TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG
BỘ MÔN THÚ Y
--------------- 0----------------

LA ĐỒNG HIỆP

Trung tâm Học Liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
KHẢO SÁT TÌNH HÌNH NHIỄM VIRÚT VIÊM NÃO NHẬT
BẢN TRÊN GIA SÚC NHAI LẠI

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP BÁC SỸ THÚ Y

Tháng 07/2007

1


TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG
BỘ MÔN THÚ Y
--------------- 0----------------

LA ĐỒNG HIỆP

Trung tâm
Học SÁT
Liệu TÌNH
ĐH Cần
Thơ
@ TàiVIRÚT

liệu học
tập và
nghiên
KHẢO
HÌNH
NHIỄM
VIÊM
NÃO
NHẬTcứu
BẢN TRÊN GIA SÚC NHAI LẠI

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP BÁC SỸ THÚ Y

Giáo Viên Hướng Dẫn
HỒ THỊ VIỆT THU

Tháng 07/2007
2


TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP & SINH HỌC ỨNG DỤNG
BỘ MÔN THÚ Y

Đề tài: Khảo sát tình hình nhiễm virút viêm não Nhật Bản trên gia súc nhai lại
do sinh viên: La Đồng Hiệp thực hiện tại TP Cần Thơ từ tháng 4 năm 2007 đến
tháng 6 năm 2007

Cần Thơ ngày tháng năm 2007
Duyệt Bộ môn


Cần Thơ ngày tháng năm 2007
Duyệt Giáo viên hướng dẫn

Trung tâm Học Liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

Cần Thơ ngày
tháng
năm 2007
Duyệt Khoa Nông Nghiệp & SHƯD

3


LỜI CẢM TẠ

Trung

Qua thời gian học tập và rèn luyện tại trường Đại Học Cần Thơ, cũng như trong
suốt quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp này, tôi đã được quý thầy cô tận tình
hướng dẫn và truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm quý báu về chuyên ngành
Thú y mà tôi đang học.
Tôi xin chân thành cảm ơn:
- Quý thầy, cô đã tham gia giảng dạy lớp Thú Y khoá 28 của chúng tôi những
kiến thức quý báu trong suốt những năm qua.
- Cô Hồ Thị Việt Thu đã tận tình hướng dẫn và gúp đỡ tôi hoàn thành luận văn
này.
- Các chị, các bạn, các anh và các chú ở lò mổ đã tận tình giúp đỡ tôi trong
suốt thời gian lấy mẫu và xét nghiệm mẫu.
- Cảm ơn gia đình và tất cả các bạn bè luôn giúp đỡ, động viên tôi trong suốt

khoá học đến khi hoàn thành luận văn.
Tuy nhiên do còn hạn chế về kiến thức, kinh nghiệm và tài liệu tham khảo nên
không tránh khỏi những thiếu sót, sai lầm. Kính mong cô hướng dẫn, quý thầy cô
trong bộ môn cùng các bạn sinh viên góp ý để luận văn được hoàn thiện hơn.
tâm Học Liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
Cuối cùng xin kính gởi đến quý thầy cô, người thân, bạn bè của tôi lời chúc
sức khỏe và xin nhận nơi tôi lòng biết ơn sâu sắc.

4


MỤC LỤC

Trung

Trang tựa..................................................................................................................i
Trang duyệt .............................................................................................................ii
Lời cảm tạ ..............................................................................................................iii
Mục lục ..................................................................................................................iv
Danh mục bảng ......................................................................................................vi
Danh mục hình ......................................................................................................vii
Tóm lược..............................................................................................................viii
Chương 1: Đặt vấn đề.............................................................................................. 1
Chương 2: Cơ sở lý luận.......................................................................................... 2
2.1 Giới thiệu về bệnh viêm não Nhật Bản .................................................. 2
2.2 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước ............................................ 2
2.2.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước ..................................................... 2
2.2.1 Tình hình nghiên cứu trong nước...................................................... 3
2.3 Căn bệnh học ........................................................................................ 4
2.3.1 Đặc điểm hình thái, cấu trúc của virút viêm não Nhật Bản................ 4

2.3.2 Sức đề kháng của virút viêm não Nhật Bản ...................................... 5
tâm Học2.3.3
Liệu
Cầncấy..............................................................................
Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
ĐặcĐH
tính nuôi
5
2.3.4 Đặc tính ngưng kết hồng cầu ............................................................ 6
2.4 Dịch tễ học............................................................................................ 6
2.4.1 Phân bố địa lý................................................................................... 6
2.4.2 Phân bố theo mùa ............................................................................. 7
2.5 Chu trình truyền bệnh............................................................................ 8
2.6 Trung gian truyền bệnh ......................................................................... 9
2.7 Ký chủ của virút viêm não Nhật Bản................................................... 10
Chương 3: Phương tiện và phương pháp thí nghiệm .............................................. 12
3.1 Phương tiện thí nghiệm ....................................................................... 12
3.1.1 Thời gian và địa điểm thực hiện ..................................................... 12
3.1.2 Đối tượng và dịa điểm lấy mẫu....................................................... 12
3.1.3 Vật liệu, hóa chất dùng trong thí nghiệm ........................................ 12
3.2 Phương pháp thí nghiệm ..................................................................... 14
3.2.1 Phương pháp lấy mẫu ..................................................................... 14
3.2.2 Rửa và bảo quản hồng cầu ngỗng ................................................... 15
3.2.3 Xử lý huyết thanh ........................................................................... 15
3.2.4 Thực hiện phản ứng HA ................................................................. 16
3.2.5 Thực hiện phản ứng HI................................................................... 16

5



3.2.6 Thực hiện phản ứng đối chứng ....................................................... 17
3.3 Các chỉ tiêu theo dõi............................................................................ 17
3.4 Xử lý số liệu........................................................................................ 18
Chương 4: Kết quả và thảo luận ............................................................................ 19
4.1 Kết quả xét nghiệm huyết thanh bằng phản ứng HI trên trâu, bò, dê.... 19
4.2 Tỷ lệ nhiễm viêm não Nhật Bản theo lứa tuổi...................................... 20
4.3 Tỷ lệ nhiễm viêm não Nhật Bản theo giới tính .................................... 21
4.4 Hiệu giá kháng thể trung bình (GMT) của các loài trâu, bò, dê............ 22
Chương 5: Kết luận và đề nghị .............................................................................. 24
5.1 Kết luận .............................................................................................. 24
5.2 Đề nghị ............................................................................................... 24
Tài liệu tham khảo................................................................................................. 27
Phụ chương ........................................................................................................... 30

