TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

NGUYỄN TRỌNG THẢO

THỰC HIỆN TIÊU BẢN MÔ ĐỘNG VẬT
TRÊN THỎ

Luận văn tốt nghiệp
Ngành: BÁC SĨ THÚ Y

Cần Thơ, 2009


TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG

Luận văn tốt nghiệp
Ngành: BÁC SĨ THÚ Y

Tên đề tài:

THỰC HIỆN TIÊU BẢN MÔ ĐỘNG VẬT
TRÊN THỎ

Giáo viên hướng dẫn:
Ths. Lê Hoàng Sĩ

Sinh viên thực hiện:
Nguyễn Trọng Thảo
MSSV: 3042922

Lớp: Thú Y K 30

Cần Thơ, 2009

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG
i


BỘ MÔN THÚ Y
Đề tài: Thực hiện tiêu bản mô động vật trên thỏ; do sinh viên: Nguyễn
Trọng Thảo thực hiện tại phòng thí nghiệm mô( Histology), bộ môn Thú ykhoa Nông Nghiệp & SHƯD- Đại học Cần Thơ từ 2/2009 đến 4/2009.

Cần thơ, ngày

tháng

năm 2009

Cần thơ, ngày

năm 2009

Duyệt giáo viên hướng dẫn

Duyệt bộ môn

Cần thơ, ngày

tháng


tháng

năm 2009

Duyệt Khoa Nông Nghiệp & SHƯD

LỜI CAM ĐOAN

ii


Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản than. Các số liệu,
kết quả trình bày trong luận văn tốt nghiệp là trung thực và chưa từng được ai
công bố trong bất kỳ công trình luận văn nào trước đây.

Tác giả luận văn

Nguyễn Trọng Thảo

LỜI CẢM TẠ

iii


Trải qua những ngày tháng thực tập tại trường và thực tập luận văn tốt nghiệp,
tôi xin tỏ lòng biết ơn vô hạn đến ông bà cha mẹ và gia đình đã hết lòng dạy dỗ tôi
nên người.
Tôi xin chân thành cảm ơn thầy Lê Hoàng Sĩ, thầy Trần Hiền Nhơn đã nhiệt
tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp.

Tôi xin chân thành cảm ơn tất cả quí thầy cô trong bộ môn Thú y và Chăn nuôi
thú y đã hết lòng truyền đạt cho tôi những kiến thức quí báu trong thời gian học tại
trường.
Tôi xin chân thành cảm ơn tất cả các ban sinh viên lớp Thú y K 30 đã cùng tôi
chia sẻ những niềm vui nổi buồn trong suốt thời gian học tập.
Chúc quí thầy cô dồi dào sức khỏe.

iv


MỤC LỤC
Trang tựa

i

Trang duyệt

ii

Lời cam đoan

iii

Lời cảm tạ

iv

Mục lục

v


Danh sách hình

vii

Tóm lược

viii

Chương 1 Đặt vấn đề.............................................................................................1
Chương 2 Lược khảo tài liệu .................................................................................2
2.1 Tổng quan về cấu tạo vi thể........................................................................2
2.1.1 Tuyến thượng thận ............................................................................2
2.1.2 Lưỡi ...................................................................................................2
2.1.3 Thực quản ..........................................................................................3
2.1.4 Dạ dày ...............................................................................................4
2.1.5 Ruột non ............................................................................................4
2.1.6 Ruột già .............................................................................................5
2.2 Tổng quan về phương pháp thực hiện tiêu bản vi thể động vật ...................5
2.2.1 Lấy mẫu lớn .......................................................................................5
2.2.2 Cố định mẫu ......................................................................................5
2.2.3 Lấy mẫu nhỏ ......................................................................................5
2.2.4 Rửa nước ...........................................................................................5
2.2.5 Khử nước ...........................................................................................5
2.2.6 Tẩm dung môi trung gian ...................................................................6
2.2.7 Tẩm Paraffin ......................................................................................6
2.2.8 Đúc khuôn .........................................................................................6
2.2.9 Cắt mẫu..............................................................................................6
2.2.10 Tải- hấp mẫu ....................................................................................6
2.2.11 Nhuộm mẫu .....................................................................................7

