TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG
-oOo-

NGÔ PHƯƠNG NGỌC

VI NHÂN GIỐNG CÂY NÁNG ĐẾ
(Beaucarnea recurvata Lem.)

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
Ngành: HOA VIÊN & CÂY CẢNH

Cần Thơ - 2011


TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG
-oOo-

NGÔ PHƯƠNG NGỌC

VI NHÂN GIỐNG CÂY NÁNG ĐẾ
(Beaucarnea recurvata Lem.)

LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP
Ngành: HOA VIÊN & CÂY CẢNH

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN
Ts. LÂM NGỌC PHƯƠNG

Cần Thơ - 2011

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG
BỘ MÔN SINH LÝ - SINH HÓA

Luận văn tốt nghiệp Hoa Viên & Cây Cảnh với đề tài:

“VI NHÂN GIỐNG CÂY NÁNG ĐẾ
(Beaucarnea recurvata Lem.)”

Do sinh viên NGÔ PHƯƠNG NGỌC thực hiện kính trình lên hội đồng chấm luận văn
tốt nghiệp.

Cần Thơ, ngày…..tháng…..năm 2011
Cán bộ hướng dẫn

Ts. Lâm Ngọc Phương

i


TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ
KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG
BỘ MÔN SINH LÝ - SINH HÓA

Hội đồng chấm Luận văn tốt nghiệp đã chấp thuận Luận văn tốt nghiệp đính kèm với
tên đề tài:

“VI NHÂN GIỐNG CÂY NÁNG ĐẾ

(Beaucarnea recurvata Lem.)”
Do sinh viên NGÔ PHƯƠNG NGỌC thực hiện và bảo vệ trước hội đồng chấm luận văn
tốt nghiệp và đã được thông qua.
Luận văn đã được hội đồng đánh giá ở mức: ……………
Ý kiến hội đồng:
……………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………
……………………………………………………………………………………………

Duyệt Khoa

Cần Thơ, ngày……tháng……năm 2011
Chủ tịch Hội đồng

Trưởng Khoa Nông Nghiệp & SHƯD

ii


LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của bản thân. Các số liệu, kết quả
được trình bày trong luận văn tốt nghiệp là trung thực và chưa từng được ai công bố
trong bất kỳ công trình luận văn nào trước đây.

Tác giả luận văn

Ngô Phương Ngọc

iii



LỜI CẢM TẠ
Kính dâng
Cha mẹ suốt đời tận tụy vì tương lai của con
Xin tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến
Cô Lâm Ngọc Phương đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn tôi trong suốt quá trình thực
hiện đề tài luận văn tốt nghiệp.
Thầy cố vấn Lê Văn Bé, cô Lê Hồng Giang cùng với quí thầy cô Khoa Nông Nghiệp và
Sinh Học Ứng Dụng đã tận tâm, dìu dắt, rèn luyện tôi suốt những năm học tại trường
Đại Học Cần Thơ.
Chân thành cảm ơn
Chị Lê Minh Lý và cùng với các anh chị, các bạn sinh viên trong phòng thí nghiệm
Nuôi Cấy Mô, Bộ Môn Sinh Lý-Sinh Hóa, Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng,
Trường Đại Học Cần Thơ đã hết lòng giúp đỡ.
Các bạn sinh viên lớp Hoa viên & cây cảnh K33 đã giúp đỡ động viên tôi trong những
năm tháng trên giảng đường Đại Học.

iv


TIỂU SỬ CÁ NHÂN
1. LÝ LỊCH
Họ và Tên:

Ngô Phương Ngọc

Ngày sinh:

19/01/1989


Nơi sinh:

Cần Thơ

Họ và Tên Cha:

Giới tính:

Nữ

Ngô Ngọc Hưng

Năm sinh:

1958

Họ và Tên Mẹ:

Lâm Ngọc Phương

Năm sinh:

1957

Quê quán:

Thành phố Cần Thơ

Nơi ở hiện nay: 30/2 CMT8, phường Cái Khế, quận Ninh Kiều, thành phố Cần

Thơ.
2. QUÁ TRÌNH HỌC TẬP
1995-2000 :

Trường Tiểu Tân An

2000-2004:

Trường Trung Học Cơ Sở Đoàn Thị Điểm

2004-2007 :

Trường Trung Học Phổ Thông Châu Văn Liêm

2007-2011 :
Trường Đại Học Cần Thơ, ngành Hoa Viên & Cây Cảnh, khóa 33,
khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng

Cần Thơ, ngày…..tháng…..năm 2011

Ngô Phương Ngọc

v


MỤC LỤC
Chương

Nội dung
Trang phụ bìa

Lời cam đoan
Lời cảm tạ
Tiểu sử cá nhân
Mục lục
Danh sách bảng
Danh sách hình
Danh sách chữ viết tắt
Tóm lược
MỞ ĐẦU