Trung tâm Học Liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

6


DANH MỤC BẢNG
Bảng 4.1 Kết quả xét nghiệm huyết thanh bằng phản ứng HI trên trâu, bò, dê ....... 19
Bảng 4.2 Tỷ lệ nhiễm viêm não Nhật Bản theo lứa tuổi ở trâu ............................... 20
Bảng 4.3 Tỷ lệ nhiễm viêm não Nhật Bản theo lứa tuổi ở bò ................................. 20
Bảng 4.4 Tỷ lệ nhiễm viêm não Nhật Bản theo giới tính ở trâu.............................. 21
Bảng 4.5 Tỷ lệ nhiễm viêm não Nhật Bản theo giới tính ở bò................................ 21
Bảng 4.6 Tỷ lệ nhiễm viêm não Nhật Bản theo giới tính ở dê ................................ 21
Bảng 4.7 Hiệu giá kháng thể trung bình của trâu, bò, dê ........................................ 22

Trung tâm Học Liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu


7


DANH MỤC HÌNH
Hình 2.1 Mô hình cấu trúc hạt virút viêm não Nhật Bản .......................................... 5
Hình 2.2 Địa dư phân bố bệnh viêm não Nhật Bản .................................................. 7
Hình 2.3 Phác đồ giả định những đường nhiễm virút viêm não Nhật Bản trong
và ngoài vụ dịch ...................................................................................................... 8
Hình 2.4 Muỗi Culex đang đẻ trứng....................................................................... 10
Hình 4.1 Tỷ lệ nhiễm viêm não Nhật Bản trên trâu, bò, dê .................................... 19
Hình 4.2 Tỷ lệ nhiễm viêm não Nhật Bản theo lứa tuổi của trâu, bò ...................... 20
Hình 4.3 Tỷ lệ nhiễm viêm não Nhật Bản theo giới tính của trâu, bò, dê ............... 22
Hình 4.4 Hiệu giá kháng thể trung bình của trâu, bò, dê ........................................ 23

Trung tâm Học Liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu

8


TÓM LƯỢC

Trung

Bệnh viêm não Nhật Bản là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm của người và động
vật do Flavivirus gây ra, bệnh là nguyên nhân gây viêm não và thất bại sinh sản ở
người và gia súc. Hầu hết các gia súc đều mẩn cảm với virút viêm não Nhật Bản
như: trâu, bò, dê, cừu và heo. Những động vật khác như: thỏ, chuột, bồ câu (Chang
và ctv, 1984), chó, gà, vịt (Huang, 1982), chim, bò sát đều mẫn cảm với virút viêm
não Nhật Bản (Chu và Joo, 1996).
Với mục đích xác định tỷ lệ nhiễm và tìm hiểu vai trò của các loài gia súc như:

trâu, bò, dê trong chu trình truyền bệnh trong tự nhiên, đề tài “KHẢO SÁT TÌNH
HÌNH NHIỄM VIRÚT VIÊM NÃO NHẬT BẢN TRÊN GIA SÚC NHAI LẠI” đã
được thực hiện từ tháng 4/2007 đến tháng 6/2007. Trong tổng số 264 mẫu huyết
thanh được xét nghiệm bằng phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI:
Haemagglutination Inhibition) gồm có: 100 bò, 100 dê, 64 trâu. Chúng tôi ghi nhận
được kết quả như sau:
- Có sự lưu hành của virút viêm não Nhật Bản trên 3 loài gia súc nhai lại này
với tỷ lệ nhiễm cao nhất trên bò (68,00%), kế đến là dê (61,00%) và trâu (43,75%).
- Tỷ lệ nhiễm virút viêm não Nhật Bản theo độ tuổi:
tâm Học Liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
+ Tỷ lệ nhiễm ở trâu từ 3 năm tuổi trở xuống là 47,06%, trâu trên 3 năm tuổi
là 51,85%, (P=0,757) không có ý nghĩa thống kê.
+ Tỷ lệ nhiễm ở bò từ 3 năm tuổi trở xuống là 68,97%, bò trên 3 năm tuổi là
72,00%, (P=0,808) không có ý nghĩa thống kê.
- Tỷ lệ nhiễm virút viêm não Nhật Bản theo giới tính:
+ Tỷ lệ nhiễm ở trâu cái và trâu đực như nhau (43,75%).
+ Tỷ lệ nhiễm ở bò cái là 77,78%, bò đực là 65,85%, (P=0,326) không có ý
nghĩa thống kê.
+ Tỷ lệ nhiễm ở dê cái là 62,50%, dê đực là 60,00%, (P=0,802) không có ý
nghĩa thống kê.
- Hiệu giá kháng thể trung bình ở 3 loài này thấp: trâu là 31,23, bò là 38,40, dê
là 39,10.

9


CHƯƠNG 1: ĐẶT VẤN ĐỀ

Trung


Viêm não Nhật Bản là bệnh truyền nhiễm chung của người và động vật do
Flavivirus gây ra được duy trì và lây truyền qua chu trình bao gồm trung gian
truyền bệnh là muỗi, chim và động vật hữu nhủ.
Ở người, bệnh có thể gây ra hội chứng viêm não cấp với tỷ lệ tử vong cao (1040%) hoặc để lại những di chứng nghiêm trọng về thần kinh, đặc biệt là đối với trẻ
em. Trong tự nhiên, heo được xem là động vật quan trọng nhất trong sự khuếch đại
của virút. Bệnh có thể gây ra hội chứng rối loạn sinh sản trên heo: thai khô, chết heo
sơ sinh, co giật ở heo con, giảm khả năng sinh tinh cũng như chất lượng tinh trên
heo đực. Do tính chất nguy hiểm trên người cùng với những thiệt hại mà bệnh gây
ra trong chăn nuôi heo nên nghiên cứu về nguồn lây truyền bệnh là yêu cầu cần thiết
giúp cho việc phòng bệnh trên heo cũng như cung cấp dữ liệu góp phần tích cực cho
việc phòng bệnh viêm não Nhật Bản ở người.
Ngoài heo, nhiều loài động vật khác cũng cảm nhiễm với virút viêm não Nhật
Bản trong đó có trâu, bò, dê. Đây cũng có thể là nguồn rất quan trọng trong chu
trình truyền bệnh, nên để hiểu rõ hơn về sự lưu hành của virút viêm não Nhật Bản
trên các loài này và được sự đồng ý của khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụngtâm
Học
ĐH
@hành
Tàithực
liệu
và nghiên
cứu
Trường
ĐạiLiệu
học Cần
ThơCần
chúngThơ
tôi tiến
hiệnhọc
đề tài:tập

“KHẢO
SÁT TÌNH
HÌNH NHIỄM VIRÚT VIÊM NÃO NHẬT BẢN TRÊN GIA SÚC NHAI LẠI”
với mục đích:
- Xác định tỷ lệ nhiễm virút viêm não Nhật Bản trên các loài gia súc nhai lại
như: trâu, bò, dê bằng phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI).
- Tìm hiểu vai trò của chúng trong chu trình truyền bệnh.