2.2.12 Dán lamelle- Dán nhãn.....................................................................8
Chương 3 Phương tiện và phương pháp tiến hành thí nghiệm................................9
3.1 Phương tiện ................................................................................................9

v


3.1.1 Địa điểm thực hiên.............................................................................9
3.1.2 Dụng cụ, trang thiết bị và hóa chất .....................................................9
3.2 Quá trình thực hiện.....................................................................................9
3.2.1 Lấy mẫu lớn .......................................................................................9
3.2.2 Cố định mẫu.....................................................................................10
3.2.3 Lấy mẫu nhỏ ....................................................................................10
3.2.4 Rửa nước .........................................................................................10
3.2.5 Khử nước .........................................................................................10
3.2.6 Tẩm dung môi trung gian .................................................................10
3.2.7 Tẩm Paraffin ....................................................................................10
3.2.8 Đúc khuôn .......................................................................................10
3.2.9 Cắt mẫu............................................................................................12
3.2.10 Tải- hấp mẫu ..................................................................................13
3.2.11Nhuộm mẫu ....................................................................................15
3.2.12 Dán lamelle- Dán nhãn...................................................................17
Chương 4 Kết quả và thảo luận............................................................................18
4.1 Tuyến thượng thận ...................................................................................18
4.2 Lưỡi .........................................................................................................20
4.2.1 Gai chỉ .............................................................................................20
4.2.2 Gai nấm ...........................................................................................21
4.2.3 Gai lá ...............................................................................................22
4.2.4 Gai đài .............................................................................................23
4.3 Thực quản ................................................................................................24

4.4 Dạ dày......................................................................................................25
4.5 Ruột non...................................................................................................26
4.6 Ruột già....................................................................................................27
Chương 5. Kết luận- đề nghị................................................................................28
TÀI LIỆU THAM KHẢO..............................................................................................29
PHẦN PHỤ CHƯƠNG ...................................................................................................30

vi


DANH SÁCH HÌNH

Hình

Tựa hình

Trang

1

Lọc Paraffin trong tủ sấy 600C

11

2

Khuôn đúc mẫu

11


3

Mẫu được đúc khuôn

12

4

Cắt mẫu

13

5

Chậu nước ấm đặt trên bếp tải

13

6

Dãy băng mẫu được chuyển vào chậu nước ấm

14

7

Lát cắt được tách rời trong chậu nước ấm

14


8

Dùng lame vớt mẫu

15

9

Nhuộm mẫu

17

10

Tuyến thượng thận( Vật kính 10X)

19

11

Gai chỉ( vật kính 4X)

20

12

Gai nấm( vật kính 4X)

21


13

Gai lá( vật kính 4X)

22

13

Gai đài (vật kính 4X)

23

14

Thực quản cắt ngang( vật kính 10X)

24

15

Dạ dày cắt ngang( vật kính 10X)

25

16

Ruột non cắt ngang( vật kính 10X)

26


17

Ruột già cắt ngang( vật kính 10X)

27

vii


TÓM LƯỢC
Với đề tài “thực hiện tiêu bản mô động vật trên thỏ” của tuyến thượng thận,
lưỡi, thực quản, dạ dày, ruột non, ruột già; nhằm khảo sát qui trình thực hiện tiêu
bản vi mẫu đối với từng mẫu cụ thể trên. Trong thời gian từ 2/2009 đến tháng
4/2009, tại phòng mô học( Histology)- Khoa Nông nghiệp & SHƯD- Đại học Cần
Thơ. Cùng các trang thiết bị như: máy cắt vi mẫu, tủ sấy, bếp tải… và hóa chất cần
thiết. Qua một số bước như: đúc khuôn, cắt mẫu, nhuộm mẫu…. Tôi đã thực hiện
được 300 tiêu bản trong đó có 143 tiêu bản hoàn chỉnh. Qua đó rút ra được một số
đặc điểm riêng trên từng mẫu so với qui trình chung.

viii


Chương 1
ĐẶT VẤN ĐỀ
Cơ thể là một khối thống nhất, hoạt động sống bình thường là nhờ sự phối
hợp nhịp nhàng của các hệ cơ quan trong cơ thể. Các cơ quan cùng thực hiện chung
một chức năng tạo thành hệ cơ quan. Trong quá trình hình thành phôi bào và phát
triển của cơ thể dưới sự ảnh hưởng của một số yếu tố ( kích thích tố, môi trường …)
các tế bào đã được biệt hóa, tức là tế bào có cấu tạo đổi mới phù hợp với chức năng
riêng biệt mà nó đảm nhận gọi là mô, và các mô này sẽ cấu tạo nên cơ quan trong

