TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG
BỘ MÔN THÚ Y

Luận văn tốt nghiệp
Ngành : BÁC SĨ THÚ Y

Tên đề tài

KIỂM TRA HIỆU QUẢ ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH ĐỐI
VỚI VACCINE H5N1 TRÊN ĐÀN GIA CẦM TẠI
HUYỆN ĐÔNG HẢI, HỒNG DÂN VÀ PHƯỚC LONG
CỦA TỈNH BẠC LIÊU

Giáo viên hướng dẫn :
TS. Trần Ngọc Bích
PGSTS. Lưu Hữu Mãnh

Sinh viên thực hiện :
Nguyễn Hoài Phong
MSSV : 3064603
Lớp : Thú y 32

Cần Thơ, Tháng 12/2010

1


TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG
BỘ MÔN THÚ Y

Đề Tài: Kểm tra hiệu quả đáp ứng miễn dịch đối với vaccine H5N1 trên gia cầm tại
huyện Đông Hải, Hồng Dân và Phước Long của tỉnh Bạc Liêu; do sinh viên: Nguyễn
Hoài Phong thực hiện tại Cơ quan Thú y vùng VII TP Cần Thơ từ tháng 10 năm 2010
đến tháng 11năm 2010.

Cần Thơ, ngày tháng
Duyệt Bộ môn

năm 2010

Cần Thơ, ngày tháng năm 2010
Duyệt giáo viên hướng dẫn

Cần Thơ, ngày
tháng
năm 2010
Duyệt Khoa Nông Nghiệp & Sinh Học Ứng Dụng

2


LỜI CẢM TẠ
Xin chân thành cảm ơn đến:
Cha mẹ và gia đình đã tạo mọi điều kiện thuận lợi cả về vật chất lẫn tinh thần
trong suốt thời gian học tập và thực hiện đề tài.
Thầy Trần Ngọc Bích và thầy Lưu Hữu Mãnh đã tận tình dạy dỗ, hướng dẫn và
giúp đỡ tôi xuyên suốt thời gian thực hiện đề tài.
Thầy Đỗ Trung Giã (cố vấn học tập) đã giúp đỡ, động viên tôi trong quá trình
học tập và làm đề tài.

Thầy cô trong Bộ Môn Thú Y đã giúp đỡ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực
hiện đề tài.
Anh Tiền Ngọc Tiên và các anh chị trong phòng chẩn đoán xét nghiệm – Cơ
quan thú y vùng VII Cần Thơ, đã nhiệt tình giúp đỡ và động viên tôi trong thời gian
làm luận văn.
Các bạn lớp Thú Y khoá 32 đã giúp đỡ và động viên tôi trong suốt thời gian của
khoá học và thực hiện đề tài.
Cần thơ, ngày

3

tháng

năm 2010


MỤC LỤC
Trang
Trang tựa............................................................................................................ 1
Trang duyệt........................................................................................................ 2
Lời cảm tạ……………………………………………………………………. 3
Mục lục………………………………………………………………………. 4
Danh sách chữ viết tắt………………………………………………………... 6
Danh mục bảng………………………………………………………………. 7
Danh mục hình………………………………………………………………. 8
Tóm lược…………………………………………………………………….. 9
Chương 1 : ĐẶT VẤN ĐỀ...…………………………………………………. 10
Chương 2 : CƠ SỞ LÝ LUẬN...……………………………………………... 11
2.1. Giới thiệu về tình hình bệnh cúm gia cầm ................................ 11
2.2 Căn bệnh học ................................................................................ 12

2.2.1 Hình thái - cấu trúc.................................................................... 12
2.2.2 Sức đề kháng của virus............................................................... 13
2.3 Dịch tể học.................................................................................. 13
2.3.1 Động vật cảm nhiễm .................................................................. 13
2.3.2 Tuổi gia cầm mắc bệnh .............................................................. 14
2.3.3 Mùa phát bệnh ........................................................................... 14
2.3.4 Phân bố dịch bệnh...................................................................... 14
2.3.5 Nguồn lây bệnh.......................................................................... 14
2.3.6 Phương thức truyền lây mầm bệnh ............................................. 15
2.4 Triệu chứng và bệnh tích............................................................... 16
2.4.1 Ở gà ........................................................................................... 16
2.4.2 Ở vịt và ngan.............................................................................. 16
2.5 Chẩn đoán..................................................................................... 16
2.6.1 Chẩn đoán lâm sàng ................................................................... 16
2.5.2 Chẩn đoán phòng thí nghiệm...................................................... 17
2.6 Biện pháp phòng chống bệnh ........................................................ 17
2.6.1 Về chăn nuôi.............................................................................. 17
2.6.2 Giám sát dịch bệnh..................................................................... 17
2.6.3 Tiêm phòng vaccine cúm gia cầm .............................................. 17
2.6.3.1Vaccine ......................................................................... 17
2.6.3.2 Nguyên lý cơ bản sử dung vaccin cúm gia cầm ............ 18
2.6.3.3 Quy định về việc tiêm phòng vaccine cúm gia cầm tại Việt Nam
................................................................................................. 18
2.6.4 Giám sát sau tiêm phòng ............................................................ 19
Chương 3 Phương tiện và phương pháp thí nghiệm ....................................... 20
3.1 Phương tiện nghiên cứu ................................................................ 20

4



3.1.1 Thời gian, địa điểm và đối tượng nghiên cứu ............................. 20
3.1.2 Dụng cụ và hóa chất................................................................... 20
3.2 Phương pháp nghiên cứu............................................................... 20
3.2.1 Qui trình phát hiện kháng thể cúm gia cầm bằng phản ứng ức chế ngưng
kết hồng cầu (HI)........................................................................................... 23
3.2.2 Chuẩn độ kháng nguyên cúm gia cầm (HA) ............................... 24
3.2.3 Tiến hành phản ứng HI .............................................................. 25
3.2.4 Phương pháp xử lý thống kê....................................................... 25
Chương 4: kết quả và thảo luận ..................................................................... 27
4.1 Kết quả kiểm tra huyết thanh học trên gà ...................................... 27
4.1.1 Huyện Hồng Dân ....................................................................... 27
4.1.2 Huyện Đông Hải ........................................................................ 29
4.1.3 Phước Long ............................................................................... 31
4.2 Kết quả kiểm tra huyết thanh học trên vịt...................................... 33
4.2.1 Huyện Hồng Dân ....................................................................... 33
4.2.2 Huyện Đông Hải ........................................................................ 35
4.2.3 Huyện Phước Long .................................................................... 37
Chương 5: Kết luận và đề nghị ...................................................................... 40
5.1 Kết luận ........................................................................................ 40
5.2 Đề nghị ......................................................................................... 40
Tài liệu tham khảo......................................................................................... 41
Phụ chương ................................................................................................... 42