10


CHƯƠNG 2: CƠ SỞ LÝ LUẬN
2.1 Giới thiệu về bệnh viêm não Nhật Bản

Trung

Bệnh viêm não Nhật Bản (VNNB) còn được gọi là bệnh viêm não Nhật Bản B
hay sốt mùa hè. VNNB là bệnh nhiễm trùng thần kinh do một loại virút gây ra, bệnh
gây ra hội chứng viêm não cấp và rối loạn sinh sản ở người và thú. Bệnh xuất hiện
lần đầu tiên năm 1871 ở Nhật Bản nhưng mãi đến năm 1935 mới phân lập được
virút từ não bệnh nhân tử vong do bệnh viêm não ở Tokyo. Năm 1938, Mitamira
phân lập được virút từ muỗi và từ đó gọi là bệnh viêm não Nhật Bản (Japanese
encephalitis – JE). Đây là bệnh có ổ dịch trong tự nhiên, heo được xem là động vật
cảm nhiễm cao nhất và quan trọng nhất. Sau heo, chim là động vật cảm thụ mạnh.
Hầu hết các loài gia súc đều cảm thụ với bệnh bao gồm: ngựa, heo, trâu, bò, dê, các
động vật khác như: thỏ, chuột, bồ câu (Chang và ctv, 1984), chó, gà, vịt (Huang,
1982), chim hoang, bò sát đều cảm thụ với virút (Chu và Joo, 1996).
Bệnh có thể lây truyền từ động vật sang người, bệnh có đặc điểm lâm sàng là
sốt cao, hội chứng nhiễm độc toàn thân với sự phát triển của viêm não tủy nặng, tỷ
lệ tử vong cao và thường để lại di chứng nặng nề sau khi khỏi bệnh. Viêm não Nhật

Bản phần lớn thường gặp ở trẻ em từ 2-10 tuổi (Trần Văn, 2004).
tâm
Học Liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
Ký chủ trung gian chủ yếu là muỗi Culex (chủ yếu là Culex.
tritaeniorhynchus). Muỗi hút máu con vật mang mầm bệnh như heo, chim... và sau
đó truyền sang người bằng con đường chích hút. Người là ký chủ cuối cùng trong
chu trình truyền bệnh.
2.2 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước
2.2.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước
Năm 1924, Futaki và năm 1925 Kaneko mô tả vụ dịch năm 1924 lan tràn nhiều
vùng ở Nhật Bản kéo dài từ tháng 7 đến tháng 10, cao điểm là vào cuối tháng 8.
Thời gian này có khoảng 6000- 7000 người bệnh viêm não. Kaneko gọi là viêm não
B nhằm phân biệt với viêm não A (viêm nãoVon Economo) cùng thời kỳ đó viêm
não B còn có tên gọi khác là viêm não mùa hè (Futaki, 1924) hay viêm não Nhật
Bản (Takaki, 1925) (trích từ Nguyễn Chương, 1996).
Năm 1954, Shimizu và cộng tác viên nghiên cứu phương thức tác động của
virút lên phôi thai và chứng minh vai trò của virút viêm não Nhật Bản trên heo đực
(Shimizu và ctv, 1954).
Năm 1959, Sherer và cộng tác viên nghiên cứu đáp ứng miễn dịch của heo bị
nhiễm virút viêm não Nhật Bản do muỗi đốt trong tự nhiên (Sherer và ctv, 1959).

11


Năm 1974, Douglas và cộng tác viên phân tích máu của 3 loài muỗi Culex
truyền bệnh viêm não Nhật Bản chủ yếu cho thấy ký chủ ưa thích nhất của chúng là
trâu và bò (Douglas và ctv, 1974).
Từ năm 1982- 1984, Horimoto và cộng tác viên nghiên cứu tình hình nhiễm
virút viêm não Nhật Bản trên bò nhận thấy tỷ lệ nhiễm trên bò ở Saitama là 65,5%
và ở Kagoshima là 68,8% (Horimoto và ctv, 1989).

Năm 1993, Chu và Joo đã xác định một danh mục các thú nuôi cảm nhiễm
virút viêm não Nhật Bản B gồm: heo, ngựa, bò, dê, cừu, chó, thỏ (Phạm Sỹ Lăng,
Nguyễn Thiện, 2004).
2.3.2.Tình hình nghiên cứu trong nước

Trung

Nước ta nằm trong vùng dịch tễ của bệnh viêm não Nhật Bản, do đó đã có
nhiều nghiên cứu để chẩn đoán, phát hiện và các biện pháp để phòng chống căn
bệnh này.
Năm 1956, Caubet, Netter, viện Pasteur Nha Trang, qua xét nghiệm huyết
thanh học đã kết luận có 20% người dân miền Nam tiếp xúc với virút viêm não
Nhật Bản. Năm 1970, trong lần điều tra dịch tễ trên heo, người ta phát hiện heo
mang kháng thể dương tính là 64,23% ở một số vùng miền Bắc. Nếu xét nghiệm
vùng thì
tỷ lệĐH
nhiễm
từng Thơ
vùng có
lên đến
Các nghiên
gia súc khác
từngHọc
tâm
Liệu
Cần
@thểTài
liệu93,4%-100%.
học tập và
cứu

như: gà, vịt, ngang, ngỗng, chó, trâu, bò cũng mang kháng thể từ 42,85%-56,52%
(trích dẫn từ Nguyễn Đa Phúc, 2001).
Năm 1960, Đỗ Quang Hà, viện vệ sinh dịch tễ học Hà Nội, phân lập được 4
chủng virút viêm não Nhật Bản, trong đó 3 chủng từ não bệnh nhân và một chủng từ
não chim Liếu điếu (Garrulex persipillatus gmelin) là HN-51, HN-59, HN-60, LD68, và đến năm 1975 phân lập được chủng TH-L-560 trên heo. Từ năm 1965-1975,
phát hiện nhiều chủng mới nâng tổng số chủng virút phân lập lên 18 chủng, trong
đó một chủng từ não heo và một chủng từ muỗi Culex tritaeniorhynchus thu thập từ
khu dân cư quanh các trại chăn nuôi (trích dẫn từ Lê Thị Thu, 2005).
Năm 1964, Đoàn Xuân Mượu, Đỗ Quang Hà đã xác định được virút viêm não
Nhật Bản ở Việt Nam được mang tên HN-60. Từ đó ở nước ta dùng kháng nguyên
Nakayama và HN-60 để triển khai các xét nghiệm huyết thanh chẩn đoán viêm não
Nhật Bản. Đoàn Xuân Mượu, Caubet, Netter cho rằng hiệu giá huyết thanh 1/320
được coi là phản ứng dương tính trên người (Nguyễn Chương, 1996).
Vào những năm 1978- 1995, tại các tỉnh phía Nam, các trung tâm nghiên cứu
đã phân lập được 29 chủng virút viêm não Nhật Bản, trong đó 10 chủng từ máu
bệnh nhân, 7 chủng từ não tủy bệnh nhân và 12 chủng từ muỗi ở các địa phương