cơ thể động vật. Vậy đối với cơ thể, tế bào có thể được coi là đơn vị sống cơ bản
của cơ thể lẫn về cấu trúc và chức năng.
Do đó để nghiên cứu sâu hơn về cơ thể thì phải nghiên cứu quan sát được ở
mức tế bào. Ngoài những phương pháp đặc biệt khác thì để nghiên cứu về tế bào và
mô trong các cơ quan động vật thì ta phải sử dụng kính hiển vi quan sát những tiêu
bản. Những tiêu bản này được tạo ra bằng một số bước cắt nhuộm của cơ quan nào
đó của cơ thể động vật trong phòng thí nghiệm. Từ những tiêu bản đó đem quan sát
dưới kính hiển vi quang học sẽ mô tả được cấu tạo của chúng dưới mức tế bào. Quá
trình đó gọi là thực hiện tiêu bản vi thể động vât.
Quá trình thực hiện phải theo qui trình chung. Nhưng tùy theo từng loài, từng
cơ quan cơ thể đông vật mà có sự thay đổi trong qui trình.
Mục tiêu: khảo sát qui trình thực hiện tiêu bản mô động vật trên thỏ của
tuyến thượng thận, lưỡi, thực quản, dạ dày, ruột non, ruột già so với qui trình chung.

1


Chương 2
LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.1 Tổng quan về cấu tạo vi thể
2.1.1 Tuyến thượng thận
Tuyến thượng thận là một tuyến phức hợp, hình thành do sự kết hợp của hai
tuyến khác nhau về nguồn gốc cũng như chức phận: thượng thận vỏ và thượng thận
tủy. Hai phần này hoạt động biệt lập nhau. Tuyến có dạng một khối dẹt, cắt dọc có
hình chữ Y nằm ngang. Bao ngoài tuyến là mô liên kết. Nhu mô tuyến gồm hai
miền: vỏ thượng thận chiếm phần ngoài của tuyến, tủy thượng thận chiếm phần
trung tâm.
* Miền vỏ thượng thận
Khá dày có màu vàng, về phía trong hơi nâu khi xem bằng mắt thường. Vỏ
thượng thận gồm có ba vùng:

- Lớp ngoài cùng là vùng cầu hoặc cung, lớp này mỏng, được tạo thành bởi
những tế bào đa diện nhỏ. Những tế bào này nằm ngay dưới lớp vỏ. Ở loài nhai lại
nhưng tế bào sắp xếp thành khối cầu, còn ở loài ăn thịt, ngựa, heo…tế bào xếp
thành hình cung.
- Vùng kế tiếp là vùng dậu, những tế bào đa diện lớn, bào tương sáng( do chứa
nhiều hạt chất vùi lipid) xếp thành dãy chạy song song nhau. Ở giai đoạn đầu của
phôi hai vùng cầu và vùng dậu lẫn lộn nhau.
- Vùng kế tiếp nữa là vùng lưới, những dãy tế bào đa diện chạy không có
hướng nhất định. Nhân tế bào nhỏ và bắt màu đậm hơn các lớp ngoài. Bào tương có
nhiều hạt sắc tố nhỏ.
Ở động vật còn non và ở thai người, giữa lớp lưới và tủy thượng thận có một
vùng đặc biệt gọi là lớp X, gồm những tế bào rất ưa chất màu. Khi lớn lên thì lớp X
này biến mất.
* Miền tủy thượng thận
Cấu tạo bởi những tế bào đa diện lớn. Xen kẽ nhưng tế bào có nhiều hốc mao
mạch. Ngoài ra còn có nhữg tế bào thần kinh giao cảm đứng riêng lẻ hay tụ thành
đám. Tế bào này có hình cầu lớn, bào tương bắt màu nhạt.
2.1.2 Lưỡi
Lưỡi là cơ quan di động nhất trong xoang miệng, gồm 2 mặt: mặt trên và mặt
dưới. Biểu mô của niêm mạc mặt trên rất dầy thuộc loại biểu mô kép lát hóa sừng.
Mặt này thường có nhiều gai lưỡi. Biểu mô mặt dưới lưỡi mỏng hơn và không có
gai.
Dưới biểu mô là mô liên kết. Ngoài ra có mô mỡ, mô này có nhiệm vụ gắn
chặt màng niêm với cơ niêm, kế đó là cơ vân. Cơ vân chen chúc nhau và chia nhánh
đến bám vào lớp đệm. Trên mặt lưỡi có bốn loại gai:

