vô khuẩn trong thử nghiệm kháng sinh đồ (mm) .......37

vii
 



DANH SÁCH CÁC HÌNH
Hình 4.1: Khuẩn lạc nghi ngờ Lactobacillus spp. trên môi trường Rogosa ............ 30
Hình 4.2: Tế bào vi khuẩn nghi ngờ Lactobacillus spp. dưới kính hiển vi.............. 31
Hình 4.3: Kết quả phân tích PCR ............................................................................. 31
Hình 4.4: Vòng vô khuẩn trong thí nghiệm đối kháng với E. coli ........................... 34
Hình 4.5: Vòng vô khuẩn trong thí nghiệm đối kháng với Salmonella sp............... 34
Hình 4.6: Chủng Đ22 đề kháng với tetracycline, cephalexin và colistin................. 38

viii
 


TÓM TẮT LUẬN VĂN
Đề tài được tiến hành nhằm mục đích phân lập và tuyển chọn một số chủng
Lactobacillus spp. mang một số đặc tính có lợi (có khả năng ức chế một số vi khuẩn
gây bệnh cơ hội và vi khuẩn gây bệnh đường ruột) trong phân heo con sau cai sữa.
Đây là bước đầu trong quá trình phân lập các chủng vi khuẩn probiotics tiềm năng
cho heo con sau cai sữa cho thị trường Việt Nam.
38 mẫu phân heo con sau cai sữa khỏe mạnh được thu thập từ 3 trại chăn
nuôi ở Thành phố Hồ Chí Minh, Đồng Nai và Tiền Giang. Mẫu được nuôi cấy trên
thạch Rogosa (môi trường chuyên biệt đối với nhóm lactobacilli). Dựa vào hình
dạng và một số tính chất sinh hóa, 23 gốc vi khuẩn nghi ngờ là Lactobacillus spp.
được phân lập. Bằng kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction), 23 gốc vi khuẩn
nghi ngờ trên được xác định các Lactobacillus spp.. Khi được kiểm tra khả năng đối
kháng với coliforms trong phân, có 11 gốc vi khuẩn Lactobacillus spp. có khả năng
làm giảm hơn 1 log10(CFU coliforms/ml). Dịch nuôi cấy của 11 gốc vi khuẩn này
cũng thể hiện khả năng ức chế sự phát triển của E. coli và Salmonella sp. phân lập
từ phân heo con tiêu chảy khi được kiểm tra bằng phương pháp khuếch tán trên

thạch. Kiểm tra kháng sinh đồ của 11 gốc vi khuẩn trên với 7 loại kháng sinh
thường dùng trong các trại chăn nuôi cho thấy tất cả các gốc vi khuẩn này đều đề
kháng với colistin, 6 gốc đề kháng đối với neomycin, 2 gốc đề kháng với
tetracycline/cephalexin, 1 gốc đề kháng với chloramphenicol/gentamicin và không
có gốc nào đề kháng với penicillin.
Tóm lại, sau thí nghiệm, 11 gốc Lactobacillus spp. đã được phân lập từ phân
heo con, chúng có khả năng ức chế coliforms, E. coli, và Salmonella sp.. Các vi
khuẩn này đã được giữ lại để tiếp tục nghiên cứu.

ix
 


CHƯƠNG 1
MỞ ĐẦU
1.1. Đặt vấn đề
Trong một thời gian dài, việc sử dụng kháng sinh trong chăn nuôi được xem
đã mang lại nhiều hiệu quả trong phòng và điều trị bệnh. Ngoài ra, việc sử dụng các
kháng sinh phổ rộng trong thức ăn với liều lượng thấp còn được cho rằng có hiệu
quả kích thích tăng trọng. Điều này dẫn đến tình trạng tồn dư kháng sinh trong các
sản phẩm, thực phẩm và sự phát triển những chủng vi khuẩn đề kháng kháng sinh.
Đồng thời, một lượng lớn kháng sinh được bài thải trong phân ra môi trường làm
ảnh hưởng đến sức khỏe cộng đồng (Addison, 1984).
Probiotics hiện đang được xem là một trong những giải pháp hữu hiệu nhất
để thay thế kháng sinh với mục đích phòng bệnh trong chăn nuôi. Các vi sinh vật có
lợi được bổ sung vào thức ăn với mục đích tăng cường chức năng miễn dịch, cải
thiện khả năng tiêu hóa, dung nạp lactose, tổng hợp vitamin B, giảm cholesterol và
ức chế các vi sinh vật có hại trong đường ruột (Gupta và Garg, 2009). Probiotics
góp phần đáng kể vào việc cải thiện sức khỏe đàn vật nuôi và sức khỏe cộng đồng.
Đối với nền chăn nuôi trong nước hiện nay, mặc dù các nhà chăn nuôi đều

xem kháng sinh là giải pháp tiên quyết, không thể thay thế để đảm bảo cho sức khỏe
của đàn vật nuôi, nhưng khái niệm probiotics đang dần trở nên quen thuộc với nhà
chăn nuôi. Nhiều nghiên cứu trong nước cho thấy việc sử dụng probiotics trong
thức ăn chăn nuôi mang lại hiệu quả tích cực đối với phòng bệnh, cải thiện năng
suất và tăng cường sức đề kháng cho vật nuôi. Tuy nhiên các sản phẩm được dùng
trong nước đa phần có nguồn gốc ngoại nhập.
Xuất phát từ nhu cầu thị trường, tiềm năng kinh tế và được sự cho phép của
ban chủ nhiệm Khoa Chăn nuôi - Thú y Trường Đại học Nông Lâm thành phố Hồ