Chương 1 LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU

Trang
iii
iv
v
xi
ix
xi
xii
xiii
1
2

1.1 Sơ lược về cây Náng đế

2

1.1.1 Nguồn gốc


2

1.1.2 Phân loại- đặc điểm thực vật

2

1.1.3 Giá trị của cây Náng đế

3

1.2 Nuôi cấy mô và phương pháp vi nhân giống

3

1.2.1 Khái niệm về vi nhân giống

3

1.2.2 Vai trò của vi nhân giống

3

1.2.3 Môi trường nuôi cấy

4

1.2.4 Các giai đoạn của vi nhân giống

7


1.3 Một số kết quả nuôi cấy mô đã đượ nghiên cứu
Chương 2 PHƯƠNG TIỆN - PHƯƠNG PHÁP

10
12

2.1 Phương tiện

12

2.2 Phương pháp

13

2.2.1 Chuẩn bị môi trường nuôi cấy

13

2.2.2 Bố trí thí nghiệm

13

2.3 Phương pháp xử lý số liệu
Chương 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

14
15

3.1 Ghi nhận tổng quát về giai đoạn vô trùng mẫu


vi

15


3.2

Hiệu quả của BA trên sự nhân chồi Náng đế

15

3.2.1 Số chồi gia tăng

15

3.2.2 Chiều cao gia tăng

16

3.2.3 Số lá gia tăng

17

3.3 Hiệu quả của BA và NAA trên sự tạo rễ của chồi Náng đế

19

3.3.1 Đường kính mô sẹo ở gốc của chồi Náng đế

19


3.3.2 Tỷ lệ (%) ra rễ

22

3.3.3 Số rễ

26

3.3.4 Chiều dài rễ

28

3.3.5 Chiều cao gia tăng

30

3.3.6 Số lá gia tăng

36

3.4 Ảnh hưởng của giá thể lên sự thuần dưỡng cây Náng đế

35

3.4.1 Tỷ lệ sống (%)

42

3.4.2 Số rễ gia tăng


42

3.4.3 Chiều dài rễ gia tăng

43

3.4.4 Chiều cao gia tăng

44

3.4.5 Số lá gia tăng

45

3.5 Xây dựng quy trình vi nhân giống cây Náng đế
Chương 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ

47
48

4.1 Kết luận

48

4.2 Đề nghị

48

TÀI LIỆU THAM KHẢO


49

PHỤ CHƯƠNG 1
PHỤ CHƯƠNG 2

vii


DANH SÁCH BẢNG
Bảng

Tựa bảng

Trang

2.1

Tổ hợp các nghiệm thức của thí nghiệm 2

13

3.1

Số chồi Náng đế gia tăng trên môi trường có các nồng độ BA
khác nhau sau 1 – 5 tuần nuôi cấy

16

3.2


Chiều cao gia tăng (cm) của chồi Náng đế sau 1 – 5 tuần nuôi
cấy trong môi trường có các nồng độ BA khác nhau

17

3.3

Số lá gia tăng của chồi Náng đế trong môi trường có các nồng
độ BA khác nhau sau 1 – 4 tuần nuôi cấy

18

3.4

Đường kính mô sẹo ở gốc của chồi Náng đế sau 3 tuần nuôi cấy
trong môi trường có các nồng độ BA và NAA khác nhau

19

3.5

Đường kính mô sẹo ở gốc của chồi Náng đế sau 4 tuần nuôi cấy
trong môi trường có các nồng độ BA và NAA khác nhau

20

3.6

Đường kính mô sẹo ở gốc của chồi Náng đế sau 5 tuần nuôi cấy

trong môi trường có các nồng độ BA và NAA khác nhau

21

3.7

Tỷ lệ (%) ra rễ của chồi Náng đế sau 3 tuần nuôi cấy trong môi
trường có các nồng độ BA và NAA khác nhau

22

3.8

Tỷ lệ (%) ra rễ của chồi Náng đế sau 4 tuần nuôi cấy trong môi
trường có các nồng độ BA và NAA khác nhau

23

3.9

Tỷ lệ (%) ra rễ của chồi Náng đế sau 5 tuần nuôi cấy trong môi
trường có các nồng độ BA và NAA khác nhau

24

3.10

Tỷ lệ (%) ra rễ của chồi Náng đế sau 6 tuần nuôi cấy trong môi
trường có các nồng độ BA và NAA khác nhau


25

3.11

Số rễ của chồi Náng đế sau 5 tuần nuôi cấy trong môi trường có
các nồng độ BA và NAA khác nhau

26

3.12

Số lá gia tăng tương đối (%) trên môi trường có các nồng độ
TDZ và loại mẫu cấy khác nhau ở 2 TSKC

30

3.13

Số rễ của chồi Náng đế sau 6 tuần nuôi cấy trong môi trường có
các nồng độ BA và NAA khác nhau

27

3.14

Chiều dài rễ của chồi Náng đế sau 5 tuần nuôi cấy trong môi
trường có các nồng độ BA và NAA khác nhau

28


viii


3.15

Chiều dài rễ của chồi Náng đế sau 6 tuần nuôi cấy trong môi
trường có các nồng độ BA và NAA khác nhau

28

3.16

Chiều cao gia tăng (cm) của chồi Náng đế sau 1 tuần nuôi cấy
trong môi trường có các nồng độ BA và NAA khác nhau

30

3.17

Chiều cao gia tăng (cm) của chồi Náng đế sau 2 tuần nuôi cấy
trong môi trường có các nồng độ BA và NAA khác nhau

31

3.18

Chiều cao gia tăng (cm) của chồi Náng đế sau 3 tuần nuôi cấy
trong môi trường có các nồng độ BA và NAA khác nhau

32


3.19

Chiều cao gia tăng (cm) của chồi Náng đế sau 4 tuần nuôi cấy
trong môi trường có các nồng độ BA và NAA khác nhau

33

3.20

Chiều cao gia tăng (cm) của chồi Náng đế sau 5 tuần nuôi cấy
trong môi trường có các nồng độ BA và NAA khác nhau

34

3.21

Chiều cao gia tăng (cm) của chồi Náng đế sau 6 tuần nuôi cấy
trong môi trường có các nồng độ BA và NAA khác nhau

35

3.22

Số lá gia tăng của chồi Náng đế sau 1 tuần nuôi cấy trong môi
trường có các nồng độ BA và NAA khác nhau

36

3.23


Số lá gia tăng của chồi Náng đế sau 2 tuần nuôi cấy trong môi
trường có các nồng độ BA và NAA khác nhau

37

3.24

Số lá gia tăng của chồi Náng đế sau 3 tuần nuôi cấy trong môi
trường có các nồng độ BA và NAA khác nhau

38

3.25

Số lá gia tăng của chồi Náng đế sau 4 tuần nuôi cấy trong môi
trường có các nồng độ BA và NAA khác nhau

39

3.26

Số lá gia tăng của chồi Náng đế sau 5 tuần nuôi cấy trong môi
trường có các nồng độ BA và NAA khác nhau