2


* Gai chỉ

Đây là những nhú mô liên kết được bao phủ bằng biểu mô kép lát hóa sừng.
Ở loài ăn thịt trục của gai hướng về phía sau miệng và gai có hình dùi trống. Ở ngựa
và heo gai nhỏ và cao. Tác dụng của gai là giữ cho thức ăn không bị rớt ra ngoài vì
tạo cho bề mặt lưỡi một độ nhám. Nó cũng giúp đưa thực phẩm vào trong.
* Gai nấm
Những lõi mô liên kết có hình dạng trên mặt to, ở góc nhỏ làm cho có hình
nấm. Bên dưới gai có nhiều nụ vị giác. Bề mặt gai được phủ bằng biểu mô kép lát
không hóa sừng. Ở chó mèo, dê, gai có nhiều nụ vị giác. Ở heo, cừu, trâu, bò, ngựa
có rất ít.
* Gai lá
Là những nếp gấp song song của niêm mạc, thấy ở hai bên bờ lưỡi. Ở người,
thú nhai lại, bò, cừu,dê không có gai này. Ở sườn của những gai này có nhiều nụ vị
giác.
* Gai đài
Thường xếp thành hình chữ V ở góc lưỡi được coi là ranh giới giữa phần
trứơc và sau lưỡi. Ở người có 9- 11 gai, ở heo chỉ có 2 gai. Mỗi gai là một gai nấm
lớn quay quanh bởi một cái rãnh hình vòng. Thành trong của rãnh có nhiều nụ vị
giác. Ở đái của rãnh có những lỗ bài xuất của tuyến Von Epne. Dưới là mô liên kết
khá dầy và cơ vân.
2.1.3 Thực quản
Thực quản đi từ yết hầu đến dạ dày. Từ trong ra ngoài thành ống chia thành 3
lớp:
* Áo trong
Thường xếp nếp dọc. Biểu mô phủ thuộc loại kép lát, thường không hóa
keratin trừ loài nhai lại. Bên dưới là lớp đệm liên kết hóa keo chặt chẽ xen lẫn sợi
đàn hồi. Cơ niêm gồm những sợi cơ chạy dọc và liên tục ở người. Ở ngựa, bò, mèo,
cơ chạy gián đoạn. Ở chó không có cơ niêm.
Lớp dưới niêm là mô liên kết lỏng lẻo có những tuyến tiết nhờn. Ở heo và
người lớp này chứa nốt bạch huyết.
* Áo giữa

Ở gia súc: phần đầu thực quản, áo cơ thuộc loại cơ vân, khoảng 1/3 về phía
dạ dày thuộc loại cơ trơn. Gồm hai lớp lúc đầu chạy xéo nhau về sau tách riêng
thành hai lớp: trong chạy vòng, ngoài chạy dọc. Riêng ở chó và thú nhai lại, áo cơ
chỉ gồm cơ vân. Ở heo gần sát dạ dày mới là cơ trơn.
* Áo ngoài
Mô liên kết, có nhiều mạch máu và thần kinh. Thần kinh đến thực quản là
thần kinh phế vị.

3


2.1.4 Dạ dày
Từ trong ra ngoài vách dạ dày chia làm 3 lớp:
* Áo trong
Từ trong ra ngoài được chia thành 4 lớp:
Biểu mô phủ thuộc loại đơn trụ, rõ nhất ở thân vị. Đó là những tế bào hình
trụ cao, nhân nằm sát đáy. Biểu mô này nằm lõm xuống tạo thành lỗ châm kim.
Lớp đệm bên dưới biểu mô có nhiều sợi lưới và chứa các tuyến dạ dày. Lớp
cơ niêm gồm những sợi cơ trơn chạy vòng phía trong, bên ngoài chạy dọc. Lớp dưới
niêm là mô liên kết thưa có mạch máu, mạch bạch huyết, những đám rối thần kinh
và đôi khi có nốt bạch huyết.
* Áo giữa
Chủ yếu là cơ trơn, bên trong là cơ vòng. Một số sợi có hướng chạy chéo tạo
thành lớp chéo phụ. Ngoài là cơ dọc cũng có một số sợi chạy chéo.
* Áo ngoài
Là phúc mạc, đó là mô liên kết thưa xen lẫn mô mỡ, thần kinh và mạch máu,
ngoài được bọc bởi một lớp biểu mô lát đơn.
2.1.5 Ruột non
Có cấu tạo như cấu tạo chung của ống tiêu hóa, từ trong ra ngoài chia thành 3
lớp: áo trong, áo giữa và áo ngoài.