1
 


Chí Minh, chúng tôi tiến hành đề tài : “Phân lập một số chủng Lactobacillus có
lợi từ phân heo con”.
1.2. Mục tiêu
Lựa chọn một số chủng vi khuẩn Lactobacillus spp. có lợi có tiềm năng dùng
trong sản xuất probiotics cho heo con.
1.3. Yêu cầu
- Phân lập và định danh vi khuẩn bằng kiểu hình và kỹ thuật PCR.
- Kiểm tra khả năng ức chế các vi khuẩn đường ruột: vi khuẩn coliforms, E. coli và
Salmonella sp..
- Kiểm tra khả năng đề kháng với một số kháng sinh của các vi khuẩn được chọn.

2
 


CHƯƠNG 2
TỔNG QUAN

2.1 Hệ vi sinh vật đường ruột động vật
Khi mới sinh ra, thú gần như không có hệ vi sinh vật đường ruột. Trong quá
trình tiếp xúc với môi trường sống, thú non bắt đầu tiếp nhận hệ vi sinh vật đường
ruột cho riêng mình. Hàng trăm loài vi sinh vật được ghi nhận như là thành phần
của hệ vi sinh vật đường ruột tại chỗ của heo sơ sinh và nguồn gốc của chúng là từ
heo mẹ và môi trường (Finegold và cs, 1983; Conway, 1997).
Tuy nhiên thú non cần phải có một khoảng thời gian nhất định để hoàn chỉnh
hệ vi sinh vật đường ruột cho riêng mình. Tiến trình hình thành quần thể vi sinh vật
này là kết quả của quá trình chọn lọc tự nhiên và thích nghi sinh thái trong đường
ruột. Lúc bắt đầu của quá trình, nhóm vi khuẩn yếm khí tùy nghi như E. coli và
enterococci phát triển mạnh mẽ và chiếm ưu thế (Rotimi và Duerden, 1981;
Yoshiota, 1991). Nhưng sau đó, chính nhờ sự phát triển của chúng đã góp phần làm
cải thiện môi trường sống, cho phép nhóm vi khuẩn kỵ khí bắt buộc có cơ hội sinh
trưởng và phát triển.
Có sự khác biệt rõ rệt về thành phần hệ vi sinh vật đường ruột tùy theo vị trí
của chúng bên trong đường ruột và khẩu phần của thú non (Drasar và Roberts,
1989). Theo nghiên cứu của Yoshiota và cs (1991), nếu trong giai đoạn đầu khẩu
phần thú non là thức ăn đơn thì bifidobacteria chiếm ưu thế trong thành phần hệ vi
sinh vật đường ruột và chiếm khoảng 1 %. Ngược lại, nếu khẩu phần của chúng là
thức ăn hỗn hợp, thành phần hệ vi sinh vật đường ruột là một tổ hợp bao gồm
bifidobacteria, bacteroides, clostridia, streptococci và các nhóm thông thường khác.
Bổ sung cho quan điểm đó, Gibson và Roberfroid (1995) cũng cho rằng hoạt động
của nhóm vi sinh vật đường ruột chịu tác động trực tiếp của đặc tính sinh lý và cấu

3
 


trúc của đường ruột. Sự hiện diện và khả năng hoạt động của chúng phụ thuộc vào
phần cơ chất có thể sử dụng được, phản ứng ô-xy hóa khử, nồng độ O2 và vị trí khác

nhau trong ruột non (Cummings và Macfarlane, 1991). Sau khi cai sữa, thú non đã
được thiết lập hệ vi sinh vật đường ruột hoàn chỉnh như thú trưởng thành (Gibson,
1995).
Thành phần hệ vi sinh vật đường ruột động vật
Động vật khỏe mạnh có hệ tiêu hóa hoạt động tốt là cơ sở cho sự chuyển hóa
tốt thức ăn phục vụ cho nhu cầu của cơ thể. Đặc tính quan trọng nhất của một hệ
tiêu hóa khỏe mạnh là sự cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột. Do đó, hệ vi sinh vật
đường ruột đóng vai trò quan trọng, đảm bảo cho sức khỏe của vật chủ. Người ta đã
phân lập được 400 - 500 loài vi khuẩn từ ruột già. Nhóm vi khuẩn này có thể gây
bệnh hay không gây bệnh (Alfonso và cs, 2004). Tuy nhiên, ngay cả khi có sự hiện
diện của vi khuẩn gây bệnh thì chưa hẳn vật chủ có thể mắc bệnh. Vật chủ mắc
bệnh hay không còn tùy thuộc vào rất nhiều yếu tố khác nhau như độc lực, tính gây
bệnh, sức đề kháng của cơ thể, sự cân bằng và tình trạng hệ vi sinh vật đường ruột.
Nhìn chung, tùy theo ảnh hưởng tốt hay xấu mà chúng mang lại cho vật chủ
mà hệ vi sinh vật đường ruột được chia thành hai nhóm chính. Ảnh hưởng có hại do
vi sinh vật có thể gây ra như: tiêu chảy, nhiễm trùng, sản sinh chất gây ung thư, lên
men thối, ảnh hưởng đến khả năng tăng trọng hay sức khỏe của vật chủ. Ngược lại,
nhóm khác lại có thể giúp cơ thể cải thiện chức năng miễn dịch, tăng khả năng tiêu
hóa và hấp thu các dưỡng chất thiết yếu, tăng cường tổng hợp vitamin (Gibson,
1995).
Tuy nhiên, Marteau (2001) và Harmsen (2002) lại cho rằng hệ vi sinh vật
đường ruột được chia ra làm ba nhóm chủ yếu, bao gồm nhóm phổ hệ chính, nhóm
phổ hệ vệ tinh và nhóm còn lại. Ở thú dạ dày đơn nhóm phổ hệ chính (chiếm hơn 90
%) phần lớn là các loài kỵ khí như clostridia, bifidobacteria, lactobacilli,
bacteroides, eubacteria…chúng sản sinh ra a-xít lac-tic và các a-xít béo chuỗi ngắn
khác. Nhóm phổ hệ vệ tinh (chiếm khoảng 1 %) chủ yếu là Enterobacter và E. coli.
Nhóm còn lại (≤ 0,01 %) thành phần chủ yếu là các loài vi sinh vật gây hại như