5


DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT
Hg: Hiệu giá
PBS: Dung dịch Phosphate Buffer Saline
Ctv : cộng tác viên


6


DANH SÁCH BẢNG
Trang

Bảng 2.1 Tỷ lệ nhiểm bệnh cúm trên gà và thủy cầm qua các đợt dịch ( Văn Đăng Kỳ,
2008)
................................................................................................................................ 12
Bảng 3.1 Số mẫu lấy tại huyện Hồng Dân ........................................................... 21
Bảng 3.2 Số mẫu lấy tại huyện Đông Hải ............................................................ 22
Bảng 3.3 Số mẫu lấy tại huyện Phước Long ........................................................ 23
Bảng 4.1Kết quả kiểm tra huyết thanh học trên đàn gà tại huyện Hồng Dân
...............................................................................................................................28
Bảng 4.2 Kết quả kiểm tra huyết thanh học trên đàn gà tại huyện Đông Hải
...............................................................................................................................32
Bảng 4.3 Kết quả kiểm tra huyết thanh học trên đàn gà tại huyện Phước Long
...............................................................................................................................25
Bảng 4.4 Kết quả kiểm tra huyết thanh học trên đàn vịt tại huyện Hồng Dân
...............................................................................................................................34
Bảng 4.5 Kết quả kiểm tra huyết thanh học trên đàn vịt tại huyện Đông Hải
...............................................................................................................................36
Bảng 4.6 Kết quả kiểm tra huyết thanh học trên đàn vịt tại huyện Phước Long
...............................................................................................................................38

7


DANH SÁCH HÌNH

Trang
Hình 2.1 Dưới kính hiển vi, virus H5N1 như những chuỗi quả cầu màu xanh đang tìm
cách phá hủy các tế bào màu hồng.
...............................................................................................................................13
Hình 2.2 Sơ đồ khả năng tiếp xúc trực tiếp và gián tiếp giữa gia cầm mắc bệnh và
không mắc bệnh.
...............................................................................................................................15
Hình 3.1 Kết quả phản ứng HI................................................................................26
Hình 4.1 Phân bố hiệu giá kháng thể kháng virus cúm gia cầm trên đàn gà tại huyện
Hồng Dân
...............................................................................................................................29
Hình 4.2 Phân bố hiệu giá kháng thể kháng virus cúm gia cầm trên đàn gà tại huyện
Phước Long
............................................................................................................................ 33
Hình 4.3 Phân bố hiệu giá kháng thể kháng virus cúm gia cầm trên đàn vịt tại huyện
Hồng Dân
...............................................................................................................................35
Hình 4.4 Phân bố hiệu giá kháng thể kháng virus cúm gia cầm trên đàn vịt tại huyện
Đông Hải
............................................................................................................................ 37
Hình 4.5 Phân bố hiệu giá kháng thể kháng virus cúm gia cầm trên đàn vịt tại huyện
Phước Long
...............................................................................................................................39

8


TÓM LƯỢC
Đề tài:” Kiểm tra hiệu quả đáp ứng miễn dịch đối với vaccine H5N1 và H5N2 trên
đàn gia cầm tại Hồng Dân, Đông Hải và Phước Long của tỉnh Cà Mau ” được thực

hiện từ tháng 08/2010 đến tháng 11/2010, tại phòng chẩn đoán xét nghiệm huyết thanh
của Cơ Quan Thú Y Vùng VII Cần Thơ. Chúng tôi tiến hành xét nghiệm 196 mẫu
huyết thanh trong đó có 96 mẫu huyết thanh gà và 100 mẫu huyết thanh vịt bằng
phương pháp ngăn trở ngưng kết hồng cầu với kháng nguyên virus cúm H5N1 do
Trung Quốc sản xuất. Dựa theo tiêu chí đánh giá của Cục Thú Y, số mẫu dương tính
được lấy ở mức hiệu giá HI≥ 1/16, tỉ lệ bảo hộ phải đạt ít nhất 70% số mẫu có hiệu giá
HI ≥1/6. Kết quả ghi nhận được: Tỉ lệ bảo hộ bình quân của đàn gà sau khi tiêm phòng
vaccine H5N1 tại huyện Hồng Dân, Đông Hải và Phước Long lần lượt là 1.27%, 75%
và 68,89%. Tỉ lệ bảo hộ bình quân trên đàn vịt sau khi tiêm phòng H5N1 tại huyện
Hồng Dân, Đông Hải và Phước Long lần lượt là 38%, 84,03% và 97,65%. Hiệu giá
kháng thể trên đàn gà, vịt phân bố nhiều ở mức hiệu giá gồm 1/128, 1/256 và 1/512.

9


CHƯƠNG I
ĐẶT VẤN ĐỀ
Dịch cúm gia cầm xuất hiện ở Việt Nam từ năm 2003 đến nay đã gây thiệt hại
lớn cho nền chăn nuôi nước ta. Bệnh cúm gia cầm (Avian Influenza) hiện đang xuất
hiện trên các loài gia cầm ở Việt Nam là do virus độc lực cao chủng H5N1 gây ra
thuộc nhóm virus cúm A (Influenzavirus A), họ Orthomyxoviridae. Bệnh có tốc độ
lây lan rất nhanh với tỷ lệ chết cao trong đàn gia cầm mắc bệnh, chủ yếu ở gà
và gà tây. Những loài chim hoang và thuỷ cầm (vịt, ngan, ngỗng) được xem như là
nguồn tồn trữ mầm bệnh chính lây sang đàn gia cầm nuôi. Đặc biệt bệnh có khả năng
gây bệnh trện người và co một số trường hợp tử vong trên thế giới. Do đo các biện
pháp phòng chống dịch được triển khai áp dụng ngay từ đầu như tiêu huỷ toàn bộ,
cấm buôn bán, vận chuyển gia cầm bệnh và gia cầm trong khu vực có dịch; tiêu
độc, sát trùng, tăng cường các biện pháp an toàn sinh học,… đã góp phần khống
chế hiệu quả các đợt dịch. Mặc dù những biện pháp này đã cho kết quả nhất định
song rất tốn kém và gây thiệt hại lớn về kinh tế, gây ô nhiễm môi trường và không

mang lại hiệu quả mong nuốn trong điều kiện chăn nuôi nông hộ nhỏ lẻ như ở Việt
Nam (Tô Long Thành và ctv, 2008).
Cho đến nay, bệnh cúm gia cầm ch ưa được khống chế hoàn toàn và vẫn tái phát
lẻ tẻ ở nhiều địa phương. Cùng các biện pháp khống chế khác, tiêm phòng vaccine cúm
gia cầm được coi là một công cụ hữu hiệu trong việc khống chế và tiến tới thanh toán
dịch bệnh. Công tác tiếp theo sau tiêm phòng vaccine cho đàn gia cần là giám sát
huyết thanh sau tiêm phòng. Mục đích của việc giám sát sau tiêm phòng là đánh giá
hiệu quả và tỷ lệ vaccine H5N1 sau tiêm phòng; giám sát virus lưu hành và phát
hiện sự biến đổi đặc tính của virus.
Được sự giúp đỡ của Cơ Quan Thú Y vùng VII, sự chấp thuận của Khoa Nông
Nghiệp & SHƯD trường Đại học Cần Thơ chúng tôi thực hiện đề tài: “Kiểm tra hiệu
quả đáp ứng miễn dịch đối với vaccine H5N1 trên gia cầm tại huyện Đông Hải, Hồng
Dân và Phước Long của tỉnh Bạc Liêu”.
Mục tiêu đề tài là đánh giá hiệu quả đáp ứng miễn dịch của vaccine H5N1 trên
đàn gia cầm của huyện Đông Hải, Hồng Dân và Phước Long trên địa bàn tỉnh Bạc Liêu
sau tiêm phòng.