* Áo trong
Niêm mạc ruột non tạo thành những nếp gấp lồi vào trong lòng ruột gọi là
van ruột.Theo Lâm Thị Thu Hương( 2005) cho rằng van làm cho diện tích niêm
mạc ruột tăng gấp 2- 3 lần. Trên niêm mạc có những phần kéo dài lồi lên như những
cái lông gọi là lông nhung, cao chừng 200- 500μm.
Lông nhung hay nhung mao ruột có ở tất cả các đoan ruột non. Ở tá tràng và
đoạn trên không tràng, lông nhung có dạng những cái mào có 2- 3 nhánh, ở đoạn
dưới thì hình lá, càng về đến hồi tràng có dạng hình nón và sợi. Biểu mô phủ nhung
mao ruột thuộc loại trụ đơn có cấu tạo bởi 3 loại tế bào:
- Những tế bào mâm khía: tế bào hình trụ, nhân bầu dục. Đỉnh tế bào có những
khía dọc do bào tương tạo thành gọi là những vi nhung mao. Vi nhung mao dài 11,5μm và có đường kính 0,1μm( Lâm Thị Thu Hương, 2005)
- Tế bào hình đài: nằm xen giữa những tế bào mâm khía. Ít thấy trên đỉnh các
nhung mao.
- Tế bào ưa crôm và ưa bạc: có dạng một cái chai, thường gặp tế bào này ở
đỉnh nhung mao.
* Áo giữa
Gồm có 2 lớp cơ. Lớp cơ dọc bên ngoài và lớp cơ vòng bên trong.

4


* Áo ngoài
Lớp biểu mô lát đơn bên ngoài.
2.1.6 Ruột già
Từ trong ra ngoài chia thành 3 lớp:
* Áo trong
Mặt niêm mạc trơn không có nhung mao và không có van(ở thú non có
nhung mao).
* Áo giữa
Cũng gồm 2 lớp, nhưng cơ dọc tạo thành 3 dãy cơ lồi về phía ngoài, còn cơ

vòng thắt lại từng đoạn.
* Áo ngoài
Lớp biểu mô lát đơn bên ngoài.
2.2 Tổng quan về phương pháp thực hiện tiêu bản vi thể động vật
2.2.1 Lấy mẫu lớn
Lấy cơ quan động vật cần để thực hiện tiêu bản.
2.2.2 Cố định mẫu
Cố định mẫu bằng dung dịch Formol 10%, mẫu sau khi lấy phải được cố
định ngay để tránh tình trạng bị thoái hóa, hoại tử hay biến dạng do một số phản
ứng sinh hóa của những enzyme nội bào hay do điều kiện bên ngoài tác động như vi
sinh vật. Mục đích giai đoạn này là giết thật nhanh tổ chức nhưng vẫn giữ nguyên
hình dạng, cấu trúc bên trong như lúc tổ chức còn sống.
Giai đoạn đầu: ngâm nguyên các phần trên trong dung dịch Formol 10%
trong 15 phút để ổn định tổ chức cho dễ cắt. Kế tiếp là vớt ra dùng lưỡi lam cắt sạch
các phần như mỡ, màng treo ruột…
2.2.3 Lấy mẫu nhỏ
Cắt nhỏ mẫu với kích thước khoảng 0,5cm x 0,5cm x 1cm. Ngâm tiếp trong
Formol 10% 48 giờ.
2.2.4 Rửa nước
Mẫu sau khi được cố định xong phải được rửa lại bằng nước sạch. Sau đó
ngâm vào nước sạch, bằng cách cho mẫu vào trong chậu nước đặt dưới vòi nước
chảy nhẹ liên tục trong 2 giờ.
2.2.5 Khử nước
Dùng cồn với nồng độ tăng dần theo thứ tự từ 700, 800, 900, 1000, 1000 để
khử nước để tránh tổ chức bị mất nước đột ngột gây co rúm lại. Ngâm mỗi lọ trong
2 giờ.