4
 



Proteus, staphylococci, pseudomonas. Trong hệ sinh thái dạ dày ruột, các loài vi
sinh vật khác nhau sống cùng nhau và được duy trì ở một mức cân bằng nhất định
(Jans, 2005).
Thành phần và mật độ các vi khuẩn này khác nhau trong cơ thể vật chủ và
được xác định bởi các yếu tố dinh dưỡng, mức độ kết bám và các yếu tố khác như
yếu tố di truyền, giới tính, tình trạng nội tiết, quá trình nuốt, chế độ ăn (khẩu phần,
cách cho ăn và tần số cho ăn), quần thể vi sinh vật đường ruột, tình trạng sức khỏe
và điều trị kháng sinh. Ngoài ra, tùy theo đặc tính thích nghi mà chúng còn được
phân bố ở những đoạn khác nhau của ống tiêu hóa (Bảng 2.1).
Bảng 2.1: Sự phân bố vi khuẩn ở các đoạn ruột non (log10CFU/ml)
Đoạn ruột

Tá tràng

Không

Hồi tràng

Manh tràng

Kết tràng

tràng
Lactobacillaceae/
Bifidobacteria

6,3±1,4


7,7±0,6

8,0±0,1

8,5±0,2

8,7±0,4

Eubacteria

6,3±1,3

7,8±0,6

8,3±0,7

8,9±0,3

9,0±0,5

Bacteroidaceae

4,1±1,3

5,4±1,1

6,7±0,8

7,9±0,6


7,9±0,6

Tổng số phổ hệ chính

2,9±0,7

4,8±1,5

6,6±1,2

7,0±0,9

7,2±1,0

E. coli

2,3±0,7

3,9±1,5

5,7± 0,7

5,8±0,2

5,8±0,9

Enterococci

6,6±1,3


8,1±0,6

8,6±0,7

9,2±0,2

9,2±0,4

Tổng số phổ hệ vệ tinh

3,0±0,4

4,9±1,4

6,8±1,0

7,0±0,9

7,3±0,9
Gedek, 1992

2.2 Nhóm vi khuẩn sinh a-xít lac-tic
Vi khuẩn sinh a-xít lac-tic là nhóm vi khuẩn có đặc điểm về hình thái,
chuyển hóa và chức năng đặc trưng. Chúng là những nhóm vi khuẩn Gram dương,
không bào tử, kỵ khí, có dạng hình cầu hay hình que. Chức năng chính của chúng là
sinh a-xít lac-tic - sản phẩm cuối cùng của quá trình lên men carbohydrate. Nhóm vi
khuẩn sinh a-xít lac-tic tương tác mạnh mẽ với nhóm vi khuẩn có trong thức ăn và
sự lên men thức ăn, bao gồm cả hệ vi khuẩn bình thường vẫn hiện diện trên màng
nhầy của người và gia súc khỏe mạnh. Thành phần của nhóm vi khuẩn này vẫn còn