40

3.27

Số lá gia tăng của chồi Náng đế sau 6 tuần nuôi cấy trong môi

trường có các nồng độ BA và NAA khác nhau

41

3.28

Tỷ lệ sống (%) của chồi Náng đế sau 3 tuần thuần dưỡng trên
các loại giá thể khác nhau

42

3.29

Số rễ gia tăng của chồi Náng đế sau 1 – 3 tuần thuần dưỡng trên
các loại giá thể khác nhau

43

3.30

Chiều dài rễ gia tăng (cm) của chồi Náng đế sau 1 – 3 tuần thuần
dưỡng trên các loại giá thể khác nhau

44

ix


3.31


Chiều cao gia tăng (cm) của chồi Náng đế sau 1 – 3 tuần thuần
dưỡng trên các loại giá thể khác nhau

45

3.32

Số lá gia tăng (cm) của chồi Náng đế sau 1 – 3 tuần thuần dưỡng
trên các loại giá thể khác nhau

46

x


DANH SÁCH HÌNH

Hình

Tựa hình

Trang

2.1

Vật liệu thực vật

12

3.1


Chồi Náng đế trong môi trường sau 5 tuần nuôi cấy với nồng độ
BA khác nhau

18

3.2

Mô sẹo ở gốc mẫu cấy

22

3.3

Số rễ chồi Náng đế trong môi trường có hoặc không bổ sung BA
kết hợp với các nồng độ NAA

27

3.4

Sự tạo rễ chồi Náng đế trên môi trường có hoặc không bổ sung
BA kết hợp với NAA

42

3.5

Náng đế sau 3 tuần thuần dưỡng trên các loại giá thể


47

3.6

Quy trình vi nhân giống cây Náng đế

48

xi


DANH SÁCH CHỮ VIẾT TẮT
BA
ctv.
EDTA
HgCl2
NAA
MS
TSKC

Benzyl adenin
Cộng tác viên
Ethylene diamine tetraacetic acid
Thủy ngân clorua
1-Naphthalene acetic acid
Murashige và Skoog (1962)
Tuần sau khi cấy

xii



NGÔ PHƯƠNG NGỌC. “Vi nhân giống cây Náng đế (Beaucarnea recurvata
Lem.)”. Luận văn tốt nghiệp kỹ sư ngành Hoa Viên & Cây Cảnh, Khoa Nông Nghiệp
và Sinh Học Ứng Dụng, Trường Đại Học Cần Thơ. Cán bộ hướng dẫn: Ts. Lâm Ngọc
Phương.

TÓM LƯỢC

Kỹ thuật nuôi cấy mô đã được áp dụng rất hiệu quả trong việc nhân giống các loài
quý hiếm, những cây đột biến và cây lai. Đề tài: “Vi nhân giống cây Náng đế
(Beaucarnea recurvata Lem.)” được thực hiện nhằm mục tiêu: Xác định được hiệu
quả của môi trường nuôi cấy trên sự sinh trưởng và phát triển cây Náng đế in vitro và
ex vitro; Xây dựng qui trình nhân giống, tạo vật liệu phục vụ cho công tác giống cây
hoa kiểng ở đồng bằng sông Cửu Long.
Đề tài gồm 3 thí nghiệm: Hiệu quả của BA lên sự nhân chồi; Hiệu quả của BA và
NAA lên sự tạo rễ của chồi Náng đế in vitro; Ảnh hưởng của giá thể lên sự thuần
dưỡng cây Náng đế. Kết quả cho thấy: Nghiệm thức 3 mg/l BA đạt số chồi gia tăng
cao hơn các nghiệm thức còn lại; Ở các nghiệm thức có sử dụng NAA 0,5 mg/l và 1
mg/l kết hợp với BA 0 mg/l và 0,2 mg/l đạt số rễ cao hơn so với các nghiệm thức còn
lại; Nghiệm thức xơ dừa, tro và tro + xơ dừa (1:1) đã giúp chồi tạo rễ nhiều hơn và
nghiệm thức xơ dừa giúp chồi sinh trưởng tốt.

xiii


MỞ ĐẦU
Hoa kiểng từ ngàn đời nay được coi là thú tiêu khiển tao nhã, ích lợi trong việc tịnh
dưỡng tinh thần, làm dịu bớt những căng thẳng trong cuộc sống. Hiện nay, với nền
kinh tế đang phát triển, đời sống con người ngày càng được nâng cao, nhu cầu chơi cây
cảnh của người dân ngày càng nhiều. Để đáp ứng được nhu cầu này, hoa kiểng được lai

tạo hoặc nhập nội ngày càng phong phú. Náng đế là loại cây phù hợp với nhu cầu trang
trí nội ngoại thất nên cũng khá được ưa chuộng.
Náng đế có tên khoa học: Beaucarnea recurvata Lem. thuộc họ Nolinaceae, nguồn gốc
từ Mexico. Cây thuộc nhóm cây mọng nước, được gây trồng làm cảnh chủ yếu ở các
tỉnh phía Nam Việt Nam trong khoảng chục năm gần đây.
Nuôi cấy mô là một công cụ nhân giống tích cực so với các phương pháp nhân giống
truyền thống là tạo được cây sạch bệnh, có hệ số nhân cao và thời gian sản xuất được
rút ngắn (Dương Công Kiên, 2007). Osorio-Rosales và Mata-Rosas (2005) đã nghiên
cứu nuôi cấy mô trên Beaucarnea gracilis và Beaucarnea recurvata, kết quả cho thấy
môi trường có bổ sung 22,2 μM BA đạt số chồi cao nhất (8,2 – 11,1 chồi); trong giai
đoạn ra rễ in vitro, môi trường MS có bổ sung than hoạt tính cho tỷ lệ ra rễ đạt 61%100% ở cây Beaucarnea gracilis và 83%-100% ở cây Beaucarnea recurvata; sau 3
tháng ra vườn ươm, tỷ lệ sống của cả 2 loài là 80%-100%.
Đề tài “Vi nhân giống cây Náng đế (Beaucarnea recurvata)” được thực hiện nhằm tìm
nồng độ các chất điều hòa sinh trưởng thích hợp cho sự sinh trưởng, phát triển của cây
Náng đế in vitro, phục vụ công tác nhân nhanh số lượng, đáp ứng yêu cầu sản xuất của
thị trường cũng như làm cơ sở cho công tác chuyển gen và lai tạo giống mới.