10


CHƯƠNG II
CƠ SỞ LÝ LUẬN
2.1 Giới thiệu về tình hình bệnh cúm gia cầm
Bệnh cúm gia cầm là bệnh truyền nhiễm cấp tính của loài gia cầm, do vius cúm
thuộc họ Orthomyxoviridae gây ra. Virus cúm được phân ra làm 2 loại: HPAI(High
Panthogenic Avian Influenza) là loại có độc lực cao và LPAI(Low Pathogenic Avian
Influenza) là loại có độc lực thấp. Sự phân loại này dựa trên cơ sở khả năng của víu gây
bệnh cho gia cầm(Tô Long Thành, 2004).
Bệnh cúm gia cầm chủng độc lực cao (High Pathogen Avian Influenza –
HPAI) hay còn gọi là bệnh cúm gà là một bệnh truyền nhiễm cấp tính rất nguy

hiểm, lây lan nhanh với tỷ lệ chết cao, do đó bệnh được tổ chức Dịch tể thế giới(OIE)
xếp vào bảng A – bảng danh mục các bệnh truyền nhiễm nguy hiểm. Bệnh này có thể
lây lan hầu hết cho các loài gia cầm như: gà, vịt, ngan, ngỗng, gà tây, đà điểu, chim
hoang dã, nhiều loài động vật có vú và con người (Tô Long Thành, 2004).
Tình hình cúm gia cầm trên thế giới và ở Việt Nam
Năm 1878, Perroncito lần đầu tiên mổ tả trận dịch tả gà ở Ý gây ra bởi chủng
virus cúm có tính gây bệnh cao.
Năm 1901, Centanni và Savunozzi xác định được nguyên nhân gây bệnh là tác
nhân qua lọc.
Năm 1955, Schafer xếp virus gây bệnh dịch tả ở gà, gà tây và một số loài gia
cầm khác với tỷ lệ chết cao vào nhóm virus cúm type A với H7N1 và H7N7.
Năm 1959, các chủng virus thuộc type phụ H5 cũng được phân lập từ trận dịch
gây chết nhiều gia cầm ở Scotland.
Năm 1997, dịch cúm gà xảy ra ở Hong Kong được xác định là do virus H5N1
Năm 2003 ở Châu Á dịch xảy ra trên diện rộng và đến tháng 2 năm 2004 đã có
11 nước thông báo có dịch: Hàn Quốc, Nhật Bản, Thái Lan, Campuchia, Việt Lào,
Indonesia, Trung Quốc, Hong Kong, Đài Loan và Pakistan.
(Hồ Thị Việt Thu, Năm 2006. Bệnh truyền nhiễm gia súc và gia cầm).
Dịch cúm gia cầm xuất hiện ở nước ta lần đầu vào cuối tháng 12/2003, tại trại
gà giống của công ty CP đóng tại xã Thủy Xuân Tiên, huyện Chương Mỹ, tỉnh Hà Tây.
Cùng thời gian này, dịch xảy ra ở 2 tỉnh Long An và Tiền Giang với tốc độ lây lan rất
nhanh, chỉ trong 2 tháng (đến tháng 2/2004), dịch đã xuất hiện 57/64 tỉnh, thành
trong cả nước. ( Văn Đăng Kỳ, 2008)

11


STT
1
2

3
4
5
6

Bảng 2.1 Tỷ lệ nhiễm bệnh cúm trên gà và thủy cầm qua các đợt dịch
Gà
Thủy cầm
Đợt
Thời gian
Số
Tỷ
Số
Tỷ
dịch
lượng(con)
lệ(%) lượng(con)
lệ(%)
Đợt 1
12/2003 – 03/2004
30.400.000 69,30
13.500.000
30,70
Đợt 2
04/2004 – 11/2004
55.999
87,30
8.132
12,70
Đợt 3

12/2004 – 05/2005
470.495
36,30
825.689
63,70
Đợt 4
10/2005 – 12/2005
1.338.523
38,50
2.135.116
61,50
Đơt 5
12/2006 – 12/2007
11.950
12,6
87.090
87,94
Đợt 6
01/2008 – 12/2008
60.090
39,10
36.592
60,90
( Văn Đăng Kỳ, 2008)

2.2 Căn bệnh học
2.2.1 Hình thái - cấu trúc
Virus gây bệnh cúm gia cầm là loại virus cúm type A, thuộc họ
Orthomyxoviridae, có hệ gen là ARN, chứa 8 phân đoạn.
Hạt virus (virion) có cấu trúc hình khối, đường kính khoảng 80 - 20 nm.

Phân tử lượng của hạt virion vào khoảng 250 triệu Dalton. Capsid nhân được
đặc trong một màng vỏ chứa nhiều protein nguồn gốc virus và lipid của tế bào vật chủ
bao gồm một số protein được glycosyl hóa (glycoprotein) và một số protein trần
không được glycosyl hóa (non – glycosylated protein). Protein bề mặt có cấu trúc từ
glycoprotein, đó là những gai, mấu có độ dài 10 – 14 nm, đường kính 4 – 6 nm.
Nucleocapsid bao bọc lấy nhân virus là tập hợp của nhiều protein phân đoạn, cấu trúc
đối xứng xoắn 130 – 150 nm, tạo vòm ở giới hạn cuối của mỗi phân đoạn và liên kết
với nhau qua cầu nối các peptid tạo vòm (loop) không gian đó. (Lê Thanh Hòa trích
dẫn từ Murphy và Webster, 1996).
Phân bố trên bề mặt của vius là loại protein gây ngưng kết hồng cầu là
HA (Hemaglutinin), tiếp đến là một loại protein có chức năng như một loại enzyme
pha hủy thụ thể của virus là NA (Neuraminidase). Chúng là các glycoprotein riêng
biệt, trong đó HA là sản phẩm do phân đoạn 4 (segment 4) tổng hợp, NA là protein
do ARN thông tin của phân đoạn 6 tổng hợp. Có 3 serotype ký hiệu là A,B và C được
phân biệt qua bản chất kháng nguyên NP (Nucleoprotein) và M (Matrix antigen).
Hình thái vi cấu trúc của của căn nguyên bệnh được Kawaoka(1988) và
Murphy mô tả khá chi tiết và nhấn mạnh rằng ARN của virus là một sợi đơn chia
thành 8 đoạn kế tiếp nhau mang 10 mật mã cho 10 loại virion protein khác nhau: HA,
NA, NP, M1, M2, PBI, PB2 và PA.
Thành phần hóa học của virus cúm gà:
ARN: 0,8-1,1%.