5
 


nhiều tranh cãi, nhưng chủ yếu bao gồm Lactobacillus spp., Leuconostoc,
Pediococcus và Streptococcus.
Sự phân loại các vi khuẩn sinh a-xít lac-tic giữa các giống chủ yếu dựa trên
đặc tính sinh lý, cách thức lên men đường glucose, nhiệt độ phát triển, cấu hình của
sản phẩm a-xít lac-tic và khả năng chịu đựng ở nồng độ cao các muối, a-xít,
alkaline…Một số nhà khoa học khác thì dựa vào thành phần cấu tạo của a-xít béo
và cấu tạo thành tế bào để phân loại chúng. Một trong những cách quan trọng nhất
để phân biệt các giống trong nhóm này là dựa vào cách thức lên men đường trong
điều kiện tiêu chuẩn (không giới hạn nồng độ glucose và các yếu tố tăng trưởng
như: a-xít amin, vitamin, tiền a-xít nucleic nhưng phải kiểm soát lượng ô-xy). Dưới
điều kiện trên người ta có thể chia nó thành hai nhóm: nhóm lên men đồng hình (lên
men glucose thành a-xít lac-tic là chủ yếu) và nhóm lên men dị hình (lên men
glucose thành a-xít lac-tic, ethanol/a-xít a-xê-tic, CO2) (McFarland, 2007).
Với hệ enzyme của mình (proteinase, lipase, β-galactosidase, glycolase)
nhóm vi khuẩn sinh a-xít lac-tic phân giải protein thành các polypeptide mạch ngắn,
phân cắt chất béo ở dạng triglyceride thành các a-xít béo và glycerol và lên men
đường lactose tạo ra a-xít lac-tic góp phần đáng kể vào việc cải thiện khả năng tiêu
hóa của thú. Theo Presser (1997), a-xít lac-tic còn có khả năng giữ lại các nguyên tố
thiết yếu cần cho sự phát triển (sắt). Không chỉ dừng lại ở đó, nhóm vi khuẩn này
còn sản sinh ra bacteriocin và các cơ chất kháng khuẩn gây ức chế sự phát triển của
các nhóm vi khuẩn khác kể cả nhóm vi khuẩn gây bệnh (Vanbelle và cs, 1989).
Lactobacillus spp.
Trong thành phần hệ vi sinh vật đường ruột phức tạp của heo con, nhóm vi
khuẩn lactobacilli được thiết lập từ rất sớm và tồn tại trong suốt quãng đời của heo
(Naito và cs, 1995). Lactobacillus spp. là một giống lớn nhất trong nhóm vi khuẩn
sinh a-xít lac-tic. Hiện nay người ta đã phát hiện hơn 120 loài và 20 dưới loài.

Không chỉ dừng ở đó, số lượng loài mới được phát hiện tăng theo từng năm. Năm
2005 người ta đã phát hiện ra thêm 13 loài mới, thêm 9 loài nữa vào năm 2006 và
vào năm 2007 là 7 loài (Lee và Salminen, 2009). Chúng là những vi khuẩn Gram

6
 


dương, không bào tử, có dạng hình que hoặc hình cầu. Chúng thuộc ngành
Firmicutes, lớp Bacilli, bộ Lactobacilales, họ Lactobacilaceae (Lee và Salminen,
2009). Lactobacillus spp. thuộc nhóm lên men hoàn toàn (kể cả homofermenters
hay heterofermenters). Chúng đòi hỏi môi trường sống phức tạp (carbohydrates, axít amin, peptides, a-xít béo, muối, dẫn xuất a-xít nucleic, vitamin) trong điều kiện
yếm khí hoặc yếm khí tùy nghi (Kandler và cs, 1986; trích dẫn bởi Lee và
Salminen, 2009). Chúng được tìm thấy rất nhiều trong môi trường giàu dinh dưỡng
hay các sản phẩm lên men. Ở thú non, số lượng Lactobacillus spp. vào khoảng 105
CFU/gam phân (Lebeer, 2008), trong khi ở thú một tháng tuổi hay lớn hơn thì vào
khoảng 106 - 108 CFU/gam phân (Mackie và cs, 1999). Không chỉ tồn tại trong môi
trường dạ dày ruột, có rất nhiều loài Lactobacillus spp. được tìm thấy trong âm đạo
của thú cái. Những loài thường xuyên tồn tại trong âm đạo người như L. crispatus,
L. gasseri, L. iners, L. jensenii…Chính nhờ sự hiện diện của chúng mà cơ thể có thể
giảm nguy cơ mắc các bệnh nhiễm trùng đường niệu dục.
Đã có rất nhiều công trình nghiên cứu chứng minh vai trò của Lactobacillus
spp. đối với sức khỏe của con người và vật nuôi. Ngay từ năm 1987, Silva và cs cho
rằng L. rharmnosus GG có khả năng tiết ra các hợp chất kháng khuẩn chống lại các
nhóm vi khuẩn khác nằm trong khoảng pH từ 3 - 5. L. reuteri (chủng ATCC 55730)
đã được khẳng định rằng có sự liên quan trực tiếp tới việc cải thiện hậu quả của rất
nhiều triệu chứng rối loạn do tiêu chảy cấp (Shonikova và cs, 1997; trích dẫn bởi
Egervärn, 2009), chứng đau bụng ở trẻ em (Savino và cs, 2007; trích dẫn bởi
Egervärn, 2009), nhiễm trùng ở trẻ sơ sinh (Weizman và cs, 2005; trích dẫn bởi
Egervärn, 2009), nhiễm trùng Helicobacter pylori (Francavilla và cs, 2008; trích

dẫn bởi Egervärn, 2009). Theo Spencer và cs (1994), các chủng L. fermentum, L.
acidophilus và L. salivarius phân lập từ dạ dày ruột của heo con cai sữa có khả năng
ngăn chặn độc tố vi khuẩn E. coli bám vào tế bào niêm mạc ruột. Roos và Jonsson
(2002) cũng cho rằng Lactobacillus spp. có khả năng bám dính vào màng nhầy của
ruột, cấu trúc bề mặt và tham gia vào việc biến đổi hệ vi sinh vật đường ruột. Theo