12


ngoại thành thành phố Hồ Chí Minh, Đồng Tháp, Sông Bé, Đồng Nai, Long An (Hạ
Bá Khiêm, 1998) (trích dẫn từ Phan Thị Ngọc Thắm, 2006).
Năm 2001, Nguyễn Đa Phúc kiểm tra đàn heo nái sinh sản tại tỉnh Vĩnh Long
cho thấy 75,29% heo có kháng thể kháng virút viêm não Nhật Bản trong đó heo tại
các hộ chăn nuôi nhỏ có tỷ lệ nhiễm cao hơn (81,11%) so với heo nuôi tập trung
(62,65%) ( Nguyễn Đa Phúc, 2001).
Năm 2005, Lê Thị Thu nghiên cứu điều tra huyết thanh học thực hiện trên đàn
heo sinh sản tại các trại chăn nuôi tập trung tại tỉnh Cần Thơ, kết quả có 72,6% heo
xét nghiệm dương tính và heo nhóm dương tính có tỷ lệ rối loạn sinh sản cao hơn
nhóm heo âm tính (45,88% và 22.22%) (Lê Thị Thu, 2005).

Năm 2006, Phan Thị Ngọc Thắm khảo sát tình hình nhiễm bệnh viêm não Nhật
Bản trên đàn heo ở thành phố CầnThơ, kết quả xét nghiệm huyết thanh cho thấy heo
ở quận Ninh Kiều có tỷ lệ nhiễm là 59,6% và ở Cờ Đỏ là 62,78% (Phan Thị Ngọc
Thắm, 2006).
2.3 Căn bệnh học

Trung

Virút viêm não Nhật Bản (Japanese encephalitis virus- JEV) là một Flavivirus
trước đây được xếp vào họ Togaviridae, thuộc nhóm B của Arbovirus, nhưng do
khám
phá mới
sinh học
phân
của liệu
chúnghọc
nên hiện
xếp vào
những
tâm
Học
Liệu
ĐHvềCần
Thơ
@tửTài
tậpnay
vàđược
nghiên
cứu
giống Flavivirus họ Flaviviridae.

2.3.1 Đặc điểm hình thái, cấu trúc của virút viêm não Nhật Bản
Virút viêm não Nhật Bản là một loại virút có kích thước nhỏ, hình cầu , đường
kính từ 45-50nm, qua được lọc, gồm 32 capsome bao quanh, vỏ bọc chứa một sợi
RNA dương, sợi RNA có hệ số lắng là 44S, trọng lượng phân tử 4.106D, chiếm 6%
trọng lượng hạt virút. Virion trưởng thành có cấu trúc khối đối xứng 20 mặt, gồm
10.976 nucleotide, tương ứng với 3432 acid amin. Ngoài 3 protein cấu trúc còn có ít
nhất 7 protein phi cấu trúc, các protein cấu trúc là glycoprotein E của vỏ (54 kD),
protein cấu trúc không có glycosylated M của vỏ (8 KD), protein của capsid (14
kD). Protein của vỏ (protein E) mang các quyết định kháng nguyên để kích thích tạo
kháng thể trung hòa, ít nhất có 8 quyết định kháng nguyên được tìm thấy trên
protein E và một trong những vị trí quyết định trên protein đó biểu hiện tính đặc
hiệu của virút viêm não Nhật Bản (Kimura-Kurota, Yasui, 1986). Glycoprotein E
trên bề mặt hạt virút tham gia chủ yếu vào việc nhận diện những thụ thể của tế bào,
gây cảm ứng tạo kháng thể trung hòa, gây đáp ứng miễn dịch tế bào và là kháng
nguyên gây ngưng kết hồng cầu. Các protein phi cấu trúc bao gồm: NS1, NS2a,
NS2b, NS3, NS4a, NS4b, NS5.

13


Vỏ virút có gai hoặc tỉa ra xung quanh nên rất dễ gây ngưng kết hồng cầu.

Hình 2.1: Mô hình cấu trúc hạt virút viêm não Nhật Bản
( Nguồn: www.stanford.edu/.../virus/flavi/2005/virion.jpg)

2.3.2 Sức đề kháng của virút viêm não Nhật Bản

Trung

Virút viêm não Nhật Bản có sức đề kháng yếu với nhiệt độ cao: ở 600C virút

chết sau 10 phút, ở 700C chết sau 5 phút. Trái lại ở nhiệt độ lạnh (-700C) virút giữ
tâm
Học Liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
nguyên độc lực. Cồn ether, acetone làm mất hoạt lực virút sau 3 ngày, lyson tiêu
diệt virút sau 5 phút, phenol 1% diệt virút sau 10 phút, formol 0,5% diệt virút sau
48 giờ (Nguyễn Duy Thanh, 1992).
Virút nhạy cảm với chloruaform, natri desoxycholate và enzyme phân giải
protein và mỡ.
pH tối ưu của virút viêm não Nhật Bản là 8,5 (Chu và Joo, 1996).
Virút có thể tồn tại nhiều tháng trong huyết thanh ở -200C và có thể gây nhiễm
tế bào nuôi cấy.
2.3.2 Đặc tính nuôi cấy
Việc nghiên cứu virút viêm não Nhật Bản đã được tiến hành ở nhiều phòng thí
nghiệm virút ở Nhật Bản, Canada, Hà Lan, Trung Quốc. Kết quả cho thấy virút phát
triển tốt trong nguyên sinh chất của các loài thú có vú, trong đó có tế bào Vero và tế
bào thận khỉ, ký hiệu là BMK-21; tế bào sợi của não chuột, ký hiệu là L–M, các
dòng tế bào khác nhau trong cơ thể muỗi cũng là môi trường thích hợp cho virút
viêm não Nhật Bản phát triển như: dòng tế bào C6/36 lấy từ ấu trùng muỗi Aedes
albopictus và tế bào lấy từ trứng của muỗi Aedes aegypti. Năm 1987, tiến sĩ
Katarnath và cộng tác viên thông báo rằng môi trường bạch cầu của nhiều loài động