5



2.2.6 Tẩm dung môi trung gian
Cồn có độ hòa tan Paraffin thấp nên Paraffin không ngấm được vào tổ chức
hoàn toàn. Sử dụng Xylen vừa loại được cồn trong mẫu, vừa làm tan Paraffin ngấm
vào trong mẫu dễ dàng. Chuyển mẫu qua 2 lọ Xylen, mỗi lọ ngâm trong 45 phút.
2.2.7 Tẩm Paraffin
Chuyển mẫu từ lọ Xylen cuối cùng vào các hộp nhựa chuyên dụng có dáng
nhãn tương ứng. Sau đó cho vào các cóc có chứa Paraffin đang lỏng đặt trong tủ sấy
ở nhiệt độ 600C. Chuyển mẫu qua 3 cóc Paraffin, mỗi cóc thay Paraffin mới. Tẩm
Paraffin ở mỗi cóc trong 2 giờ.
2.2.8 Đúc khuôn
* Chuẩn bị
- Chùi sạch thanh kim loại và bảng kim loại.
- Lọc sạch Paraffin bằng giấy lọc để loại tạp chất trong Paraffin. Paraffin phải
được lọc trong tủ sấy ở nhiệt độ 600C.
- Dùng các thanh kim loại gãy góc xếp thành hình chữ nhật có kích thước
mong muốn.
- Chuẩn bị đèn cồn, kẹp gắn mẫu.
* Tiến hành
- Lấy lọ Paraffin đang lỏng đổ đầy khuôn. Dùng kẹp hơ nóng trên ngọn đèn
cồn, gắp mẫu vào khuôn và chỉnh ngay ngắn theo chiều thích hợp đã định trước.
Sau 15 phút tách khối Paraffin ra khỏi thanh kim loại và đúc mẫu khác.
- Dán nhãn, ghi kí hiệu mẫu vào khối mẫu.
- Sau 1- 2 ngày đem cắt mẫu.
2.2.9 Cắt mẫu
* Chuẩn bị
Gọt khối Paraffin( chừa chừng 2- 3 mm Paraffin quanh mẫu)
* Tiến hành
- Gắn mẫu lên trục mang mẫu, siết chặt ốc.
- Gắn dao nghiêng khoảng 150 đến 200.
- Điều chỉnh cho mẫu và lưỡi dao chạm nhau.

- Cắt thử ở vạch 10 rồi giảm đến độ mỏng cho phép( mẫu không rách)
2.2.10 Tải- hấp mẫu
* Chuẩn bị
- Chậu nước đặt trên bếp tải mẫu được điều chỉnh ở nhiệt độ 400C.
- Lame sạch.

6


* Tiến hành
- Dùng kim mũi giáo đỡ nguyên băng mẫu cho vào chậu nước ấm.
- Trên dãy băng cắt xong, dùng kim mũi giáo tách nhẹ những lát cắt từ băng
cắt cho rời ra.
- Khi Paraffin đã căng, lấy lame nghiêng nhẹ trên mặt nước sao cho mẫu đã
chọn đúng vị trí giữa lame.
- Nghiêng lame cho ráo nước rồi cho vào tủ hấp mẫu, để ở 600C trong 30 phút
hoặc 400C trong 1 ngày đêm thì đem nhuộm
2.2.11Nhuộm mẫu
* Chuẩn bị
Năm lọ Xylen, năm lọ cồn tuyệt đối, hai lọ cồn 900, hai lọ cồn 800, một lọ
cồn 70 , một lọ Hematoxylin, một lọ Eosin nhuộm, hai chậu nước sạch, giấy thấm.
0

* Tiến hành
Qui trình nhuộm:
XylenII
1’

Cồn 1000


Cồn 1000

1’

1’

Hematoxylin
2-5’

Rửa nước
2- 5’

Cồn 800

Cồn 900

1’

1’

Rửa nước
10’

Eosin
10-15’

Cồn 700
1’

Cồn 800


Cồn 1000

Cồn 1000
1’

Cồn 1000

Cồn 900

1’

Xylen
2’

Xylen
2’

XylenI
20’

1’

1’

Xylen
2’

- Cho lame từ tủ hấp vào lọ Xylen I, II làm Paraffin tan ra khỏi mẫu.


- Ngâm mẫu trong cồn 1000, 900, 800 để rút Xylen ra khỏi mẫu.
- Rửa nước để loại cồn trong mẫu.
- Hematoxylin: nhuộm nhân.
- Ngâm lame vào nước 10 phút để rửa sạch mẫu.
- Eosin nhuộm tế bào chất.

7

1’


- Nhúng qua cồn 700,800, 900, 1000 để loại hết màu dư và khử nước( mỗi lọ 1
phút).
- Ngâm Xylen để loại hết cồn ra khỏi mẫu.
3.2.12 Dán lamelle- Dán nhãn
* Cố định mẫu bằng Mount-quick
- Chuẩn bị: Lamelle, keo, kim mũi giáo, giấy thấm.
- Tiến hành:
Nhỏ giọt keo lên lamelle sạch.
Dùng hai tay nghiêng nhẹ nhàng lamelle xuống lame sao cho giọt keo dán
ngay giữa mẫu.
Ấn nhẹ cho keo lan đều ra. Dùng vải sạch thấm Xylen chùi hết keo lang ngoài
lamelle (nếu có).
* Dán nhãn
- Ghi tên tổ chức, loại gia súc.
- Vị trí( trên, giữa, hay dưới tổ chức).
- Chiều hướng cắt( ngang, dọc).
Để vào hộp chứa tiêu bản.