7
 


Sigrid và cs (2006), khả năng kháng chống lại S. Typhimurium SL1344 xuất hiện
sau 7,5 giờ bổ sung L. rhamnosus GG vào trong môi trường nuôi cấy.
Theo Gorbach (1996), vi khuẩn Lactobacillus spp. lí tưởng dùng trong sản
xuất probiotics phải chịu đựng được tính a-xít và muối mật, có khả năng bám dính
vào niêm mạc ruột, sống tốt trong môi trường ruột và sản xuất các chất kháng khuẩn
để tiêu diệt vi khuẩn gây bệnh.
2.3 Kháng sinh trong chăn nuôi
Sự ra đời của kháng sinh là một phát minh to lớn của nhân loại, có ý nghĩa
thiết thực trong y học và đời sống. Từ khi kháng sinh xuất hiện đã làm giảm đáng
kể các ca tử vong do nhiễm trùng, giảm tỉ lệ thương vong do chiến tranh. Trong
chăn nuôi, kháng sinh giúp vật nuôi chống chọi lại với bệnh tật, tỉ lệ loại thải thấp,
giảm chi phí trong sản xuất, hạ giá thành sản phẩm và tăng lợi nhuận cho người
chăn nuôi. Kháng sinh được sử dụng trong điều trị bệnh, ngăn ngừa sự lan truyền
mầm bệnh giữa các đàn vật nuôi hay phòng ngừa bùng nổ dịch bệnh ở những nơi có
yếu tố nguy cơ cao trong thời gian dài, dùng cho thú bị stress sau khi vận chuyển.
Mãi đến năm 1949 người ta mới biết đến khía cạnh khác của kháng sinh. Người
chăn nuôi dùng nó trên cương vị dinh dưỡng để gia tăng năng suất tích lũy (Dương
Thanh Liêm, 2006).
Trong thú y, kháng sinh được dùng trong phòng trị bệnh và được sử dụng
như là một chất kích thích tăng trọng (Barton, 2000; Singer và cs, 2003). Tùy mục

đích sử dụng khác nhau mà kháng sinh được dùng với liều lượng khác nhau.
Kích thích tăng trưởng
Trong thời gian đầu ứng dụng kháng sinh vào trong chăn nuôi đã làm tăng
năng suất vật nuôi trung bình từ 8 - 15 % và giảm 6 - 10 % chi phí thức ăn (Dương
Thanh Liêm, 2001). Để kích thích tăng trưởng, kháng sinh được sử dụng với liều
thấp và bổ sung liên tục trong thức ăn. Tùy theo từng loại kháng sinh mà liều dùng
là khác nhau, nói chung là vào khoảng 30 - 50 mg/kg thức ăn đối với
chlotetracycline, oxytetracline (Dương Thanh Liêm, 2006). Hầu hết các nước có

8
 


nền chăn nuôi tiên tiến trên thế giới đã nghiêm cấm sử dụng kháng sinh bổ sung vào
thức ăn với mục đích kích thích tăng trọng.
Cơ chế chính xác của tác động kích thích tăng trưởng của kháng sinh chưa
được chứng minh rõ ràng. Người ta cho rằng kháng sinh giúp ức chế các vi khuẩn
gây bệnh ở ruột, từ đó làm giảm các chất độc hại do vi khuẩn sinh ra trong quá trình
chuyển hóa, ức chế sự sinh các chất độc như ammonia hoặc monoamines, giảm sự
phân hủy chất dinh dưỡng của vi khuẩn, tăng tổng hợp vitamin và các yếu tố kích
thích tăng trưởng khác. Đồng thời kháng sinh giúp tăng hấp thu dưỡng chất do làm
mỏng thành ruột (Huỳnh Kim Diệu, 2010). Bổ sung kháng sinh cho phép thú tăng
trọng nhanh hơn trong khi sử dụng lượng thức ăn ít hơn cho một kilogam tăng
trọng.
Tuy nhiên hiệu quả của phương pháp này là kết quả của các quá trình tương
tác phức tạp giữa nhiều yếu tố: dinh dưỡng, sinh lý, vi khuẩn, bệnh lý. Hiệu quả tác
động lên tăng trưởng này thay đổi tùy theo giống, loài, lứa tuổi, môi trường sống,
thức ăn…Kháng sinh được trộn vào trong thức ăn với liều thấp hơn liều ức chế tối
thiểu. Trước đây, với những lợi ích mà kháng sinh mang lại, người ta đã sử dụng
rộng rãi kháng sinh phục vụ cho mục đích điều trị và kích thích tăng trọng (Bảng

2.2 và Bảng 2.3).
Theo số liệu của Follet (2000), trong năm 1997 tổng lượng kháng sinh dùng
trong nhân y và chăn nuôi ở các nước châu Âu là 10.500 tấn (qui theo mức 100 %
tinh khiết của các thành phần hoạt tính), trong đó 52 % sử dụng trong nhân y, 33 %
trong điều trị thú y và 15 % như chất bổ sung trong thức ăn chăn nuôi. Trong đó, tỷ
lệ các loại kháng sinh được sử dụng trong chăn nuôi: penicillin (9 %), tetracycline
(66 %), macrolide (12 %), aminoglycoside (4 %), fluoroquinolone (1 %),
trimethomprime/sulfamethoxazole (2 %) và các kháng sinh khác (6 %). Theo số liệu
của viện Thú y Mỹ (AHI), lượng kháng sinh được sử dụng trong chăn nuôi ở Mỹ
năm 1999 là khoảng 20,42 triệu pound (9.270 tấn), trong đó kháng sinh nhóm
ionophore và arsen chiếm nhiều nhất (47,5 %), tetracycline (15,67 %), penicillin