1


CHƯƠNG 1

LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
1.1. SƠ LƯỢC VỀ CÂY NÁNG ĐẾ
1.1.1 Nguồn gốc
Cây Náng đế hay còn gọi là cây cọ đế, đuôi ngựa hay chân voi có tên tiếng Anh là
Elephant-foot tree hay Pony Tail Palm. Tên khoa học: Beaucarnea recurvata (syn.
Nolina recurvata), thuộc họ Nolinaceae (họ Náng đế hay Phong nữ). Chúng có nguồn
gốc từ Mexico được gây trồng làm cảnh chủ yếu ở các tỉnh phía Nam Việt Nam.
1.1.2 Phân loại - Đặc tính thực vật

1.1.2.1 Phân loại
Lịch sử phân loại họ Nolinaceae khá phức tạp. Trong suốt thế kỷ XIX, các chi của loài
này được phân loại chung với họ Liliaceace. Vào năm 1879, Sercno Watson đã tách
Dasylirion và Nolina từ Yuccae (có chứa Yucca và Hesperaloe). Sau đó nó được phân
loại theo họ Agavacea, năm 1985 được tách riêng theo lớp 1 lá mầm thành họ
Nolinaceae bao gồm 4 chi là Beaucarnea recurvata Lemaire 1861, Calibanus Rose
1906, Dasylirion Zuccarini 1838 và Nolina Michaux 1803. Ngày nay họ Nolinaceae có
khoảng 55 chi và 60 loài (Mary và Gary, 2000).
Theo Bajaj (1997), Beaucarnea recurvata đã được danh dự mang tên của Jean-Baptiste
Beaucarne, một trong những nhà sưu tập thực vật nổi tiếng của Bỉ trong thế kỷ 19.
1.1.2.2 Đặc tính thực vật
Náng đế có nguồn gốc từ vùng khô cằn và khu vực bán sa mạc phía Đông Nam của
Mexico, thích hợp ở khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới, ưa khí hậu nóng ẩm (Mary và
Gary, 2000). Mặc dù vậy nhưng nó có thể chịu đựng được thời tiết khá lạnh. Cây
trưởng thành có thể sống sót ở nhiệt độ khoảng -7°C (Mary và Gary, 2000).
Thân cây dạng cột mảnh cao 1-2 m, không phân nhánh, gốc phình rộng thành một đế
lớn hình bán cầu đường kính 30-40 cm. Lá tập trung ở đầu cành, dạng thuôn hẹp hình
dài, nhọn mảnh ở đầu, xếp tỏa tròn, màu xanh bóng mềm uốn cong ra ngoài.
Theo Wang và Sauls (1988), Náng đế là loài cây ưa sáng, trồng trong môi trường
thoáng khí, cây trong điều kiện đất đọng nước gây thối rữa gốc. Thường xuyên tưới với
chu kỳ khô hạn ngắn sẽ làm gia tăng đáng kể sự tăng trưởng của cây. Cây có thể thích
nghi các điều kiện đất trồng cao (sét, mùn, cát, đất tính axit hay kiềm) (Dehgan, 1998).
2


1.1.3 Giá trị của cây Náng đế
Náng đế có nhiều công dụng hữu ích trong làm cảnh, cây có thể là tâm điểm của sân
vườn hoặc quanh hồ, và cũng phù hợp khi trồng với xương rồng và những cây mọng
nước lớn khác. Vì là cây thuộc nhóm mọng nước chịu được khô hạn nên không tốn
công chăm sóc (Mary và Gary, 2000).

Ngoài tác dụng để thưởng thức ra, là loại cây CAM, Náng đế có đặc điểm hấp thu khí
CO2 do cây hô hấp ra và có trong không khí ban ngày lẫn ban đêm (Dương Ngọc Hiệp,
2010) nên có thể trang trí trong phòng khách, phòng làm việc, ngay cả phòng ngủ.
1.2 NUÔI CẤY MÔ VÀ PHƯƠNG PHÁP VI NHÂN GIỐNG
1.2.1 Khái niệm về vi nhân giống
Nuôi cấy mô tế bào thực vật là sự nuôi cấy vô trùng các cơ quan, mô, tế bào thực vật
trên môi trường nuôi cấy được xác định rõ, việc nuôi cấy được duy trì dưới các điều
kiện kiểm soát, khác với cây in vivo là quá trình trồng cây trong điều kiện tự nhiên
(Nguyễn Đức Thành, 2000).
Kỹ thuật nuôi cấy mô mang tính thương mại chủ yếu trên cơ sở vi nhân giống. Vi nhân
giống là việc nhân đúng kiểu cây của một kiểu gen được tuyển chọn bằng cách sử dụng
kỹ thuật in vitro. Vi nhân giống thông thường là phương pháp nhân nhanh và giảm giá
thành (Nguyễn Bảo Toàn, 2004).
1.2.2 Vai trò của vi nhân giống
Theo các tác giả Pierik (1975), Anonymous (1980), Van Assche (1983), Gebhard et al.
(1983), Kunneman-Kooij (1984), trích từ Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thuỷ Tiên,
(2002) thì vi nhân giống có những lợi ích sau:
- Nhân giống vô tính in vitro nhanh hơn nhân giống vô tính in vivo.
- Có thể tiến hành ở một số loài thực vật mà nhân giống in vivo không thể thực
hiện do nhân giống in vitro có thể cảm ứng được sự trẻ hoá của mô.
- Việc nhân giống cây in vitro tạo được những cây sạch bệnh.
- Do cây in vitro được nuôi cấy trong điều kiện hoàn toàn thích hợp (nguồn dinh
dưỡng và điều kiện môi trường) do đó có thể sản xuất cây con quanh năm.
- Có thể sử dụng cây nhân giống in vitro để làm cây mẹ cho các bước nhân
giống tiếp theo.