8



Chương 3
PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP
TIẾN HÀNH THÍ NGHIỆM
3.1 Phương tiện
3.1.1 Địa điểm thực hiện
Đề tài được thực hiện tại Phòng Mô Học ( Histology)- Khoa Nông Nghiệp và
Sinh Học Ứng Dụng. Thời gian từ tháng 2 đến tháng 4 năm 2009.
3.1.2 Dụng cụ, trang thiết bị và hóa chất
* Dụng cụ
- Thủy tinh: chai lọ, phễu, lame và lamelle.
- Dao cắt vi mẫu.
- Dụng cụ giải phẫu: dao lam, kéo, kẹp.
* Dụng cụ riêng biệt
- Máy cắt vi mẫu.
- Kính hiển vi quang học.
- Tủ hấp, tủ sấy, bếp tải.
- Bản và thanh đúc mẫu.
* Hóa chất
- Cồn 1000, 900
- Xylen.
- Phẩm nhuộm: Hematoxylin, Eosin Y.
- Formol.
- Paraffin.
- Keo Mount-quick( Nhật Bản)
- Acid: acid Acetic đđ.
- Nước cất
3.2 Quá trình thực hiện
3.2.1 Lấy mẫu lớn

Thỏ khoảng 3kg, khỏe mạnh, cắt cổ cho máu chảy ra hết, dùng kéo giải phẩu
mổ từ cổ đến hậu môn lấy các bộ phận: tuyến thượng thận, lưỡi, thực quản, dạ dày,
ruột non, ruột già.
- Tuyến thượng thận: lấy toàn bộ tuyến
- Lưỡi: lấy toàn bộ lưỡi
9


- Thực quản: lấy một đoạn ở giữa thực quản
- Dạ dày: lấy phần thân vị, cắt một mảnh ngang 2 cm và dài 3 cm
- Ruột non: cắt một đoạn tá tràng khoảng 3cm
- Ruột già: cắt một đoạn kết tràng khoảng 3cm
3.2.2 Cố định mẫu
Cố định mẫu bằng dung dịch Formol 10%, mẫu sau khi lấy phải được cố
định ngay để tránh tình trạng bị thoái hóa, hoại tử hay biến dạng do một số phản
ứng sinh hóa của những enzyme nội bào hay do điều kiện bên ngoài tác động như vi
sinh vật. Mục đích giai đoạn này là giết thật nhanh tổ chức nhưng vẫn giữ nguyên
hình dạng, cấu trúc bên trong như lúc tổ chức còn sống.
Giai đoạn đầu: ngâm nguyên các phần trên trong dung dịch Formol 10%
trong 15 phút để ổn định tổ chức cho dễ cắt. Kế tiếp là vớt ra dùng lưỡi lam cắt sạch
các phần như mỡ, màng treo ruột…
3.2.3 Lấy mẫu nhỏ
Cắt nhỏ mẫu với kích thước khoảng 0,5cm x 0,5cm x 1cm. Ngâm tiếp trong
Formol 10% 48 giờ.
3.2.4 Rửa nước
Mẫu sau khi được cố định xong phải được rửa lại bằng nước sạch. Sau đó
ngâm vào nước sạch, bằng cách cho mẫu vào trong chậu nước đặt dưới vòi nước
chảy nhẹ liên tục trong 2 giờ.
3.2.5 Khử nước
Dùng cồn với nồng độ tăng dần theo thứ tự từ 700, 800, 900, 1000, 1000 để

khử nước để tránh tổ chức bị mất nước đột ngột gây co rúm lại. Ngâm mỗi lọ trong
2 giờ.
3.2.6 Tẩm dung môi trung gian
Cồn có độ hòa tan Paraffin thấp nên Paraffin không ngấm được vào tổ chức
hoàn toàn. Sử dụng Xylen vừa loại được cồn trong mẫu, vừa làm tan Paraffin ngấm
vào trong mẫu dễ dàng. Chuyển mẫu qua 2 lọ Xylen, mỗi lọ ngâm trong 45 phút.
3.2.7 Tẩm Paraffin
Chuyển mẫu từ lọ Xylen cuối cùng vào các hộp nhựa chuyên dụng có dáng
nhãn tương ứng. Sau đó cho vào các cóc có chứa Paraffin đang lỏng đặt trong tủ sấy
ở nhiệt độ 600C. Chuyển mẫu qua 3 cóc Paraffin, mỗi cóc thay Paraffin mới. Tẩm
Paraffin ở mỗi cóc trong 2 giờ.
3.2.8 Đúc khuôn
* Chuẩn bị
- Chùi sạch thanh kim loại và bảng kim loại.