12


Protein: 70-75%.
Lipid: 20-24%.
Hydrocacbon: 5-8%.
Lipid tập trung ở màng virus và chủ yếu là virus có gốc phosphor, số còn lại là
cholesterol, glucolipid và một ít hydrocacbon gồm các loại enzyme galactose,

mannose, ribose, fructose, glucosamin.

Hình 2.1 Dưới kính hiển vi, virus H5N1 như những chuỗi quả cầu màu xanh
đang tìm cách phá hủy các tế bào màu hồng.
Nguồn:www.sinhhocvietnam.com.vn

2.2.2 Sức đề kháng của virus
Virus cúm gia cầm được bảo vệ trong vật chất hữu cơ như dịch tiết ở mũi, trong
phân làm tăng sức đề kháng của virus đối với tác nhân vật lý và hoá học. Virus thường
tồn tại lâu hơn trong môi trường ở nhiệt độ mát, ẩm độ cao. Virus cúm có thể tồn tại
trong phân 30-35 ngày ở nhiệt độ 4oC và 7 ngày ở 20oC (Lê Văn Năm, 2004).
Ngoài ra, trong tủ lạnh và tủ đá virus sống được hàng tháng.Tuy nhiên, ở nhiệt
0
độ 70 C chúng bị tiêu diệt trong vòng 3 phút. Chúng bị tiêu diệt dễ dàng dưới ánh sáng
mặt trời và các hóa chất sát trùng thông thường như: formol 3%, dung dịch NaOH 3 –
5%, nước vôi 10%, cồn 70 – 90o, acid fenic 5%,…. Người ta có thể dung các chất này
để tổng hợp tẩy uế chuồng trại, dụng cụ chăn nuôi và các thiết bị chăn nuôi khi cơ sở
chăn nuôi bị đe dọa.
2.3 Dịch tể học
2.3.1 Động vật cảm nhiễm

13


Phần lớn các loài chim thuần dưỡng (gà, vịt, ngan, ngỗng…) hoặc nhiều
loài chim hoang dã (đặc biệt các loại thủy cầm di cư) ở tất cả các lứa tuổi đều có thể
cảm nhiễm virus cúm, chúng có thể biểu hiện lâm sàng hoặc không.
Các loài thuỷ cầm hoang kể cả vịt, ngan, ngỗng có thể nhiễm virus cúm H5N1
nhưng ít có biểu hiện lâm sàng và chúng trở thành nguồn lây truyền tiềm ẩn cho
đàn gia cầm nuôi.

Trong nhiều nghiên cứu, ở một số loài heo, thỏ, chồn, mèo, chuột, ngựa...và con
người có biểu hiện nhiễm virus cúm A, H5N1. Hiện nay, virus cúm H5N1 đã gây ra
nhiều trường hợp tử vong ở người trên thế giới.
2.3.2 Tuổi gia cầm mắc bệnh
Theo Lê Văn Năm(2004):
Gà, ngan, vịt ở tất cả mọi lứa tuổi đều có nguy cơ bị bệnh cúm, nhưng bệnh
thường ở độ tuổi từ 4 - 6 tuần tuổi.
Cụ thể hơn:
Sớm nhất: Ở gà là 26 ngày tuổi, vịt là 28 ngày tuổi.
Muộn nhất: Ở gà là 10 tháng tuổi, ở vịt là 18 tháng tuổi.
2.3.3 Mùa phát bệnh
Theo Tô Long Thành( 2006) thì bệnh lây nhiễm quanh năm không phụ
thuộc vào mùa vụ. Nhưng người ta thường thấy các ổ dịch cúm gà xảy ra khi thời
tiết chuyển từ ấm áp sang lạnh, từ mùa thu sang mùa đông ở các nước Châu Á. Ngoài
ra còn có các loài chim di cư (vịt trời, ngỗng trời, quạ...) mang mầm bệnh từ phương
Bắc trong mùa đông giá lạnh, truyền cho các loài gia cầm ở các nước Đông và Nam
Á khi chúng đến trú đông
2.3.4 Phân bố dịch bệnh
Sự phân bố và lưu hành virus cúm gia cầm rất khó xác định chính xác. Sự phân
bố này bị ảnh hưởng của cả loài vật nuôi và chim hoang dã, tập quán chăn nuôi gia
cầm, mùa vụ và hệ thống báo cáo dịch bệnh. Bên cạnh đó, sự phân bố và lưu hành
virus cúm gia cầm đã xảy ra trong phạm vi toàn cầu do sự di trú của các loài
chim hoang. Do đó, rất khó dự đoán khi nào virus xuất hiện và gây thành dịch cho đàn
gia cầm nuôi (Theo Bùi Quang Anh, Văn Đăng Kỳ, 2006).
2.3.5 Nguồn lây bệnh
Các loài chim hoang và thủy cầm được xem như là nguồn tồn trữ mầm
bệnh chính lây sang đàn gia cầm nuôi. Virus cúm H5 độc lực thấp có thể lây nhiễm
vào đàn vịt nuôi và ngỗng sau đó lây nhiễm sang gà. Ở gà, virus này biến đổi thành
virus có độc lực cao trước khi lây nhiễm trở lại vịt và ngỗng. Ở các loài thuỷ
cầm, chủng virus này sẽ kết hợp với các virus khác và kết quả là tạo ra một chủng

virus mới lây nhiễm sang đàn gia cầm nuôi, người và đôi khi lây sang heo.
Tại Việt Nam, kết quả giám sát huyết thanh trên đàn gia cầm ở ĐBSCL
của Nguyễn Tiến Dũng và ctv (2005) kết luận tỷ lệ nhiễm virus cúm H5N1 lên đến
36,20%.