3


1.2.3 Môi trường nuôi cấy

Một trong những yếu tố quan trọng nhất trong sự tăng trưởng và phát sinh
hình thái của tế bào và mô thực vật trong nuôi cấy là thành phần môi trường nuôi
cấy. Thành phần môi trường nuôi cấy tế bào và mô thực vật thay đổi tuỳ theo loài và bộ
phận nuôi cấy, tuỳ theo mục đích thí nghiệm mà mô cấy được duy trì ở trạng thái mô sẹo,
tạo rễ tạo mầm hay muốn tái sinh thành cây hoàn chỉnh. Tuy vậy, tất cả các môi trường
nuôi cấy điều bao gồm các thành phần cơ bản sau: nước, các nguyên tố khoáng đa
lượng, các nguyên tố khoáng vi lượng, nguồn cacbohydrat, vitamin, các chất điều hoà
sinh trưởng. Ngoài ra, người ta còn bổ sung một số chất hữu cơ có thành phần xác
định (amino acid, vitamin, …) và một số chất có thành phần không xác định như nước
dừa, dịch trích nấm men (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thuỷ Tiên, 2002)
1.2.2.1 Nước
Phẩm chất nước là điều kiện quan trọng trong nuôi cấy. Nước sử dụng trong nuôi cấy
thường là nước cất một lần. Trong một số trường hợp người ta cũng sử dụng nước cất
hai lần hoặc nước khử khoáng (Nguyễn Bảo Toàn, 2005).
1.2.2.2 Các nguyên tố khoáng đa lượng, vi lượng
Theo Lê Văn Hoà và ctv. (1999) khoáng đa lượng rất cần cho cây, có ảnh hưởng rất
tốt cho sự hấp thu của mô cấy và chúng không gây độc. Các nguyên tố khoáng đa
lượng gồm các nguyên tố được sử dụng ở nồng độ tên 30 mg/l. Những nguyên tố đó
là N, S, P, K, Mg và Ca.
Trong nuôi cấy mô in vitro nguồn nitơ thường được sử dụng dưới dạng nitrat (NO3) và
amnium (NH4+) đồng thời cũng sử dụng các dạng nitơ hữu cơ như acid amin. Tuy
nhiên nếu chỉ dùng acid amin làm nguồn nitơ thì mô phát triển rất yếu, sự có mặt đồng
thời của nguồn nitơ vô cơ và hữư cơ ở hàm lượng thích hợp sẽ thúc đẩy tế bào sinh trưởng
mạnh (Vũ Văn Vụ, 2003).
Các nguyên tố khoáng vi lượng là các nguyên tố được sử dụng với nồng độ thấp hơn
30 mg/l. Đó là các nguyên tố: Fe, Bo, Mn, I, Mo, Zn, Cu, Ni, Co. Các nguyên tố
này đóng vai trò quan trọng trong hoạt động của các enzym (Nguyễn Xuân Linh, 1998).
1.2.2.3 Nguồn cacbohydrat
Trong nuôi cấy mô, nguồn cacbon giúp mô, tế bào thực vật tổng hợp nên các chất hữu cơ
giúp mô và tế bào phân chia, tăng sinh khối. Không phải là do quá trình quang hợp

cung cấp mà chính là nguồn cacbon bổ sung vào môi trường nuôi cấy dưới dạng
đường. Hai dạng đường thường gặp nhất là sucrose và glucose, nhưng hiện nay
4


sucrose được sử dụng phổ biến hơn và nồng độ sucrose biến đổi từ 1-8 % (Nguyễn Đức
Lượng và Lê Thị Thuỷ Tiên, 2002).
1.2.2.4 Vitamin
Trong môi trường nuôi cấy, đa số mô cấy chưa có cấu trúc để tự tổng hợp đủ
lượng cần thiết nên cần phải bổ sung thêm vitamin từ bên ngoài vào (Lê Văn Hòa và
ctv., 1999). Vitamin đóng vai trò là chất xúc tác trong hệ thống enzyme và chỉ yêu cầu
với lượng nhỏ. Các vitamin thường được sử dụng nhiều nhất trong nuôi cấy mô
là: thiamin (B1), acid nicotinic (B3), pyridoxin (B6) và myo-inositol. Trong đó,
thiamin là một vitamin căn bản cần thiết cho sự tăng trưởng của tất cả các tế bào
(Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002). Myo-inositol có vai trò trong sự
sinh tổng hợp thành tế bào và thường được dùng với hàm lượng lớn 50-100 mg/l
(Nguyễn Xuân Linh, 1998). Các vitamin khác, đặc biệt là nicotinic acid (vitamin
B3), canxi pantothenat (vitamin B5) và biotin cũng được sử dụng để nâng cao sức
sinh trưởng của mô nuôi cấy.
1.2.2.5 Agar
Agar là chất thường được sử dụng nhất để tạo môi trường đặc hay môi
trường bán đặc để nuôi cấy mô thực vật. Agar trộn với nước thì tạo thành dạng gel và
tan ra ở nhiệt độ 60-100oC và đặc lại khi nhiệt độ giảm xuống 45oC. Nồng độ agar
thường sử dụng trong môi trường nuôi cấy mô thực vật là 0,5-10 %. Theo Nguyễn
Bảo Toàn (2005), nồng độ agar được sử dụng sẽ ảnh hưởng đến: thế năng nước
trong môi trường nuôi cấy, độ cứng của môi trường, sự sinh trưởng của mẫu cấy, các
vấn đề sinh lý của mẫu cấy như sự thừa nước, sự hoạt động của cytokinin trong môi
trường có agar.
1.2.2.6 Nước dừa
Nước dừa được bổ sung vào môi trường nhằm tăng sự sinh sinh trưởng và phát triển

mô. Trong nước dừa có chứa các loại khoáng, acid amin, myo-inosytol, đường, chất
béo và chất điều hòa sinh trưởng như cytokynin có lợi cho sự tạo phôi tạo mô sẹo và tái
sinh cây. Đối với nhiều loại mẫu nuôi cấy, lượng nước dừa phù hợp nhất là 15-20 % thể
tích (Vũ Văn Vụ, 1999).
1.2.2.7 pH
pH của môi trường nuôi cấy mô có thể từ 5,0 - 6,5 và thường được điều chỉnh để đạt
khoảng 5,8. Môi trường có pH thấp (thấp hơn 4,5) hoặc cao (cao hơn 7,0) ức chế sự
phát triển của mô (Bùi Bá Bổng, 1995).
5