9
 


(4,26 %) và các loại khác (32,57 %). Trong số 20,42 triệu pound, có khoảng 2,8
triệu pound (13,7 %) được dùng như chất kích thích tăng trưởng.
Bảng 2.2: Những kháng sinh cho phép sử dụng kích thích tăng trọng ở châu Âu
Thuốc

Bò

Heo

A-xít arsanilic
Avoparcin

-


+
+

Bacitracin

+

+

Flavomycin

+

+

Lasalocid

+

-

Monensin

+

-

Nitrovin

+


+

Salinomycin

+

+

Spiramycin

+

+

Tylosin

-

+

Virginiamycin

+

+

(+): có sử dụng
(-): không có sử dụng


Prescott, 1993

Phòng bệnh và trị bệnh
Trong giai đoạn thú bị stress do thay đổi thời tiết, luân chuyển chuồng nuôi,
cai sữa, cắt đuôi, sau phẫu thuật hay trong giai đoạn thú phải đối mặt với nguy cơ
dịch bệnh thì kháng sinh được xem như là giải pháp giúp thú thoát khỏi bệnh tật.
Đối với chứng tiêu chảy cũng vậy, kháng sinh luôn là sự lựa chọn tất yếu giúp vật
nuôi cắt đứt các triệu chứng tiêu chảy do góp phần ức chế hay tiêu diệt mầm bệnh.
Một khi đã quyết định phải có liệu pháp kháng sinh cho việc điều trị, kháng sinh
cần được nhanh chóng sử dụng để tránh phát tán mầm bệnh. Nồng độ kháng sinh
phải đủ mạnh để ức chế hoặc tiêu diệt vi khuẩn (Võ Thị Trà An, 2010). Trong điều
trị, kháng sinh được dùng với liều cao hơn từ 3 - 4 lần liều phòng bệnh (Dương
Thanh Liêm, 2006).

10
 


Bảng 2.3: Danh sách kháng sinh được phép sử dụng trong chăn nuôi ở Mỹ
Thuốc

Bò
Kích thích

Heo
Phòng bệnh

tăng trọng

Kích thích


Phòng bệnh

tăng trọng

Arsenicals

-

-

+

+

Bacitracin

+

+

+

+

Bambermycin

-

-


+

-

Carbadox

-

-

+

+

Tetracyclines

+

+

+

+

Chlotetracycline
Sulfamethazine
Penicillin

-


-

+

+

Erythromycin

+

-

+

-

Furazolidone

-

-

Lincomycin

-

-

+


+

Monencin

+

-

-

-

Neomycin

-

+

-

+

Penicillin
Streptomycin
Tiamulin

-

-


-

+

-

-

+

+

Tylosin
Tylosin
Sulfamethazine
Virginiamycin

+
-

+
-

+
-

+

-


-

+

(+): có sử dụng
(-): không có sử dụng

+

+
+
Prescott, 1993

Ngày nay, mặc dù việc sử dụng kháng sinh đang vướng phải rất nhiều bất
cập, nhưng vai trò của kháng sinh đối với bệnh nhiễm trùng là không thể thay thế
được. Các kháng sinh cephalexin, gentamicin, neomycin, colistin…thường là các
kháng sinh được chỉ định trong điều trị tiêu chảy. Châu Bá Lộc và cs (2000) tiến
hành xác định sự nhạy cảm với một số loại kháng sinh của một số nhóm vi khuẩn
gây tiêu chảy trên heo ở Cần Thơ. Thí nghiệm của nhóm nghiên cứu cho thấy E.
coli nhạy cảm với amikacin, norfloxacin trong khi Klebsiella, Salmonella thì nhạy
cảm với gentamycin và chloramphenicol. Nghiên cứu của Lý Thị Liên Khai và cs
(2002) khẳng định rằng sự phối hợp kháng sinh cho hiệu quả cao trong điều trị tiêu
chảy. Nghiên cứu cho thấy các sản phẩm genta - colinro và Coli - Norgent có tác

11
 


dụng tốt trên 80 % heo con và hầu hết heo con tiêu chảy đều phục hồi sau 3 ngày

điều trị.
Bảng 2.4: Các loại kháng sinh trong phòng và trị bệnh tiêu chảy
Kháng sinh

Liều phòng bệnh trong

Liều điều trị trong thức

thức ăn (ppm)

ăn (ppm)