14


Qua đó cho thấy, trên thực tế số gia cầm nhiễm virus H5N1 nhưng không có
biểu hiện bệnh là rất lớn, nhất là đàn thuỷ cầm. Nhưng virus này có thể gây bệnh trở
lại sau khi phát sinh yếu tố làm giảm sức đề kháng của đàn gia cầm.
Bên cạnh đó, đã có nhiều nghiên cứu khẳng định gia cầm sống được bán ở chợ
có tỷ lệ nhiễm virus cúm cao và được xem như là nguồn lây bệnh quan trọng thứ hai
cho đàn gia cầm nuôi sau các loài chim hoang dã.
2.3.6 Phương thức truyền lây mầm bệnh
Theo Bùi Bá Bổng và ctv ( 2007) thì khi gia cầm nhiễm cúm, virus được nhân
lên trên đường hô hấp và đường tiêu hóa. Sự lây truyền bệnh được thực hiện theo 2
phương thức trực tiếp và gián tiếp:
Truyền trực tiếp giữa con mắc bệnh và con khỏe.
Lây trực tiếp do con vật mẫn cảm tiếp xúc với con vật mắc bệnh
thôngqua các hạt khí dung được thải ra từ đường hô hấp hoặc qua phân,thúc ăn, nước
uống có chứa mầm bệnh.
Lây gián tiếp qua các hạt khí dung trong không khí với khoảng cách gần
hoặc những dụng cụ chứa virus do gia cầm mắc bệnh bài thải qua phân hoặc
lây qua chim,thú, thức ăn, nước uống,lồng nhốt, quần áo, xe vận chuyển, côn tr ùng.
Truyền gián tiếp thông qua không khí, gió đưa bụi phân có chứa virus đi
xa, dụng cụ chăn nuôi, thức ăn nước uống, phân rác hoặc tay chân,giầy dép của ng ười
có tiếp xúc với gia cầm mắc bệnh v à vô tình truyền mầm bệnh đi nơi khác.
Như vậy, virus cúm gia cầm dễ dàng truyền tới những tới những vùng khác do
con người, phương tiện vận chuyển, dụng cụ chăn nuôi, ...

Tiếp xúc trực tiếp

Nuôi nhà có hàng
rào bao quanh
Chim hoang dã

Tiếp xúc gián tiếp

Quần, áo, giày, dép
Chuồng có
gia cầm
khỏe mạnh

Xe máy, xe đạp, ô tô

Chuồng
nuôi đã
nhiễm

Phân bón, nước ao hồ

Hình 2.2 Sơ đồ khả năng tiếp xúc trực tiếp và gián tiếp giữa gia cầm mắc bệnh
và không mắc bệnh.
(Bùi Bá Bổng, và ctv, 2007).

15


2.4 Triệu chứng và bệnh tích
Theo Lê Văn Năm (2005), các biểu hiện lâm sàng và bệnh tích chủ yếu

của bệnh cúm gia cầm tại Việt Nam như sau:
2.4.1 Ở gà
Gà từ 3 tuần tuổi đến 2 tháng tuổi
Nước mắt, nước dải chảy giàn dụa. Gà rất khó thở, nên phải há miệng thở dốc.
Có một số con đầu và cổ bị co giật hoặc lắc lư không bình thường.
Cả đàn ăn giảm rõ rệt, uống nhiều nước và tiêu chảy nặng phân loãng trắng hoặc
loãng xanh. Sức khỏe đàn gà suy sụp nhanh, gà chết ồ ạt, tỷ lệ chết khá cao, thường từ
70 – 100% trong vòng 2 – 10 ngày.
Mào và tích gà thường bị thâm tím và quăn lại, xuất huyết dưới da ống chân, kẻ
ngón chân là biểu hiện đặc trưng. Gà từ 3 – 10 tháng tuổi, đặc biệt là gà sắp đẻ và đang
đẻ
Đàn gà đang bình thường bỗng nhiên thấy vài con sốt cao, ăn kém đi,
uống nhiều nước và tiêu chảy phân loãng trắng lẫn loãng xanh. Các biểu hiện thần
kinh khá rõ, gà chạy tán loạn, thường hay lắc đầu, có con bỗng dưng nhảy xốc lên rồi
chết.
Mào và tích bị thâm tím, phù nề rất nhanh và thấy rõ xuất huyết dưới da ống
chân, kẽ ngón chân, rìa mép mào và tích.
Khí quản viêm xuất huyết chứa nhiều đờm và đôi khi lẫn máu. Xuất huyết mỡ
bụng, mỡ màng treo ruột, mỡ bao tim thấy rất rõ, đây là một trong những bệnh
tích điển hình của bệnh.
2.4.2 Ở vịt và ngan
Các biểu hiện giống như ở gà nhưng khác với gà là các triệu chứng hô hấp nhẹ
hơn. Bệnh kéo dài 1 - 7 ngày và tỷ lệ chết gần như 100% số ngan, vịt có trong chuồng.
Rất nhiều ngan, vịt lười vận động, sau đó bị bại chân, bại cánh đi không vững,
run rẩy, đầu và cổ vươn dài lắc lư về các phía. Con vật mắc bệnh bị tiêu chảy nặng,
phân loãng trắng như phân cò, đôi khi có phân trắng xanh, xung quanh lỗ huyệt bẩn.
Các biến đổi bệnh tích đại thể của bệnh cúm gia cầm trên ngan và vịt về cơ bản cũng
giống như ở gà. Tuy nhiên, tần suất biến đổi tập trung chủ yếu thấy ở phổi, tim,buồng
trứng và sau cùng mới là tiêu hóa.
2.5 Chẩn đoán

Để chẩn đoán chính xác bệnh cúm gia cầm thể độc lực cao H5N1, chủ yếu là
dựa vào chẩn đoán lâm sàng, dịch tễ học của bệnh kết hợp với chẩn đoán phòng thí
nghiệm.
2.5.1 Chẩn đoán lâm sàng
Dựa vào đặc điểm dịch tễ là nhiều loại gia cầm ở mọi lứa tuổi mẫn cảm với
bệnh, tỷ lệ mắc bệnh và tỷ lệ chết cao.
Các triệu chứng điển hình gồm: thở khó, thở dốc, viêm mũi, phù nề mặt và đầu,
phù thủng, xuất huyết ở da chân và ngón chân, triệu chứng thần kinh,…