14


vật có vú khác nhau cũng có thể dùng nuôi cấy được virút viêm não Nhật Bản (Chu
và Joo, 1996).
Ngoài ra còn có thể nuôi cấy virút trong môi trường tế bào gia cầm, màng
nhung niệu phôi gà, tế bào Hela và thú thí nghiệm thường là chuột bạch. Theo Đỗ
Quang Hà và cộng sự (1976), khi nuôi cấy virút trên tế bào thận chuột thì sau 60
phút đã có những virút tiếp cận màng tế bào, sau 3 giờ thì virút tiếp cận trong

nguyên sinh chất của một vài loại tế bào, còn hầu hết các tế bào khác chưa thay đổi,
sau 3-4 ngày hầu hết các tế bào đã thoái hóa hoặc bong ra khỏi thành chai, lúc này
virút đã nhân lên ở mức độ cao và tập trung thành những đám lớn hoặc rải rác trong
nguyên sinh chất tế bào ( trích dẫn từ Lê Thị Thu, 2005).
2.3.4 Đặc tính ngưng kết hồng cầu
Virút viêm não Nhật Bản có khả năng ngưng kết hồng cầu gà, ngỗng, bồ câu,
chuột lang, nhưng tốt nhất là hồng cầu gà con 1 ngày tuổi.
Yếu tố pH có ảnh hưởng rất lớn đến ngưng kết hồng cầu:
- Kháng nguyên chế từ não cần pH tối ưu là 6,3- 6,5.
- Kháng nguyên chế từ tế bào nuôi cấy cần pH tối ưu là 6,0- 6,2.
2.4 Dịch tể học

Trung tâm Học Liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
2.4.1 Phân bố địa lý

Viêm não Nhật Bản có phân bố địa lý tại các khu vực Đông và Nam châu Á,
bệnh được ghi nhận ở Nhật Bản, Hàn Quốc, Trung Quốc, Đài Loan, Hong Kong,
Philippines, Indonesia, Singapore, Malaysia, Việt Nam, Lào, Campuchia, Thái Lan,
Bruney, Sri-lanka, Ấn Độ và các quần đảo Thái Bình Dương.

15


Hình 2.2: Địa dư phân bố bệnh viêm não Nhật Bản
(Nguồn: />
Trung tâm HọcGhiLiệu
ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
chú: phần màu đỏ là khu vực phân bố của bệnh viêm não Nhật Bản
2.4.2 Phân bố bệnh theo mùa
Bệnh viêm não Nhật Bản có liên quan đến khí hậu và mùa. Tính chất mùa thể

hiện rõ trên người, ở những vùng ôn đới (Triều Tiên, Nhật Bản, Trung Quốc, Đài
Loan, miền Bắc Việt Nam, miền Bắc Thái Lan, Nepal và Bắc Ấn Độ) bệnh có tính
chất dịch và phần lớn ca bệnh tập trung vào một vài tháng mùa hè, từ tháng 5 đến
tháng 10. Ở những vùng nhiệt đới (Indonesia, Malaysia, Philippine, Nam Thái Lan,
Srilanka, Nam Ấn Độ và Nam Việt Nam) dịch bệnh thường xuất hiện quanh năm,
bệnh bắt đầu tăng vào đầu màu mưa (Đỗ Mạnh Dũng, 2006). Mật độ muỗi có vai
trò quyết định đến sự lan truyền của bệnh.
Khí hậu với những yếu tố nhiệt độ và mưa cũng có ảnh hưởng đến tình hình
bệnh. Vào mùa mưa, ruộng lúa đầy nước tạo điều kiện tốt cho muỗi sinh sản và phát
triển mạnh trong tự nhiên, trùng hợp với thời điểm bệnh xảy ra nhiều. Vào mùa hè
thời tiết nóng, nhiệt độ 270C- 300C virút phát triển tốt trong cơ thể muỗi, nếu dưới
200C thì sự phát triển của virút dừng lại. Do đó mô hình dịch tễ học khác nhau giữa
miền Bắc và miền Nam Việt Nam: miền Bắc bệnh giảm nhiều vào những tháng
lạnh, tăng vào những tháng hè và đỉnh cao là vào tháng 5,6,7. Còn ở miền Nam thời
tiết nóng nên bệnh rải rác quanh năm (www.medinet.hochiminhcity.gov.vn).

16


2.5 Chu trình truyền bệnh
Trong tự nhiên, virút được duy trì và lây truyền qua chu trình bao gồm: trung
gian truyền bệnh là muỗi (chủ yếu là muỗi Culex), chim và động vật hữu nhũ (Chu
và Joo, 1996). Sự tồn tại của virút chủ yếu nhờ vào những động vật mà sự nhiễm
trùng không có biểu hiện triệu chứng lâm sàng. Trong tự nhiên có rất nhiều gia súc
và động vật hoang là nguồn cung cấp virút cho chu trình truyền bệnh như: heo,
chim, trâu, bò, dê, cừu, khỉ, chó, mèo…
Sau khi muỗi đốt vật chủ mang mầm bệnh và tiếp tục đốt sang người, người sẽ
bị nhiễm virút và trở thành vật chủ ngẫu nhiên chứa virút. Sự tồn tại của virút trong
cơ thể người trong một thời gian ngắn với một số lượng virút rất thấp nên khả năng
muỗi hút máu người có chứa virút để truyền cho người khác là cực kỳ hiếm nếu

không muốn nói là không có, cho nên người được xem là vật chủ cuối cùng trong
dây chuyền truyền bệnh viêm não Nhật Bản.
Chim hậu điểu
Muỗi
trùngvà
tiềmnghiên
tàng
Trung tâm Học Liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu Nhiễm
học tập
cứu
các súc vật chưa biết

Cò đêm Dê

Bò

Ngựa

Heo

Muỗi
Người
Người

Hình 2.3: Phác đồ giả định những đường nhiễm virút viêm não Nhật Bản trong và
ngoài vụ dịch (Nguyễn Duy Thanh, 1992)