1.2.2.8 Sơ lược về chất điều hòa sinh trưởng
Chất điều hoà sinh trưởng là những chất có hoạt tính sinh học cao nên với một hàm
lượng rất nhỏ (10-9) có thể kích thích, ức chế hoặc bổ sung bất kỳ một quá trình sinh lý
nào trong thực vật. Hiệu lực tác dụng của chúng rất khác nhau, tuỳ thuộc vào bản chất
và nồng độ tế bào nhận tác dụng. Hiện nay có hai nhóm chất điều hoà sinh trưởng
thực vật được sử dụng phổ biến là auxin và cytokinin.
 Auxin
Trong nuôi cấy mô thực vật, nhóm Auxin thường được sử dụng gồm các chất: 2,4-D
(Dichlorophenoxy acetic acid); IBA (Indol butyric acid); IAA (Indol acetic acid); NAA
(Naphthalene acetic acid ).
Tác dụng đặc trưng nhất của auxin kích thích pha dãn dài tế bào; tuy nhiên trong quá
trình sinh trưởng của tế bào, auxin ảnh hưởng không chỉ lên pha dãn dài tế bào mà có
thể kích thích và kìm hãm quá trình phân chia tế bào (Trần Văn Minh, 1994).
Theo Nguyễn Văn Uyển và ctv. (1993), các chất điều hoà sinh trưởng nhóm
auxin gồm 2,4-D; NAA; IAA; IBA sử dụng với nồng độ trong khoảng 0,1-5 mg/l.
Auxin được dùng với hàm lượng thấp thì sẽ gia tăng sự hình thành rễ phụ, ngược lại
nếu dùng ở nồng độ cao thì sẽ ảnh hưởng không tốt đến sự tạo lập rễ nhưng lại kích
thích sự tạo callus (Vũ Văn Vụ, 1999).
 Cytokinin

Cytokinin là những hợp chất adenin được thay thế, nó kích thích sự phân chia tế bào và
những chức năng điều hòa sinh trưởng khác giống như Kinetin, Cytokinin đầu tiên
được phân lập từ DNA tinh trùng cá trích được thanh trùng và được gọi là Kinetin
(Nguyễn Minh Chơn, 2005).
Cytokinin đóng vai trò quan chính trong sự thành lập chồi và cơ quan trong nuôi cấy
mô (Nguyễn Bảo Toàn, 2005). Theo Nguyễn Minh Chơn (2005), cytokinin có khả
năng kích thích chồi bên và đặc biệt là vượt qua ảnh hưởng ưu thế chồi ngọn. Nồng độ
sử dụng đối với cytokinin trong khoảng 0,1-2 mg/l (Nguyễn Văn Uyển, 1984). Trong
đó, BA và kinetin là hai loại được sử dụng rộng rãi hơn cả. Nồng độ sử dụng 0,1-2
mg/l. Để tăng sinh chồi bên, nếu nồng độ cytokinin quá cao sẽ kích thích sự hình thành
của nhiều chồi nhỏ nhưng những chồi này không thể kéo dài, hoặc làm cho lá bị biến
dạng hoặc làm cho chồi có nhiều nước. Nồng độ cytokinin cao (5 - 10 mg/l) thường
cản hoặc làm chậm sự tạo rễ (Schraudolf và Reinert, 1959; Harris và Hart, 1964; Ben
Jaacov và ctv, 1991; Humphries, 1960; trích bởi Vũ Văn Vụ, 2003). Vì lý do này mà
6


người ta thường không sử dụng cytokinin trong môi trường kích thích sự ra rễ của chồi để
tạo cây con. Đôi khi người ta cũng cấy chuyền chồi một hoặc vài lần qua môi trường
không có cytokinin để làm giảm lượng cytokinin trong mô (Nguyễn Đức Lượng và Lê
Thị Thuỷ Tiên, 2002).
Hầu hết thực vật đều cần đến cytokinin để cảm ứng sự tạo chồi và auxin có vai trò ngược
lại. Tỉ lệ cytokinin/auxin sẽ xác định sự tạo cơ quan: tỉ lệ cao: tạo chồi; tỉ lệ thấp: tạo rễ .
Tỉ lệ cytokinin/auxin thường là 10/1 (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002).
1.2.4 Các giai đoạn của vi nhân giống
Vi nhân giống đã được Debergh và Zimmerman (1991) chia thành năm giai đoạn khác
nhau, mỗi giai đoạn có một chức năng riêng (Nguyễn Bảo Toàn, 2004):
Giai đoạn 0: Lựa chọn và chuẩn bị cây mẹ
Khởi đầu của quá trình vi nhân giống cần phải có sự lựa chọn cẩn thận và cải thiện thật
tốt điều kiện vệ sinh của cây mẹ. Tình trạng sinh lý của cây mẹ cũng như nguồn dùng