16


Bệnh tích ở mào và tích rất điển hình: thâm tím, sưng tấy, phù nề, xuất huyết.
Viêm xuất huyết và hoại tử ở tim, gan, lách, thận, phổi, tụy. Xuất huyết ở mỡ bụng,
mỡ tim, mỡ màng treo ruột, niêm mạc hậu môn, dưới da, cơ đùi, lồng ngực,..
(Hồ Thị Việt Thu, 2006)
2.5.2 Chẩn đoán phòng thí nghiệm
Phát hiện virus
Phân lập virus trên trứng gà có phôi
Phương pháp Reverse Transcription – Polymerase Chain Reaction (RT-PCR)
Phát hiện kháng thể
Phương pháp Agar Gel Immunodiffusion (AGID)
Phản ứng Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA)
Phương pháp Intravenous Pathogenicity Index (IVPI)
Phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu - Haemagglutination (HI)
2.6 Biện pháp phòng chống bệnh
2.6.1 Về chăn nuôi
Gia cầm nuôi phải có nguồn gốc rõ ràng, xác nhận của cơ quan thú y. Cho gia
cầm ăn uống đầy đủ, nuôi hợp vệ sinh. Chủ động tiêm phòng vaccine, áp dụng các
biện pháp an toàn sinh học trong chăn nuôi. Gia cầm phải được nuôi nhốt trong phạm

vi gia đình, không thả tự do trong thôn ấp. Nếu nuôi vịt chạy đồng phải báo cáo với
chính quyền địa phương, bắt buộc phải tiêm phòng đầy đủ.
2.6.2 Giám sát dịch bệnh
Trong vùng chưa có dịch: khi có gia cầm bị bệnh và chết, hộ chăn nuôi phải báo
cáo ngay cho trưởng thôn, ấp hoặc cán bộ thú y cơ sở.
Trong vùng có dịch
Thế nào là một ổ dịch cúm gia cầm? Theo quy định của Bộ nông nghiệp
và phát triển nông thôn (2007) ổ dịch cúm gia cầm là một nơi đang có bệnh cúm gia
cầm xảy ra gồm một hoặc nhiều hộ chăn nuôi gia đình, trại chăn nuôi gia cầm tại thôn,
ấp, xã, phường và khu vực liền kề nơi có gia cầm mắc bệnh. Sau khi phát hiện ổ dịch
cúm gia cầm tuyệt đối không nên chữa trị đàn gia cầm, không bán chạy, phân tán gia
cầm ra khỏi vùng dịch, vứt xác gia cầm ra ngoài thiên nhiên như ao, hồ, kênh, rạch,
ruộng, vườn.
2.6.3 Tiêm phòng vaccine cúm gia cầm
2.6.3.1Vaccine
Theo Lê Văn Hùng (2002), vaccine là những chế phẩm chứa kháng nguyên vi
sinh vật dùng để kích thích hệ thống miễn dịch đặc hiệu hoạt động.
Khi mầm bệnh được giết chết (trường hợp này gọi là vaccine vô hoạt hoặc
vaccine chết) hay mầm bệnh được làm yếu đi (gọi là vaccine sống hay vaccine nhược
độc). Khi vaccine được đưa vào cơ thể , nó không có khả năng gây được bệnh hoặc chỉ
gây một bệnh rất nhẹ, không có hại cho con vật. Trái lại, nó gây cho cơ thể con vật một
phản ứng, tạo cho con vật được bảo hộ chống lại bệnh, phản ứng đó gọi là đáp ứng

17


miễn dịch. Đáp ứng miễn dịch tạo trong cơ thể con vật những chất gọi là kháng thể.
Kháng thể hiện diện trong huyết thanh, miễn dịch này gọi là miễn dịch dịch thể.
Ngày nay do tiến bộ của khoa học kỹ thuật, cách điều chế vaccine đã có những
tiến bộ vượt bậc làm cho vaccine có tác dụng tốt hơn, đặc hiệu hơn. Tuy nhiên những

yêu cầu của vaccine phải có tính sinh miễn dịch,tính kháng nguyên, tính hiệu lực và
tính vô hại.
2.6.3.2 Nguyên tắc cơ bản trong sử dụng vaccine cúm gia cầm
Phải tuân thủ những quy định của tổ Chức Dịch Tể Thế Giới (OIE) về sử
dụng vaccine cúm gia cầm.
Chuẩn bị đủ vaccine, chỉ dùng vaccine sản xuất theo công nghệ phù hợp với các
hướng dẩn của OIE.
Phải xem việc sử dụng vaccine như là một trong những biện pháp để khống chế,
tiến tới thanh toán dịch bệnh. Do đó các biện pháp an toàn sinh học trong chăn nuôi,
quy hoạch chăn nuôi, giảm mật độ đàn đặc biệt là thủy cầm phải được tiến hành đồng
thời.
Chỉ tiêm phòng vaccine cho các đàn gà, vịt khỏe mạnh; Nếu trong vùng tiêm
phòng đã có dịch xảy ra thì ít nhất là 60 ngày không phát sinh thêm ổ dịch mới.
Trong trường hợp có dịch mới xảy ra, ngoài biện pháp tiêu hủy ổ dịch, biện
pháp tiêm phòng bao vây sung quanh ổ dịch phải được thực hiện.
2.6.3.3 Quy định về việc tiêm phòng vaccine cúm gia cầm tại Việt Nam
Khái niện tiêm phòng
Tiêm phòng là đồng nghĩa với việc gây miễn dịch chủ động nhằm giúp
cho cá thể có khả năng tạo ra một cơ chế bảo vệ chống lại sự xâm nhập của một
cơ thể xâm lược hoặc độc tố của nó. Đặc điểm quan trọng của việc tiêm phòng
vaccine là phải đảm bảo mức độ an toàn, không gây bệnh nhưng phải tạo ra cho
cá thể tiếp thu được tính miễn dịch khi có tác nhân hoang dại xâm nhập.
Đối tượng tiêm phòng
Phạm vi đối tượng áp dụng: gà giống cụ kị, ông bà, bố mẹ, gà trứng
thương phẩm, gà thịt nuôi từ 70 ngày trở lên, vịt giống, vịt đẻ trứng thương
phẩm, gà chọi. Không tiêm phòng cho bồ câu, chim cút, vịt xiêm.
Đối tượng áp dụng: tất cả các tổ chức, cá nhân có hoạt động chăn nuôi
gia cầm trên lãnh thổ Việt Nam.
Chế độ tiêm phòng
Tại Việt Nam, lịch tiêm vaccine cúm gia cầm trong năm gồm 2 đợt chính.

Đối với gà: sử dụng vaccine chết chủng H5N1 của Trung Quốc tiêm cho
gà 15 ngày tuổi trở lên, tiêm 1 mũi, sau 4 tháng tiêm nhắc lại. Vaccine Trovac –
AIV H5 (vaccine sống đậu gà - cúm gia cầm) dùng cho gà con một ngày tuổi ấp
nở công nghiệp trước khi chuyển đi nuôi ở các trang trại theo hình thức chăn
nuôi công nghiệp.