17



2.6 Trung gian truyền bệnh

Trung

Trong tự nhiên, virút được truyền giữa các vật chủ với nhau và sang người nhờ
muỗi giống Culex, chủ yếu là Culex tritaeniorhynchus, ngoài ra còn có Culex
gelidus, Culex vishnui, Culex pipiens, Culex pseudovishnui,…Người ta cũng phát
hiện virút viêm não Nhật Bản tồn tại và phát triển được ở một số loài muỗi thuộc
giống Aedes (chủng Aedes togoi, Aedes japonicus), có tài liệu nói cả đến Anopheles
maculipennis cũng có khả năng truyền bệnh (Bùi Đại và ctv, 2002). Muỗi cái có thể
truyền virút từ đời mẹ sang đời con. Muỗi Culex tritaeniorhynchus sinh sản và phát
triển nhiều ở đồng ruộng, đốt chim, gia súc và người. Theo Douglas J. Gould và ctv
(1974), ký chủ ưa thích nhất của những loài muỗi Culex là trâu, bò, tuy nhiên chưa
có tài liệu nào cho thấy những loài này có biểu hiện bệnh và phát triển nhiễm trùng
huyết. Chim nhiễm viêm não Nhật Bản và phát triển virút huyết với nồng độ cao và
kéo dài trong nhiều ngày nhưng không mắc bệnh. Heo tham gia dây chuyền truyền
bệnh thường ở dạng nhiễm trùng thể ẩn. Trong máu heo, nồng độ virút rất cao nên
có khả năng truyền bệnh cho người khi muỗi chích hút. Muỗi hút máu heo trong
thời kỳ nhiễm trùng huyết, virút nhân lên trong muỗi với hiệu giá cao, sau đó có khả
năng truyền bệnh suốt đời và có thể truyền virút sang thế hệ sau qua trứng, cho nên
muỗi vừa là trung gian truyền bệnh vừa là nguồn bệnh. Người và ngựa cũng nhiễm
tâm Học Liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
virút nhưng không thể lây truyền được (Nguyễn Duy Thanh, 1992).
Muỗi Culex tritaeniorhynchus hoạt động mạnh vào mùa nóng, mật độ cao nhất
vào tháng 3,4 đến tháng 7, thích hợp ở nhiệt độ 22-280C, ẩm độ 80-90%, sinh sản ở
đồng ruộng, ao hồ, vũng nước quanh nhà, chu kỳ sinh sản 15-16 ngày, không hoạt
động ban ngày, muỗi ưa hoạt động trong và quanh nhà, hút máu về đêm từ 18 giờ
đến 22 giờ, giảm dần và ngừng hoạt động lúc 8 giờ sáng (Nguyễn Duy Thanh,
1992).
Trong tự nhiên sự xâm nhiễm của virút viêm não Nhật Bản được duy trì một

cách đều đặn theo chu kỳ đòi hỏi phải có muỗi làm vector truyền bệnh. Ngoài Culex
tritaeniorhynchus- nguyên nhân chủ yếu truyền bệnh, các loài muỗi khác cũng đóng
vai trò vector truyền bệnh tùy vào điều kiện sinh thái, khí hậu, thời tiết của từng địa
phương khác nhau.

18


Hình 2.4: Muỗi Culex đang đẻ trứng
(Nguồn: />
2.7 Ký chủ của virút viêm não Nhật Bản

Trung

* Heo: Heo đựợc xem là nguồn nhiễm virút huyết quan trọng nhất truyền cho
muỗi vì:
đượcĐH
nhiềuCần
lứa, tạo
ra số@
lượng
thể học
heo cảm
- Heo đẻ
tâm Học
Liệu
Thơ
Tàiquần
liệu
tậpnhiễm

và mới.
nghiên cứu
- Luân chuyển thường xuyên mỗi 6-8 tháng.
- Chỉ số heo nhiễm virút trong tự nhiên cao hơn tất cả các gia súc khác.
- Nồng độ virút huyết ở heo cao nên dễ truyền virút qua muỗi
(www.medinet.hochiminhcity.gov.vn).
Heo nhiễm virút viêm não Nhật Bản và biểu hiện triệu chứng lâm sàng: chết
thai, sẩy thai ở heo nái, heo con sơ sinh yếu ớt, ứ nước dưới da và não và có triệu
chứng thần kinh như: run, co giật và chết sau vài ngày (Shimizu và ctv, 1954), heo
đực bị viêm dịch hoàn, thủy thủng, làm giảm số lượng và chất lượng tinh.
* Chim: Chim là vật chủ quan trọng chứa virút viêm não Nhật Bản, người ta
phân lập được virút viêm não Nhật Bản từ nội tạng của chim hoang dã (chim liếu
điếu và một số chim khác), chim mang virút huyết kéo dài nhưng lại không biểu
hiện bệnh và là nguồn lây nhiễm cho các loài muỗi trong tự nhiên. Loài chim thiên
di có thể lây truyền virút từ vùng này sang vùng khác.
Ở Việt Nam có hai nhóm chim có khả năng truyền bệnh:
- Nhóm thứ nhất: gồm những loài chim sống trong làng mạc, lũy tre, cây ăn
quả như: chim bông lao, rẽ quạt, sẻ nhà, liếu điếu, chim khách, chích chòe...
- Nhóm thứ hai: gồm những chim kiếm ăn ngoài đồng ít vào trong làng như:
cò, sáo, quạ, cu gáy, chim chèo bẽo... (Nguyễn Duy Thanh,1992).

19


* Người: Virút viêm não Nhật Bản có thể phân lập được từ máu người nhưng
không biết được giai đoạn virút huyết ở người bị nhiễm hoặc là giai đoạn virút
huyết xảy ra rất ngắn hoặc là nồng độ virút không đủ cao để truyền virút cho muỗi.
Vì vậy mà sự truyền từ người sang người là rất hiếm. Ở người, tỷ lệ mắc bệnh ở trẻ
em cao hơn người lớn 5-10 lần với triệu chứng là viêm não, viêm màng não, bệnh
có tỷ lệ tử vong cao 14-20%. Nếu ở thể nhẹ nhất cũng bị di chứng chậm phát triển

thần kinh, còn thể nặng có thể liệt vận động, liệt toàn thân, tàn tật suốt đời (Huỳnh
Phương Liên, 1998). Cũng như ở người, ngựa thỉnh thoảng cũng mắc bệnh viêm
não sau khi nhiễm virút viêm não Nhật Bản, nhưng chúng không được xem là
nguồn chứa virút quan trọng cho muỗi (Leon Rosen, 1986).
Nhiều loài động vật khác cũng nhiễm virút viêm não Nhật Bản trong tự nhiên
đã được xác định như: chó, thỏ, bồ câu, gà, vịt, chuột nhắt và một số loài bò sát.
Những loài vật này không biểu hiện triệu chứng lâm sàng nhưng là nguồn tàng trữ
mầm bệnh trong tự nhiên (Phạm Sỹ Lăng, Nguyễn Thiện, 2004).