làm mẫu cấy có thể được cải thiện bởi một số kỹ thuật như tưới nhỏ giọt, ghép nhiều
tầng (Nguyễn Bảo Toàn, 2004) làm cho mẫu cấy non hơn và sạch hơn. Ngoài ra, các
thủ tục để phát hiện và làm giảm hay loại trừ các mầm bệnh về vi khuẩn, virus là điều
cần thiết (George, 1993).
Giai đoạn 1: Khử trùng mẫu cấy
Đây là sự kết hợp giữa một phương pháp khử trùng đầy đủ và một tỉ lệ sống cao của
mẫu cấy không bị nhiễm. Thực tế điều này khó đạt 100% trong kỹ thuật vô trùng mẫu
Để nâng cao tỉ lệ tuyệt trùng, cần chú ý đến nồng độ hoá chất và thời gian khử trùng.
Nồng độ và thời gian khử trùng thay đổi tuỳ theo loài và kích thước của mẫu cấy.
(Nguyễn Bảo Toàn, 2004).
Giai đoạn 2: Nhân chồi
Toàn bộ quá trình nhân giống vô tính in vitro chỉ nhằm mục đích tạo ra hệ số nhân cao
nhất. George (1993) cho rằng số lượng chồi được nhân lên phụ thuộc vào số lần cấy
chuyền và nồng độ kích thích tố sử dụng trong môi trường. Mục tiêu của giai đoạn này là
tăng nhanh số lượng cá thể bằng sự sinh phôi soma, tăng số lượng chồi bên, tạo chồi bất
định. Chồi bên và chồi ngọn có thể được cảm ứng trên in vitro bằng cách làm tăng số chồi
đang hiện hữu. Một mẫu cấy có mang chồi đơn sẽ phát triển thành một chồi hay một cụm
chồi tuỳ thuộc vào loài thực vật và môi trường nuôi cấy. Sau vài lần cấy chuyền các chồi
được tạo ra và chuyền sang giai đoạn 3 để cảm ứng ra rễ (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị
Thuỷ Tiên, 2002)
7


Nguyễn Xuân Linh (1998) cho rằng toàn bộ quá trình nhân giống in vitro xét
cho cùng chỉ nhằm mục đích tạo ra hệ số nhân cao nhất. Vì vậy giai đoạn này được
coi là giai đoạn then chốt của quá trình. Để tăng hệ số nhân người ta thường phải
thêm vào môi trường dinh dưỡng nhân tạo các chất điều hoà sinh trưởng (auxin,
cytokinin, gibberellin,…) các chất bổ sung khác như nước dừa, nước chiết nấm men, dịch
thủy phân casein…kết hợp với các yếu tố nhiệt độ, ánh sáng phù hợp. Tuỳ thuộc vào đối
tượng nuôi cấy, người ta có thể nhân nhanh bằng kích thích sự hình thành cụm chồi (nhân

cụm chồi) hay kích thích sự phát triển của các chồi nách (vi giâm cành) hoặc thông qua
việc tạo cây từ phôi vô tính.
Có 3 phương pháp nhân chồi là phát sinh chồi bất định từ mô sẹo nhận được
từ mô thực vật nuôi cấy, phát sinh chồi bất định trực tiếp từ mô thực vật không thông
qua mô sẹo và phương pháp nhân chồi bên (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thuỷ
Tiên, 2002). Trong đó phương pháp khá đơn giản để nhân nhanh số chồi là phương
pháp nhân chồi bên. Phương pháp này có ý nghĩa rất quan trọng trong thực tế vì nó
đơn giản hơn phương pháp khác, tốc độ nhân giống cao, sản phẩm ổn định về mặt di
truyền, cây con tăng trưởng rất tốt có lẽ là do đã được trẻ hoá (Dương Công Kiên, 2002).
Theo Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên (2002), ảnh hưởng của cytokynin trên
sự nuôi cấy mô và cơ quan phụ thuộc vào loại cytokinin sử dụng, kiểu nuôi cấy, loài
thực vật được nuôi cấy và mẫu cấy được thu từ mô còn non hay mô trưởng thành. Ở
Corylus avellana, BA nồng độ 5 mg/l là nồng độ thích hợp nhất trong nuôi cấy và tăng
sinh chồi từ các mẫu cấy còn non, nhưng khi nuôi cấy đốt thân của những đoạn cây
trưởng thành thì cần phải có zeatin 10 mg/l. Đối với một số loại cây, số lần cấy chuyền
càng nhiều thì nhu cầu về cytokynin càng giảm là do cây đã quen với cytokinin và mô
đã được trẻ hóa. BA là là loại cytokinin có hiệu quả cao trong sự cảm ứng chồi ở nhiều
loại thực vật. Khi sử dụng BA ở nồng độ cao sẽ tạo ra nhiều chồi không bình thường.
Tốt hơn là nên chuyển các chồi bất định hình thành trên môi trường có nồng độ cao sang
môi trường có nồng độ cytokinin thấp hơn để chồi tăng trưởng.
Giai đoạn 3: Tạo rễ hoặc tiền thuần dưỡng
Mục đích của giai đoạn này giúp cho cây con gia tăng chiều cao và tạo rễ đầy đủ làm tăng
tỉ lệ sống sót cao khi chuyển ra trồng bên ngoài. Do các chồi hoặc cây con từ giai đoạn 2
nhỏ và chưa có khả năng tự phát triển trên đất hoặc phân trộn (George, 1993) nên chúng
được chuyển sang môi trường cảm ứng ra rễ để trở thành cây con hoàn chỉnh (Nguyễn
Đức Lượng và Lê Thị Thuỷ Tiên, 2002).