18


Đối với vịt: sử dụng vaccine chết chủng H5N1 của Trung Quốc tiêm cho
vịt 15 ngày tuổi trở lên, tiêm lần 2 cách lần đầu 4 tuần và sau 4 tháng tiêm nhắc
lại.
2.6.4 Giám sát sau tiêm phòng
Mục đích của việc giám sát sau tiêm phòng là nhằm đánh giá hiệu quả và tỷ lệ
tiêm phòng, giám sát virus lưu hành và phát hiện được sự biến đổi đặc tính của virus.
Thực hiện các hoạt động giám sát:
Xét nghiệm huyết thanh học sau tiêm phòng, mục đích chính của hoạt động này
nhằm đánh giá liệu việc tiêm phòng trên thực địa có mang lại mức miễn dịch bảo hộ
thích hợp cho gia cầm hay không.
Đánh giá trước tiêm phòng, việc đánh giá đáp ứng miễn dịch trên gia cầm có thể
sẽ gặp khó khăn khá nhiều do đàn gia cầm đã có kháng thể. Như vậy, cần thiết phải so
sánh hiệu giá kháng thể trước và sau tiêm phòng.
Đánh giá sau tiêm phòng
Lấy mẫu ở gà và vịt được tiêm phòng nhắc lại hoặc được tiêm phòng lần đầu. Mỗi
đàn lấy 5 mẫu. Thời điểm lấy mẫu sau 01 tháng kể từ khi gia cầm được tiêm phòng đầy
đủ số lần tiêm theo quy định. Sử dụng phương pháp ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI)
để xác định hiệu giá kháng thể của gia cầm được tiêm phòng.Tiêu chí đánh giá là hiệu
giá HI ≥1/16 (4log2) được coi là hiệu giá bảo hộ của cá thể gia cầm; đàn gia cầm được
bảo hộ là đàn có ≥ 70% số cá thể có hiệu giá HI ≥1/16 (4log2).


19


CHƯƠNG III
PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM
3.1 Phương tiện nghiên cứu
3.1.1 Thời gian, địa điểm và đối tượng nghiên cứu
Thời gian nghiên cứu: từ tháng 08/2010 đến tháng 11/2010.
Địa điểm nghiên cứu: Trung tâm Thú y vùng VII Cần Thơ – Phòng xét nghiệm
huyết thanh học.
Đối tượng nghiên cứu: huyết thanh trên đàn gà, vịt tại huyện Đông Hải, Hồng
Dân và Phước Long thuộc tỉnh Bạc Liêu.
3.1.2 Dụng cụ và hóa chất
Dụng cụ: tủ lạnh; tủ ấm; tủ sấy; máy ly tâm; máy lắc; nồi hấp cách thủy; pipet:
1ml, 5ml, 10ml; type nhựa chắc huyết thanh; máng nhựa; đĩa làm phản ứng ngưng kết.
( đáy hình chữ U hoặc V).
Hóa chất: kháng nguyên cúm vô hoạt H5N1 (H5N1Inactivated Ag/Vet Lab
Agency/UK); hồng cầu gà 0,5%; nước cất vô trùng; dung dịch Phosphate Buffer Soline
(PBS); nước sinh lý 0,85% NaCl.
Pha chế một số dung dịch
Dung dịch chống đông (dung dịch Alsever): Glucose 20,5g; NaCl 4,2g; Solium
Citrate 8g; nước cất vừa đủ 1000ml.
Dung dịch Phosphate Buffer Saline (PBS): dung dịch PBS được pha từ 8g NaCl
+ 0,2g KCl +1,15g NaHPO4 + 0,2g KH2PO4 trong 1000ml nước cất, điều chỉnh pH
dung dịch về 7,2 bằng NaOH 0,1M và 0,01M sau đó hấp vô trùng ở 1210C trong 30
phút.
Nước muối sinh lý 0,85% NaCl: pha 8,5g NaCl trong 1000ml, điều chỉnh pH về
7,2 bằng NaOH 0,1M và 0,01M sau đó hấp khử trùng ở nhiệt độ 1210C trong thời gian
15 phút.
3.2 Phương pháp nghiên cứu

Cách lấy mẫu xét nghiệm: sát trùng nhẹ nơi tĩnh mạch cánh gia cầm, sau đó
dùng bơm tiêm vô trùng ghim vào lòng tĩnh mạch và rút máu ra từ từ. Đối với mỗi cá
thể gia cầm lấy khoảng 2 – 3 ml máu. Để nghiêng ống bơm chứa mẫu ước chừng
khoảng 450 so với mặt đất, để yên mẫu trong 20 phút, sau đó cho vào túi nylon cột chặt
lại.
Bảo quản và vận chuyển mẫu xét nghiệm: Bảo quản trong thùng lạnh có đá, sau
đó chuyển đến phòng xết nghiệm trong ngày
Tổng số mẫu xét nghiệm là 487 mẫu.

20


Bảng 3.1 Số mẫu được lấy tại huyện Hồng Dân

Tên xã

Số mẫu

Gia cầm

Ngày tiêm phòng

Ngày lấy mẫu

10

Gà

15 – 16/7/2010


17/8/2010

30

Vịt

16 – 18/7/2010

17/8/2010

10

Gà

8/7/2010

17/8/2010

30

Vịt

15-16/7/2010

17/8/2010

20

Gà


15-16/7/2010

18/8/2010

29

Vịt

10-12/7/2010

18/8/2010

20

Gà

6-8/5/2010

18/8/2010

30

Vịt

7-8/6/2010

18/8/2010

Lộc Ninh


Ninh Thạnh
Lợi

Ninh Thạnh
Lợi A

Vĩnh Lộc

21


Bảng 3.2 Số mẫu được lấy tại huyện Đông Hải

Tên xã

Số mẫu

Gia cầm

Ngày tiêm phòng

Ngày lấy mẫu

20

Gà

1 – 4/6/2010

17/8/2010


20

Vịt

14 – 20/6/2010

17/8/2010

20

Gà

22/6/2010

17/8/2010

20

Vịt

19 – 18/6

18/8/2010

19

Gà

26/5/2010


18/8/2010

20

Vịt

17/6/2010

18/8/2010

20

Gà

15/6/2010

17/8/2010

30

Vịt

23 – 25/2010

17/8/2010

An Phú

An Trạch


Định Thành

Long Điền

22


Bảng 3.3 Số mẫu được lấy tại huyện Phước Long

Tên xã

Số mẫu

Gia cầm

Ngày tiêm phòng

Ngày lấy mẫu

30

Gà

30/6/2010

5/8/2010

30


Vịt

29/6/2010

5/8/2010

20

Gà

23/6/2010

5/8/2010

20

Vịt

25/6/2010

5/8/2010

20

Gà

25/6/2010

4/8/2010


20

Vịt

29/6/2010

4/8/2010

15

Gà

1/7/2010

6/8/2010

15

Vịt

1/7/2010

6/8/2010

Vĩnh Thanh

Hưng Phú

Vĩnh Phú


Thị trấn
Phước Long

3.2.1 Qui trình phát hiện kháng thể cúm gia cầm bằng phản ứng ức chế ngưng kết
hồng cầu (HI)
Qui trình phát hiện kháng thể cúm gia cầm bằng phản ứng ức chế ngưng kết
hồng cầu gồm có các bước sau:
Chuẩn bị mẫu huyết thanh xét nghiệm.
Chuẩn bị hồng cầu gà 10% và 0,5%.
Chuẩn độ kháng nguyên cúm gia cầm (HA).
Chuẩn bị dung dịch kháng nguyên 4 đơn vị (4HAU) 25 µl cho phản ứng
HI.
Tiến hành phản ứng HI.
Chuẩn bị mẫu huyết thanh xét nghiệm
Pha loãng mẫu huyết thanh bằng dung dịch PBS với tỷ lệ một phần mẫu
huyết thanh + ba phần PBS (30 µl huyết thanh + 90 µl PBS).