Trung

* Trâu, bò, dê: Những nghiên cứu của Douglas và cộng tác viên (1974),
Arunachalam và cộng tác viên (2005), cho thấy ký chủ ưa thích nhất của muỗi
Culex là trâu và bò. Sự lưu hành của kháng thể được nghiên cứu ở Malaysia cho
thấy tỷ lệ nhiễm cao nhất là trên heo kế đến là trâu (45%), bò (42%), dê (14%)
tâm Học Liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
(Oda K và ctv, 1996). Trong kết quả khảo sát huyết thanh tìm kháng thể chống virút
viêm não Nhật Bản được tiến hành trong và xung quanh Bareilly, Uttar Pradesh (Ấn
Độ) để thăm dò vai trò của những ký chủ không phải là người trong chu trình truyền
bệnh trong tự nhiên cho thấy tỷ lệ nhiễm trên trâu là 21,92%, dê là 17,86%, bò là
1,98% (Mall và ctv, 1995). Trong nghiên cứu huyết thanh ở một số tỉnh của Ấn Độ,
cho thấy tỷ lệ nhiễm viêm não Nhật Bản trên dê là từ 70%-74%, hiệu giá kháng thể
trên dê thấp từ 1/10-1/80 và kháng thể sẽ giảm và mất đi sau 3-4 tuần (Rajendran và
ctv, 2003). Ở Nhật, những mẫu huyết thanh được thu thập từ những con bê và mẹ
của chúng để kiểm tra kháng thể HI chống virút viêm não Nhật Bản trên bê và tìm
mối tương quan giữa kháng thể trên bê và mẹ của nó, cho thấy có 63,6% bê mới
sinh được chứng minh là nhận kháng thể chống virút viêm não Nhật Bản từ mẹ
(Horimoto và Sakai, 1990). Trong dịch xoang ngực của 1bê trong tổng số 35 bê bị
sẩy thai cũng đã phát hiện kháng thể chống virút viêm não nhật Bản (Seong In Lim
và ctv, 2007). Những động vật này nhiễm virút viêm não nhật Bản thường xuyên

nhưng không biển hiện bệnh, và cũng chưa có bằng chứng nào chứng minh có hiện
tượng virút huyết ở các loài động vật này (Ilkal và ctv, 1988). Tuy nhiên, Peiris và
ctv (1993) đã chứng minh có sự liên quan giữa tình hình nhiễm bệnh trên các loài
này với sự xuất hiện các ca bệnh trên người.

20


CHƯƠNG 3: PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM
3.1 Phương tiện thí nghiệm
3.1.1 Thời gian và địa điểm thực hiện
Thời gian thực hiện đề tài từ 04/2007 đến 06/2007
Địa điểm thực hiện:
Phòng thí nghiệm Bệnh Truyền Nhiễm - Bộ môn Thú Y - Khoa Nông nghiệp Trường Đại Học Cần Thơ.
3.1.2 Đối tượng và địa điểm lấy mẫu
Đối tượng lấy mẫu
Mẫu máu của trâu, bò, dê được thu thập tại nơi giết mổ.
Số lượng: gồm 64 mẫu máu trâu, 100 mẫu máu bò, 100 mẫu máu dê.
Địa điểm lấy mẫu:
Máu trâu và bò được lấy ở lò mổ thuộc quận Ô Môn - TP Cần Thơ.
Máu dê được lấy ở quận Bình Thủy - TP Cần Thơ.
3.1.3 Vật liệu, hóa chất dùng trong thí nghiệm
Trung tâm
Học Liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
Vật liệu và dụng cụ lấy mẫu

Ống nghiệm vô trùng để đựng máu, thùng trữ lạnh và nước đá
Vật liệu và dụng cụ xử lý, xét nghiệm
- Kháng nguyên viêm não Nhật Bản chủng Nakayama chuẩn
- Ống tiêm 12 ml và kim tiêm 23G vô trùng để lấy máu ngỗng

- Các chai, lọ, bình tam giác, pipet
- Micropipet, dispenser
- Máy ly tâm
- Hematocrit
- Đĩa microplate đáy chử U 96 giếng
- Týp nhựa đựng huyết thanh
- Máu ngỗng

21


Các dung dịch cần thiết cho xét nghiệm
Dung dịch dùng cho hồng cầu
- Dung dịch Alsever ( dung dịch chống đông)
Dextrose ( C6H12O6 )
20,50g
NaCl
4,20g
Citric acid
0,55g
Sodium citrate
8g
Nước cất hai làn vừa đủ
1000ml
0
Sấy ướt 110 C trong 10 phút

Trung tâm

- Dung dịch DGV ( Dextrose- Gelatine- Veronal )

Veronal
0,58g
Gelatine
0,6g
Sodium Veronal
0,38g
CaCl2
0,02g
MgSO4.7H2O
0,12g
NaCl
8,5g
Glucose
10g
Học Liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập
Nước cất hai lần vừa đủ
1000ml
Dung dịch dùng trong phản ứng
* Các dung dịch mẹ
- Dung dịch NaCl 1,5M
NaCl
43,85g
500ml
Nước cất vừa đủ
- Dung dịch acid boric 0,5M
BO3H3
7,73g
Nước cất vừa đủ
250ml
( Hòa tan trong nước nóng sau đó thêm vào nước cất vừ đủ )

- Dung dịch NaOH 1N
NaOH
40g
Nước cất vừa đủ
1000ml
- Dung dịch Phosphate ( dung cho hồng cầu )
+ Dung dịch Na2HPO4 0,5M
Na2HPO4.12H2O
179,08g
Nước cất vừa đủ
1000ml

22

và nghiên cứu


Trung

+ Dung dịch NaH2PO4 1M
NaH2PO4.2H2O
156,01g
Nước cất vừa đủ
1000ml
* Các dung dịch làm việc
- Dung dịch VAD
Dung dịch NaCl 1,5M
100ml
Dung dịch Na2HPO4 0,5M
62ml

Dung dịch NaH2PO4 1M
160ml
Nước cất vừa đủ
1000m
- Dung dịch Borat pH= 9
Dung dịch NaCl 1,5M
80ml
Dung dịch BO3H3 0,5M
100ml
Dung dịch NaOH 1N
24ml
Nước cất vừa đủ
1000ml
- Dung dịch 4% Bovalbumine (Fraction V )
Bovalbumine
2g
50ml
Dung dịch Borat pH= 9 vừa đủ
(Chỉnh lại pH=9 bằng dung dịch NaOH 1N )
tâm Học
Liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học
- Dung dịch BABS 0,4%
Dung dịch Bovalbumine 4% pH=9
10ml
Dung dịch Borat pH= 9
90ml
- Dung dịch Kaolin 25%
Kaolin
25g
Dung dịch Borat pH= 9

100ml
0
Trữ lạnh ở 4 C

tập và nghiên cứu

3.2 Phương pháp thí nghiệm
Trong đề tài này chúng tôi sử dụng phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI)
để phát hiện kháng thể kháng virút viêm não Nhật Bản trên trâu, bò, dê.
* Nguyên lý của phản ứng HI:
- Virút viêm não Nhật Bản có đặc tính gây ngưng kết với một số loại hồng cầu.
- Kháng thể đặc hiệu kháng virút viêm não Nhật Bản có thể ức chế ngưng kết
hồng cầu. Các bước tiến hành như sau:
3.2.1 Phương pháp lấy mẫu
Máu trâu, bò, dê được lấy lúc chích huyết cho vào ống nghiệm vô trùng để ở
nhiệt độ thường. Khi thấy máu ra huyết thanh thì cho vào thùng có nước đá, sau đó