Ampicillin

300

600-700

Cephalexin

300

600-700

Chloramphenicol

400

800


Gentamycin

150

300

Neomycin

300

500-600

90

120

Enrofloxacin

100-200

250

Norfloxacin

100-200

250

Ofloxacin


100-200

250

Ciprofloxacin

120-150

250-300

240

500

Colistin

Sulfamethoxazole/Trimethoprime

Laval, 1995; trích dẫn bởi Nguyễn Quế Hoàng, 2006

2.4 Những hệ lụy của việc sử dụng kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi
Việc sử dụng kháng sinh bổ sung vào thức ăn ngày càng bộc lộ những tồn tại
và tác hại khó tránh khỏi. Khi kháng sinh hiện diện thường trực trong thức ăn thì
dần dần cơ thể sẽ không sản sinh ra kháng thể để chống lại với các vi khuẩn gây hại,
từ đó làm giảm sức chống chọi với bệnh tật (Dương Thanh Liêm và cs, 2006).
Người làm công tác chọn giống không thể lựa chọn những đàn thú giống có bổ sung
kháng sinh trong thức ăn vì những kiểu hình tốt chỉ là do tác động của kháng sinh
mang lại, không xuất phát từ chính kiểu gen. Điều này sẽ rất bất lợi cho công tác
chọn giống (Dương Thanh Liêm và cs, 2006).
Ngoài ra, tiếp xúc với kháng sinh thường xuyên chính là tác nhân khiến vi

khuẩn trở nên thích ứng, biến chủng, thay đổi cấu trúc DNA để chống lại kháng
sinh. Dần dần các vi sinh vật gây bệnh biến kháng sinh trở thành yếu tố cần thiết để
bảo vệ chúng chống lại sự tấn công của các vi khuẩn khác. Tổ chức GAO (United
States General Accounting Office, 1999) cảnh báo về sự phát triển và sự lan truyền
những vi khuẩn đề kháng kháng sinh trên toàn thế giới. Các loại kháng sinh truyền

12
 


thống thường được sử dụng trong phòng và trị bệnh trên gia súc (penicilline,
erythromycin, tetracycline, streptomycin) đều bị đề kháng gần 100 % bởi E. coli
(Bảng 2.5). Theo Võ Thành Thìn và cs (2010) vi khuẩn E. coli phân lập từ phân heo
con tiêu chảy kháng lại với nhiều loại kháng sinh với tỉ lệ đề kháng cao. Trong đó,
vi khuẩn kháng gần như tuyệt đối với oxacillin (99,46 %), tiếp đến là tetracyclin
(94,57 %), colistin (85,33 %), trimethoprime/sulfamethoxazole (73,91 %),
streptomycin (67,39 %), a-xít nalidixic (66,85 %), cephalothin (47,28 %). Vi khuẩn
E. coli phân lập từ lợn có khả năng đề kháng mạnh với tetracyclin, ampicillin,
streptomycin, a-xít nalidixic (Saenz và cs, 2001; Varga và cs, 2008; Van, 2008).
Bảng 2.5: Kết quả kháng sinh đồ đối với E. coli (dung huyết α)
Tp. HCM

Kháng sinh

Tiền Giang

Bà Rịa-Vũng

Cộng chung


Tàu
(n=94)
R*

(n=6)

(n=55)

%

R*

%

R*

%

(n=155)
R*

%

Penicilline

94

100,00

6


100,00

55

100,00

155

100,00

Erythromycin

94

100,00

6

100,00

55

100,00

155

100,00

Tetracycline


93

98,94

6

100,00

55

100,00

154

99,35

Streptomycin
Lincomycin

82
77

87,23
81,91

5
3

83,33

50,00

55
40

100,00
72,73

142
120

91,61
77,42

Ampicillin

63

67,02

5

83,33

44

80,00

112


72,26

Bactrim

59

62,77

5

83,33

46

83,64

110

70,97

Amoxicillin
55
Chloramphenicol 50

58,51
53,19

4
3


66,67
50,00

42
46

76,36
83,64

101
99

65,16
63,87

Cephalexine

29

30,85

2

33,33

55

100,00

86


55,48

Flumequine

47

50,00

4

66,67

17

30,91

68

43,87

Neomycin
Kanamycin

34
30

36,17
31,91


2
2

33,33
33,33

22
23

40,00
41,82

58
55

37,42
35,48

Colistin

29

30,85

2

33,33

15


27,27

46

29,68

Gentamycin
Norfloxacine

23
19

24,47
20,21

1
2

16,67
33,33

10
6

18,18
10,91

34
27


21,94
17,42

R*= resistance ( kháng thuốc)

Dương Thanh Liêm và Kevin Liu, 2001

Vi khuẩn đề kháng kháng sinh có thể truyền lây từ các loài động vật sang
con người. Có nhiều nghiên cứu về dịch tễ đã chỉ ra rằng tỉ lệ nhiễm vi khuẩn E.
coli và Campylobacter tăng cao ở những vùng sử dụng nhiều kháng sinh cho đàn