23


Thêm 5 – 10 µl hồng cầu 10% vào tất cả các giếng của đĩa pha loãng mẫu,
ủ ở nhiệt độ phòng 30 – 60 phút hoặc trong ngăn mát tủ lạnh (4-80C) 2-3 giờ.
Lấy 50 µl huyết thanh để làm xét nghiệm ( 25 µl làm đối chứng huyết
thanh, 25 µl làm xét nghiệm).
Chuẩn bị hồng cầu gà (Red Blood Cells – RBC) 10% và 0,5%.
Chọn 2 – 3 con gà khỏe mạnh.
Lấy máu ở 2 – 3 con gà trộn lại khoảng 4 – 5 ml, có chất kháng đông.
Thêm một lượng tương đương PBS vào máu gà vừa lấy, lắc đều.
Ly tâm ở 1500 – 2000 vòng/phút khoảng 10 phút.
Loại bỏ nước ở bên trên.

Lặp lại bước 3,4,5 làm 3 lần. Sau bước 5 của lần 3, cho thêm 10 ml PBS và
lắc đều để thu hoạch hồng cầu.
Dùng phương pháp Micro Haematorit để đo tỉ lệ hồng cầu.
Dùng công thức:
V1* C1 = V2 * C2, để pha hồng cầu 10%.
Trong đó: - V1, C1: là thể tích và nồng độ hiện có.
- V2, C2: là thể tích và nồng độ cần dùng.
Từ hồng cầu 10%, áp dụng công thức trên tính pha hồng cầu 0,5% (hoặc từ
hồng cầu 10% pha 1/20 với PBS sẽ được hồng cầu 0,5%)
3.2.2 Chuẩn độ kháng nguyên cúm gia cầm (HA)
Nguyên lý: Trên bề mặt virus cúm có cấu trúc kháng nguyên Haemagglutination
có khả năng kết hợp với các thụ thể trên bề mặt hồng cầu của các loài gà, ngỗng,... làm
ngưng kết các loại hồng cầu này.
Tiến hành:
Chọn 3 hàng 12 giếng trong đĩa Microplate có 96 giếng (đáy chữ U hay chữ
V), có ký hiệu A, B, C.
Cho 25 µl PBS vào giếng 1 đến giếng 12 (hàng A, B, C).
Cho 25 µl kháng nguyên cúm vào giếng A1 và B1.
Dùng Micropipette trộn đều ở giếng A1 và B1, lấy 25 µl từ giếng A1 và B1
chuyển sang giếng A2 và B2, trộn đều.
Lặp lại bước 4 cho đến giếng A12 và B12, ở A12 và B12 bỏ đi 25 µl.
Thêm 25 µl PBS vào tất cả các giếng của hàng A, B, C.
Thêm 50 µl hồng cầu 0,5% vào tất cả các giếng (A1 – A12, B1 – B12, C1 –
C12), lắc nhẹ bằng tay.
Ủ ở 40C trong 30 – 45 phút.
Đọc kết quả: Hiệu giá kháng nguyên – một đơn vị ngưng kết hồng cầu
(1HAU) là độ pha loãng cao nhất có 100% hồng cầu ngưng kết. Kết quả chỉ được ghi
nhận khi hồng cầu ở hàng đối chứng hồng cầu (hàng A, từ A1 – A12) hoàn toàn không
ngưng kết.
Chuẩn bị dung dịch kháng nguyên 4 đơn vị (4HAU) 25 µl cho phản ứng HI


24


Nguyên lý: Một số loại virus như cúm, virus newcaslte có đặc tính gây ngưng
kết hồng cầu một số loại gia súc, gia cầm. Nếu gặp kháng thể đặc hiệu tương ứng, thì
virus bị kháng thể trung hòa, không còn virus để tiếp xúc với hồng cầu, hay nói cách
khác, kháng thể đã ngăn trở ngưng kết hồng cầu của virus. Hoặc ngược lại, nếu virus
không gặp kháng thể đặc hiệu tương ứng, virus sẽ không bị trung hòa bởi kháng thể và
virus sẽ làm hồng cầu ngưng kết lại với nhau.
Ví dụ: Giả sử hiệu giá của kháng nguyên 1 đơn vị (1HAU) là 1/256.
→ 4HAU/25 µl = (1/256) x 4 = 1/64
Phải kiểm tra dung dịch 4HAU trước khi tiến hành phản ứng HI.
3.2.3 Tiến hành phản ứng HI
Cho 25 µl PBS vào tất cả các giếng (từ A1 – H12).
Cho 25 µl huyết thanh (mẫu đã xử lý) vào các giếng H1 – H12 (dùng làm đối
chứng huyết thanh) và A1 – A12.
Từ giếng A1 – A12, dùng Micropipette trộn đều rồi lấy 25µl chuyển sang B1
– B12, tương tự từ giếng B1 – B12 chuyển sang giếng C1 – C12, lập lại đến giếng
G1 – G12, ở các giếng G1 – G12 chuyển bỏ đi 25 µl.
Ghi chú: - Đến bước này huyết thanh đã được pha loãng từ 1/8 – 1/512.
Tiến hành làm đối chứng hồng cầu cùng thời gian.
Cho 25 µl kháng nguyên 4 HAU vào các giếng từ A1 – G12, lắc đều.
Để ở nhiệt độ phòng 60 phút.
Cho 50 µl hồng cầu gà 0,5% vào tất cả các giếng từ A1 – H12.
Ủ 40C /45 phút.
Đọc kết quả: Hiệu giá kháng thể kháng virus Cúm gia cầm trong mẫu huyết
thanh đó có hiện tượng ức chế (ngăn trở) ngưng kết hồng cầu 100%.
Kết luận: mẫu huyết thanh được xem là có kháng thể kháng virus Cúm gia
cầm (dương tính) khi có hiệu giá kháng thể là > 1/8, subtype dương tính tùy thuộc vào

loại kháng nguyên sử dụng trong phản ứng.
Tỷ lệ phải đạt ít nhất 70% số mẫu có hiệu giá HI ≥1/16.
3.2.4 Phương pháp xử lý thống kê
Để xác định ý nghĩa, độ tin cậy và so sánh tỷ lệ bảo hộ giữa gà với gà, vịt với vịt
giữa các địa phương và so sánh sự khác nhau giữa gà với vịt chúng tôi dùng phương
pháp chi bình phương và phần mềm MINITAB Version 15 để xử lý số liệu.

25