23


đem về phòng thí nghiệm để chiết huyết thanh. Huyết thanh được chiết vào týp
nhựa vô trùng và bảo quản ở nhiệt độ - 200C.
3.2.2 Rửa và bảo quản hồng cầu ngỗng

Trung

Máu ngỗng được lấy ở tĩnh mạch cánh, trước khi lấy phải sát trùng vị trí lấy
máu. Dùng ống tiêm 10ml và kim tiêm 23G vô trùng hút 1,5ml dung dịch Alsever
để chống đông. Sau đó lấy khoảng 8,5ml máu ở tĩnh mạch cánh. Rút kim ra, hút hơi
vào ống tiêm và lắc nhẹ cho tan đều và máu không bị đông. Sau đó bơm nhẹ vào

ống nghiệm vô trùng.
Tương tự, lấy cho đến khi đủ lượng máu cần thiết cho việc xét nghiệm
Hồng cầu ngỗng được rửa 4 lần trong dung dịch DGV
Một khối lượng máu toàn phần và 2,5 khối lượng DGV, lắc nhẹ cho đều, ly
tâm 1000 vòng /phút trong 15 phút, rút bỏ phần nước nổi bên trên.
Hòa hồng cầu với 3 khối lượng DGV, lắc nhẹ cho đều, quay ly tâm 1000
vòng/phút trong 15 phút, rút bỏ phần nước nổi bên trên.
Rửa tiếp hai lần nữa với DGV (cách rửa như trên).
Dùng Hematocrit để xác định tỷ lệ hồng cầu, sau đó pha hồng cầu 8% trong
DGV (đủ lượng hồng cầu 8% làm phản ứng) và bảo quản lạnh ở 40C.
cầu 8%ĐH
sẽ được
tục pha
trong học
VAD tập
theo và
tỷ lệnghiên
1/24 khi sử
Hồng Liệu
tâm Học
CầntiếpThơ
@ loãng
Tài liệu
cứu
dụng trong phản ứng HA và HI (hồng cầu 0,33%). Pha ra với lượng đủ để làm phản
ứng và bảo quản lạnh ở 40C.
3.2.3 Xử lý huyết thanh
Trước khi làm phản ứng phải xử lý huyết thanh nhằm mục đích loại bỏ chất
kìm hãm ngưng kết hồng cầu không đặc hiệu.
Hấp thụ Kaolin: Dùng Micropipet hút 0,1ml huyết thanh cho vào ống nghiệm

vô trùng và 0,4ml dung dịch Borat (pH=9) và 0,5ml dung dịch Kaolin lắc kỹ hỗn
dịch trong 5 phút/lần (4 lần) bằng máy lắc, sau đó đem ly tâm 1000 vòng/phút bằng
máy ly tâm trong 15 phút. Lấy phần nước trong ta sẽ được huyết thanh pha loãng
1/10.
Hấp thụ chất ngưng kết: Phần nước trong sau khi cho hấp thụ với Kaolin đã
pha loãng 1/10 cho vào ống nghiệm vô trùng cho thêm một giọt hồng cầu ngỗng đặc
lắc nhẹ cho đều, ngâm trong nước đá tan, cho tiếp xúc 20 phút, sau đó đem ly tâm
1000 vòng/phút trong 15 phút, lấy phần nước trong bên trên cho vào týp nhựa vô
trùng, ta được huyết thanh đã xử lý. Trữ huyết thanh đã xử lý ở nhiệt độ -200C.

24


3.2.4 Thực hiện phản ứng HA

Trung

* Thành phần của phản ứng HA
- Kháng nguyên chuẩn chủng Nakayama pha loãng 1/10 trong dung dịch Borat.
- Dung dịch Borat.
- Hồng cầu ngỗng đã pha loãng 0,33% trong dung dịch VAD.
* Tiến hành phản ứng
Cho vào tất cả 12 lỗ, mỗi lỗ 0,05ml dung dịch Borat, tiếp tục cho vào lỗ thứ
nhất 0,05ml kháng nguyên đã pha loãng 1/10, trộn đều, hút 0,05ml sang lỗ thứ hai,
trộn đều, hút 0,05ml sang lỗ thứ ba,... Tiếp tục như thế đến lỗ thứ mười hai thì bỏ đi
0,05ml. Sau đó, cho vào mỗi lỗ 0,05ml hồng cầu 0,33% rồi lắc đĩa để trộn kháng
nguyên, hồng cầu và Borat, để ở nhiệt độ phòng sau một giờ đọc kết quả.
* Đọc kết quả phản ứng HA
- Dương tính 4(+): Nếu hồng cầu kết thành một lớp mỏng, che kín cả đáy lỗ
- Dương tính 3(+): Nếu đại đa số hồng cầu kết thành một lớp mỏng, nhưng đáy

lỗ còn một ít hồng cầu không ngưng kết tụ lại thành hình nhẫn.
- Dương tính 2(+): Đại đa số hồng cầu tụ lại ở đáy lỗ thành cụm, xung quanh
có một ít hồng cầu ngưng kết lấm tấm.
- Âm tính: Hồng cầu tụ lại thành một cụm tròn nhỏ ở đáy lỗ.
tâm Học Liệu ĐH Cần Thơ @ Tài liệu học tập và nghiên cứu
Từ kết quả của phản ứng HA, ta có thể xác định được hiệu giá kháng nguyên:
Hiệu giá ngưng kết của kháng nguyên là độ pha loãng cuối cùng của kháng nguyên
còn khả năng ngưng kết ở mức độ 4(+) hay 3(+) và gọi là một đơn vị ngưng kết.
3.2.5 Thực hiện phản ứng HI
* Thành phần phản ứng
- Dung dịch BABS 0,4%
- Huyết thanh đã xử lý.
- Kháng nguyên có 8 đơn vị ngưng kết pha loãng trong dung dịch BABS 0,4%
để ở nhiệt độ 40C trong một giờ.
- Hồng cầu ngỗng 0,33% pha loãng trong VAD.
* Tiến hành phản ứng
Cho vào mỗi lỗ của microplate 0,025ml dung dịch BABS 0,4%
Cho 0,025ml huyết thanh đã xử lý vào lỗ thứ nhất, trộn đều, hút 0,025ml sang
lỗ thứ hai, trộn đều, hút 0,025ml sang lỗ thứ ba... Tiếp tục như thế cho đến lỗ thứ 12
và hút bỏ đi 0,025ml.
Tiếp tục cho vào mỗi lỗ 0,025ml kháng nguyên đã pha loãng trong BABS
0,4% (trữ lạnh ở 40C), lắc đều. Sau đó đem ủ ở nhiệt độ 40C trong khoảng 8 đến 18
giờ hoặc 1 giờ ở nhiệt độ phòng.

25