8



Trong giai đoạn nhân, chồi được cấy chuyền thành từng cụm nhưng trước khi
chuyển sang môi trường ra rễ thì chồi phải được tách ra thành từng cụm đơn riêng rẽ.
Đây là giai đoạn các chồi được chuyển sang môi trường cảm ứng ra rễ để trở thành cây
con hoàn chỉnh, giai đoạn này có thể kéo dài 2-4 tuần, loại và dạng chất kích thích ra rễ
tuỳ theo loài thực vật. Tuy nhiên, một số loài ra rễ nhất thiết phải có sự hiện diện của
auxin. Những loại auxin thường được bổ sung vào môi trường để cảm ứng ra rễ là IAA,
IBA, NAA. Sự đáp ứng của chồi với auxin và sự hình thành rễ hoàn toàn phụ thuộc vào
loại thực vật, đôi khi chính cytokinin còn tồn tại trong môi trường nhân giống đã cản sự ra
rễ của chồi trong giai đoạn tạo rễ (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thuỷ Tiên, 2002).
Theo Nguyễn Xuân Linh (1998) khi chồi đạt đựơc kích thước nhất định, các
chồi đó được chuyển từ môi trường ở giai đoạn 3 (nhân nhanh) sang môi trường tạo
rễ. Thường sau 2-3 tuần từ những chồi riêng lẻ này sẽ xuất hiện rễ và trở thành cây
hoàn chỉnh. Ở giai đoạn này có thể thêm than hoạt tính làm cho bộ rễ có chất lượng tốt
hơn. Nồng độ auxin thường được sử dụng trong môi trường nuôi cấy là 0,1-2,0 ppm vì
chúng có hiệu quả ở nồng độ thấp (Vũ Văn Vụ và ctv., 2006).
Ít có loài thực vật nào có thể ra rễ ngay trong môi trường nhân giống. Nguyên nhân là do
cytokinin hiện diện trong môi trường nuôi cấy đã ức chế sự hình thành rễ vì vậy cần có
một môi trường chuyên biệt để cảm ứng sự tạo rễ. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự tạo rễ
là chất điều hòa sinh trưởng thực vật, khoáng đa vi lượng, các hợp chất hữu cơ, cơ chất
(chất làm đặc môi trường), ánh sáng, nhiệt độ, điều kiện môi trường nuôi cấy cũng có
thể ảnh hưởng đến sự ra rễ của chồi. Khi cấy chồi trên môi trường agar thì lông rễ sẽ
không phát triển bình thường vì trong môi trường agar điều kiện không khí kém. Ánh
sáng cũng cần thiết cho sự ra rễ ở một số loài thực vật xác định. Nhu cầu ánh sáng xảy
ra ở một số loài thực vật để củng cố hàm lượng carbohydrat nội sinh khi sự tạo rễ xảy
ra (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002).
Giai đoạn 4: Thuần dưỡng
Mục đích của giai đoạn này là làm giảm mức độ chết của cây con in vitro khi chuyển
từ trạng thái sống dị dưỡng sang tự dưỡng trong nhà lưới. Để tăng tỉ lệ sống sót bên
ngoài thì cây con nhất thiết phải trải qua thời gian tập quen dần với điều kiện gần giống
bên ngoài như tăng cường ánh sáng, nhiệt độ. George (1993) cho biết là tưới phun

sương trong giai đoạn này rất hiệu quả để duy trì độ ẩm.

9


1.3 Một số kết quả nuôi cấy mô đã được nghiên cứu
Osorio-Rosales và Mata-Rosas (2005), thấy rằng trên môi trường có bổ sung 22,2 μM
BA số chồi cây Beaucarnea gracilis và Beaucarnea recurvata được nhân lên cao nhất
(8,2 – 11,1 chồi). Trong giai đoạn ra rễ in vitro, cây được cấy trong môi trường có bổ
sung than hoạt tính và không có kích thích tố cho kết quả tỷ lệ ra rễ đạt 61%-100% ở
cây Beaucarnea gracilis và 83%-100% ở cây Beaucarnea recurvata. Sau 3 tháng ra
vườn ươm, tỷ lệ sống của cả 2 loài là 80%-100%.
Theo Bajaj (1997), rễ Beaucarnea recurvata Lem. xuất hiện sau 3 đến 4 tuần nuôi cấy
và đều phát triển tốt, rất dài, không phân nhánh trong môi trường không có NAA.
Việc nhân chồi Nolina recurvata đạt kết quả cao nhất (6 chồi) trong môi trường có bổ
sung 4,45 μM BA and 0,5 μM IBA. Trong giai đoạn ra rễ, môi trường có 1,76 mmol βcyclodextrin kết hợp 5 μmol IBA đạt tỷ lệ ra rễ 100% (Bettaieb và ctv, 2008).
Theo Fernando (2008), sau 65 ngày nuôi cấy Beaucarnea recurvata Lem., trong môi
trường có bổ sung nồng độ BA nồng độ 2,5 mg/l, 5 mg/l and 7,5 mg/l số chồi được tạo
thành đạt cao nhất (10,93 chồi).
Yucca elephantipes đạt số chồi cao nhất (5,8 – 6,5 chồi) trong môi trường có bổ sung
4,5 μM TDZ hoặc 11,1 and 22,2 μM BA. Bên cạnh đó môi trường không có chất điều
hòa sinh trường hoặc có BA nồng độ thấp (0,4 μM) hiệu quả cho việc ra rễ (Danuta,
2010)
Bentz và ctv (1988), cũng cho rằng môi trường có bổ sung 32 μM BA trong nuôi cấy
Yucca glauca cho số chồi cao nhất.
Theo Atta-Alla và Staden 1997, kết quả vi nhân giống cây Yucca aloifolia chồi đạt cao
nhất khi kết hợp NAA (1,1 μM) và TDZ (4,5 μM). Bên cạnh đó, môi trường ½ MS +
than hoạt tính có bổ sung IBA (2,5 hoặc 4,9 μM) có hiệu quả trong sự ra rễ.
Atta-Alla và ctv (1997), cho thấy trong môi trường có bổ sung 4,5 μM TDZ + 1,1 μM
NAA cho số chồi Y. aloifolia cao nhất (6,6 chồi).

Theo Sakr và ctv (1999) môi trường có kết hợp 2,2 μM BA và 9,9 μM IBA tạo rễ tốt
trên cây Yucca elephantipe.
Agave grijalvensis được nuôi cấy trong môi trường có bổ sung 38,2 uM BA cho kết
quả số chồi cao nhất đạt. Bên cạnh đó môi trường ½ MS có bổ sung 22,7 μM IBA tốt
nhất cho sự ra rễ (Sanchez-Urbina và ctv, 2008)
Những cây thuộc loài Agavaceae có thể ra rễ in vitro trong môi trường không có kích

10