10


- Lọc sạch Paraffin bằng giấy lọc để loại tạp chất trong Paraffin. Paraffin phải
được lọc trong tủ sấy ở nhiệt độ 600C.

Hình 1: Lọc Paraffin trong tủ sấy 600C

- Dùng các thanh kim loại gãy góc xếp thành hình chữ nhật có kích thước
mong muốn.

Hình 2:Khuôn đúc mẫu

11



- Chuẩn bị đèn cồn, kẹp gắn mẫu.
* Tiến hành
- Lấy lọ Paraffin đang lỏng đổ đầy khuôn. Dùng kẹp hơ nóng trên ngọn đèn
cồn, gắp mẫu vào khuôn và chỉnh ngay ngắn theo chiều thích hợp đã định trước.
Sau 15 phút tách khối Paraffin ra khỏi thanh kim loại và đúc mẫu khác.

Hình 3: Mẫu được đúc khuôn

- Dán nhãn, ghi kí hiệu mẫu vào khối mẫu.
- Sau 1- 2 ngày đem cắt mẫu.
3.2.9 Cắt mẫu
* Chuẩn bị
Gọt khối Paraffin( chừa chừng 2- 3 mm Paraffin quanh mẫu)
* Tiến hành
- Gắn mẫu lên trục mang mẫu, siết chặt ốc.
- Gắn dao nghiêng khoảng 150 đến 200.
- Điều chỉnh cho mẫu và lưỡi dao chạm nhau.

12


- Cắt thử ở vạch 10 rồi giảm đến độ mỏng cho phép( mẫu không rách)

Hình 4:Cắt mẫu

3.2.10 Tải- hấp mẫu
* Chuẩn bị
- Chậu nước đặt trên bếp tải mẫu được điều chỉnh ở nhiệt độ 400C.
- Lame sạch.


Hình 5: Chậu nước ấm đặt trên bếp tải

13


* Tiến hành
- Dùng kim mũi giáo đỡ nguyên băng mẫu cho vào chậu nước ấm.

Hình 6: Dãy băng mẫu được chuyển vào chậu nước ấm

- Trên dãy băng cắt xong, dùng kim mũi giáo tách nhẹ những lát cắt từ băng
cắt cho rời ra.

Hình 7: Lát cắt được tách rời trong chậu nước ấm

14


- Khi Paraffin đã căng, lấy lame nghiêng nhẹ trên mặt nước sao cho mẫu đã
chọn đúng vị trí giữa lame.

Hình8: Dùng lame vớt mẫu

- Nghiêng lame cho ráo nước rồi cho vào tủ hấp mẫu, để ở 600C trong 30 phút
hoặc 400C trong 1 ngày đêm thì đem nhuộm.
3.2.11Nhuộm mẫu
* Chuẩn bị
Năm lọ Xylen, năm lọ cồn tuyệt đối, hai lọ cồn 900, hai lọ cồn 800, một lọ
cồn 700, một lọ Hematoxylin, một lọ Eosin nhuộm, hai chậu nước sạch, giấy thấm.


15


* Tiến hành
Qui trình nhuộm:
XylenII
1’

Cồn 1000

Cồn 1000

1’

1’

Hematoxylin
2-5’

Rửa nước
2- 5’

Cồn 800

Cồn 900

1’

1’


Rửa nước
10’

Eosin
10-15’

Cồn 700
1’

Cồn 800

Cồn 1000

Cồn 1000

Cồn 1000

Cồn 900

1’

1’

1’

1’

Xylen
2’


Xylen
2’

Xylen
2’

XylenI
20’

1’

- Cho lame từ tủ hấp vào lọ Xylen I, II làm Paraffin tan ra khỏi mẫu.

- Ngâm mẫu trong cồn 1000, 900, 800 để rút Xylen ra khỏi mẫu.
- Rửa nước để loại cồn trong mẫu.
- Hematoxylin: nhuộm nhân.
- Ngâm lame vào nước 10 phút để rửa sạch mẫu.
- Eosin nhuộm tế bào chất.
- Nhúng qua cồn 700,800, 900, 1000 để loại hết màu dư và khử nước( mỗi lọ 1
phút).
- Ngâm Xylen để loại hết cồn ra khỏi mẫu.
Theo dõi và thường xuyên thay mới nhưng tránh lãng phí hóa chất.

16