13
 


vật nuôi. Đồng thời cũng có nhiều chứng cứ chứng minh sự truyền lây Salmonella
và Campylobacter đề kháng kháng sinh cho người là do tiêu thụ và tiếp xúc với thịt
đã vấy nhiễm (GAO). Đây chính là mối nguy cơ lớn đe dọa sức khỏe của đàn vật
nuôi nói riêng và sức khỏe cộng đồng nói chung.
Hơn thế nữa, quá trình sử dụng kháng sinh lâu dài dẫn tới tình trạng tồn dư
kháng sinh trong các sản phẩm chăn nuôi gây hại cho sức khỏe của con người. Một
số kháng sinh có nguồn gốc tổng hợp như carbadox, olaquindox đã được xác định là
tác nhân gây ung thư (Hội đồng EC số 2788/98).
Xác định yếu tố nguy cơ từ việc lạm dụng kháng sinh trong chăn nuôi, Liên
minh Châu Âu (EU) đã ra qui định số 282198 ngày 17/12/1998, cấm sử dụng
tylosin phosphate, virginiamycin (nhóm streptogramin), spiramycin (nhóm
macrolides), zics - bacitracin (đang dùng trong nhân y) trong thức ăn gia súc. Sau
đó, ngày 22/12/1998 Hội đồng EC cũng ra quyết định số 2788/98, cấm sử dụng
carbadox và olaquindox (nhóm quinolone) trong thức ăn gia súc, gia cầm. Đồng
thời, avoparcin (nhóm glycopeptide, sản phẩm gây đề kháng chéo với vancomycin)

cũng bị cấm sử dụng trong thú y. Đến năm 2002, Việt Nam cũng công bố danh sách
các hóa chất và kháng sinh bị cấm sử dụng ở Việt Nam (Bảng 2.6) và có sửa đổi
vào năm 2009 (Phụ lục 1, Phụ lục 2). Tháng 6 năm 2003, Liên minh Châu Âu chính
thức công bố quyết định cấm tất cả các loại kháng sinh trong thức ăn chăn nuôi với
mục đích kích thích tăng trọng.
Bảng 2.6: Danh sách hóa chất và kháng sinh cấm sử dụng ở Việt Nam
STT

Tên hóa chất và kháng sinh cấm sử dụng ở Việt Nam

1

Chloramphenicol (Tên khác: Choloromycetin, Chlornitromycin, Laevomycin, Chlorocid,

2

L
k
i và một số dẫn xuất nhóm Nitrofuran (Nitrofural, Furacillin, Nitrofurazon,
Furazolidon

3

Furacin, Nitrofuratoin, Furoxon, Orafuran, Furadonin, Furadatin, Furaltadon, Payzone,
Dimetridazole (Tên khác: Emtryl).

4

Metronidazole (Tên khác: Trichomonoacid, Flagyl, Klion, Avimetronid).


5

Dipterex (Tên khác: Metriphonat, Trichlorphon, Neguvon, DTHP); DDVP (Tên khác:
Dichlorvos, Dichlorovos).
Số 26/2002/QĐ-BNN, ngày 24 tháng 04 năm 2002

14
 


Tóm lại, sự ra đời của kháng sinh là một phát minh to lớn của nhân loại, có ý
nghĩa thiết thực trong phòng và trị bệnh, mang đến nhiều lợi ích to lớn cho con
người, nhưng nó cũng chứa đựng những nguy cơ về lâu dài. Tuy nhiên, chúng ta
cần hiểu biết một cách đầy đủ về kháng sinh, nắm vững quy tắc sử dụng và cân
nhắc thật kĩ trước khi dùng.
2.5 Đại cương về probiotics
2.5.1 Giới thiệu về probiotics
Probiotics là một thuật ngữ bắt nguồn từ tiếng Hy Lạp với nghĩa là trợ sinh
(prolife). Nó được Lilly và Stillwell (1965) sử dụng để mô tả những yếu tố kích
thích sinh trưởng được sản sinh bởi vi sinh vật. Sau đó, Fuller (1989) đề nghị định
nghĩa “probiotics là thành phần bổ sung vi sinh vật vào thức ăn để cải thiện sự cân
bằng của hệ vi sinh vật đường ruột”. Đến năm 1992 thì Fuller cũng đề nghị chia trợ
sinh thành 2 loại chính: môi trường chứa vi sinh vật sống và sản phẩm lên men vi
sinh vật sống (trích dẫn bởi Trần Thị Dân, 2005). Theo Naidu và cs (1999),
probiotics là những chế phẩm sinh học chứa vi sinh vật sống có lợi khi đưa vào
trong cơ thể vật chủ sẽ giúp cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột, tạo điều kiện cải
thiện tăng trưởng và tăng cường sức đề kháng của vật chủ. Tổ chức FAO/WHO
(2001) định nghĩa probiotics là những vi sinh vật sống mà khi bổ sung vào cơ thể
một liều lượng thích hợp sẽ góp phần tăng cường sức khỏe cho vật chủ.
Probiotics thường chứa một hay nhiều chủng vi khuẩn thuộc các giống

Lactobacillus (L. acidophilus, L. brevis, L. bulgaricus, L. casein, L. lactis, L.
plantarum), Bifidobacterium, Streptococcus, Enterococcus, Bacillus (B. cereus, B.
coagulans, B. lentus, B. subtilis), nấm men (S. boulardii) và nấm mốc (A. niger, A.
oryzae). Những vi sinh vật có lợi này tham gia chuyển hóa carbohydrate sinh a-xít
lac-tic làm giảm pH đường ruột, cạnh tranh chất dinh dưỡng và vị trí bám với các vi
sinh vật gây bệnh, kích thích hệ thống miễn dịch (Trần Thị Dân, 2005).
Để có thể được sử dụng làm probiotics thì các chủng vi sinh vật phải thỏa
mãn những điều kiện nhất định. Khả năng bám dính, sống sót và phát triển được
trong đường ruột vật chủ được xem như là yếu tố quyết định hiệu quả sử dụng các

15